Спосіб перетворення азоту первинної аміногрупи a, b

1. Спосіб перетворення азоту первинної аміногрупи ,  - або ,  -гідрокси первинного аміну на азот мононенасиченої азотовмісної гетероциклічної сполуки, яка містить від 5 до 6 атомів у кільці, у якому послідовно виконують наступні стадії: а) обробляють гідроксіамін надлишковою кількістю галогенальдегіду, що містить альдегідний вуглець, C2 2 (19) 1 3 рецепторів та підтипів рецепторів для аналогів соматостатину на певних нормальних та уражених пухлинами тканинах. Бомбесиноподібні пептиди та наявність рецепторів бомбесину/GRP [рилізинг-пептидів росту] на різних нормальних та уражених пухлинами тканинах описано в огляді N. Bunnett in Gut Peptides: Biochemistry and Physiology 423-445 (1994) Ed.: J. Walsh і G. J. Dockray, Raven Press, New York і by E. Spindell in Recent Progress in Hormone Research 48, (1993) [Academic Press]. Доксорубіцин (DOX) є зараз найбільш широко використовуємим та дуже ефективним протираковим агентом. Однак, пухлини певних типів не реагують на нього взагалі, і його застосування обмежується такими ускладненнями, як резистентність до багатьох препаратів (MDR) і кардіотоксичність, а також нейтропенія, які розвиваються внаслідок хронічних захворювань. З метою подолання цих недоліків і подальшого використання значного протипухлинного потенціалу, властивого структурі антибіотиків ряду антрацикліну, було вивчено кілька тисяч їх синтетичних похідних, включаючи цілеспрямовані аналоги у сполученні з різноманітними макромолекулами носіїв. Майже все про DOX та його аналоги описано в "Адріаміцин", David W. Henry, ACS Symposium Series, No. 30, Cancer Chemotherapy, American Chemical Society, pp. 15-57 (1976), а також у монографії Доксорубіцин, Federico Arcamone, Academic Press, (1981). Високоактивний, алкілований, не маючий перехресної резистентності З'-деаміно-3'-(3"-ціано4"-морфолініл)-DОХ та його похідні, які відзначаються протипухлинною активністю, описано в патенті США №4.464.529, автори Mosher, et al., зареєстрованому 7 серпня 1984 року. Синтез та оцінку біологічної активності цих препаратів ["Intensely Potent Morpholinyl Anthracyclines"] розкрито також в J. Med. Chem. 1984, 27, 638-645. В Proc. Natt. Acad. Sci. USA Vol. 88, pp. 48454849, червень 1991 року, автори Gao et al., описано формальдегід-опосередковане алкілювання послідовності ДНК похідною даунорубіцину. Застосування а,-дийодо сполуки для алкілювання дауносамінового азоту в DOX і, таким чином, для утворення нової морфолінілової похідної DOX описано в Європейському патенті ЕР 434 960, зареєстрованому [Фармація Карло Ерба (Pharmacia Carlo Erba) 12 грудня 1989 року.] N-Трифтороацетиладріаміцин14-Огеміглутарат і -геміадіпат як аналоги Nтрифтороацетиладріаміцин14-О-валерату (AD-32) з поліпшеною розчинністю у воді описано у таких авторів, як Israel, et al., в патенті США 4.299.822, зареєстрованому 10 листопада 1981 року. Hoiton і Priebe [J. Antibiotics, XXXVI, 12111215.] описали декілька 14-О-естерів різних аналогів антрацикліну, які істотно не відрізняються з погляду на їхню протиракову активність у порівнянні з батьківськими аналогами 14-ОН. 76474 4 В галузі створення цілеспрямованих хіміотерапевтичних агентів головними задачами виступають: 1. Стабільність хімічного зв'язку між молекулою носія та власне хіміотерапевтичним агентом до повного досягнення поставленої мети. 2. Збереження біологічних характеристик молекули носія в кон'югаті, насамперед збереження властивості зв'язування. 3. Збереження фармакологічної активності хіміотерапевтичного агента в кон'югаті, насамперед збереження цитотоксичної активності. 4. Як наслідок кон'югації - створення аналогів з більш інтенсивною активністю та/або нижчою периферійною токсичністю у порівнянні з некон'югованими складовими. Кон'югація DOX шляхом окислення NаlO4 дауносамінової складової DOX з подальшим відновлювальним алкілюванням за участю первинного аміну молекули носія описано в патенті США 4.263.279, автори Sela, et al., зареєстрованому 21 квітня 1981 року. Для приєднання дауносамінового азоту до макромолекулярних носіїв з чутливим до рН зв'язком використовували як спейсер цисаконітову кислоту, як це описано в Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981 102, 1048-1054. Утворення складноефірних та C-N-зв'язків між 14-бромодаунорубіцином і білками чи полі-Lамінокислотами описано таким авторами, як Zunino et.al. (1981) в Tumori 67, 521-524 і (1984) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 20, 421-425. Морфоліно-DOX (високоактивний, модифікований дауносаміном аналог DOX) кон'югували з антитілом через здатний до гідролізу (лізосомотроп, чутливий до рН) гідразоновий зв'язок, включаючи С-13-оксо-функцію цитотоксичного агента; це описано в Bioconjugate Chemistry 1990 1(5), 325-330. Чутливість карбоксамідного зв'язку лейцинового залишку до ферментативного розщеплення успішно застосовували в кон'югатах DOX, які містять пептид "плеча спейсера" ("spacer arm" peptide)., переважно Ala-Leu-Ala-Leu, де карбокси-закінчення Leu ацилює даунсаміновий азот в DOX, у той час як зміно-закінчення Аlа приєднується до носія через спейсер дикарбонову кислоту; це описано в РrоС.Natl. Acad. Sci. USA 1982 79, 626-629. Дауносаміновий азот DOX ацилювали спейсером - глутаровою кислотою - і приєднували до аналогів LH-RH із значною втратою цитотоксичної активності, як це описано в РrоС.Nati. Acad. Sci. USA 1992 89, 972-976. Нижче за текстом наведено додаткові публікації, на які робилися посилання у зв'язку із застосуванням сполук цього винаходу для лікування різноманітних пухлинних утворень в організмі людини. 1. Serially et.al. (1996) в Лікування with GnRH Analogs: Controversies і Perspectives, eds. Filicori, M. & Flamigni, C. (Parthenon,Carnforth, U.K.), pp. 3344. 2. Nagy et.al.(1996) РrоС.Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93, 7269-7273. 5 3. Yano et.al. (1994) РrоС.Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91,7090-7094. 4. Rekasi et.al. (1993) Endocrinology 132(5) 1991-2000. 5. Srkalovic et.al. (1990) Cancer Res. 50, 18411846. 6. Emons et.al. (1993) Cancer Res. 53, 54395446. 7. Emons et.al. (1993) Journal of Clin. Endocrin. і Metabol. 77(6) 1458-) 8. Schally, A. V. (1988) Oncological applications соматостатину analogs. Cancer Res. 48, 6977-6985. 9. Schally et.al. (1994) International Journal of Pancreatology 16, 277-280. 10. Srkalovic et.al. (1990) Journal of Clinical Endocrinology і Metabolism 70(3), 661-669. 4 Pinski et.al. (1994) Int. J. Cancer 57, 574-580. 11. Radulovic et.al. (1992) Cancer Letters 62, 263-271. 12. Qin et.al. (1995) Int. J. Cancer 60, 694-700. 13. Radulovic et.al. (1992) P.S.E.B.M. 200, 394401. 14. Radulovic et.al. (1994) Acta Oncologica 33(6) 693-701. 15. Pinski et.al. (1993) Cancer Letters 71, 189196. 16. O'Byrne et.al. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(11) 1682-1687. 17. Pinski et.al. (1994) Br. J. of Cancer 70, 886892. 18. Pinski et. al. (1994) Cancer Res. 54, 58955901. 19. Pinski et.al. (1996) Int. J. Cancer 65, 870874. 20. Banks et.al. (1992) Anticancer Drugs. 3, 519523. 21. Reubi і Kvois (1992) Cancer Res. 52, 60746078. 22. Schally et.al. (1994) International Journal of Pancreatology 16, 277-280. 23. Hatmos et.al. (1995) Cancer Res. 55, 280287. 24. Hatmos et.al. (1994) Cancer Letters 85, 111118. 25. Qin et.al. (1994) J. Cancer Res. Ctin. Oncol. 120, 519-528 26. Qin et.al. (19940 Cancer Res. 54, 1035-1041. 27. Qin et.al. (1995) Int. J. Cancer 63, 257-262. 28. Reile et.al. (1994) The Prostate 25, 29-38. 29. Pinski et.al. (1994) Int. J. Cancer 57, 574580. 30. Radulovic et.al. (1992) P.S.E.B.M. 200, 394401. 31. Radulovic et.al. (1994) Acta Oncologica 33(6) 693-701. 32. Pinski et.al. (1993) Cancer Letters 71, 189196. 33. Pinski et.at. (1994) Br. J. of Cancer 70, 886892. 34. Pinski et. al. (1994) Cancer Res. 54, 58955901. Посилання на всі ці публікації включено у текст опису цього винаходу. Сполуки цього винаходу являють собою нові, цілеспрямовані цитотоксичні пептидні гормони, які 76474 6 включають антрацикліновий цитотоксичний агент, такий як DOX чи DM-DOX, кон'юговані з пептидним гормоном, таким як аналоги LH-RH, бомбесин та соматостатин. Ці кон'югати цитотоксичних пептидних гормонів розроблено для лікування пухлин, які несуть специфічні для кон'югата рецептори, наприклад, ракових пухлин грудної залози, яєчника, ендометрію, простати, підшлункової залози, товстої кишки, шлунку та легенів. Деякі з цих (некон'югованих) антрациклінових цитотоксичних агентів, запропоновані згідно з цим винаходом, є новими per se і мають високу активність; однак, рівень їхньої токсичності є надто високим для того, щоб їх можна було застосовувати в некон'югованій формі. Даунсамін-модифіковані аналоги DOX, представлені в цьому винаході, під час проведення досліджень розроблялися як нові, високоактивні аналоги DOX, які не мають перехресної резистентності і здатні утворювати разом з пептидними носіями ковалентні кон'югати. Утворення стабільних ковалентно зв'язаних кон'югатів з повним збереженням біологічної активності їхніх складових було досягнуто завдяки використанню спейсера - дикарбонової кислоти, зокрема глутарової кислоти. Одна карбоксильна група спейсера утворює складноефірний зв'язок з групою 14-ОН в DOX або DM-DOX, а інша карбоксильна група спейсера утворює карбоксамідний зв'язок з обгрунтовано вибраною вільною аміногрупою пептидного носія. Сполуки цього винаходу репрезентовані загальною формулою Q14-O-R-P (І) яка відрізняється тим, що Q має загальну формулу де Q OH O O O O CH3 O OH H3C HO CH2 O O R (ІІ) "Q14" означає складову Q з боковим ланцюгом в положенні 14, R-являє собою Н або -С(O)-(СН2)n-С(O)-, і n=07, R' являє собою NH2 або ароматичну, насичену або частково насичену 5- або 6-членну гетероциклічну сполуку з принаймні одним атомом азоту в кільці і - як варіант - з бутадієновою складовою, приєднаною до суміжних атомів вуглецю згаданого кільця з утворенням біциклічної системи, Р являє собою Н або пептидну складову, оптимально LHRH, аналог соматостатину чи бомбесину, не виключаючи, однак, інші фізіологічно активні пептиди. Зокрема, бажаними є ті аналоги LHRH, які мають спорідненість до рецепторів пухлинних клітин, особливо аналоги, в 7 яких складова D-Lys знаходиться в положенні 6, а також аналоги соматостатину та бомбесину зі скороченою формулою. Проте, якщо R' являє собою NH2, тоді R та Р є іншими, ніж Н. Якщо R та Р являють собою Н, тоді R' є іншим, ніж NH2. Під час проведення досліджень, пов'язаних з цим винаходом, було виявлено нову синтетичну реакцію. Було не лише виявлено те, що доксорубіцин та його похідні можуть зв'язуватись через дикарбоксильну складову в положенні 14 з утворенням нових фармакологічно ефективних кон'югатів, але й знайдено новий шлях утворення частково насичених гетероциклічних складових з суміжних та відокремлених первинних амінів, таких як ,- або ,-гідрокси. Особливої уваги в цьому винаході заслуговує утворення складових 2"-піролініл та 1",3"-тетрагідропіридиніл на дауносаміновому цукрі. Проте цю реакцію застосовують у більш широкому аспекті. 5-та 6членні частково насичені гетероциклічні складові можуть утворюватися у випадку, коли суміжні або відокремлені гідроксиаміни реагує з галогензаміщеним альдегідом, який має 2 або 3 складові між альдегідовим атомом вуглецю і атомом вуглецю з групою гало. Такі складові можуть бути лише метиленовими групами або складатися із різних атомів, наприклад, включати атом кисню. Реакція відбувається у три стадії. Значна надлишкова кількість галоальдегіду реагує з кислотною сіллю гідроксиаміну, оптимально в полярному інертному безводному органічному розчиннику. Таким чином утворюється п'ятичленне оксазолідинове кільце (або шестичленне тетрагідрооксазинове кільце), за допомогою конденсації альдегідної групи гідроксильною або аміно групами. Цей продукт обробляють органічною основою, оптимально третинним аміном, внаслідок чого елементи гідрогалогенової кислоти елімінуються з положення між галогеновою складовою першого галогенальдегіда і другою аміногрупою оксазолідину або 1,3тетрагідрооксазинового кільця, з утворенням злитої кільцевої структури шляхом приєднання 5або 6-членного кільця. Далі основу нейтралізують слабкою кислотою, оптимально органічною кислотою, наприклад кристалізованою оцтовою кислотою. Обробка водним розчином кислоти, оптимально органічної кислоти, відкриває оксазолідинову або 1,3-тетрагідрооксазину частину злитого кільця. Для фахівців є зрозумілим те, що - в залежності від вихідного альдегіду кінцеве азот-вміщуюче кільце може містити принаймні один з зазначених вище додаткових гетероатомів. Загальний шлях реакції можна проілюструвати таким чином: -C-Z-COH NH3+ X' H CH2 O C-(CH2-Y) (ІІІ) Безводний апротонний розчинник (значний надлишок) 76474 8 -C-Z-CO NH CH2-X' Основа (третинний безводний амін) CH-(CH2-Y) (ІV) -C-Z-C O N CH2 CH-(CH2-Y) Н2О + кислота (V) -C-Z-CHO N CH CH2 (CH-Y) (VI) де X' являє собою галоген, оптимально бромо або йодо, краще йодо, Y являє собою СН2, ОСН2, CH2-CH2, Z є нульовим або CH2 Якщо Z є нульовим, альдегідна складова на першій стадії утворює 5-членне оксазолідинове кільце. Якщо Z являє собою CH2, альдегідна складова утворює 6-членне 1,3тетрагідрооксазинове кільце. Оскільки такі типи утворення кілець є добре відомими, в комбінації з замиканням циклу, зумовленим галогеналкановим боковим ланцюгом у основному середовищі, наприклад, третинним аміном у безводному середовищі, реакція є новою та оригінальною. Фігура 1 являє собою графік зміни об'єму естроген-незалежних ракових пухлин молочної залози у мишей (МХТ) для різних рівнів дозування сполук цього винаходу і DOX. Фігура 2 являє собою графік зміни об'єму естроген-незалежних ракових пухлин молочної залози у мишей (МХТ) для різних рівнів дозування однієї зі сполук цього винаходу, сполуки відомого рівня техніки, DOX і в контрольній групі тварин. Фігура 3 являє собою графік ефективності деяких цитотоксичних аналогів LHRH на виживання мишей (МХТ) із естроген-незалежними раковими пухлинами молочної залози. Фігура 4 являє собою графік зміни об'єму пухлини у самців копенгагенських щурів з трансплантантами щурячої карциноми простати Dunning R-3327-H впродовж лікування тварин відомим раніше агоністом і однією зі сполук цього винаходу. Фігура 5 являє собою графік, який відображає вплив лікування однією зі сполук цього винаходу і відповідним цитотоксичним аналогом LH-RH на об'єм злоякісної пухлини простати Dunning R-3327H у щурів. Фігура 6 являє собою графік, який відображає вплив лікування однією зі сполук цього винаходу і відповідним цитотоксичним аналогом LH-RH на вагу тіла копенгагенських щурів з трансплантантами щурячої карциноми простати Dunning R-3327-Н 9 Фігура 7 являє собою графік, що відображає інгібування зростання пухлини, яке досягається за допомогою лікування однією зі сполук цього винаходу і DOX. Складова Q при заміщенні радикалу R' певними прийнятними групами має субскладові з додатковими позначеннями Q1-Q8, з яких субскладові Q2-Q8 є новими цитотоксичними складовими. R' має оптимальні значення, при яких одержують бажані складові Qх, позначені в дужках: NH2 (Q1), піролідин-1-іл (Q2), ізоіндолін-2-іл (Q3), 3-піролін-1-іл (Q4), 3-піролідон-1-іл (Q5), 2піролін-1-іл (Q6), 3-піперидон-1-іл (Q7), або 1,3тетрагідропіридин-1-іл (Q8). Отже, якщо R-P являє собою Н, і -R' являє собою -NH2, Q1 являє собою DOX, якщо R-Р являє собою Н і -R' являє собою піролідин-1-іл, Q2 являє собою 3'-деаміно-3'-(піролідин-1"-іл)-доксорубіцин (Q2), якщо R-P являє собою Н і -R' являє собою ізоіндолін-2-іл, Q3 являє собою 3'-деаміно-3'(ізоіндолін-2"-іл)-доксорубіцин (Q3); якщо R-P являє собою Н і -R' являє собою 3-піролін-1-іл, Q4 являє собою 3'-деаміно-3'-(3"-піролін-1"-іл)доксорубіцин (Q4); якщо R-P являє собою Н і -R' являє собою S-піролідон-1-іл, Q5 являє собою 3'деаміно-3'-(3"-піролідон-1"-іл)-доксорубіцин (Q5); якщо R-P являє собою Н і -R' являє собою 2руrr.оlіnе-1-іл, Q6 являє собою 3'-деаміно-3'-(2"піролін-1"-іл)-доксорубіцин (Q6), якщо R-P являє собою Н і -R' являє собою 3-піперидон-1-іл, Q7 являє собою 3'-деаміно-3'-(3"-піперидон-1"-іл)доксорубіцин (Q7), якщо R-P являє собою Н і -R' являє собою 1,3-тетрагідро-піридин-1-іл, Q8 являє собою 3'-деаміно-3'-(1",3"-тетрагідропіридин-1"-іл)доксорубіцин (Q8). Сполуки, які містять дауносаміновий азот в п'ятичленному кільці з алкілювальною функцією є в 10-50 разів більш активними in vitro, ніж їхні аналоги, які містять дауносаміновий азот в шестичленному кільці. (Такими парами є Q5 і Q7, а також Q8 і Q8). В оптимальних варіантах реалізації цього винаходу в речовині формули Q14-O-R-P, R і Р є іншими, ніж водень. Якщо Р є іншим, ніж водень, тобто якщо він являє собою Р1, Р2 і Р3, оптимально якщо Р1 являє собою носій агоніста LH-RH, носій антагоніста LH-RH або носій скороченого аналога LH-RH, P2 являє собою скорочений аналог соматостатину, і Р3 являє собою антагоніст бомбесину. Оптимально, Р1 являє собою Aaa-Bbb-CccSer-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd, де (Ххх) являє собою водень або замісник діаміно, наприклад, А2Вu або А2Рr, де якщо: Ааа являє собою Gip, тоді Bbb являє собою His, Ссc являє собою Тrр, і Ddd являє собою GlyNH2, Ааа являє собою Ac-D-Nal(2), Ac-D-Phe або AcD-Phe(4Cl), тоді Bbb являє собою D-Рh(4Сl) або D-Phe, Ссc являє собою D-Pal(3), і кожний з D-Trp та Ddd являє собою D-Ala-NH2; і якщо Ааа-Вbb-Ссс являє собою Ас, тоді Ddd являє собою -NН-СН2СН3; 76474 10 P2 is Aaa-Cys-Bbb-D-Trp-Lys-Ccc-Cys-Ddd-NH 2 де: якщо Ааа являє собою D-Phe, тоді Bbb являє собою Туr, Ссc являє собою Val і Ddd являє собою Thr або Тrр; і якщо Ааа являє собою D-Trp, тоді Bbb являє собою Phe, і Ссc і Ddd являють собою Thr; і P3 являє собою Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisLeu Bbb-NH; якщо: Ааа є нульовим, кожний з D-Tpi або DPhe і Bbb являють собою (СН2-NН)Leu, (CH2NH)Phe, (CH2-NH)Trp, (СН2-N)Тас або (CH2N)DMTac. В нових сполуках цього винаходу, які містять аналоги LH-RH, цитотоксичний радикал Q приєднується до бокового ланцюга D-Lys аналогів LH-RH або зв'язаної з ними групи Ххх через спейсер - дикарбонову кислоту, як це видно з Формули VII: Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)m(Q14-O-R)nLeu-Arg-Pro-Ddd (VII) де m дорівнює 1 або 0, і n дорівнює 1 або 2, за умови, що коли m дорівнює 1, тобто (Ххх) являє собою А2Вu або А2Рr, n дорівнює 1 або 2, when m дорівнює 0, тобто (Ххх) являє собою Н, n дорівнює 1. В нових сполуках цього винаходу, які містять аналоги соматостатину, цитотоксичний радикал Q приєднується до аміно-закінчення аналогів соматостатину через спейсер -дикарбонову кислоту, як це видно з Формули VIII: Q14-O-R-Aaa-Cys-Bbb-D-Trp-Lys-Ccc-Cys-Ddd-NH2 (VIII) В нових сполуках цього винаходу, які містять аналоги антагоністів бомбесину, цитотоксичний радикал Q приєднується до аміно-закінчення антагоністів бомбесину, як це видно з Формули IX: Q14-O-R-Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu BbbNH2 (IХ) До найбільш оптимальних варіантів реалізації цього винаходу належать пептидні кон'югати, які містять Q1 і Q6 як цитотоксичні радикали і глутарову кислоту - як дикарбоновокислотний спейсер, що утворює 14-O-естерний зв'язок з Q1 (доксорубіцином) або Q6 (2-піролінодоксорубіцином) і карбоксамідний зв'язок з пептидним носієм. До найбільш оптимальних варіантів реалізації цього винаходу належать цитотоксичні аналоги LH-RH таких формул: 1. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q114-O-glt)-LeuArg-Pro-Gly-NH2; 2. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q614-O-glt)-LeuArg-Pro-Gly-NH2; цитотоксичні аналоги соматостатину таких формул: Q114-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 ; Q614-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 ; 11 Q114-O-glt-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 ; Q614-О-glt-D-Тrp-Суs-Рhе-D-Тrp-Lys-Тhr-Суs-Тhr-NH2 ; Q114-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2 ; and Q614-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH 2 ; і цитотоксичні аналоги антагоністів бомбесину таких формул: 9. Q114-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH2NH)Leu-NH2; 10. Q614-O-gtt-Gln-Trp-Ata-Val-Gly-His-Leu (CH2NH)Leu-NH2; 11. Q114-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH2-NH)Leu-NH2; і 12. Q614-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisLeu(CH2-NH)Leu-NH2. В новому способі утворення частково насиченого гетероциклічного кільця з атомом азоту суміщеного або відокремленого - тобто ,або ,-гідрокси аміну першу стадії реакції проводять в безводному інертному органічному полярному негідроксильному (апротонному) розчиннику, оптимально - в диметилформаміді, із значним, оптимально - 30-разовим надлишком галогенальдегіду, з яких найефективнішими є 4йодобутиральдегід і 5-йодовалеральдегід. Проте винахід не обмежується цими сполуками, і замість йодо- використовують також бромо-. Цю реакцію першої стадії способу, які і наступні стадії, виконують при температурі оточуючого середовища. Стадію перетворення в основу виконують у надлишку, оптимально у 2-4разовому, органічної основи. Для цього прийнятними є такі третинні аміни, як тріалкіламіни. Утворене таким чином біциклічне кільце є відкритим для вивільнення суміщеної чи відокремленої гідроксильної групи шляхом обробки органічною кислотою в присутності води. Можуть використовувати розбавлений водний розчин трифторооцтової кислоти, оптимально в інертному органічному розчиннику, наприклад, в ацетонітрилі. Одержаний продукт очищають шляхом видалення летких компонентів при зменшеному тиску, надлишок галогене екстрагують гексаном, і залишок очищають на ВЕРХ. Скорочення Для опису пептидів та їхніх похідних згідно з цим винаходом застосовують традиційні скорочення для амінокислот, які є загальноприйнятими в галузі хімії пептидів і рекомендовані Комісією IUPAC-IUB з біохімічної номенклатури [European J. Biochem., 138, 937(1984]. Скорочення для окремих залишків амінокислот грунтуються на звичайних назвах амінокислот, наприклад, "Gip" означає піроглутамову кислоту, 76474 12 "His" означає гістидин, "Тrр" означає триптофан тощо. Скорочення відображають L-ізометричну форму амінокислот, за винятком спеціально оговорених моментів, наприклад, "Ser" означає Lсерин, a "D-Lys" - D-лізин Скорочення нетрадиційних амінокислот цього винаходу такі: "D-Nal(2)" означає D-3-(2нафтил)аланін, і "D-Pal(3)" означає D-3-(3піридил)аланін, "D-Phe(4Cl)" означає D-4хлорофенілаланін. Написання пептидних послідовностей відповідає вимогам згаданого договору; отже амінокислота з М-закінченням позначається в лівій частині напису, в той час як амінокислота з Сзакінченням позначається в правій частині напису, наприклад, Glp-His-Trp. Формула Leu (CH2-NH)Leu-NH2 описує відновлений пептидний зв'язок між лейцином та амідним залишком лейцину на С-закінченні пептидної послідовності. Використовуються також інші скорочення: АаВи: діамінобутирова кислота А2Рr: діамінопропіонова кислота BN: бомбесин реанент ВОР: бензотріазол-1ілокситрис(диметиламіно)фосфонію гексафторофосфат DIPEA: N,N-діізопропілетиламін DM-DOX: дауносамін-модифікований доксорубіцин DMF: N,N-диметилформамід DMTac: 5,5-диметил-тіазолідин-4-карбонова кислота DOX: доксорубіцин Fmoc: 9-флуоренілметилоксикарбоніл git: -С(O)-СН2-СН2-СН2-С(O)-, глутарил Glt2O: ангідрид глутарової кислоти HOBt: 1-гідроксибензотріазол HO-glt-OH: глутарова кислота HOSu: N-гідроксисукцинімід ВЕРХ: високоефективна рідинна хроматографія TFA: трифторооцтова кислота Тас: тіазолідин-4-карбонова кислота Трі: 2,3,4,9-тетрагідро-1Н-піридо[3,4-b]індол-3карбонова кислота Застосовували аналітичну систему ВЕРХ [Beckman analytical HPLC system], обладнану діодним матричним детектором (модель 168) і оснащену програмним забезпеченням для хроматографії System Gold [Beckman], за допомогою якого здійснюється управління хімічними реакціями і перевірка хімічної чистоти сполуки цього винаходу. Застосовували колонку Dynamax C-18 (250(4,6мм); розмір пор: 300А; розмір частинок: 12 нм. Система розчинників, яка складалася із двох компонентів: (і) 0,1% TFA у воді та (іі) 0,1% TFA в 70% водному ацетонітрилі, використовувалась в режимі лінійного градієнту, починаючи з 1% (іі) протягом 1 хвилини. Це було необхідно для контролю за хімічною реакцією. Систему використовували в ізократичному режимі для проведення контролю чистоти. Для виділення та очищення сполуки винаходу застосовували напівпрепаративну систему ВЕРХ 13 [модель 342, Beckman]. Використовували колонку типу Aquapore Octyl (250(10мм; розмір пор: 300 А; розмір часток: 15 мкм). Система розчинників була тією ж, що описана вище для аналітичної ВЕРХ. Аналіз Для ідентифікації структури похідних доксорубіцину використовували ЯМР-спектрометр ARX300 (Bruker, частота 300МГц 1Н, частота 75МГц 13С) і електродисперсний мас-спектрометр ЯМР Finnigan-MAT TSQ 7000. Синтез пептидних носіїв Пептиди цього винаходу зазвичай вводять у формі фармацевтичне прийнятних нетоксичних солей, наприклад, у формі солей, утворених приєднанням кислоти. Прикладами таких солей є гідрохлорид, гідробромід, сульфат, фосфат, фумарат, гліконат, танат, малеат, ацетат, трифтороацетат, цитрат, бензоат, сукцинат, альгінат, памоат, малат, аскорбат, тартрат тощо. Якщо активний компонент призначений для введення у формі таблетки, така таблетка має містити фармацевтично прийнятний розріджувач, який включає зв'язувальну речовину, наприклад, трагакант, зерновий крохмаль або желатин, диспергаційний агент, наприклад, альгінову кислоту, і змащувальну присадку, наприклад, стеарат магнію. При необхідності введення у формі рідини застосовують підсолоджування фармацевтичноприйнятних розріджувачів і додавання до них ароматизаторів та смакових добавок; при внутрішньовенному введенні ефективним є використання ізотонічного розчину, буферних розчинів фосфатів тощо. Фармацевтичні композиції зазвичай містять пептид, кон'югований зі стандартним фармацевтично-прийнятним носієм. Як правило, доза для введення становить від близько 1 до близько 100 мікрограмів пептиду на кілограм ваги тіла пацієнта для введення внутрішньовенне; дози для орального введення бувають значно більшими. Загалом, лікування пацієнтів цими пептидами зазвичай проводять у такий самий спосіб, як і лікування в клінічних умовах з використанням інших аналогів LHRH, соматостатину і аналогів доксорубіцину. Для одержання біологічного гормонального впливу шляхом приєднання до специфічних рецепторів ці пептиди вводять в організм ссавців внутрішньовенне, підшкірне, внутрішньом'язово чи внутрішньовагінально. У випадку застосування аналогів LHRH цей вплив передбачає зворотне пригнічення статевої функції, а у випадку застосування аналогів соматостатину - інгібування функції шлунково-кишкового тракту. Ефективні дози змінюються в залежності від форми введення та від конкретного виду хворого ссавця. Одним з прикладів типового дозування є фізіологічний розчин, що містить пептид: цей розчин вводять у дозах від близько 0,1 до 2,5мг/кг ваги тіла пацієнта. Оральним шляхом пептид вводять як у твердій, так і у 18 рідкій формі. Синтез пептидних носіїв цього винаходу виконують за допомогою способів, відомих фахівцям у галузі хімії пептидів. Підсумки щодо 76474 14 застосування прийнятних способів можна знайти ум. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlar, Heidelberr, 1984. Способи виконання твердофазного синтезу пептидів можна знайти у підручнику таких авторів, як J.M. Stewart і J.D. Younr, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2nd ed.),, а також в огляді, зробленому G. Barany et al., Int. J. Peptide and Protein Res. 30, 705-739 (1987). Синтез носіїв аналогів LH-RH, що їх використовують згідно з цим винаходом, детально наведено в прикладах патенту США 5.258.492, автори Sandor Bajusz і Andrew V. Schally, зареєстрованому 2 листопада 1993 року,, а також у статтях Bajusz et al., Proc. Nail. Acad. Sci. USA 85, 1637-1641 (1988) і 86, 6318-6322 (1989) і Janaky etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1023-1027 і 972-976 (1992). Синтез носіїв аналогів соматостатину, що їх використовують згідно з цим винаходом, детально наведено в прикладах патенту США 4.650.787, зареєстрованому 17 березня 1987 року, автори Andrew V. Schally і Ren Z. Саі. Опис цього синтезу можна також знайти в статтях Саі et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1896-1900 (1986) і Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2502-2506 (1987). Синтез носіїв антагоністів бомбесину, що їх використовують згідно з цим винаходом, детально наведено в статтях Coy et al., J. Biol. Chem. 263, 5056-5060 (1988) і 264, 14691-14697 (1989),, а також Саі et al., Peptides 13, 267-271 (1992) і Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12664-12668 (1994). Синтез похідних доксорубіцину, що їх використовують у цьому винаході, а також утворення їхніх кон'югатів з різними пептидними носіями детально описано в прикладах, що їх наведено нижче у цьому тексті; ці приклади мають ілюстративний характер, і застосування сполук винаходу ними не обмежується. ПРИКЛАД 1. Приготування та виділення N-Fmoc-DOX14-Oгеміглутарату. Сіль НСl сполуки DOX, 50мг (86мкмоль) розчиняли в 1мл DMF, і додавали 30мг (90мкмоль) Fmoc-OSu, після чого додавали 31мкл (180мкмоль) DIPEA. Після перемішування протягом трьох годин проходження реакції оцінювали за допомогою аналітичної ВЕРХ. Розчинник випаровували до сухості у високовакуумному випарнику (Speed Vac), і залишок кристалізували за допомогою перетирання з 0,1% TFA в Н20. Кристали відфільтровували і промивали один раз холодним ефіром, з метою видалення слідів надлишку FmocOSu. Після висушування в ексикаторі одержували m=62мг 98%-вого очищеного N-Fmoc-DOX. Вихід: 94%. Ця проміжна речовина реагувала протягом доби з 11,4мг (100мкмоль) Glt2O в 1мл безводного DMF у присутності 26,1мкл (150мкмоль) DIPEA. Розчинник випаровували в Speed Vac, і залишок масляної речовини робили твердим за допомогою перетирання з 0,1%-им водним розчином TFA (об./об.). Одержана у такий спосіб неочищена речовина містить 70%-ий N-Fmос-DОХ14-Oгеміглутарат, 20% N-Fmoc-DOX, що не 15 прореагував, і 10% інших домішків (за оцінкою аналітичної ВЕРХ). Цей неочищений продукт застосовують для приготування пептидних кон'югатів DOX без додаткового очищення. Далі цей неочищений матеріал розчиняли в 20мл 60%ого водного розчину ацетонітрилу з вмістом TFA 0,1% і піддавали напівпрепаративній ВЕРХ, як кінцевий продукт одержували 45,7мг 98%-вого очищеного N-Fmoc-DOX14-O-геміглутарату. (Вихід: 64%). ПРИКЛАД 2. Приготування та виділення 3'-деаміно-3'(піролідин-1"-іл)-доксорубіцинової солі TFA (Q2) і its 14-O-геміглутаратової (AN-193) солі TFA. Сіль НСl сполуки DOX, 50мг (86мкмоль), розчиняли в 1мл DMF, і додавали 171мкл (1,3ммоль) 15-разового надлишку 1,4дийодобутан, після чого додавали 45мкл (260мкмоль) 3-разового надлишку DIPEA. Реакційну суміш перемішували протягом доби при кімнатній температурі. Через 16 годин проходження реакції оцінювали за допомогою аналітичної ВЕРХ. Розчинник випаровували в Speed Vac, залишок масляної речовини розчиняли в 3мл 0,1%-ого TFA в Н2О, екстрагували ефіром для видалення надлишку 1,4-дийодобутану. Водний екстракт після цього очищали на ВЕРХ, і одержували 41,6мг 98%-ої очищеної похідної DOX. (Вихід 68%) 41,6мг (58ммоль) 3'-деаміно-3'-(піролідин-1"іл)-доксорубіцинової солі TFA (Q2), одержаної у такий спосіб, вводили в реакцію з 1,2 еквіваленту Glt2O в сухому DMF у такий самий спосіб, який описано в Прикладі 1. Вихід становив 35% (16.9мг), а чистота - 98%. GHBRKFL 3. Приготування та виділення 3'-деаміно-3'(ізоіндолін-2"-іл)доксорубіцинової солі TFA (Q3). Сіль НСl сполуки DOX, 50мг(86мкмоль), розчиняли в 1мл DMF, і додавали 226мг (1,3ммоль) 15-разового надлишку ,'-дихлороорто-ксилену, після чого додавали 45мкл (260мкмоль) 3-разового надлишку DIPEA і каталітичну кількість Nal. Через 16 годин розчинники видаляли за допомогою Speed Vac, залишок розчиняли в 3мл 0,1%-ого водного розчину TFA і екстрагували 3мл ефіру, з метою видалення надлишку сполуки галогену. Одержану у такий спосіб неочищену речовину очищали за допомогою ВЕРХ. Після очищення одержували 36мг, 98%-ого очищеного кінцевого продукту. (Вихід: 55%) ПРИКЛАД 4. Приготування та виділення 3'-деаміно-3'-(3"піролін-1"-іл)-доксорубіцинової солі TFA (Q4). Сіль НСl сполуки DOX, 50мг (86мкмоль), розчиняли в 1мл DMF, і додавали 136,8мкл (1,3ммоль) 15-разового надлишку цис-1,4дихлоро-2-бутену (Aldrich), після чого додавали 45мкл (260мкмоль) 3-разового надлишку DIPEA. Через 16 годин розчинники видаляли в Speed Vac, залишок розчиняли в 3мл 0,1%-ого водного розчину TFA і екстрагували 3мл гексану, з метою видалення надлишку сполуки галогену. Одержану у такий спосіб неочищену речовину обробляли за 76474 16 допомогою ВЕРХ. Після очищення одержували 22,6мг, 98%-ого очищеного кінцевого продукту. (Вихід: 37%) ПРИКЛАД 5. Приготування та виділення 1-хлоро-4-бромо-2бутанону (C4Н6СlВrО) і 1-хлоро-5-бромо-2пентанону (C5H8ClBrO). 3-Бромопропіонілхлорид, 100,8мкл (1ммоль) (Aldrich), змішували з діазометаном в ефірі. Через 1 год ефірний розчин елюювали і піддавали аналізу плям за допомогою ХШТ. Як стаціонарну фазу використовували прийняті в хроматографії тонких шарів алюмінієві пластини, покриті силікагелем 60 F254 (Merck Art No. 5554), а як рухливу фазу - СНСl3:МеОН 95:5 (об./об.). Для проведення аналізу плям реагент 2,4динітрофенілгідразин [Vogel: A textbook of Practical Organic Chemistry, page 1061, Third Edition, Longmans, New York.] після елюювання наносили на пластину ХШТ. Таким чином утворювалося жовта пляма діазометилкетону з Rf:0,3. Ефірний розчин після цього змішували з безводним розчином НСl в ефірі, перетворюючи діазометилкетон на бажаний кінцевий продукт, 1хлоро-4-бромо-2-бутанон. Цей продукт одержували у вигляді жовтої плями, яка є характерною для оксо-сполук з Rf:0,8, у тій самій системі розчинника і з тим самим реагентом для аналізу плям, що його описано вище. Після випаровування розчинника неочищений продукт обробляли на колонці (15см завдовжки, 2,5 в діаметрі), з силікагелевим наповненням (15г силікагелю, Merck, марка 9385, розмір чарунок сита 230-400, розмір пор 60А. Як рідину, тобто мобільну фазу, застосовували нерозбавлений СНСl3. Фракції з вмістом бажаного кінцевого продукту (визначеного за допомогою згаданого аналізу плям) змішували і випаровували до сухості. Одержували чисту масляну речовину (1,5г). Вихід: 80%. 1-хлоро-5-бромо-2-пентанон приготовляли з 4бромобутирилхлорид у такий самий спосіб, як описано для 1-хлоро-4-бромо-2-пентанону, за винятком того, що замість 3-бромопропіоніл хлорид використовували 4-бромобутирил хлорид. Одержували чисту масляну речовину(1,6г). Вихід: 80%. ПРИКЛАД 6. Приготування та виділення 3'-деаміно-3'-(3"піролідон-1"-iл)-доксорубіцинової солі TFA (Q5). Сіль НСl сполуки DOX, 50мг (86мкмоль), розчиняли в 1мл DMF, і додавали 241мг (1,3ммоль) 15-разового надлишку 1-хлоро-4бромо-2-бутанону, після чого додавали 45мкл (260мкмоль) 3-разового надлишку DIPEA. Через 16 годин розчинники видаляли в Speed Vac, залишок розчиняли в 3мл 0,1%-ого водного розчину TFA і екстрагували 3мл гексану, з метою видалення надлишку галогенової сполуки. Одержану у такий спосіб неочищену речовину очищали за допомогою ВЕРХ. Після очищення одержували 20,6мг, 98%-ого очищеного кінцевого продукту. (Вихід: 33%) ПРИКЛАД 7. 17 Приготування та виділення 3'-деаміно-3'-(3"піперидон-1"-іл)-доксорубіцинової солі TFA (07). Сіль НСl сполуки DOX, 50мг(86мкмоль), розчиняли в 1мл DMF, і додавали 260мг (1,3ммоль) 15-разового надлишку 1-хлоро-5бромо-2-пентанону, після чого додавали 45мкл (260мкмоль) 3-разового надлишку DIPEA. Через 16 годин розчинники видаляли в Speed Vac, залишок розчиняли в 3мл 0,1%-ого водного розчину TFA і екстрагували 3мл гексану, з метою видалення надлишку сполуки галогену. Одержану у такий спосіб неочищену речовину очищали за допомогою ВЕРХ. Після очищення одержували 18мг (95%) очищеного кінцевого продукту. (Вихід: 28%) ПРИКЛАД 8. Приготування та виділення 4йодобутиральдегід і 5-йодовалеральдегіду 2-(3Хлоропропіл)-1,3-діоксолан (4-хлоро-nбутиральдегід етиленацеталь), в кількості 1,3мл (10ммоль, Fluka) розчиняли в 200мл ацетону, який містив 30г (200ммоль, 20-разовий надлишок) йодиду натрію Nal. Розчин нагрівали зі зворотним охолодженням впродовж 24 годин, після чого випаровували до сухості. Для того, щоб екстрагувати органічний матеріал з неорганічного твердого залишку, використовували 100мл ефіру. Ефірний розчин після цього промивали 50мл H2O, 50мл 5% водного розчину Na2S2O2 і 3 рази - 50мл Н2О. Ефір видаляли in vacuo, і масляний залишок розчиняли в 3мл 50%-го водного розчину оцтової кислоти. Через 1 год до цього розчину додавали 100мл ефіру, і оцтову кислоту та етиленгліколь видаляли за допомогою промивання 50мл H2O (3 рази). Головний продукт елюювали при Rf:0,8 на колонці ХТШ в нерозбавленому СНСl3. Аналіз плям, який використовували для функції альдегіду, був такий самий, як описано для кетонів в Прикладі 5. Ефір після цього видаляли, і масляну речовину чорного кольору обробляли на колонці (15см завдовжки, 2,5см в діаметрі), наповненій силікагелем (15г), Merck, чистота 9385, розмір чарунок сита 230-400, розмір пор 60А. Як рідину, тобто рухливу фазу, використовували СНСl3. Фракції з вмістом бажаного кінцевого продукту (визначеного за допомогою згадано аналізу плям) перемішували і випаровували до сухості. Одержували 1,6г масляної речовини жовтого кольору. Вихід: 80%. 5-Йодовалеральдегід одержували у такий самий спосіб, починаючи з 2-(4-хлоробутил)-1,3діоксолану (5-хлоро-п-валеральдегід етиленацеталю) (Fluka). Одержували 1,65г масляної речовини жовтого кольору. Вихід: 80%. ПРИКЛАД 9. Приготування та виділення 3'-деаміно-3'-(2"піролін-1"-іл)-доксорубіцинової солі TFA (Q6). Сіль НСl сполуки DOX, 50мг (86мкмоль), розчиняли в 1мл DMF, і додавали 515мг (2,6ммоль) 30-разового надлишку 4йодобутиральдегіду, після чого додавали 45мкл (260мкмоль, 3-разового надлишку) DIPEA. Через 1 годину 100мкл льодяної оцтової кислоти додавали до реакційної суміші, яку після цього по краплинах додавали до 5мл 0,1%-ого TFA в 70%-ому 76474 18 водному розчину ацетонітрилу (розчинник іі системи ВЕРХ)). Цей розчин розводили 2мл 0,1%ого водного розчину TFA, після чого ацетонітрил видаляли в Speed Vac. Одержаний розчин екстрагували гексаном, з метою видалення надлишку сполуки галогену. Матеріал, одержаний у такий спосіб, очищали за допомогою ВЕРХ. Після очищення одержували 52мг (98%) очищеного кінцевого продукту. (Вихід: 85%) ПРИКЛАД 10. Приготування та виділення 3'-деаміно-3'-(1",3"тетрагідропіридин-1"-іл)-доксорубіцинової солі TFA (Q8). Сіль НСl сполуки DOX, 50мг (86мкмоль), розчиняли в 1мл DMF, і додавали 552мг (2,6ммоль) 30-разового надлишку 5йодовалеральдегіду, після чого додавали 45мкл (260мкмоль) 3-разового надлишку DIPEA. Через 1 годину 100мкл льодяної оцтової кислоти додавали до реакційної суміші, яку після цього по краплинах додавали до 5мл 0,1%-ого TFA в 70%-ому водному розчині ацетонітрилу (розчинник іі системи ВЕРХ). Цей розчин розбавляли 2мл 0,1%ого водного розчину TFA, після чого в Speed Vac видаляли ацетонітрил. Одержаний розчин екстрагували гексаном, з метою видалення надлишку галогенової сполуки. Матеріал, одержаний у такий спосіб, очищали за допомогою ВЕРХ. Після очищення одержували 46мг (98%) очищеного кінцевого продукту. (Вихід: 75%). ПРИКЛАД 11. Приготування та виділення цитотоксичного агоністичного аналога LH-RH, який містить DOX. ([D-Lys6(DOX14-O-glt)]LH-RH,Q114gL) [D-Lys6H-RH, 60мг (37,5мкмоль) і 52мг (64%вого очищеного, 37,5мкмоль) N-Fmос-DОХ14-Oгеміглутарату (див. Приклад 1), розчиняли в 1мл DMF, і додавали 22мг (50мкмоль) реагенту ВОР (бензилоктилфталату) (Aldrich), 13,5мг (100мкмоль) HOBt, а також 52мкл (300мкмоль) DIPEA. Після перемішування протягом 1 год при кімнатній температурі реакція завершується. Розчинники випаровували, залишок масляної речовини кристалізували 3мл етилацетату і після цього двічі промивали 3мл етилацетату. 90мг неочищеної твердої речовини після цього розчиняли в 3мл DMF, і додавали 300мкл піперидину. Через 5 хвилин реакційну суміш поміщали в льодяну ванну і підкислювали за допомогою додавання суміші 300мкл TFA, 700мкл піридину і 2мл DMF. Після випаровування розчинників масляний залишок робили твердим за допомогою етилацетату. Неочищений твердий продукт, одержаний у такий спосіб, розчиняли в 1мл 70%-ого водного розчину ацетонітрилу з вмістом TFA 0,1% (і), розбавляли 3мл 0,1%-ого водного розчину TFA (іі) і піддавали напівпрепаративній ВЕРХ. Одержували 40мг (14,8мкмоль) 98%-го очищеного кінцевого продукту. Вихід: 48%. ПРИКЛАД 12. Приготування цитотоксичного агоністичного аналога LH-RH, який містить 2-піроліно-DOX([DLys6(-піроліно-DOX14-O-glt)LH-RH,Q614gL) 19 Q114gL, 11,2мг (5мкмоль) (див. Приклад 11) розчиняли в 200мкл DMF, і додавали 30мг (150мкмоль, 30-разовий надлишок) 4йодобутиральдегіду (Приклад 8), після чого додавали 3мкл (17мкмоль) DIPEA. Через 1 годину реакція завершувалася (див. Приклад 9), і 10мкл льодяної оцтової кислоти додавали до реакційної суміші, яку після цього по краплинах додавали до 1мл 0,1%-ого TFA в 70%-ому водному розчині ацетонітрилу. Цей розчин після цього розбавляли 1мл 0,1%-ого водного розчину TFA, і ацетонітрил видаляли in vacuo. Залишковий водний розчин після цього екстрагували 1мл гексану і очищали за допомогою ВЕРХ. Одержували 7,6мг (99%) очищеного кінцевого продукту. (Вихід: 66%.) ПРИКЛАД 13. Приготування та виділення цитотоксичного аналогу соматостатину, який містить DOX (DOX14-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2, Q114gS) D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Fmoc)-Val-Cys-Thr-NH2, 20мг (14,5мкмоль) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, pp. 1986-1990), і 20мг (64%-вого очищеного, 14,5мкмоль) N-Fmoc-ООХ14-0-геміглутарату (Приклад 1) розчиняли в 200мкл DMF, і додавали 8,8мг (20мкмоль) реагенту ВОР (бензилоктилфталату) (Aldrich), 5,4мг (40мкмоль) HOBt, a також 17мкл (100мкмоль) DIPEA. Після перемішування протягом 1 год при кімнатній температурі одержували реакційну суміш. Після видалення розчинників in vacuo залишок стверджували етилацетатом. Далі твердий матеріал розчиняли в 1мл DMF, і додавали 100мкл піперидину. Через 7 хвилин реакційну суміш поміщали в льодяну ванну і підкислювали за допомогою додавання суміші 100мкл TFA, 300мкл піридину і 2мл DMF. Після випаровування розчинників масляний залишок стверджували етилацетатом. Неочищений твердий продукт, одержаний у такий спосіб, розчиняли в 1мл 70%ого водного розчину ацетонітрилу з вмістом TFA 0,1% (і), розбавляли 3мл 0,1%-ого водного розчину TFA (іі) і піддавали напівпрепаративній ВЕРХ. Одержували 9,7мг (5,1мкмоль) 95%-го очищеного кінцевого продукту. Вихід: 35%. ПРИКЛАД 14. Приготування цитотксичного аналогу соматостатину, який містить 2-піроліно-DOX (2-пipoлiнo-DOX14-Oglt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH 2, Q614gS) D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 (6,4мг, 5мкмоль) розчиняли в 100мкл DMF, і додавали 2пipoлiнo-DOX14-O-гeмiглyтapaт (4,1мг, 5мкмоль), після чого додавали реагент ВОР (бензилоктилфталат) (4,4мг, 10мкмоль), HOBt (100мкмоль) і DIPEA (50мкмоль). Після перемішування протягом 2 год при кімнатній температурі реакційну суміш підкислювали 20мкл АсОН, розбавляли 500мкл 70%-ого водного розчину ацетонітрилу з вмістом TFA 0,1%, далі розбавляли 700мкл 0,1%-ого водного розчину TFA і очищали за допомогою ВЕРХ. Одержували 3,9мг (Вихід: 40%) 99%-го очищеного кінцевого продукту. 76474 20 2-Пipoлiнo-DOX14-O-гeмiглyтapaт приготовляли за допомогою реакції DOX14-Oгеміглутарату з 4-йодобутиральдегідом, як це описано в ПРИКЛАДІ 9. DОХ14-О-геміглутарат приготовляли з NFmос-DОХ-O-геміглутарату шляхом розщеплення захисної групи Fmoc, як це описано в ПРИКЛАДІ 11. (Вихід: 40%) ПРИКЛАД 15. Приготування та виділення цитотоксичного антагоніста бомбесину, який містить DOX (DOX14-O-glt-Gln-Trp-Ata-Val-Gly-His-Leu (CH2NH)Leu-NH2, Q114gB) Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH2-NH)Leu-NH2, 20мг (15,8мкмоль) (Int. J. Peptide Protein Res. 38, 1991, pp. 593-600) і 22мг (64%-вого очищеного, 15,8мкмоль) N-Fmос-DОХ14-O-геміглутарату (Приклад 1) розчиняли в 200мкл DMF, і додавали 8,8мг (20мкмоль) реагенту ВОР (бензилоктилфталату) (Aldrich), 5,4мг (40мкмоль) HOBt, а також 17мкл (100мкмоль) DIPEA. Після перемішування протягом 1 год при кімнатній температурі реакція завершувалася. Після видалення розчинників in vacuo залишок кристалізували етилацетатом. Одержаний у такий спосіб твердий матеріал після цього розчиняли в 1мл DMF, і додавали 100мкл піперидину. Через 5хв реакційну суміш поміщали в льодяну ванну і підкислювали за допомогою додавання суміші 100мкл TFA, 300мкл піридину і 2мл DMF. Після випаровування розчинників масляний залишок стверджували етилацетатом. Неочищений твердий продукт, одержаний у такий спосіб, розчиняли в 1мл 70%-ого водного розчину ацетонітрилу з вмістом TFA 0,1% (і), розбавляли 3мл 0,1%-ого водного розчину TFA (іі) і піддавали напівпрепаративній ВЕРХ. Одержували 13,5мг (7,1мкмоль) 98%-ого очищеного кінцевого продукту. Вихід: 45%. ПРИКЛАД 16. Приготування та виділення цитотоксичного аналога антагоніста бомбесину, який містить 2піроліно-DОХ 2-пipoлiнo-DOX14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gty-HisLeu(CH2-NH)Leu-NH2, Q614gB, Q114gB 9,5мг (5мкмоль) (Приклад 15) розчиняли в 200мкл DMF, і додавали 30мг (150мкмоль, 30-разовий надлишок) 4-йодобутиральдегіду (Приклад 8), після чого додавали 3мкл (17мкмоль) DIPEA. Через 1 годину реакція завершувалася (Приклад 9), і 10мкл льодяної оцтової кислоти додавали до реакційної суміші, яку після цього по краплинах додавали до 1мл 0,1%-ого TFA в 70%-ому водному розчині ацетонітрилу. Цей розчин після цього розбавляли 1мл 0,1%-ого водного розчину TFA, і ацетонітрил видаляли in vacuo. Залишковий водний розчин після цього екстрагували 1мл гексану і обробляли за допомогою ВЕРХ. Одержували 6мг 98%-ого очищеного кінцевого продукту. (Вихід: 60%.) Визначення цитотоксичної активності in vitroю Від д-ра Гюнтера Бернхардта з Регенсбурзького Університету, Німеччина [Dr. Gunter Berndhardt, University of Regensburr, Germany], отримали клітинну лінію естрогеннезалежної карциноми молочної залози мишей 21 76474 (МХТ). Всі інші клітинні лінії, що їх використовували для визначення антипроліферативної активності сполук цього винаходу, отримали з Американської колекції типових культур (АТСС). Для оцінки активності аналогів застосовували колориметричний тест на цитотоксичність в планшетах для мікротитрації, який грунтується на кількісному визначенні біомаси за допомогою штучного забарвлювання клітин крезиловим фіолетовим, що дуже добре корелює з визначенням числа клітин. [Reile et al.; Anal. Biochem. 187, 262-267, 1990: Bernhardt G. et al, J. Cancer Res. Clin. Oncol. [1992], 118, 35-43; Spruss Th. et al, J. Cancer Res. Clin. Oncol 117, 435443, 1991; Gillies, R. J., Anal. Biochem. 159, 109113, 1986; Kuenr, W. et al.; Anal. Biochem., 182 1619, 1989.] Протокол тестування Через один-два дні після посіву клітин в 96лункових планшетах культуральне середовище замінюють свіжим середовищем, яке містить досліджувані сполуки, і свіжим середовищем лише для контрольних культур. Після різних періодів інкубації клітини фіксують діальдегідом глутарової кислоти і зберігають у фетальній сироватці ВРХ (FBS) при 4°С до самого кінця експерименту. Клітини забарвлюють крезиловим фіолетовим, 22 забарвлену речовину екстрагують 70%-им водним розчином ЕtOН. Оптичну густину вимірюють пристроєм ЕІА Reader (Bio-Tek Instruments) або Biornek 1000 (Beckman) при довжині хвилі 590 нм або 600 нм, відповідно. Кожна експериментальна точка спостереження представлена середнім значенням для восьми лунок з культурою. Значення T/Cs розраховують як Т/С=(Т-СО)/(ССО), де Т= оптична густина оброблених культур, С= оптична густина контрольних (необроблених) культур, С0= оптична густина культур на початку інкубації (t=0). ПРИКЛАД 17. Цитотоксична активність дауносамінмодифікованих похідних DOX in vitro. В Таблиці 17-1 показано вплив доксорубіцину та його дауносамін-модифікованих похідних на клітинну лінію карциноми молочної залози людини (MCF-7) in vitro. Цитотоксичні радикали, які мають даунсомін N, що включений в п'ятичленне кільце з реакційною функцією, є в 5-50 разів більш активними, ніж їхній гомологічний аналог із шестичленним кільцем, наприклад, 3-піролідоноDOX (Q5) і 3-піперидино-DOX (Q6), а також 2піроліно-DОХ (Q6) і 1,3-тетрагідро-піридино-DОХ (Q8). Таблиця 17-1 Вплив Доксорубіцину і його Дауносамін-модифікованих похідних на клітинну лінію карциноми молочної залози людини (MCF-7) in vitro Сполука Значення Т/С при конц. (М) Інкубація Час (год.) 3х10-10 Доксорубіцин (DOX) ПіролідиноDOX (Q2) ПіперидиноDOX(AN-183) ІзоіндоліноDOX (Q3) 3-ПіроліноDOX (Q4) З-ПіролідоноDOX (Q5) 3-ПіперидиноDOX (Q7) 2-ПіроліноDOX(Q6) 1,3-Тетрагідро піридино-DOX (Q8) 70 120 70 120 70 120 70 120 70 120 70 120 70 120 70 120 70 120 Клітини інкубували в середовищі ІМЕМ, яке містить 5% HI-DCC-FBS (нагрітий інактивований декстран, покритий обробленою активованим вугіллям фетальною сироваткою ВРХ), на 96лункових планшетах. Відношення числа клітин в оброблених та контрольних планшетах визначали способом забарвлювання крезиловим фіолетовим і виражали у вигляді значень Т/С, де Т/С=(Т-С0/СС0)  100 [Т= спектральна поглинальна здатність (оптична густина) оброблених культур, С= спектральна поглинальна здатність (оптична густина) контрольних культур, Со= спектральна поглинальна здатність (оптична густина) культур 10-9 3х10-9 114 109 50 26 96 99 -3 2 88 93 106 97 87 67 96 97 -18 -9 69 62 10-8 98 95 97 94 70 67 118 108 72 65 30 25 80 70 3х10-8 82 66 25 17 4 0 86 77 -3 -5 -28 -10 59 43 10-7 54 33 -26 -19 -11 -29 на початку інкубації (t=0). Спектральна поглинальна здатність (оптична густина), що вимірюється, є пропорційною числу клітин.] Більш низькі значення Т/С свідчать про зниження рівня виживання ракових клітин завдяки обробці. Коротко кажучи, "75" означає 75% виживання клітин у порівнянні зі 100% для контрольних чи з 25% інгібованих. ПРИКЛАД 18. Повне збереження in vitro цитотоксичної активності DOX в пептидному кон'югаті Q114gL агоніста LH-RH і суперактивного 2-піроліно-DОХ (Q6) в пептидному кон'югаті Q614gL агоніста LH-RH. 23 76474 Таблиця 18-1 показує вплив доксорубіцину та його дауносамін-модифікованої похідної, 2піролінодоксорубіцину (Q6) - у порівнянні до їхніх кон'югатів з агоністичними аналогами LH-RH [D 24 Lys6]LH-RH (Q114gL і Q614gL, відповідно) - на ріст клітинної лінії карциноми молочної залози людини (MCF-7) і естроген-незалежної клітинної лінії карциноми молочної залози мишей (МХТ) in vitro. Таблиця 18-1 Сполука Доксорубіцин* Q114gL Q6 Q614gL Сполука Час інкубації (год) 70 120 70 120 70 120 70 120 Час інкубації (год) Значення Т/С для клітинної лінії MCF-7 при концентр.(М) 3х10-11 10-10 310-10 10-9 З10-9 10-8 З10-8 10-7 98 95 8266 54 33 111 89. 63 78 55 28 50 -3 -18 26 -2 -9 74 28 -24 60 16 -14 Значення Т/С для клітинної лінії МХТ при конц.(М) 10-8 З10-11 10-10 310-10 10-9 З10-9 З10-8 10-7 26 85 90 59 50 74 60 43 Q114gL 26 87 91 73 50 71 59 50 Q6 28 90 78 56 69 52 6 -13 Q614gL 28 91 78 64 69 59 15 -11 Клітини MCF-7 інкубували в середовищі ІМЕМ, яке містило 5% HI-DCC-FBS на 96-лункових планшетах. Клітини МХТ інкубували в середовищі RРМІ 1640, яке містило 0,6 г/л L-глутаміну і 10%-ий FBS *Визначено аналогічно тому, як в Таблиці 17-1. Доксорубіцин ПРИКЛАД 19. Таблиця 19-1 показує, що цитотоксична активність in vitro аналогів соматостатину, який містить сполуку DOX цього винаходу, повністю зберігається. Таблиця 19-1 Вплив цитотоксичних аналогів соматостатину, який містив доксорубіцин, на ріст МІІА РаСа-2 лінії ракових клітин підшлункової залози людини in vitro Значення Т/С при конц. (М) 10-8 10-7 10-6 DOX14-O-glt-S-98* 28 93 95 32 (Q114gS98) 76 103 11 -3 Аналог носія S-98* 28 96 76 98 DOX14-O-glt-S28 93 82 35 121**(Q114gS121) 76 97 10 -4 Аналог носія S-121** 28 76 76 96 Доксорубіцин 28 95 64 -28 76 71 10 -7 Клітини інкубували в середовищі RPMI 1640, яке містило 10% фетальної сироватки ВРХ, на 96-лункових планшетах. Сполука *D-Tyr-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 Час інкубації (год.) ; **D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 ПРИКЛАД 20. . Вплив цитотоксичних аналогів антагоністів бомбесину, які містили доксорубіцин, на ріст 25 76474 CFPAC-1 ракових клітин підшлункової залози людини in vitro Таблиця 20-1 показує, що цититиксична активність in vitro антагоністичних 26 аналогів бомбесину, який містить DOX цього винаходу, повністю зберігається. Таблиця 20-1 Значення Т/С при концентрації (М) 3х10-8 10-7 Зх 10-7 10-6 14 DOX -O-gIt 66 95 81 44 9 В-94 95 95 57 28 4 (Q114qb) 137 94 28 19 0 В-94* 66 99 106 104 100 95 97 99 99 96 137 98 98 100 96 14 DOX -O-glt-B-50 66 102 78 39 5 95 97 55 24 -1 137 92 28 19 -2 В-50** 66 100 93 99 93 95 98 100 102 98 137 97 98 99 98 DOX 66 88 52 15 -7 95 73 32 10 -6 137 49 20 7 -4 Клітини інкубували в середовищі IMDM, яке містило 10%фетальної сироватки ВРХ, на 24-лункових планшетах. *Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-N)-Leu-NH2 **D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-N)-Tac-NH2 Сполука Час інкубації (год.) Властивості зв'язування похідних гормонів, що збереглися. ПРИКЛАД 21. Гормональна активність і здатність приєднуватись до рецептора цитотоксичного агоністичного аналога LH-RH Q114gL ([D-Lys6LHRH, що містить DOX) і Q614gL ([D-Lys6]LH-RH, що містить 2-піроліно-DОХ) у порівнянні з пептидомносієм, [D-Lys6]LH-RH Таблиця 21-1 Сполука Гормональна активність* (LHвідповідь відн. LH-RH=1) Значення ІС50** для рецепторів гіпофізу щурів (нМ) 2,29 5,59 Значення ІС50** для рецепторів рака грудної залози (нМ) 7,24 6,70 Q114gL 15 Q614gL 10 [D-Lys6H8 2,26 1,80 RH В Таблиці 21-1: *Відповіді LH на аналоги визначали в гиперфузній системі суспендованих клітин щуриного мозочка, як це описано в S. Vigh і А. V. Schally, Peptides 5, 241-247 (1984). **Зв'язувальна спорідненість аналогів до рецепторів LH-RH щуриного мозочка і рецепторів молочної залози людини визначали за допомогою альтернативних експериментів щодо зв'язування з використанням [1251]-міченого [D-Trp6] LH-RH як радіоактивного ліганду, як це описано в В. Szoke et al., Peptides, 15(2), 359-366 (1994). Зв'язувальну спорідненість виражали у формі значень ІС50, тобто концентрації неміченого аналога, потрібної для інгібування 50% специфічного зв'язування радіоактивного ліганду. ПРИКЛАД 22. Аналоги соматостатину інгібують виділення гормону росту (GH)) зі спеціально підготовленого щурячого мозочка, як це описано в Carlson et al., Thyrotropin-releasing hormone stimulation i somatostatin inhibition of growth hormone secretion from perfused rat adenohypophyses Endocrinology, 94, 1709-(1974). Відповідно, цей спосіб використовували для порівняння цитотоксичних аналогів соматостатину цього винаходу з батьківськими молекулами-носіями стосовно їхньої гормональної активності. Інгібування рилізинг-гормону гормону росту людини (hGН-РН(1-29)NН2)-індуковане вивільнення гормону росту з гиперфузних клітин щурячого мозочка за соматостатину S-98-1 допомогою D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 аналогів ; та S-121 20 D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 ; у порівнянні з їхньою цитотоксичною похідною, Q114gS98-1(DOX14-O-glt-S-98-1) і Q114gS121(DOX14O-glt-S-121), відповідно. У суперфузну систему клітин щурячого мозочка аналоги соматостатину вводили протягом 3хв при дозі 1 нМ одночасно з 1 нМ hGH-RH(129)NH2. Введення аналогів соматостатину 27 продовжували ще 6хв. GH-відповіді на 3-хвилинне введення 1 нМ hGH-RH(1-29)NH2 визначали під час перфузії аналогів соматостатину (0 хв) і через 76474 28 30, 60 і 90хв після припинення введення. Дані наведено у Таблиці 22-1. Таблиця 22-1 Вивільнення GH**, індуковане 3-хвилинним введенням 1 нМ hGH-RH(1-29)NH2 у різні моменти часу після введення аналогів соматостатину 0 хв 30 хв 60 хв 90 хв S-98-1 2,9 94,7 117,6 Q114gS98 0 90 89,7 S-121 7,8 62,2 57,3 77,9 Q114gS121 8,8 58,5 54,3 67,7 **Відображено у відсотках вивільнення GH, індукованого 3-хвилинним введенням 1 нМ hGH-RH (1-29)NH2 перед введенням аналогів соматостатину. Аналоги соматостатину ПРИКЛАД 23. Вивчення зв'язування рецепторів з цитотоксичними антагоністами бомбесину Радіоактивне йодування [Tyr4]BN (Sigma) з використанням комплекту пристрою Вiо-Rad Enzymobead Radio lodination і виділення монойодованого [125I-Tyr4]BN виконували у спосіб, описаний раніше (1). Зв'язування міченим [Tyr4]BN і заміщення цитотоксичним аналогом антагоніста бомбесину, Q614gB проводили за допомогою виповненого моношару клітин Swiss 3T3 (отриманих з Американської колекції типових культур) в 24-лункових планшетах в модифікації (2) способу, який викладено у Kris et al (3). Через три-п'ять днів після посіву моношарові клітини двічі промивали збалансованим сольовим розчином Хенкса (Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)) та інкубували протягом 30хв при 37°С з використанням 50 пМ [125I-Tyr4]BN у відсутності або у присутності певних концентрацій немічених конкурентів (Q614gB або BN) в сумарному об'ємі 0,5мл буфера зв'язування (DMEM з 50мм HEPES, 0,1% бичого сироваточного альбуміну (BSA), 5мм MgCl2 і 100 мкг/мл бакітрацину, рН:7,4). Неспецифічне зв'язування визначали у присутності 1 мкМ неміченого ліганда. Після трьох промивань льодяним збалансованим сольовим розчином Хенкса (HBSS), який містив 0,1% BSA (рН; 7,4), клітини відокремлювали за допомогою 0,05%-го розчину Trypsin/0,53мм EDTA [етилендіамінтетраоцтова кислота] і переносили в пробірки. Радіоактивність вимірювали за допомогою гамма-лічильника [Micromedic Systems Inc, Huntsville, AL]. Дані про характер зв'язування оцінювали за допомогою програм радіоактивного аналізу зв'язування ліганду (McPherson, (4)). Значення Кj, що їх представлено в Таблиці 23-1, розраховували за формулою Ченга і Прусоффа (Cheng і Prusoff) (5). 1. Halmos.etal., Cancer Letters,85,111-118 (1994) 2. Cai, et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA 91:12664 -12668, (1994.) 3. Kris, et al., J. Biol. Chem, 262: 11215-11220, (1987.) 4. McPherson, G.A., J.Pharmaco Methods, 14: 213-228, (1985) 5. Cheng i Prusoff, Biochem.Pharmacol. 22:30993108, (1973) Таблиця 23-1 Характеристика специфічного зв'язку цитотоксичного антагоніста бомбесину Q614gB(2-пipoлiнo-DOX14-Ogit-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(-(CH2-N)Leu-NH2 з рецепторами бомбесину в клітинній лінії Swiss 3Т3 у порівнянні з бомбесином Сполука Бомбесин Q114gB Порівняння ефективності і токсичності кон'югатів гормонів і цитотоксичного радикалу. ПРИКЛАД 24. Лікування 2-піроліно-DОХ (Q6), цитотоксичним агоністичним аналогом LH-RH Q314gL ([D-Lys6HRH, зв'язаним з Q614-О-геміглутарат), і (DOX) естроген-незалежних ракових пухлин молочної залози мишей (МХТ) (KS-49) Для порівняння активності інгібування пухлин цитотоксичною похідною доксорубіцину Q6 та її цілеспрямованого цитотоксичного пептидного кон'югата, Q614, а також добре відомого К, (нМ) 1,2 1,0 антинеопластичного агента, DOX, і для визначення оптимального шляху введення та нетоксичного дозування, МХТ, що має рецептор LH-RH (3.2) з ділянок пухлин (1мм3), вводили підшкірне мишам-самицям B6D2F1. Через день після трансплантації мишей за способом випадкового вибору розділяли на групи по п'ять тварин у кожній, після чого розпочинали лікування. Сполуки розчиняли в 0,1%-ій трифторооцтовій кислоті (рН2) та вводили внутрішньочеревним шляхом. Групи, схеми лікування та дозування, а також середню тривалість виживання наведено в 29 76474 Таблиці 24-1. Результати підсумовано в Таблиці 24-2 та на Фігурі 1. У Таблиці 24-2 наведено вплив введення Q6 і цитотоксичного аналогу LH-RH Q614gL на розміри пухлин та виживання мишей з естрогеннезалежними раковими пухлинами молочної залози. Як видно з Таблиці 24-2, Q6 у кількості 1,25 нмол вводили на 1, 2, 7, 8, 14 та 15 день; в групі 2 відзначено було сильно підвищену токсичність із середньою тривалістю виживання 17, 4 днів, що значно менше, ніж тривалість виживання у контрольній групі тварин, яким не вводили препарат. Для порівняння, введення таких самих доз Q614gL (група 6) призвело до збільшення середньої тривалості виживання 30,8 днів, що є значно більшим строком, ніж у контрольній групі. Більш висока ефективність Q614gL у порівнянні з Q6 також підтверджується за підсумками 30 порівняння середнього остаточного розміру пухлин в групі 2 (1065мм3 на 16 день) і в групі 6 (863мм3 на 31 день). Аналогічні висновки можна зробити при 14 порівнянні Q6 і Q6 gL для іншого режиму лікування, коли 0,5ммоль препаратів вводили по п'ять днів на тиждень впродовж трьох послідовних тижнів. Доксорубіцин у токсичній дозі (сумарна кількість 1560 нмоль, середня тривалість виживання 20 діб) не може знищити та викоренити пухлину, у той час як лікування за допомогою Q614gL у нетоксичній дозі (сумарна кількість 7 нмоль, середня тривалість виживання > 31 діб) призводить до такого показника виживання, як 2 тварини з 5, без подальшого прогресування пухлини. Таблиця 24-1 № Доза/ ін'єк. Доза/ ін'єк. Ін'єк./ Дні між Тижні Сум. Введ. групи (нмол) (мкг) тижд. введ. введ. кільк. 1 Контр 2 1,25 0,92 2 5 7,5 3 0,5 0,37 Q6 4 0,25 * 0,19 5 2 9,5 5 0,2 0,15 21 6 1,25 2,9 2 5 7,5 7 0,5 1,16 14 Q6 gL 3 8 0,25 * 058 5 2 9,5 9 0,2 0,46 21 10 35 8,12 7 11 4 9,28 2 8 1 6 12 5 11,6 10 13 DOX 520 340 3 1560 З дня 9 по день 12 дозу збільшували до 2,5 нмол. 3 дня 9 по день 12 дозу збільшували до 5,0 нмол. *Виживання Серед. вижив.* доба 22 17,5 19,6 14,6 13,0 30,8 26,8 18,4 13,6 >31 13,4 20,0 Таблиця 24-2 Шлях введення № Група Доза/ ін'єк. (нмоль) Немає ін'єк на тижд Пауза між ін'єк. (діб) Триваллі кув. (тижд.) Сумар. кільк ін'єк (нмоль) Остат. розм. пухл. (мм3) День вимір. Серед. трив. вижив. (діб) Кільк. мишей, що вижили без ознак пухл., з 5-ти твар. на групу на день 18 на день 31 1 Контр 7322 21 22,0±1,6 0 2 Q6 1,25 2 5 3 7,5 1065 16 17,4±0,2 0 6 Q614gL 1,25 2 5 3 7,5 863 31 30,8±0,4** 2 3 Q6 0,5 5 2 3 7,5 2531 18 19,6±0,7 0 14 7 Q6 gL 0,5 5 2 3 7,5 3978 31 26,8±2,6** 1 14 10 Q6 gL 3,5 1 6 2 7 669 31 >31** 4 14 12 Q6 gL 5,0 1 6 2 10 0 10 13,4 0 13 DOX 520 1 6 3 1560 1560 28 20 1 ** Тривалість виживання є значно довшою (р