Спосіб одержання клона бактерій escherichia coli, трансформованого плазмідой рbr322, який містить вставку pst-1, кодуючу інтерферон alрha або beta

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является одновременный отбор клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с геном, кодирующим oi- и В—интерферон. Одновременный отбор клонов обеспечивается наличием гомологии между (от 5 до 7) функциональными IFN оіи IFN-|3 генами. Участок гомологии имеет длину 13 нуклеотидов со следуюиіей формулой Ь*CCTTCTGGAACTG-З'. Кроме тлго, и РНК из клеток Namalva выделяют через 9 ч после индукции вирусом, синтез к ДНК осуществляют на (А) + РНК с величиной молекулы 6 и 18 S, а дн.ДНК получают размером 600 п.о. (О 1 1346048 Клетки отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 1000 g, один раз промывают буфером NP-40 (0,14моль j NaCl, 1,5 ммоль MgCl 2 . 10 ммоль трисНС1, рН 7,4) и ресуспендируют в NP 40 (Shell)-буфере с 0,5% неионного детергента КР-40 (Шелл) и 2 мг/моль бентонита. Через 5 мин в ледяной ю бане клеточное ядро центрифугируют, пеллетируют, как описано выше, экстрагируют содержащую РНК цитоплаэмическую фракцию добавлением 2% натрийдодецилсульфата, 5 ммоль этиленди15 нитрилотетрауксусной кислоты и 50 ммоль трис—HCl, рН 9, затем трижды смесью фенол - хлороформ и один раз хлороформом ч непосредственно после этого осаждают РНК спиртом. + Поли(А) РНК очищают с помощью опито20 ві]) -целлюлозной хроматографии, в щие клетки для производства П О Л И ( А ) результате центрифугирования в 5— РНК, которые содержат человеческие 20%-ном градиенте сахарозы в Юммоль IFN-^и IFN-p- иРНК. буфера ацетата натрия, рН 5,5, Различные человеческие клетки индуцируют сендайвкрусом для про- 25 1 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты( 20 ч при скорости 25000 об/мин изводства интерферона известными мес ротором Spinco SW 27) разделяют по тодами. Через 24-48 ч определяют совеличине молекулы и собирают молекудержание IFN-et, и IFN-6 нейтрализацилы величиной порядка 6 S (единица ей специфической для типов антисывороткой. . , „ седиментации) и 18 S (для простоты названная поли 123-РНК)„ Выявляют, что клетки намальва Содержание интерферонспецифичес— продуцируют более 50% IFW-ei и до кой иРНК ( J F N - О І И 1ПЯ-р мРНК) опреде50% lFN-р после индукции сендаивируляют в результате микроинъекции сом. 12S-PHK в ооциты херононуса, измеряТест на нейтрализацию проводят 35 ют активность интерферона в ооиитах. следугатпим образом. При этом получают \ / г инъецированной и Приблизительно 10 ед. интерферона (12S-PHK среднего титра интерфеинкубируют при 37 С в течение 6 0 рона около 1000 IE интернациональ80 мин: ная единица интерферона , считая на 1) антисыворстка против IFN-oi; 40 стандарт интерферона 69/19. окончательное разбавление 1:100; При этом около 80% активности ней2) антисыворотка против человечестрализуется антисывороткой против кого IFN-A; конечное разбавление об—типа интерферона, в то время как 1:300; общая активность нейтрализуется толь3) смесь первой и второй антисыво- 45 ко смесью, состоящей из анти—оі— и роток. анти—|^—интерферона антисыворотки. После инкубации определяют остаП р и м е р з . Поли(А)* РНК, кототочную активность интерферона меторая И М Є Р Т величину молекулы 6—18 S дом определения стерильных пятен. П р и м е р 2„ Получают поли(А) 50 (12S-PHK), применяют в качестве матрицы для получения однониточной кДНК, РНК, которая содержит человеческие причем 40 j г/мл поли(А)*РНК инкубиu IPK-ot- иРНК из клеток намальва, руют з 50 ммоль трис—НС1, рН 8,3, индуцированных сендаивирусом. 10 ммоль MgCl 2 , 100 мочь КС1, 1 ммоль Разводят клетки намальва и индуdHTPS, 0,4 ммоль дитиотрейтола, цируют сендаивирусом. иРНК Еыделяют 55 4 ммоль пироЛосфата натрия, 20 іц г/мл через 9 ч после индукции сендаивируолиго (деокси^тикидина 12-18 (PTj-биосом, так как после этого интерзала химия), 25 ( г/мл актиномицина D со У количество интерферонспецифичесдсих 100 ед/мп АМУ обратной транскриптамРНК достигает максимума. Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является одновременный отбор клонов, несущих рекомбинатные молекулы ДНК с геном, кодирующим^- ий -интерферон. Одновременный отбор клонов обеспечивается наличием гомологии между (от 5 до 7) функциональными IFN-oiи 1РЭД-В-генами. При этом участок гомологии имеет длину 13 нуклеотидов со следующей формулой 5* CCTTCTGGAA1 CTG3 . Кроме того, и РНК из клеток Namalwa выделяют через 9 ч после индукции вирусом, синтез к ДНК осу+ ществляют на (А) РНК С величиной молекулы 6 и 18 S, а дн.ДНК получают размером 600 п.о. П р и м е р 1. Выбирают подходя+ 1346048 С помощью этого метода регенерируется место расщепления рестрикционной эндоиуклеазой Pst 1 и в послед4 ствии это можно использовать для того, чтобы вырезать из векторного гибрида кДНК-вставку. Полученные этим методом гибридплаз миды из pBR322 и намальва-кДНК применяют для трансформации Escherichia coli HB 101* Этим методой получают 30000 клонов трансформированных клеток її. coli, которые разделяют на микротитропластинах. П р и м е р з . Тридекануклеотид метят в 50 ммоль трис-HCl, рН 7,5, 10 ммоль MgCl., 5 ммоль дитиотрейтола, 0, 1 ммоль спермидина, 1 ї м й Р— )г'аденозі-їнтрифосфата с 60 єд./мл Т4 полинуклеотидкиназы (Bethesda Research Laboratories'! в течение 30 мин при 37 С до специфической і активности около 500 Ku/ммоль у 5 -конца молекулы. Этот меченый тридекануклеотид применяют в качестве праймеpa (Dsimes) для синтеза однониточной кДНК, при эт'ом в качестве матрицы служит поли(А^ДНК ИЗ индуцированных сендаивирусом r-леток намальва. Реакцию прсводят при 5-Ю—кратном молярном избытке праймера по отношению к РНК в 50 ммоль трис-НСІ, рН 8,3, 60 ммоль КС1, 5 MtfOJb дитиотрейтола, 50 и г/мл актиномицика 1 ? 4 ммоль MgCl,2, 4 ммепь натрийпирофосфата, 0,5 ммоль dNTPS со 100 ед./мл АМУ обратной транскриптазы в течение 90 кнн при 37° С. После удаления РНК гибрид РНКДНК инкубируют 1 ч в 0,3 моль йаОН при 50 С с последующей нейтрализацией 0,3 моль уксусной кислоты и кДНК применяют в качестве пробы гибридизации. Полученная таким образом кДНК несет радиоактивную метку лииь помощью рестрикционной эндокуклеазы Pst 1, смесь кДНК удлиняют путем на— ^Ь в молекулах, которые были синтезированы из интерферонспецифического триложения олигодезоксигуанидина у конт декануклеотида в качестве праймера ца З молекулы и модифицируют, полуи, следовательно, обладает высокой чая выступающие концы олигодезокси— специфичностью для опознания интергуанидина. Получают стабильные днДНК 5 0 феронДНК—последовательности в гибрипутем основного спаривания концов олигодеоксигуанидина со свободными дизации. концами олигодеэоксицитидина молекулы П р и м е р 4. Клетки отдельных кДИК. Для этого оба компонента этой клонированных трансформантов перереакции инкубируют в 0,1 ммоль NaCl, 1 ммоль этилендинитрилотетрауксусной 55 водят на нитроцеллкшозный фильтр (22x15 см, величина пор 0,45 им, кислоты, 20 ммоль трис—НС1, рН 8, в Millipore odes Schlliches), выращитечение 10 мин при 65 С, затем в тевают до величины колонии 2 мм дичение 2,5 ч при 45 С и затем в течеаметром и подготавливают к гибридиние ночи при 37°С, зы в течение 45 мин при 44-45°С. Непосредственно после этого РНК гибрида РНК-ДНК удаляют путем одночасовой инкубации в 0,3 моль КаОН при t 50°С, после чего однониточную кДКК нейтрализуют и осаждают этанолом. Вторая нитка ДНК, комплементарная к однониточной ДНК, синтезируется при следующих условиях: 30 шг/мл од- ю нониточной кДНК инкубируют в 0,12 моль буфера фосфата калия, рН 6,9, 10 ммоль MgCl 2 » 10 ммоль дитйо— трейтола, 1 ммоль dNTPS с 300 ед/мл ДНК полимеразы 1 (Bolhringer Mann75 heim), 6 ч 15 С, Затем экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Полученную таким образом двуниточную смесь кДНК у обоих концов нитки модифицируют, удаляют выступающие 20 концы отдельных нитей. Для этого ДНК инкубируют в 0,3 моль NaCl, 30 ммоль ацетата натрия, рН 4,5, 1 ммоль ZnCl 2 с 1250 ед/мл S 1 нуклеазы (Miles Laboratories) в течение 25 30 мин при 37 С, после чего экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Полученную таким образом двуниточную кДНК разделяют на 5-20%-ном градиенте сахарозы в 10 ммоль буфера ацетата зо натрия при рН 5,5, в I ммоль этилен— динитрилотетрауксуснои кислоты и зыделяют те фракции, которые имеют по крайней мере 600 о.п. кДНК (0,5 n г) j удлиняют приблизительно на 15 нуклео— тидов путем наложения олигодезокси— цитидина у 3 —конца обеих в результате инкубации в 140 ммоль калийкакозилата, рН 6,9, 30 ммоль трис-НС1 5 рН 6,9, 2 ммоль СоС1 2 , 0,1 ммоль дитиотрейтола, 0,1 мг/мл BSA, 5 (»моль 40 dCTPs с помощью 500 ед. терминальной трансферази в течение 4 мин при 37°С. Аликвоту 2JU г pBR322 линеаризуют с 1346048 эации. Гибридизацию нуклеиновой кислоты меченой на концах кДНК проводят в смеси, содержащей 50% форм— амида, 4xSE^ (USET=O,1S моль NaCl, 5 ммоль ттилендинитрилотетрауксусной кислоты, 50 ммоль трис-HCl, рН 8 ) , Wраствора Денхардта (0,02% BSA, 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона), 0,5 мг/мл денатурированной ,Q спермы лосося ДНК, 0,1% натрийпиро— фосфата и 0,1% натрийдодецилсульфа— та, в течение 48 ч при 37°С. Фильтр промывают в растворе, состоящем из 50% формамида и 0,2*SSC (l* SSC= 15 =0,15 моль NaCl, 0,015 моль нитрата натрия) при 20-25 С в течение 6—8 ч и затем опрыскивают раствором ixSSC» Фильтры высушивают при 20-25°С и при -70°С экспонируют с рентгеновской пленкой (кодак 5CR). Всего в ре- 20 зультате скрининга получают приблизительно 13000 трансформированных колоний бактерий й выделяют 190 клонов. В соответствии с этим около 1% всех 25 клонов клонбанка содержат специфическую последовательность &ССТТСТ— GGAACTG. 1,4%-ном плавающем агаре, переносят на нитроцеллюлозный фильтр и гибри9г дизируют с пла'чмидной ДНК, Р~меченной с ПОМОРСЬКІ никтрансляции, Плазмид— ную ДНК, которая произошла от индуцированного гена, гибридизируют в этой серии опытов только РНК из инду" цированных клеток, но не РНК из неиндуцированных клеток. Применяемые для гибридизации плазмиды-ДНК являются Р1Н1 (А), Р1Г12 (В,і), Р2Н10(С), Р1А6 СЕ), Р2В10 (Г). Из испытанных плазмид гибридиэировались только " P1F12, Р2Н10 и Р1А6 только с РНК из индуцированных клеток, в то время как Р1Н1 и Р2В10 гибридизуются также с РНК из неиндуцированных клеток. Величина молекулы РНК, гибрядизирующей™ ся с P1F12 и Р2Н10, 11-12 S, величина РНК, гибридизирующейся с Р1АН, 12—14 S (эти величины молекул известны для TKN-йили ІИЇ-^-иРНК. Плазмиды P1F32, Р2Н10 и Р1А6 исследуют дополнительно, чтобы однозначно уста" новить их содержание в интерферонДНКпоследовательности . П р и м е р 7. Плачмидиую ДНК фикП р и м е р 5с Тридекануклеотидсируют на нитроцеллюлозном фильтре позитивные клоны (микротитропластины 30 и инкубируют при условиях гибридизаР1 и Р2) и произвольно выбранные ции с П О Л И ( А ) РНК из индуцированных , клоны микротитровой пластины (Е52) клеток намальва. Получают связанную переносят на нитроцеллюлозный фильтр у ДНК—последовательность интерферона, разводят, подготавливают для гибриНегибридизированную РНК смывают, гибдизации бактерий и гибридизуют раз35 ридиэированную РНК выплавляют из ДНК' личными Р—меченными кДНК—вставками• и инъецируют в ооциты Xenopus laevis. Гибридизацию проводят, добавляя в Если в ооцитах синтезируется интерраствор гибридизации 50 ї г/мл поли(и) ї ферон—протеин , антивирусные свойства и lQair/мл поли (і) : поли(с), которого могут быть доказаны методом фильтр промывают после гибридизации 40 подсчета стерильных бляшек, lOjur в 50%-ном формамиде и lx tSSC. Оказалинеаризованной плазмидной ДНК деналось, что клон Р1Н1 гибридизирует турируют в 200 |цл 0,5 н. NaOH, нейболее чем 90% всех тридекануклеотид— трализуют 2 0 0 ^ л 0,5 ч. уксусной кипозитивных клонов пластины Р1 и Р2, слоты и 20 х БЕТ и фильтруют свяэмва— а также некоторые клоны пластины Е52, Идентичность многих этих клонированных45 н и е м н а нитроцеллюлозяом фильтре последовательностей подтверждают реаметром 2,5 мм. Фильтр высушивают при комнатной температуре, выдержистрикционным анализом. Клон Р2Н10 вают 2 ч при 80°С и затем в течение гибридизируется не только сам с со1 ч при 53 D С или также при 37 а С в бой, а также с клоном позиции ЇС12» IFI2, Е52Е1. Клоны Р1А6 и Р2В10 ана- L50 смеси, содержащей 50% форм&мида, 20 ммоль пиперазин-NjH'-6ис-(2-этанлизируют таким же методом. сульфокислоты), рН 6,5, 0,4 моль NaCl, 5 ммоль этилендинитрилотетра— П р и м е р 6, ЇЇОЛИ(А)* РНК отделяуксусной кислоты, 10% декстрансульфают от индуцированных и неиндуцированных клеток намальва, денатурируют в 55 та, 1% натрийдодецилсульфата,20^г/мл результате инкубации в течение 1 ч Е, coli ntPHK, 50 jnr/мл поли(А)препри 50°С в J моль глиоксаля, 50%-ном гибридизированной, и в самом буфере диметилсульфонсиде, 10 ммоль буфера после добавления 14—40 ц г индуцирофосфата натрия, рН 7, разделяют на ванной намальва-поли(А)+РНК гибриди 1346048 зировали в течение 5 ч. После отого PstI и Eg! II сайты рестрикции. Крофильтр промывают 3x20 мин при 25°С ме того, последовательность ДНК " в смеси, содержащей 0,2-1 • SET, 0,2% вставки клонов P1F12 и Р2Н10 с IFK- і натриидодецилсульфата, \7О декстрангеном определяют по методу Максама сульфата, 5 jur/мл т-РНК, затем 2* и Гилберта (правый 3' Pvu II - и е М О мин при 25 С в смеси, содержащей Bgl II фрагмент) и сравнивают с опу2 ммоль этилендинитрилотетрауксуеной бликованной IFN-В-последовательнокислоты, рН 8,0, 0,2% натрийдодецилстью. Последовательности P1F12 и сульфата, \% декстрансульфата,, Р2НІ0 идентичны с IFN~/}-reHOM. 10 D 5 fur/мл т-РНК, затем 5 мин 60 C в Выяснилось, оба клона на 5* консмеся 2 ммоль этилендннитрилотетраце не имеют полной IFN-P--последова— уксусной кислоты, рН 8,0, 0,2% наттельности} у них отсутствуют приблирийдодецклеульфата, 1 % цекстрансуль— зительно 60 нуклеоткдов региона, кофата, 5 fur/мл т—РНК, затем 5 мин дирующего для зрелого протеина, У 15 при 60°С в 2 ммоль этилендиннтрило™ 3'-конца P1F12 является полным, Р2НІ0 7 тетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2% также содержит весь З —регион IFN-^ — натрийдодецилсульфата, 5 р г / м л т—РНК. -кДНК, включая поли(cLA)последовательГибридизированную РНК в течение ность9 происходящую от поли(А)РНК. 4 мин элюируют при 100 С в 1 мл К^О 20 Р2Н10 простирается однако еще заметс 10 (иг т-РНК. После хроматографии нее (1400 п . о . ) 9 3' П О Л И ( 1 А ) лежит в на олихо—(dT)-целлюлозной колонке ортюй области с последовательностью РНК осаждают этанолом, вносят в олиго(б.С), следуя от последовательности неизвестного происхождения, ана5 мл Н 2 0 и инъецируют в ооциты Хеnopus laevis. Ооциты после инкубации1 25 лиз ДНК—последовательности различных отрезков этого дополнительного регив течение 2 дней при комнатной темона Р2Н10 не дает гомологии с IFN-j?пературе испытывают методом подсчета генсм. Перекрестно гибридизировакные стерильных бляшек на активность инс клоном Р2НЗО клоны Р1С12 и Е52Е1 терферона. гкбридизкруются и с дополнитЄЛЬНЇІІМ Подтвердилось, что клоны P!Fi2 и 30 регионом Р2Н10, а не с частью IFK-^i, P2HI0 несут вставку интерферокЦИК, П р и м е р б . Клон РЇА6 гибриди— В таблице приведены результаты зируют с вирус—индуцированной накаль-™ испытаний. ча-?ЯК в регионе 12—14 S. Он содержит вставку кДНК приблизительно Клон АктивНейтрализация с 35 900 гс.о., которая, как показал ре— ность ин- помощью антисыво— стрикииокный анализ, не кмеет сайта терферо- ротки, % против рестрикции для BamHI э Bgl II, Есо на, ед. /мл R I 5 Hind III, PstI и Pvu II. выступа IFN-p IFN-ot ооцитов Доказательство того, что клон 40 Р1А6 содержит TFN-^-последовательноетъ получают путем анализа ДНКP1F13 ~50 98 последовательности. Последовательность кДНК—вставки Р1А6 определяют -50 Р2Н10 98 . . . сравнением с IFN-еб-последоваіельно— Р1Н1