Модифікований вірус грипу, призначений для моніторингу і підвищення ефективності вакцини

1. Молекула гемаглютиніну (НА) вірусу грипу, що містить аспарагін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 223 в НА Н5, де молекула НА не походить з ізоляту людського Н5 А/НК/213/03 і де включення аспарагіну в положення 223 приводить до підвищеної реактивності відносно антисироватки, отриманої з 2 (19) 1 3 94717 4 тному положенню 223, та де амінокислотна заміна приводить до підвищеної імуногенності вакцинного вірусу. 11. Протигрипозна вакцина, що містить молекулу гемаглютиніну вірусу грипу за п. 1. Перехресне посилання на споріднені заявки Дійсна заявка претендує на пріоритет попередньої заявки на патент США No. 60/705808, зареєстрованої 4 серпня 2005 р., яка цілковито включена в дійсний опис як посилання. Заява, що стосується дослідження або розробки, що субсидувалися за рахунок федеральних коштів Дослідження, в результаті якого було створено дійсний винахід, проводилося в рамках гранту AI95357 Національного інституту алергії та інфекційних захворювань (National Institute of Allergy and Infectious Disease) і за підтримки Центру ракових досліджень (Cancer Center Support (CORE)) в рамках гранту CA21765 Національних інститутів охорони здоров’я (National Institutes of Health). Відповідно до цього уряд США володіє певними правами на винахід. Посилання на додаток, записаний на компактному диску Не застосовне. Галузь техніки, до якої відноситься винахід В цілому дійсний винахід відноситься до підвищення антигенності і/або імуногенності певних підтипів групи вірусів грипу. Передумови створення винаходу Віруси грипу Віруси грипу, серед яких, перш за все, слід відзначити конкретні штами вірусів A і B, є серйозною причиною захворюваності і смертності у всьому світі в результаті щорічних спалахів захворювання. Періодично, але з нерегулярними інтервалами виникають пандемії, що приводять до особливо високих рівнів захворюваності і смертності. Історично пандемії з’явилися результатом виникнення нових підтипів вірусу грипу A, які утворилися шляхом перегрупування сегментованого геному (антигенна мінливість), тоді як щорічні епідемії, як правило, є результатом еволюції поверхневих антигенів вірусу грипу A і B (антигенний дрейф). Віруси грипу людини часто походять від пташиних штамів вірусу грипу, так що в основі зараження грипом лежить зооноз. Очевидно також, що свині можуть служити проміжним господарем ("змішувані судини") при утворенні нових штамів, що походять від птахів, які є патогенними для людини [Scholtissek та ін., Virology, 147, 1985, C.287]. Спалах захворювання в Гонконзі в 1997р., викликаного штамом H5N1 вірусу грипу A, показав, що віруси грипу A, які володіють високою патогенністю, можуть передаватися також безпосередньо від різних видів птахів людині [Claas та ін., Lancet, 351, 1998, C.472; Suarez та ін., J.Virol., 72, 1998, C.6678; Subbarao та ін., Science, 279, 1998, C.393; Shortridge, Vaccine, 17 (прил. 1), 1999, C.26-29]. У 2003 р. штами вірусів H5N1 в Південно-східній Азії були різними генотипами, що співіснували, але в 2004 р. домінантним став один генотип, відомий як "Z-генотип" [Li та ін., Nature, 430, 2004, C.209). Сучасні дані свідчать про те, що випадки смерті людей були обумовлені безпосередньою передачею цього генотипу від птахів людині і що цей генотип заражає також кішок шляхом безпосередньої передачі від кішки до кішки [Kuiken та ін., Science 2004, 306:241]. Це та інші докази зміни діапазону господарів і широке розповсюдження цього вірусу привело до розуміння того, що H5N1-віруси можуть набувати властивостей, що дозволяють здійснювати перенесення від людини до людини. Люди не можуть набувати імунітету до таких H5N1вірусів, що може викликати катастрофічну пандемію грипу [Fouchier та ін., Nature, 435, 2005, С.419]. Здатність вірусів грипу A утворювати нові патогенні штами з величезної кількості штамів, циркулюючих в тваринах-носіях збудників вірусної інфекції, означає, що боротьба з цим захворюванням вимагає здійснення моніторингу цих вірусів і розробки покращених противірусних терапій і вакцин. Швидкість, з якою розвиваються нові штами вірусу, вимагає особливої уваги при здійсненні такого моніторингу, включаючи застосування вдосконалених методів оцінки ефективності вакцин проти нових штамів. Віруси грипу A, B і C сімейства Orthomyxoviridae всі мають сегментований геном з негативним ланцюжком РНК, який реплікується в ядрі інфікованої клітини, має сумарну кодуючу ємність, що становить приблизно 13 т.п.н., і містить генетичну інформацію для десяти вірусних білків. Конкретно віруси грипу мають вісім генних сегментів антисмислової РНК (nsРНК), які кодують щонайменше 10 поліпептидів, включаючи білки РНК-полімерази (PB2, PB1 і PA), мішенню яких є РНК, нуклеопротеїн (NP), нейрамінідазу (NA), гемаглютинін (HA, який після ферментативного розщеплення утворює асоціацію субодиниць HA1 і HA2), матриксні білки (M1 і M2) і неструктурні білки (NS1 і NS2) [Krug та ін., В: The Influenza Viruses, під ред. R.M. Krug, вид-во Plenum Press, New York, 1989, C.89-152]. Розроблені останнім часом зворотні генетичні системи повинні дати можливість здійснювати маніпуляції з геномом вірусу грипу [Palese та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1996, С.11354; Neumann і Kawaoka, Adv. Influenza Res., 53, 1999, С.265; Neumann та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1999, С.9345; Fodor та ін., J. Virol., 73, 1999, С.9679]. Було продемонстровано, наприклад, що експресія восьми nsРНК, здійснювана плазмідою під контролем промотору pol I, і коекспресія білків полімеразного комплексу приводить до утворення інфекційного вірусу грипу A [Hoffmann та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2000, C.6108]. Вірусна частинка вірусу грипу має розмір при 5 близно 125 нм і складається з ядра, що включає антисмислову вірусну РНК, асоційовану з ядерним білком, яке оточене вірусною оболонкою, що має двошарову ліпідну структуру. Внутрішній шар вірусної оболонки складається переважно з матриксних білків, а зовнішній шар складається в основному з ліпідного матеріалу, що походить з господаря. Так звані "поверхневі білки", нейрамінідаза (NA) і гемаглютинін (HA) виступають у вигляді піків на поверхні тіла вірусу. Інфективність нових вірусів грипу залежить від розщеплення HA специфічними протеазами господаря, тоді як NA бере участь у відділенні віріонів-нащадків від клітинної поверхні і попереджає аглютинацію нового вірусу, що утворився. Білки HA і NA, занурені у вірусну оболонку, є основні антигенні детермінанти вірусу грипу [Air та ін., Structure, Function, and Genetics, 6, 1989, C.341-356; Wharton та ін. в: The Influenza Viruses, під ред. R.M. Krug, вид-во Plenum Press, New York, 1989, C.153-174]. Завдяки перегрупуванню сегментованого геному вірусу грипу постійно утворюються нові варіанти HA і NA, відносно яких у щойно зараженого організму не виробляється анамнестична реакція (вторинна імунна відповідь). Глікопротеїном HA є основний антиген для нейтралізуючих антитіл і він бере участь в зв’язуванні вірусних частинок з рецепторами на клітинахгосподарях. Послідовності молекул HA з різних штамів вірусу володіють значною подібністю, як на рівні нуклеїнових кислот, так і на рівні амінокислот. Ступінь подібності варіюється, коли порівнюють штами різних підтипів, при цьому для деяких штамів характерні вищі ступені подібності, ніж для інших [Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, C.7643]. Ступені подібності амінокислот варіюються між вірусними штамами одного підтипу і вірусними штамами інших підтипів [Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, C.7643]. Ця варіація достатня для встановлення окремих підтипів і напряму еволюційного диференціювання різних штамів, проте можна досить легко здійснювати порівняльний аналіз первинної структури ДНК і амінокислотних послідовностей різних штамів за допомогою звичайних біоінформаційних методів [Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, C.7643; Suzuki і Nei, Mol. Biol. Evol., 19, 2002, C.501]. Протигрипозні вакцини Протигрипозні вакцини, дозволені в даний час органами охорони здоров’я для застосування в Сполучених Штатах і Європі, є інактивованими протигрипозними вакцинами, а також живою ослабленою вакциною FLUMIST, вживаною в Сполучених Штатах. Віруси, що є представниками важливих в епідеміологічному відношенні штамів вірусу грипу A і вірусу грипу B, вирощують в запліднених курячих яйцеклітинах, і потім вірусні частинки очищають та інактивують за допомогою хімічних засобів для одержання біомаси вакцини. Щороку ВООЗ відбирає підтипи, які за прогнозом повинні зустрічатися з найбільшою вірогідністю, для створення вакцин. Хоча протигрипозні вакцини застосовують для вакцинації людини з початку 1940-х років і для 94717 6 вакцинації свиней з кінця 1960-х років, існування численних тварин-носіїв збудників вірусної інфекції у поєднанні із загрозою виникнення нового вірусу грипу, здатного викликати пандемію, примушує проводити дослідження з метою розробки нових терапевтичних методів боротьби з вірусом. За останні декілька років в області боротьби з грипом були досягнуті ряд важливих успіхів [див. огляд Cox і Subbarao, Lancet, 354, 1999, С.1277-1282]. Наприклад, було експериментально встановлено, що інтраназальне введення живої ослабленої тривалентної протигрипозної вакцини може володіти високою ефективністю відносно захисту дітей молодшого віку від штаму вірусу грипу AH3N2 і вірусу грипу B. Інші підходи до підвищення ефективності існуючих (убитих) вакцин на основі вірусу грипу включають створення адаптованих для захисту від застуди і сконструйованих генетичним шляхом вірусів грипу, які містять послаблюючі мутації [див. огляд у Palese та ін., J. Infect. Dis., 176 прил. 1, 1997. С.45-49]. Існує надія, що такі змінені генетичним шляхом віруси, в які шляхом перегрупування були інтродуковані гени HA і NA з циркулюючих штамів, можна застосовувати як безпечні живі вакцини на основі вірусу грипу для індукції пролонгованої захисної імунної відповіді у людини. Хоча, мабуть, адаптовані для захисту від застуди вакцини є ефективними для дітей і підлітків, їх можна послаблювати достатньою мірою для стимулювання ідеальної імунної відповіді у літніх людей, які є основною групою з числа 20000-40000 індивідуумів, вмираючих щороку в США в результаті зараження грипом. Легко доступні вакцини повинні стати найбільш ефективним інструментом для боротьби з несподівано виникаючою пандемією грипу. Після спалаху H5N1 в Гонконзі в 1997р. на людях були випробувані вакцини, що отримуються за допомогою двох різних підходів. Звичайна вакцина на основі субодиниці (підтипу) H5, отриманої з A/duck/Singapore/3/97, володіла слабкою імуногенністю для людини навіть проти близькоспоріднених за антигенними властивостями штамів і навіть після декількох вакцинацій [Nicholson та ін., Lancet, 357, 2001, С.1937; Stephenson та ін., Journal of Infectious Disease, 191, 2005, С.1210]. Застосування ад’юванту MF59 підвищувало титр антитіл до вказаної вакцини на основі H5 [Stephenson та ін., Vaccine, 21, 2003, С.1687]. Вакцинація з використанням інактивованої "розщепленої" вакцини, отриманої на основі непатогенного вірусу A/duck/HK/836/80 (H3N1) і модифікованого гемаглютиніну H5 з вірусу A/HK/156/97 (H5N1), індукувала титри нейтралізуючих антитіл, що слабо виявлялися [Takada та ін., Journal of Virology, 73, 1999, С.8303]. Таким чином, хоча вказані вакцини на основі H5N1 добре переносилися, виявилось, що вони володіли слабкою імуногенністю. Недолік існуючих на даний час ефективних вакцин проти штамів вірусу H5N1 підвищує загрозу того, що ці віруси можуть викликати пандемічне захворювання. Імуногенність протигрипозної вакцини Методи визначення титрів антитіл в сироватці є сурогатними методами оцінки імунного захисту 7 після вакцинації або вірусної інфекції. Як методи визначення титрів антитіл в сироватці переважно застосовують аналізи титрів вірус-нейтралізуючих антитіл і аналізи титрів з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI). Ці аналізи засновані на здатності антитіл до вірусу грипу з людської сироватки вступати в перехресну реакцію з антигенами в умовах in vitro. Методи аналізу для конкретної ситуації вибирають не лише на основі їх здатності давати несуперечливі і застосовні результати, але також і на основі простоти їх застосування і вимог до устаткування, необхідного для здійснення кожного типу аналізу. В цілому аналіз на основі нейтралізації вірусів полягає в тому, що оцінюють здатність антитіл зі зразку сироватки блокувати зараження культивованих клітин вірусом грипу. Цей аналіз здійснюють шляхом приготування серійних розведень (титрів) зразка сироватки і об’єднання кожного з цих розведень із стандартною кількістю інфекційного вірусу. Потім кожну суміш, отриману з використанням цих розведень, вносять до певної культури клітин і аналізують отримані коефіцієнти зараження. Вважається, що аналіз титрів вірус-нейтралізуючих антитіл є надзвичайно цінним і надійним тестом для оцінки рівня імунозахисних антитіл, присутніх в організмі конкретного індивідуума. Проте він залежить від характеристик спеціалізованої культури клітин і тому не є повністю універсальним. Крім того, методологія є дуже трудомісткою і вимагає великої кількості часу, унаслідок чого вона погано пристосована для скринінгу великої кількості зразків. При аналізі з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI) також оцінюють здатність антитіл зі зразку сироватки зв’язуватися із стандартизованим еталонним вірусом. Цей аналіз заснований на тому факті, що віруси грипу повинні зв’язуватися з еритроцитами і викликати їх аглютинацію. У HI-аналізі серійні розведення зразка сироватки змішують із стандартними кількостями еталонного вірусу і після ряду інкубацій додають до еритроцитів. Після цього візуально виявляють асоціацію, що приводить до утворення комплексів, між еталонними вірусами і еритроцитами. Найбільше розведення сироватки, яке інгібує гемаглютинацію, приймають за титр інгібування гемаглютинації. Хоча HI-аналіз не володіє такою ж чутливістю відносно імуногенності вакцини, як інші аналізи, він знаходить широке застосування завдяки відносно простій технології і невисоким вимогам до лабораторного устаткування. Зважаючи на вказані вище обмеження існуючих на даний час методів, придатних для розробки і оцінки протигрипозних вакцин, існує необхідність в удосконаленні методів оцінки імуногенності для визначення імунної відповіді після зараження, а також ефективності вакцини. Короткий виклад суті винаходу У дійсному винаході запропоновані амінокислотні заміни в молекулі гемаглютиніну (HA) вірусу грипу A, які можуть змінювати антигенність та імуногенність HA. Ці заміни можуть приводити до зміни областей детермінанти шляхом зміни специфічності рецептору і/або зв’язування антитіло 94717 8 антиген. У різних варіантах здійснення винаходу підвищену антигенність, обумовлену заміною, можна використовувати для підвищення чутливості аналізу з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI) в зразках сироватки, узятих у заражених тварин. Така інформація важлива для створення призначених для діагностики еталонних вірусів і нових протигрипозних вакцин. Переважно амінокислотна заміна приводить до утворення молекул, які володіють імуногенними характеристиками, властивими амінокислотній заміні на аспарагін в положенні 223 в HA H5-підтипу. Таким чином, певні об’єкти дійсного винаходу відносяться до молекули гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, що має одну або декілька амінокислотних замін в рецепторному сайті зв’язування, що підсилює антигенність молекули HA відносно антитіл, що володіють специфічністю до молекули HA, в якій відсутня амінокислотна заміна в її рецепторному сайті зв’язування. Молекула HA з підвищеною антигенністю вірусу грипу може містити амінокислоту аспарагін в положенні, що відповідає положенню 223 в HA H5, при цьому включення аспарагіну приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму тварини, яка інфікована вірусом грипу, що несе молекулу HA дикого типу. Підвищена антигенність молекули HA вірусу грипу може бути обумовлена присутністю амінокислоти аспарагіну в положенні, що відповідає положенню 223 в HA H5, де молекула HA не виведена з ізоляту людського H5 A/HK/213/03, і включення аспарагіну в положення 223 приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму тварини, інфікованої вірусом грипу. У деяких варіантах здійснення винаходу амінокислотна заміна приводить до зміни сайту глікозирування. У деяких варіантах здійснення винаходу вірусом грипу є вірус грипу A людини. Вірус грипу A людини може бути, наприклад, представником підтипу H5. Вірус грипу A людини може бути вірусом грипу A/Vietnam/1203/04 (H5N1). У деяких варіантах здійснення винаходу вірусом грипу є вірус грипу B. Під об’єм винаходу підпадають молекули HA вірусу грипу з підвищеною антигенністю, отримані з вірусу грипу птахів. Інші об’єкти винаходу відносяться до рекомбінантного вірусу грипу, що має молекулу гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, яка містить одну або декілька амінокислотних замін в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних для молекули HA, в якій відсутні амінокислотні заміни в її рецепторному сайті зв’язування. Рекомбінантний вірус грипу може включати модифіковану молекулу HA, отриману з вірусу грипу H5N1, в генетичному оточенні вірусу грипу A. Вірус грипу A може бути вихідним вакцинним штамом грипу. Рекомбінантний вірус грипу можна використовувати як діагностичний еталонний вірус в аналізі з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI). Рекомбінантний вірус грипу можна включати в набір для аналізу з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI). Інші об’єкти винаходу відносяться до зворот 9 них генетичних систем, призначених для одержання вірусу, що містить молекулу гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, яка має амінокислотну заміну в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних для молекули HA, в якій відсутні амінокислотні заміни в її рецепторному сайті зв’язування. Наступні об’єкти представленого в дійсному описі винаходу відносяться до способів створення вірусу, що містить молекулу гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, яка має амінокислотну заміну в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних для молекули HA, в якій відсутні амінокислотні заміни в її рецепторному сайті зв’язування. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що інтродукують рекомбінантний вектор, який експресує молекулу HA з підвищеною антигенністю, в зворотну генетичну систему. Крім того, спорідненими об’єктами винаходу є способи визначення ефективності вакцини на основі вірусу грипу для тварин. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що антисироватку, отриману з організму вакцинованої тварини, піддають взаємодії з молекулою гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, яка має одну або декілька амінокислотних замін в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних для молекули HA, в якій відсутні амінокислотні заміни в рецепторному сайті зв’язування, присутньою у вакцині на основі вірусу грипу. У деяких варіантах здійснення винаходу молекулу HA з підвищеною антигенністю отримують з ізоляту A/HK/213/03 людського H5N1, і включення аспарагіну в положення, яке відповідає положенню 223 в HA з вірусу H5N1, приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму вакцинованої тварини. У деяких варіантах здійснення винаходу тварина є людиною. В інших варіантах здійснення винаходу тварина є тхором. Іншими спорідненими об’єктами дійсного винаходу є способи створення вірусу грипу, який містить молекулу гемаглютиніну (HA), які полягають в тому, що культивують за допомогою зворотного генетичного процесу зворотну генетичну систему, в якій кодуюча HA ДНК кодує одну або декілька амінокислотних замін в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних для молекули HA, в якій відсутні амінокислотні заміни в рецепторному сайті зв’язування. Крім того, винахід відноситься до способів підвищення чутливості аналізу з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI), які полягають в тому, що антисироватку, отриману з організму вакцинованої або інфікованої тварини, піддають взаємодії з молекулою гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, яка має одну або декілька амінокислотних замін в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних для молекули HA, в якій відсутні амінокислотні заміни в рецепторному сайті зв’язування. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб підвищення чутливості HI-аналізу при 94717 10 водить щонайменше до 2-разового підвищення чутливості аналізу з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI). У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб підвищення чутливості HI-аналізу приводить щонайменше до 4-разового підвищення чутливості аналізу з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI). Іншим об’єктом винаходу є способи визначення того, чи інфікована тварина вірусом грипу. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що антисироватку, отриману з організму тварини, піддають взаємодії з призначеним для діагностики еталонним вірусом, який виведений з даного вірусу грипу, але містить молекулу гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, яка має амінокислотну заміну в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних для молекули HA, в якій відсутні амінокислотні заміни в її рецепторному сайті зв’язування, що приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки. У деяких варіантах здійснення винаходу тварина є людиною. В інших варіантах здійснення винаходу тварина є тхором. Наступними об’єктами винаходу є інші способи визначення того, чи інфікована тварина вірусом грипу. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що антисироватку, отриману з організму тварини, піддають взаємодії з діагностичним еталонним вірусом, який виведений з даного вірусу грипу, але містить модифіковану молекулу HA вірусу грипу, яка має амінокислоту аспарагін в положенні, що відповідає положенню 223 в HA H5, при цьому включення аспарагіну приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму тварини, інфікованої вірусом грипу з молекулою HA дикого типу, що приводить до підвищення реактивності у відношенні антисироватки. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб визначення того, чи інфікована тварина вірусом грипу, полягає в тому, що антисироватку, отриману з організму тварини, піддають взаємодії з діагностичним еталонним вірусом, який виведений з даного вірусу грипу, але містить модифіковану молекулу HA вірусу грипу, яка має амінокислоту аспарагін в положенні, що відповідає положенню 223 в HA H5, де молекула HA не походить з ізоляту людського H5 A/HK/213/03 і включення аспарагіну в положення 223 приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму тварини, інфікованої вірусом грипу. У деяких варіантах здійснення винаходу тварина є людиною. В інших варіантах здійснення винаходу тварина є тхором. Під об’єм винаходу підпадають також призначені для одержання вакцини віруси грипу, що містять молекулу гемаглютиніну (HA), що має амінокислотну заміну в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних для молекули HA, в якій відсутні амінокислотні заміни в її рецепторному сайті зв’язування, і де модифікація приводить до підвищення імуногенності вакцинного вірусу. Одним з об’єктів дійсного винаходу є виділені нуклеїнові кислоти, що кодують молекулу гемаг 11 лютиніну (HA) вірусу грипу, яка містить амінокислотну заміну в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних відносно молекули HA, в якій відсутня амінокислотна заміна в її рецепторному сайті зв’язування. У деяких варіантах здійснення винаходу молекула HA вірусу грипу, кодована виділеною нуклеїновою кислотою, містить амінокислоту аспарагін в положенні, що відповідає положенню 223 в HA H5, де молекула HA не виведена з ізоляту людського H5 A/HK/213/03 і включення аспарагіну в положення 223 приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму тварини, зараженої вірусом грипу. Крім того, винахід відноситься до способів одержання нуклеїнових кислот, що кодують молекулу гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, яка містить амінокислотну заміну в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних відносно молекули HA, в якій відсутня амінокислотна заміна в її рецепторному сайті зв’язування. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що інтродукують нуклеотидну послідовність в нуклеїнову кислоту, яка кодує молекулу HA, в якій відсутня амінокислотна заміна в рецепторному сайті зв’язування, що приводить до амінокислотної заміни в послідовності молекули HA, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних відносно молекули HA, в якій відсутня амінокислотна заміна. Під об’єм дійсного винаходу підпадають ці та інші об’єкти винаходу, як це детальніше вказано в розділах "Докладний опис винаходу" і "Приклади". Опис креслень На кресленнях показано: На фіг.1 - графік, що ілюструє HI-титри антитіл у тхорів, яким інокулювали віруси грипу H5N1, виділені в 2003 р. і 2004 р. (A); HI-титри і титри віруснейтралізуючих антитіл у тхорів, імунізованих вірусами ΔH5N1/03 і ΔH5N1/04 (Б). Представлені на фіг.1A дані отримані з використанням зразків си6 роватки, узятих в день 28 після інокуляції 10 EID50 (середня інфікуюча доза для курячого ембріону) вірусів H5N1, які титрували проти 4 гемаглютинуючих одиниць (HAU) гомологічного вірусу. Даними є репрезентативні значення, отримані для 2 або 4 зразків сироватки. Представлені на фіг.1Б дані отримані з використанням зразків сироватки, узятих з організму тхорів, вакцинованих двічі з використанням кожного разу по 7 мкг HA вірусів ΔH5N1/03 і ΔH5N1/04, які титрували проти 4 HAU і 100 TCID50 (середня цитопатогенна доза) гомологічного вірусу відповідно. На фіг.2 - графік, що ілюструє вірусні титри в назальних змивах, отриманих у вакцинованих і контрольних тхорів після контрольного зараження вірусом A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Тхорам, вакцинованим рекомбінантними вірусами ΔH5N1/04 або 6 ΔH5/04, інтраназально інокулювали 10 EID50 вірусу A/Vietnam/1203/04. Титрами є середні значення (log10 EID50/0,1 мл)  С.К.О., визначені для назальних змивів у 3 тхорів. Слід зазначити, що відмінності у величинах 94717 12 титрів для вакцинованої і контрольної груп є статистично достовірними і характеризуються значеннями р, що становлять 0,0028 - 0,0173 згідно неспареного t-критерію. На фіг. 3 - модель молекули поліпептиду HA H5, на якій показано положення амінокислоти (положення 154 і 223) в тривимірній (3D-) структурі HA вірусу A/duck/Singapore/3/97 (H5N3). На фіг.3A вказаний рецепторний сайт зв’язування амінокислот в 3D-структурі. На фіг.3Б кружок позначає поверхню розділу між представленим мономером і двома іншими мономерами (не показані) в тривимірній молекулі HA. Амінокислота в положенні 223 знаходиться в 220-петлі рецепторного зв’язуючого домену між залишком глутаміну, який, як правило, присутній в положенні 222, і залишком гліцину, який, як правило, присутній в положенні 224. Докладний опис винаходу У дійсному винаході запропоновані зміни в амінокислотній послідовності молекули гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, які надають молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних відносно молекул HA, в яких відсутні зміни. Такі зміни послідовності включають заміни і делеції. HA, що утворився, позначають як "HA з підвищеною антигенністю". Молекулу HA з підвищеною антигенністю можна застосовувати для тестування ефективності вакцини, оскільки зміна підвищує чутливість методів діагностики антитіл до вірусу грипу в сироватці. У конкретному варіанті здійснення винаходу вірусом є вірус грипу A. В іншому варіанті здійснення винаходу вірус може бути також вірусом грипу B, а ще в одному варіанті здійснення винаходу він може бути вірусом грипу C. У варіанті здійснення винаходу, в якому вірусом є вірус грипу A, він може бути H5-підтипом вірусу грипу A. У конкретнішому варіанті здійснення винаходу молекулу HA H5-підтипу модифікують з метою включення амінокислоти аспарагіну в положення 223 (N223), що приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої від тварини, інфікованої H5-підтипом вірусу грипу. У конкретному варіанті здійснення винаходу молекула HA, пропонована у винаході, не є молекулою HA A/HK/213/03, яка відноситься до H5-підтипу, що зустрічається в природних умовах, що містить аспарагін в положенні 223. Вірус грипу може бути вірусом грипу A людини H5-підтипу, включаючи вірус A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Амінокислотні зміни, які надають молекулі HA більшу антигенність, можна здійснювати в рецепторному зв’язуючому домені HA, наприклад, як показано на фіг.3A, перш за все в області 220петлі рецепторного зв’язуючого домену. Така зміна може зменшувати зв’язування HA з рецепторами сіалової кислоти на еритроцитах, підвищуючи тим самим здатність антитіл до HA інгібувати гемаглютинацію, що приводить до посилення здатності зв’язуватися з антитілом в аналізі з використанням реакції гальмування гемаглютинації. У альтернативному варіанті амінокислотну зміну, яка надає молекулі HA більшу антигенність, можна здійснювати для того, щоб змінити або видалити шляхом делеції сайт глікозирування на білку HA, перш за 13 все сайт глікозирування, який маскує епітопи на HA, розпізнавані специфічними відносно HA антитілами. Ще в одному варіанті здійснення винаходу амінокислотну зміну можна здійснювати на амінокислотному залишку, відповідному залишку 223 HA H5-підтипу. У всіх варіантах здійснення винаходу амінокислотні модифікації, які надають молекулі HA більшу антигенність, можна легко ідентифікувати за допомогою імуноаналізів з використанням антитіл, специфічних відносно конкретного підтипу HA. Модифікація, яка надає молекулі HA більшу антигенність, повинна приводити до помітно вищої зв’язуючої активності відносно антитіла, яке титрують, в порівнянні із зв’язуючою активністю відносно молекули HA, до якої виробляються антитіла. До таких аналізів відносяться аналізи з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI). У конкретному варіанті здійснення винаходу заміна в молекулі HA H5-підтипу залишку серину (який може бути глікозирований залишком) на аспарагін (який може бути або неглікозирований, або мати іншу схему глікозирування) приводить до підвищення антигенності. Проте інші заміни також можуть приводити до помітного підвищення антигенності. Такі заміни можуть бути консервативними замінами, такі як заміна треоніну на серин або глутаміну на аспарагін, але не обов’язково консервативні заміни. Вони можуть зберігати відносну полярність, наприклад, заміна аспарагіну на серин або лізину на аспарагінову кислоту, що зберігає полярність, яка існувала до вказаних змін. Можна розглядати також заміну на такі залишки, як гліцин і аланін, що приводить до усунення реактивного бічного ланцюга, не роблячи істотного впливу на структуру поліпептиду. І, нарешті, можна здійснювати повністю неконсервативні зміни. І в цьому випадку за допомогою простих імуноаналізів можна встановлювати, чи приводить конкретна зміна до підвищення антигенності. Деякі H5N1-віруси грипу птахів, виділені в Центральній і Південній Америці, несуть основну амінокислоту аргінін в положенні 223. Нейтральна амінокислота аспарагін виявлена в положенні 223 HA людського ізоляту A/HK/213/03. Цей амінокислотний залишок розташований в 220-петлі рецепторного зв’язуючого домену між залишком глутаміну, як правило, присутнього в положенні 222, і залишком гліцину, як правило, присутнього в положенні 224 (Фіг. 3). Експериментальні дані дозволяють припустити, що вищі HI-титри відображають зміну специфічності рецептору. Фактично глутамін, як правило, присутній в положенні 222, і гліцин, як правило, присутній в положенні 224, зв’язуються безпосередньо з рецептором сіалової кислоти. Амінокислоти, присутні в 220-петлі, або суміжні з нею відіграють важливу роль в конформації рецепторної зв’язуючої кишені [Ha та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2001, С.11181]. Хоча в дійсному винаході не затверджується яке-небудь конкретне пояснення спостережуваного ефекту, може виявитися можливим, що заміна аспарагіну на серин в положенні 223 H5 приводить до конформаційних змін і змінює специфічність рецептору. Згідно наступного об’єкту винаходу молекули 94717 14 HA, модифіковані відповідно до винаходу з метою досягнення більшої антигенності, володіють також більшою імуногенністю. Такі молекули як компонент протигрипозної вакцини можуть викликати сильнішу або ефективнішу імунну відповідь, що, у свою чергу, приводить до ефективнішого захисту від зараження грипом. Віруси грипу, джерелом яких є птахи-носії збудників інфекції, мають особливе значення для суспільної охорони здоров’я. Вважається, що ці віруси з найбільшою вірогідністю здатні викликати спалахи пандемії грипу в людській популяції. Тому молекула HA з пташиного підтипу з підвищеною антигенністю і/або імуногенністю може виявитися найбільш придатною для застосування в імуноаналізах, що проводяться при розробці вакцини. Стратегію, проілюстровану в дійсному описі на прикладі H5, можна застосовувати для підвищення титрів в HI-аналізі (інгібування гемаглютинації) проти інших підтипів HA, що особливо важливо для оцінки імунітету відносно грипу птахів. У деяких варіантах здійснення винаходу молекулу HA, що має амінокислотні заміни в рецепторному сайті зв’язування, можна отримувати з вірусу грипу птахів, включаючи підтипи від H1 до H16 включно. Одним з об’єктів дійсного винаходу є застосування рекомбінантного вірусу грипу, що містить молекулу HA з підвищеною антигенністю, як еталонний вірус в імуноаналізі, перш за все HI-аналізі, а також набір для здійснення такого аналізу. Наприклад, заміна амінокислоти аспарагіну в положенні 223 в молекулі HA H5 підвищує зв’язування з рецепторами сіалової кислоти еритроцитів (RBC), що мають альфа-2,6-зв’язок, такими, які присутні в організмі коня, але знижує зв’язування з рецепторами, що мають N-глікозилсіалову кислоту з альфа-2,3-зв’язком, такими, які присутні в організмі коня. Таким чином, один з об’єктів винаходу полягає в тому, що в результаті досягнутої зниженої здатності до зв’язування з рецепторами на кінських RBC має бути потрібною менша кількість антитіла для інгібування гемаглютинації. Цей принцип, який полягає в інтродукції амінокислотних замін, які підвищують антигенність, що оцінюють за зв’язуванням з антитілом, можна застосовувати до всіх 16 підтипів HA, включаючи підтипи вірусів грипу A птахів. Під об’єм винаходу підпадають способи оцінки ефективності вакцини на основі вірусу грипу для тварини. Цей спосіб полягає в тому, що антисироватку, отриману з організму вакцинованої тварини, піддають взаємодії з вірусом грипу, що містить молекулу гемаглютиніну (HA) з підвищеною антигенністю. У деяких варіантах способу оцінки ефективності вакцини на основі вірусу грипу для тварин, як це продемонстровано за допомогою прикладів, антисироватку, отриману з організму вакцинованої тварини, піддають взаємодії з молекулою HA H5-підтипу вірусу грипу, що містить амінокислоту аспарагін в положенні 223 (N223), наприклад, молекулою HA з ізоляту людського H5N1 A/HK/213/03. Присутність аспарагіну в положенні 223 приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму тварини, інфікованої іншим H5-підтипом вірусу грипу. Вак 15 цинована тварина може відноситися до будь-якого з численних видів тварин, включаючи тхорів і людину. Під об’єм дійсного винаходу підпадають також способи підвищення чутливості HI-аналізу шляхом використання еталонного вірусу, який містить молекулу HA з підвищеною антигенністю. У деяких варіантах здійснення винаходу, таких, в яких молекула HA виведена з ізоляту штаму людського H5N1 A/HK/213/03, амінокислотна заміна полягає в інтродукції аспарагіну в положення 223, що приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму тварини, інфікованої вірусом грипу H5, що має інший амінокислотний залишок в цьому положенні, таким як A/Vietnam/1203/04. Таке підвищення реактивності може досягати будь-якого рівня, зокрема щонайменше 2-разового або щонайменше 4-разового підвищення реактивності. 2-Разове або 4-разове підвищення чутливості може виявитися особливо важливим в ситуаціях, коли кінцеві концентрації при використанні загальноприйнятих методів титрування знаходяться нижче за межу виявлення. Конкретним варіантом здійснення винаходу є також застосування як діагностичного еталонного вірусу рекомбінантного вірусу грипу, який містить модифіковану молекулу HA H5-підтипу, що має амінокислоту аспарагін в положенні 223, що приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму тварини, інфікованої вірусом грипу H5. У конкретному варіанті здійснення винаходу молекула HA H5 в діагностичному еталонному вірусі виведена з ізоляту штаму людського H5N1 A/HK/213/03. В іншому варіанті здійснення винаходу залишок аспарагіну (або глутамату) замінений в положенні 223 молекули H5 з іншого штаму вірусу грипу. Очевидно, що такий же підхід можна застосовувати для будь-якої молекули HA з будь-якого штаму вірусу грипу. У різних варіантах здійснення винаходу тварина може бути будь-якою з численних видів тварин, включаючи тхорів і людину. Окрім застосування еталонних вірусів, які володіють підвищеною чутливістю, в клінічних дослідах з вивчення вакцини для людини, ці віруси можна застосовувати в сіроепідеміологічних дослідженнях. Отримання даних, які показують, як багато людей заражені вірусами H5N1, за допомогою швидких і простих методів виявлення, таких як HI-аналізи, дозволяє отримувати важливу інформацію про поширеність вірусів H5N1 серед людей. Ці дані можна використовувати для оцінки вірогідності передачі вірусів H5N1 від людини до людини або від різних видів птахів до людини. До інших об’єктів винаходу відносяться способи визначення того, чи інфікована тварина вірусом грипу, які полягають в тому, що антисироватку, отриману з організму тварини, піддають взаємодії з діагностичним еталонним вірусом. Діагностичний еталонний вірус отримують з того ж штаму вірусу грипу, що й інфікуючий вірус, але еталонний вірус містить молекулу HA з підвищеною антигенністю. У одному з варіантів здійснення винаходу еталонний вірус містить молекулу HA, що має залишок аспарагіну в положенні, що відповідає положенню 94717 16 223 в HA H5, де включення залишку аспарагіну приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму тварини, інфікованої вірусом грипу, що містить молекулу HA дикого типу, що приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки. В іншому варіанті здійснення винаходу еталонний вірус містить молекулу гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, що має амінокислоту аспарагін в положенні, що відповідає положенню 223 в HA H5, і де молекула H5 не походить з ізоляту людського H5 A/HK/213/03 і включення залишку аспарагіну в положення 223 приводить до підвищення реактивності відносно антисироватки, отриманої з організму тварини, інфікованої вірусом грипу. У конкретному варіанті здійснення винаходу інфікуючим вірусом є вірус H5N1 і еталонний вірус є ізолятом людського H5N1 A/HK/213/03, який містить залишок аспарагіну в положенні 223 амінокислотної послідовності, що приводить до підвищення реактивності відносно H5N1-специфічної антисироватки. В інших варіантах здійснення винаходу тварина може бути будь-якою з численних видів тварин, включаючи тхорів і людину. Під об’єм винаходу підпадають також протигрипозні вакцини, що містять молекулу HA з підвищеною антигенністю. У конкретному варіанті здійснення винаходу вірусом є ізолят людського H5N1. У конкретнішому варіанті здійснення винаходу HA отримують з ізоляту A/HK/213/03. Ще в одному варіанті здійснення винаходу HA є H5, модифікованим шляхом включення амінокислоти аспарагіну в положення 223. Введення модифікацій в молекулу HA вимагає здійснення маніпуляцій на генетичному рівні, як це добре відомо в даній області і описано детальніше нижче. Після створення модифікованого гену HA можна використовувати ряд підходів, таких як зворотні генетичні методи, для інтродукції модифікованої молекули HA у вірус грипу, внаслідок чого його можна застосовувати як еталонний вірус для тестування ефективності вакцини або діагностичного еталонного вірусу для спостереження за епідеміями грипу, включаючи передачу вірусу від тварини до людини і передачу вірусу від людини до людини. Деякі об’єкти винаходу відносяться до рекомбінантних вірусів грипу, що містять молекулу гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, що має щонайменше одну зміну в амінокислотній послідовності, яка надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних відносно молекули HA, в якій відсутні зміни. Зміни в амінокислотній послідовності можуть включати заміну або делецію однієї або більшої кількості амінокислот. Модифіковану молекулу HA можна отримувати з вірусу грипу H5N1 в генетичному оточенні вірусу грипу A. У деяких варіантах здійснення винаходу вірусом грипу A є вихідний вакцинний штам вірусу. Рекомбінантні віруси, що містять модифіковану молекулу HA, що володіє підвищеною антигенністю відносно антитіл, специфічних відносно молекул HA, в яких відсутня зміна в амінокислотній послідовності, можна застосовувати як діагностичний еталонний вірус в аналізі з використанням реакції гальмування гема 17 глютинації (HI). Рекомбінантний вірус можна також включати до складу набору для аналізу з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI). Інші об’єкти винаходу відносяться до способів створення вірусу, що містить молекулу гемаглютиніну (HA). Наприклад, одним з об’єктів винаходу є спосіб створення вірусу, що містить молекулу гемаглютиніну (HA) вірусу грипу, яка має щонайменше одну зміну в амінокислотній послідовності, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних відносно молекул HA, в яких відсутні зміни. Спосіб може полягати в інтродукції рекомбінантного вектора, який експресує модифікований HA в зворотній генетичній системі. Спосіб створення вірусу грипу, що містить молекулу гемаглютиніну (HA), може полягати в культивуванні за допомогою зворотного генетичного методу зворотної генетичної системи, в якій ДНК, яка кодує HA, кодує амінокислотну заміну в рецепторному сайті зв’язування, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних відносно молекули HA, в якій відсутня амінокислотна заміна в рецепторному сайті зв’язування. Під об’єм винаходу підпадають також способи одержання нуклеїнових кислот, що кодують молекулу гемаглютиніну (HA). Молекула HA може мати щонайменше одну зміну в амінокислотній послідовності, яка надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних відносно молекул HA, в яких відсутні зміни. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що нуклеотидну послідовність інтродукують в нуклеїнову кислоту, яка кодує молекулу HA, в якій відсутня амінокислотна заміна в рецепторному сайті зв’язування, що приводить до амінокислотної заміни в послідовності молекули HA, що надає молекулі HA більшу антигенність відносно антитіл, специфічних відносно молекули HA, в якій відсутня амінокислотна заміна. Визначення У контексті дійсного опису поняття "Вірус грипу" відноситься до типів вірусу, патогенні штами яких викликають захворювання, відоме під назвою інфлуенца або грип. Поняття "вихідний вакцинний штам вірусу" позначає штам вірусу, який застосовують для створення використовуваних у вакцині штамів, що володіють здатністю до швидкого росту, або ослаблених штамів. Такі вихідні вакцинні штами, як правило, містять шість сегментів гену, використовуваних у вакцинному вірусі (PB1, PB2, PA, NP, NA, M і NS). Вихідний вакцинний штам вірусу може бути штамом, який застосовують також як компонент вакцини, зокрема штам вірусу A/PR/8/34. Поняття "поліпептид" відноситься до полімеру амінокислот і не пов’язане з конкретною довжиною продукту; таким чином, під визначення "поліпептид" підпадають пептиди, олігопептиди і білки. Це поняття не відноситься або не включає післятрансляційні модифікації поліпептиду, наприклад, глікозирування, ацетилування, фосфорилування тощо. У контексті дійсного опису поняття "інфекційний" позначає здатність вірусу розмножуватися в клітині і продукувати вірусні частинки. Інфектив 94717 18 ність можна оцінювати або шляхом виявлення вірусу, тобто вірусного навантаження, або шляхом виявлення розвитку захворювання у тварини. Поняття "індивідуум" або "суб’єкт" або "тварина" в контексті дійсного опису відносяться до хребетних, які схильні до інфекції, що викликається вірусом з антисмисловим ланцюгом РНК, конкретно інфекції, що викликається вірусом грипу, включаючи (але не обмежуючись ними) птахів (таких як водоплаваючі і кури) і представників різних видів ссавців, таких як псові, котячі, вовки, тхори, гризуни (щурі, миші тощо), коні, корови, вівці, кози, свині і примати, останні включають людину. У конкретному варіанті здійснення винаходу суб’єкт є тхором, який є придатною модельною твариною для вивчення грипу. В іншому варіанті здійснення винаходу суб’єкт є людиною. У контексті дійсного опису поняття "імуногенний" означає, що вірус або поліпептид володіє здатністю викликати гуморальну або клітинноопосередковану імунну відповідь і переважно обидві відповіді. Імуногенна субстанція є також антигенною. Імуногенна композиція є композицією, яка викликає гуморальну або клітинно-опосередковану імунну відповідь і переважно обидві відповіді при введенні тварині. Молекула є "антигенною", якщо вона володіє здатністю специфічно взаємодіяти з молекулою імунної системи, що розпізнає антиген, такий як імуноглобулін (антитіло) або Т-клітинний антигенний рецептор. Антигенний поліпептид містить "епітоп", що складається щонайменше з приблизно п’яти і переважно щонайменше з приблизно 10 амінокислот. Антигенний фрагмент поліпептиду, який в дійсному описі позначають також як "епітоп", може бути фрагментом, який є імунодетермінантою для розпізнавання антитілом або Тклітинним рецептором, або він може бути фрагментом, використовуваним для створення антитіла до молекули шляхом кон’югації антигенного фрагменту з поліпептидом-носієм з метою імунізації. Не є необхідним, щоб антигенна молекула була сама по собі імуногенною, тобто володіла здатністю викликати імунну відповідь у відсутності носія. У контексті дійсного опису поняття "амінокислотна заміна" відноситься до вбудовування амінокислоти в конкретне положення в амінокислотній послідовності даної молекули. Амінокислотна заміна є заміною конкретної амінокислоти на будьяку іншу амінокислоту, яка може займати дане положення. Поліпептид, що утворюється в результаті зміни амінокислотної послідовності, може містити також зміни, що є післятрансляційними модифікаціями, такі як глікозирування, ацетилування, фосфорилування, або будь-які інші амінокислотні модифікації, а також амінокислотну заміну. У контексті дійсного опису поняття "зворотна генетична система" відноситься до методів створення частинок вірусу грипу, поліпептидів, віріонів або нуклеїнових кислот з використанням методів генної інженерії. Такі методи включають (але, не обмежуючись ними) "плазмідну систему", описану у Hoffmann [Hoffmann та ін., Vaccine, 20, 2002, С.3165; публікація патенту США 2002/0164770A1, 7 листопада 2002 р., яка цілковито включена в 19 дійсний опис як посилання]. В цілому, зворотні генетичні системи дозволяють створювати вірусні частинки, поліпептиди і/або нуклеїнові кислоти, що містять специфічні послідовності, з використанням методів генної інженерії, відомих фахівцям в даній області. Такі системи описані також детальніше нижче. У контексті дійсного опису поняття "рецепторний сайт зв’язування" відноситься до фрагменту молекули HA, з яким зв’язується рецептор, що представляє інтерес, такий як рецептор сіалової кислоти на еритроцитах. Структура молекули H5 A/duck/Singapore і положення рецепторного сайту зв’язування гемаглютиніну вірусу H5-підтипу відомі і описані в літературі [Ha та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2001, С.11181]. Модель молекули вказаного HA H5, включаючи рецепторний сайт зв’язування, представлені на фіг.3. Поняття "діагностичний еталонний вірус" відноситься до вірусу, що містить HA з підвищеною антигенністю. Такий діагностичний еталонний вірус можна застосовувати в імуноаналізі, наприклад, в аналізі інгібування гемаглютиніну. Поняття "інфікуючий вірус" відноситься до вірусу, який інфікує конкретну тварину. Така інфекція може здійснюватися в процесі повсякденної діяльності, такої як контакт з інфікованим суб’єктом, наприклад, що приводить до інфікування людини інфекційним вірусом грипу. Така інфекція може бути результатом спеціального клінічного контрольного зараження, наприклад, при проведенні лабораторних дослідів, наприклад, коли лабораторну тварину, таку як тхір, спеціально інфікують вірусом. Така інфекція може бути здійснена при імунізації з використанням протигрипозної вакцини. Поняття "фармацевтично прийнятний" відноситься до молекул і композицій, які є фізіологічно переносимими і, як правило, при введенні людині не викликають алергічну або аналогічну несприятливу реакцію, таку як шлунковий розлад, запаморочення тощо. У контексті дійсного опису поняття "фармацевтично прийнятний" переважно означає "затверджений" регулюючим органом Федерального уряду або уряду штату або "дозволений" Фармакопеєю США або іншими загальновизнаними фармакопеями для застосування на тваринах і конкретніше для людини. Поняття "носій" відноситься до розчинника, ад’юванта, ексципієнта або наповнювача, разом з яким вводять сполуку. Такі фармацевтичні носії можуть бути стерильними рідинами, такими як вода або масла, включаючи масла, отримані з нафти, тварини, рослинного або синтетичного походження, такі як арахісове масло, соєве масло, мінеральне масло, кунжутне масло тощо. Як носії, перш за все для ін’єкційних розчинів, переважно використовують воду або водні фізіологічні розчини і водні розчини декстрози і гліцерину. Придатні фармацевтичні носії описані в "Remington’s Pharmaceutical Sciences" під ред. E.W. Martin, 18-е видавництво. У контексті дійсного опису поняття "ад’ювант" відноситься до сполуки або суміші, яка підсилює імунну відповідь на антиген. Ад’ювант може слу94717 20 жити як депо в тканині, яке повільно вивільняє антиген, а також як активатор лімфатичної системи, який неспецифічно підсилює імунну відповідь [Hood та ін., Immunology, 2-е видавництво, вид-во Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA, 1984, С.384]. Часто первинне контрольне зараження з використанням тільки антигену у відсутності ад’юванту не може викликати гуморальну або клітинноопосередковану імунну відповідь. Ад’юванти включають (але не обмежуючись ними) повний ад’ювант Фрейнда, неповний ад’ювант Фрейнда, сапонін, мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію, поверхнево-активні речовини, такі як лізолецитин, плюронові поліоли, поліаніони, пептиди, масло або вуглеводневі емульсії, гемоціаніни лімфи равлика і потенційно придатні для людини ад’юванти, такі як N-ацетилмураміл-L-треоніл-Dізоглутамін (thr-MDP), N-ацетилнормураміл-Lаланіл-D-ізоглутамін, N-ацетилмураміл-L-аланілD-ізоглутамініл-L-аланін-2-(1'-2'-дипальмітоїл-snгліцеро-3-гідроксифосфорилокси)етиламін, БЦЖ (бацила Кальмета-Герена) і Corynebacterium parvum. Переважно ад’ювант є фармацевтично прийнятним. У контексті дійсного опису поняття "виділений" означає, що даний матеріал видалений з його нативного оточення, наприклад, з клітини або вірусу. Так, виділений біологічний матеріал може бути вільний від деяких або всіх клітинних компонентів, тобто компонентів клітин, в яких нативний матеріал зустрічається в природних умовах (наприклад, цитоплазматичного або мембранного компоненту). Слід вважати, що матеріал виділений, якщо він присутній в клітинному екстракті або супернатанті. В разі молекул нуклеїнової кислоти до виділених нуклеїнових кислот відноситься ПЦР-продукт, виділена мРНК, кДНК або отриманий шляхом рестрикції фрагмент. В іншому варіанті здійснення винаходу виділена нуклеїнова кислота переважно «вирізана» з хромосоми, в якій вона може бути присутньою, і переважніше не пов’язана з некодуючими областями і не знаходиться в безпосередній близькості від них (проте вона може бути пов’язана з її нативними регуляторними областями або їх фрагментами), або з іншими генами, розташованими проти ходу або по ходу транскрипції відносно гену, що міститься у виділеній молекулі нуклеїнової кислоти, коли вона присутня в хромосомі. Ще в одному варіанті здійснення винаходу у виділеній нуклеїновій кислоті відсутній один або декілька інтронів. До виділених молекул нуклеїнової кислоти відносяться послідовності, вбудовані в плазміди, косміди, штучні хромосоми тощо, тобто коли вони є частиною химерної рекомбінантної конструкції нуклеїнової кислоти. Так, в конкретному варіанті здійснення винаходу рекомбінантна нуклеїнова кислота є виділеною нуклеїновою кислотою. Виділений білок може бути асоційований з іншими білками або нуклеїновими кислотами, з якими він зв’язаний в клітині, або ними обома, або з клітинними мембранами, якщо він є асоційованим з мембраною білком. Виділену органелу, клітину або тканину видаляють з анатомічної області, в якій вона присутня в організмі. Виділений матеріал може бути очищений, але це не є 21 обов’язковим. У контексті дійсного опису поняття "очищений" відноситься до матеріалу, який був виділений в умовах, які дозволяють зменшити або виключити присутність, матеріалів, що не мають до нього відношення, тобто забрудників, включаючи нативні матеріали, з яких отриманий даний матеріал. Наприклад, очищений віріон переважно практично вільний від компонентів клітини-господаря або культури, включаючи тканинну культуру або білки яйцеклітини, неспецифічні патогени тощо. У контексті дійсного опису поняття "практично вільний від" використовують в конкретному контексті аналітичного визначення чистоти матеріалу. Переважно очищений матеріал, практично вільний від забрудників, має щонайменше 50%-ний ступінь чистоти, переважніше щонайменше 90%-ний ступінь чистоти, і ще переважніше щонайменше 99%ний ступінь чистоти. Ступінь чистоти можна оцінювати за допомогою хроматографії, гельелектрофорезу, імуноаналізу, аналізу складу, біологічного аналізу та інших методів, відомих в даній області. Методи очищення добре відомі в даній області. Вірусні частинки можна очищати за допомогою ультрафільтрації або ультрацентрифугування, переважно безперервного центрифугування (див. Furminger, вище). Можна застосовувати інші методи очищення, які розглянуті в дійсному описі. Очищений матеріал може містити менше, ніж приблизно 50%, переважно менше, ніж приблизно 75%, і найпереважніше менше, ніж приблизно 90% клітинних компонентів, середовищ, білків або інших небажаних компонентів або домішок (дивлячись по контексту), з яким він був асоційований у вихідному стані. Поняття "практично чистий" означає найбільший ступінь чистоти, який можна досягти за допомогою загальноприйнятих методів очищення, відомих в даній області. У конкретному варіанті здійснення винаходу поняття "орієнтовно" або "приблизно" означає, що величина знаходиться в статистично певному діапазоні значень. Такий діапазон може складати по порядку величин переважно 50%, переважніше 20%, ще переважніше 10%, і ще переважніше 5% від вказаного значення або діапазону. Допустимі варіації, що підпадають під поняття "орієнтовно" або "приблизно", залежать від конкретної даної системи і звичайний фахівець в даній області легко може оцінити їх. Гемаглютинін Гемаглютиніном (HA) є основний оболонковий глікопротеїн вірусів грипу A і B. Гемаглютинінестераза (HE) вірусів грипу C є гомологом HA цих вірусів. Нові підтипи молекул HA, джерелом яких, як правило, є водоплаваючі птахи, які, як відомо, є природними носіями вірусів грипу, приводять до виникнення пандемій грипу [див. Suzuki і Nei, Mol. Biol. Evol., 19(4), 2002, С.501-509]. HA має два поліпептидні ланцюги, HA1 і HA2, що кодуються одним геном і що утворюються в результаті протеолізу з однієї молекулипопередника, що включає втрату сигнального пептиду [Suzuki і Nei, вище; Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(12), 1981, С.7639-7643]. HA1 містить при 94717 22 близно 320-амінокислот і є білком, що зв’язує рецептор, який є основною мішенню імунних відповідей. HA2 містить приблизно 220 амінокислот і забезпечує "заякорення" на вірусній оболонці (Suzuki і Nei, вище). Гени HA з вірусу грипу A підрозділяють на 16 підтипів відповідно до їх антигенних властивостей. Гени HA (HE) вірусів грипу B і C не підрозділяють на підтипи. Послідовності підтипів H1 - H15 вірусу грипу і HA (HE) вірусів грипу B і C представлені в статті Suzuki і Nei, вище, на фіг.1, яка включена в дійсний опис як посилання. Порівняння послідовностей HA підтипів H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11 і H12 вірусу грипу A, включаючи консервативні амінокислотні залишки зі всіх дванадцяти підтипів, представлене на фіг.1 в статті Air, вище, яка включена в дійсний опис як посилання. В обох посиланнях описані штами, з яких були отримані ці послідовності. Нові молекули HA, пропоновані у винаході, створюють шляхом інтродукції таких змін в амінокислотну послідовність молекули HA, які приводять до підвищення антигенності. Виділення нуклеїнових кислот, що кодують такі молекули HA, є стандартною процедурою (див. Air, вище), також як і модифікація нуклеїнової кислоти з метою інтродукції змін в амінокислотну послідовність, яку здійснюють, наприклад, за допомогою сайтнаправленого мутагенезу. В альтернативному варіанті здійснення винаходу молекули HA одного з штамів конкретного підтипу HA вже містять амінокислотну послідовність, яка підсилює антигенність в порівнянні з молекулами HA того ж підтипу з інших штамів, що проілюстроване в дійсному описі на прикладі штаму A/HK/213/03, спорідненого, наприклад, штаму A/Vietnam/1203/04. В цьому випадку штам вірусу грипу, що містить молекулу HA з більшою антигенністю, може служити як діагностичний еталонний штам. В іншому варіанті здійснення винаходу амінокислотні залишки з HA з більшою антигенністю можна інтродукувати або здійснювати з їх використанням заміну в послідовності молекули HA з меншою антигенністю, надаючи тим самим молекулі HA більшу антигенність. До підвищення антигенності можуть приводити різні зміни послідовності молекули HA. Як вказано вище, ланцюгом, в якому можна здійснювати такі зміни, є ланцюг HA1, який є рецепторним зв’язуючим доменом і служить основною мішенню імунної відповіді. Зміни можуть підвищувати аффінність антитіла до молекули HA, наприклад, в результаті видалення сайту глікозирування, який утворює епітоп, або в результаті утворення сприятливішої конформації, що володіє підвищеною аффінністю до зв’язування з антитілом. В альтернативному варіанті зміна може приводити до зменшення зв’язування з рецептором HA, наприклад, рецептором сіалової кислоти на еритроцитах, внаслідок чого антитіла, специфічні відносно молекули HA, стають ефективнішими конкурентами в реакції гемаглютинації. Різні імуноаналізи, що дозволяють виявляти такі зміни, включаючи аналіз з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI), добре відомі в даній області. 23 У HI-аналізі використовують цілі частинки вірусу грипу, які застосовують в даний час у вакцинах. Таким чином, у винаході запропоновані віруси грипу, що містять молекули HA з підвищеною антигенністю. Такі віруси найзручніше створювати за допомогою "зворотного генетичного методу", хоча можна застосовувати також класичний метод перегрупування. Зворотні генетичні методи Розроблені в даний час зворотні генетичні методи дозволяють здійснювати маніпуляції з геномом вірусу грипу [Palese та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1996, С.11354; Neumann і Kawaoka, Adv. Грипу Res., 53, 1999, С.265; Neumann та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1999, С.9345; Fodor та ін., J. Virol., 73, 1999, С.9679; заявка на патент США 20040029251]. Наприклад, було продемонстровано, що забезпечувана плазмідою експресія восьми вРНК під контролем промотору polI і всіх мРНК під контролем промотору polII приводить до утворення інфекційного вірусу грипу A [Hoffmann та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2000, С.6108; публікація патенту США No. 20020164770, яка включена в дійсний опис як посилання в частині, що стосується опису мінімальної плазмідної зворотної генетичної системи і опису методів генної інженерії]. Такі методи рекомбінації дозволяють здійснювати специфічне створення типів вірусу грипу із специфічними змінами амінокислотної послідовності поліпептиду. Молекула HA, що містить необхідну заміну, може бути частиною рекомбінантного вірусу грипу. Рекомбінантний вірус грипу можна створювати також будь-якими методами, відомими фахівцям в даній області, включаючи такий метод генної інженерії, як метод, заснований на використанні "тільки плазмідної" системи [Hoffmann та ін., Vaccine, 20, 2002, С.3165]. Рекомбінантний вірус грипу можна отримувати з вірусу H5N1. Рекомбінантний вірус може знаходитися в генетичному оточенні вірусу H1N1, використовуваного для створення вакцини, такого як вірус A/PR/8/34 або будь-який вірус грипу A, включаючи адаптовані для захисту від застуди штами A/Leningrad/134/17/57, A/Leningrad/134/47/57 і A/Ann Arbor/6/60. Нуклеїнову кислоту, відповідну послідовності молекули HA, можна виділяти з вірусу і секвенувати. Методи виділення і модифікації конкретних нуклеїнових кислот і білків добре відомі фахівцям в даній області. Згідно дійсного винаходу можна застосовувати загальноприйняті методи молекулярної біології, мікробіології і рекомбінантної ДНК, відомі фахівцям в даній області. Такі методи детально описані в літературі, див., наприклад, Sambrook, Fritsch і Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е видавництво, вид-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (у дійсному описі цитується як «Sambrook та ін., 1989»); DNA Cloning: A Practical Approach, томи I і II, під ред. D.N. Glover, 1985; Oligonucleotide Synthesis, під ред. M.J. Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridization, під ред. B.D. Hames і S.J. Higgins, 1985; Transcription And Translation, під ред. B.D. Hames і S.J. Higgins, 1984; Animal Cell Culture, під ред. R.I. Freshney, 1986; Immobilized Cells And 94717 24 Enzymes, вид-во IRL Press, 1986; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984; Current Protocols in Molecular Biology, під ред. Ausubel, F.M., вид-во John Wiley & Sons, Inc., 1994. Ці методи включають сайтнаправлений мутагенез з використанням олігонуклеотидів із зміненими нуклеотидами для одержання ПЦР-продуктів, що містять мутації (наприклад, за допомогою набору "Quikchange", що виробляється фірмою Stratagene). Імуноаналізи Для виявлення зв’язування і підвищеної антигенності, що створюється згідно дійсного винаходу, можна застосовувати різноманітні методи виявлення імуноспецифічного зв’язування антитіла з антигеном, відомі в даній області. Один з перших методів виявлення взаємодії між антигеном і антитілом був заснований на виявленні і аналізі комплексу за допомогою преципітації в гелях. Інший метод виявлення зв’язаної пари аналізована субстанція-ідентифікуюче антитіло заснований на використанні міченого радіоактивним йодом ідентифікуючого антитіла або міченого радіоактивним йодом білка, що володіє реактивністю відносно IGG, такого як протеїн A. Ці перші методи добре відомі фахівцям в даній області, і огляд цих методів даний в Methods in Enzymology, 70, 1980, С.166-198. Пізніші методи визначення присутності аналізованої субстанції в зразку з використанням тільки одного антитіла засновані на застосуванні аналізів конкурентного зв’язування. У цьому методі антитіло, яке найчастіше має бути іммобілізованим на твердій підложці, приводять в контакт із зразком, який, як припускають, містить аналізовану субстанцію, у поєднанні з відомою кількістю міченої аналізованої субстанції. Після цього дві аналізовані субстанції, а саме, мічена аналізована субстанція і аналізована субстанція, що міститься в зразку, повинні конкурувати за сайті зв’язування антитіла. Визначають кількісно або вільну мічену аналізовану субстанцію, або зв’язану мічену аналізовану субстанцію і за наслідками цього вимірювання визначають кількість конкуруючої аналізованої субстанції в зразку. Детальніше цей метод описаний в " Principles of Antigen-Antibody Reaction" [у Labat, Methods in Enzymology, 70, 1980, С.3-70]. В цьому випадку мічена аналізована субстанція може нести або радіоактивну, або ферментну мітку. У сучасніших імуноаналізах застосовують метод подвійних антитіл для виявлення присутності аналізованої субстанції. Ці методи також описані в процитованому томі Methods in Enzymology. Так, згідно одного з варіантів здійснення дійсного винаходу присутність індивідуальних маркерів визначають з використанням пари антитіл для кожного з призначених для виявлення маркерів. У контексті дійсного опису одне з вказаної пари антитіл позначають як "ідентифікуюче антитіло", а друге з вказаної пари антитіл позначають як "іммобілізоване антитіло". Так, в одному з варіантів здійснення дійсного винаходу застосовують сендвіч-метод з використанням двох антитіл для виявлення аналізованої субстанції в зразку біологічної рідини. У цьому методі аналізовану субстанцію поміщають 25 між ідентифікуючим антитілом та іммобілізованим антитілом, причому іммобілізоване антитіло необоротно іммобілізоване на твердій основі. Ідентифікуюче антитіло повинно нести мітку, що виявляється, для того, щоб ідентифікувати присутність сендвіча антитіло-аналізуєма субстанція і тим самим присутність аналізованої субстанції. Перші звичайні тверді основи знаходилися у формі полістирольних пластин, трубок або гранул, які всі добре відомі в області радіоімунного аналізу та імуноферментного аналізу. Останніми роками як тверді основи застосовують численні пористі матеріали, такі як нейлон, нітроцелюлоза, ацетат целюлози, скловолокно та інші пористі полімери. Можна застосовувати різні методи і відповідні сенсорні пристрої. Автоматизовані пристрої для аналізу включають пристрої для аналізу з неперервною/довільною вибіркою. Прикладами таких систем є OPUS™ фірми PB Diagnostic System, Inc. і аналізатор IMX™, створений фірмою Abbott Laboratories of North Chicago, Ill. Прилади для автоматизованого аналізу фірми PB Diagnostic Systems, Inc. описані в U.S. 5051237; 5138868; 5141871 і 5147609. Іншими класами систем для аналізу імунохімії, які можна використовувати при здійсненні на практиці дійсного винаходу, є оптичні імуносенсорні системи. В цілому, оптичним імуносенсором є пристрій, в якому використовуються принципи оптики для кількісного перетворення хімічних або біохімічних концентрацій, що представляють інтерес, або активностей на електричні сигнали. Ці системи можна згрупувати в чотири основні категорії: пристрої для вимірювання віддзеркалення; пристрої для вимірювання резонансу поверхневого плазмону; волоконні оптичні (світлопроводи) пристрої та інтегрально-оптичні пристрої. Пристрої для вимірювання віддзеркалення включають еліпсометричні пристрої, пристрої для множинної інтегральної відбивної спектроскопії і капілярні пристрої з флуоресцентним заповненням. Волоконні оптичні пристрої включають пристрої для вимірювання флуоресценції в полі, що швидко змінюється, оптичні волоконні капілярні трубки і волоконні оптичні флуоресцентні сенсори. Інтегрально-оптичні пристрої включають пристрої для вимірювання флуоресценції в плоскому полі, що швидко змінюється, імуносенсор з градуюючим пристроєм введення, інтерферометр Маха-Цендера, інтерферометр Хартмана і різнісні (диференціальні) інтерферометричні сенсори. Голографічне виявлення реакцій зв’язування здійснюють шляхом виявлення присутності голографічного зображення, яке створюють в заздалегідь призначеному положенні зображення, коли один реагент пари, що зв’язується, зв’язується з іммобілізованим другим реагентом пари, що зв’язується [див. U.S. No.5352582, виданий 4 жовтня 1994 р. на ім’я Lichtenwalter та ін.]. Приклади оптичних імуносенсорів описані в цілому в оглядовій статті G.A. Robins, Advances in Biosensors, 1, 1991, С.229-256. Конкретніший опис цих пристроїв можна знайти, наприклад, в U.S. 4810658; 4978503 і 5186897; у R. A. Brady та ін. в Phil. Trans. R. Soc. Land. B., 316, 1987, С.143-160 і у G. A. Robinson та ін. в Sensors 94717 26 and Actuators, вид-во Elsevier, 1992. Для встановлення діагнозу грипу, а також в пошукових дослідженнях, що стосуються епідеміології і антигенності вірусних штамів, широко застосовують серологічні аналізи. Зокрема, широко застосовують аналіз з використанням реакції гальмування гемаглютинації (HI) завдяки мінімальним вимогам до лабораторного устаткування і простоти застосування. Передбачається, що дійсний винахід повинен підвищити застосовність HIаналізу завдяки підвищенню його чутливості. HIаналіз можна застосовувати також для виявлення антигенності модифікованої молекули HA і для полегшення характеризації модифікованої молекули HA як молекули, що володіє більшою або меншою антигенністю, ніж немодифіковані молекули. HI-аналіз дозволяє визначати здатність антитіл зі зразку сироватки зв’язуватися із стандартизованим еталоном. У HI-аналізі серійні розведення (титри) зразку сироватки змішують із стандартними кількостями еритроцитів і візуально виявляють їх асоціацію в комплекси. Результатом аналізу є встановлення нижньої межі титру сироватки, при якому можна візуально виявити комплекс. Як вказано вище, в дійсному винаході запропонований покращений спосіб одержання і валідації вакцин для лікування або попередження інфекцій, що викликаються вірусом грипу. Зокрема, дійсний винахід застосовний до вакцин, які отримують за допомогою зворотних генетичних методів. Передбачається, що винахід повинен знайти застосування для валідації і перевірок імунної відповіді після вакцинації. Зокрема, завдяки підвищеній антигенності модифікованої молекули HA винахід дозволяє проводити (але, не обмежуючись цим) ефективніше виявлення антитіл після того, як індивідуум був інфікований вірусом грипу. Ця підвищена антигенність забезпечує підвищену чутливість аналізу, вживаного для виявлення імунної відповіді, такого як HI-аналіз. Створення вакцини Як показано нижче на прикладах, модифікований вірус, що містить молекулу HA з підвищеною антигенністю, сам по собі володіє більшою імуногенністю, що, у свою чергу, приводить до сильнішої імунної відповіді і вищого потенціалу вакцини. Стратегії підвищення ефективності вакцини включають застосування ад’ювантів (Wood і Williams, вище), сумісне введення імуностимулюючих молекул [Salgaller і Lodge, J. Surg. Oncol., 68, 1998, С.122] і стратегій вакцинації через слизову оболонку. Стратегії імунізації через слизову оболонку включають інкапсуляцію вірусу в мікрокапсули [U.S. 5075109, 5820883 і 5853763] і використання імунопотенціюючого мембранного носія [WO 98/0558]. Крім того, імуногенність імуногенів, що вводяться оральним шляхом, можна підвищувати шляхом використання еритроцитів (RBC) або гемолізованих RBC (U.S. 5643577), або шляхом використання антигену "синього язику" (blue tongue antigen) (U.S. 5690938). Хоча ці підходи є багатообіцяючими для розробки майбутніх стратегій вакцинації, їх застосування в конкретних ситуаціях вимагає валідації і спостереження для гарантії 27 ефективності вакцини. Передбачається, що представлений в дійсному описі винахід повинен поліпшити ці стратегії, зокрема шляхом підвищення здатності виявляти їх терапевтичні дії. Приклади Нижче різні об’єкти винаходу проілюстровані на прикладах, що не обмежують його об’єм. Приклад 1: Титри антитіла в сироватці інокульованих тхорів Віруси H5N1, що володіють високою патогенністю, отримували від лабораторій, що знаходяться в Азії і співпрацюють з Всесвітньою Організацією Охорони Здоров’я (ВООЗ). Всю роботу з цими вірусами проводили на устаткуванні BL3+ в Дитячому дослідницькому госпіталі Св. Іуди (St. Jude Children’s Research Hospital). При створенні винаходу для порівняння імуногенності вірусів грипу Zгенотипу, виділених в 2003 р., який став переважаючим в 2004 р., з вірусами, виділеними в 2004 р., здійснювали інокуляцію тхорів вірусом H5N1, виділеним з організму загиблої людини (A/HK/213/03) [Guan та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2004, С.8156], і чотирма вірусами H5N1, виділених з організму людини, курей і соколів в 2004 р. (фіг.1A). Самців і самок виведених шляхом аутбридингу тхорів отримували в рамках спеціальної програми селекції Центру ресурсів тварин при St. Jude Children’s Research Hospital. Тварини мали вік 3-5 місяців і при проведенні HI-аналізів вони давали негативну серологічну реакцію (були серонегативними) відносно зараження циркулюючими в даний час вірусами грипу A H1N1, H3N2 і H5N1 і вірусів грипу B. Віруси розмножували в аллантоїдних порожнинах 10-денних запліднених курячих яйцеклітин при 35°C протягом 48 год. Аллантоїдну рідину, зібрану після одного пасажу запліднених курячих яйцеклітин, заморожували при o 80 C і використовували в експериментах. Сироваткові антитіла при проведенні HI-аналізу титрували і здійснювали контрольне зараження вірусами через 28 днів після інокуляції. Вірус A/HK/213/03 індукував високі титри антитіла (від 1:640 до 1:1280), тоді як чотири штами 2004 р. індукували дуже низькі HI-титри (від 1:20 до 1:40). Порівняно низькі HI-титри вірусів H5N1 2004 р. могли бути результатом загальної імуносупресії, що індукується вірусом. Проте результати вакцинації з використанням вакцин ∆H5N1-A/PR/8/34 (6+2), які містили HA і нейрамінідазу з A/HK/213/03 і A/Vietnam/1203/04, показали, що основний внесок в цей ефект може бути обумовлений відмінностями в H5 (фіг.1Б). Вакцинація з використанням двох доз вакцини ∆H5N1/03 по 7 мкг індукувала високі рівні антитіл в сироватці, які можна було виявляти як за допомогою HI-аналізу, так і тесту з нейтралізації вірусу (фіг.1Б). Після такої ж вакцинації з використанням ∆H5N1/04 при HI-аналізі були виявлені дуже низькі (приблизно 1:20) титри, тоді як нейтралізуючі титри були набагато вищі (вони складали приблизно половину від титрів, індукованих ∆H5N1/03). У проведених раніше дослідженнях було встановлено, що інактивована вакцина, отримана на основі A/duck/Singapore/3/97 (H5N3), індукувала низькі або такі, що не виявляються рівні антитіла в сироватці [Nicholson та ін., 94717 28 Lancet, 357, 2001, C.1937; Stephenson та ін., Vaccine, 21, 2003, С.1687]. Узяті в сукупності, ці результати свідчать про те, що деякі ізоляти H5 можуть володіти незвичайними імуногенними і/або антигенними властивостями. Порівняльний аналіз первинної структури амінокислотних послідовностей H5 дозволив встановити, що HA з вірусів A/HK/213/03 і A/Vietnam/1203/04 грипу розрізняються 10 амінокислотами в HA1-області (таблиця 1б). Вірус A/Vietnam/1203/04 має потенційний сайт глікозирування на залишку аспарагіну N154 (N*154S155-T156, N-X-S/T, X≠P). Порівняння послідовностей дозволило виявити три амінокислоти (S120, K189 і S223), які були присутні у всіх вірусах 2004 р., але не присутні в A/HK/213/03. Для вірусу A/Vietnam/1203/04 відмінною особливістю була присутність K212. Приклад 2: Створення рекомбінантних вірусів ∆H5-A/PR/8/34 і визначення їх антигенних характеристик Для оцінки впливу ідентифікованих амінокислот на імуногенність і захист від контрольного зараження вірусом (введення провокаційної проби) при створенні винаходу використовували 8плазмідну зворотну генетичну систему для створення рекомбінантних вірусів, що несуть сім сегментів гену A/PR/8/34 і сегмент гену HA A/Vietnam/1203/04, що містить одиночні точкові мутації (Hoffmann та ін., Vaccine, 20, 2002, С.3165). Рекомбінантні віруси, позбавлені патогенності в результаті модифікації HA H5 в сайті розщеплення, створювали за допомогою ДНК-трансфекції (Hoffmann та ін., Vaccine, 20, 2002, С.3165). Точкові мутації вбудовували в HA за допомогою ПЦР з використанням набору для сайтнаправленого мутагенезу QuikChange® (фірма Stratagene, Цедар Крик, шт. Техас, США) і набору специфічних для HA H5 праймерів. Перегруповані віруси містили ген HA або гени HA і нейрамінідази (NA) з вірусів H5N1 в генетичному оточенні вірусу A/PR/8/34 (H1N1) (див. таблицю 1a, в якій представлені віруси, сконструйовані при створенні дійсного винаходу, і вказані їх скорочені позначення). Аллантоїдну рідину, зібрану після одного пасажу запліднених o курячих яйцеклітин, заморожували при -80 C і використовували в експериментах. Гени HA рекомбінантних вірусів ампліфікували за допомогою ОТПЦР і секвенували з метою перевірки того, що присутні тільки вказані мутації. Зміну амінокислотної послідовності перевіряли шляхом секвенування сегменту HA рекомбінантних вірусів (таблиця 1a). Для оцінки антигенних властивостей і різноманітності рекомбінантних HA при створенні винаходу проводили HI-аналізи з використанням панелі з шести моноклональних антитіл до HA (таблиця 2). Моноклональні антитіла (МАт) CP24, CP46, CP58 і 406/7 до HA вірусу A/chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N3) створювали у Відділенні інфекційних захворювань St. Jude Children’s Research Hospital. МАт VN04-6 до HA вірусу A/Vietnam/1203/04 і МАт HK03-3 до HA вірусу A/HK/213/03 створювали за допомогою модифікованого методу, описаного у Kohler і Milstein [Kaverin та ін., Journal of Virology, 78, 2004, С.240; Koher та ін., European Journal of 29 Immunology, 6, 1976, С.511]. П’ять МАт вступали в реакцію при відносно високих титрах з вірусом ∆H5N1/03, але тільки 3 вступали в реакцію з HA ∆H5/04. Схеми реактивності вірусів ∆H5S155→N, T156→A/04, ∆H5S120→N/04 и ∆H5R212→K/04 в цілому були схожими зі схемою реактивності вірусу ∆H5/04. Реакції вірусу ∆H5S120→N, S155→N, T156→A/04 були схожими з реакціями вірусу ∆H5N1/03. Чотири МАт розпізнавали ∆H5/04 HA, що несе мутацію S223→N (∆H5S223→N/04). Зворотна мутація N223→S в HA вірусу 2003 р. (∆H5N223→S/03) приводила до істотного зменшення HI-титрів або до втрати здатності розпізнаватися МАт. Приклад 3: HI-аналізи з використанням курячих і кінських еритроцитів Інший цікавий результат був отриманий в HIаналізі з використанням курячих і кінських еритроцитів (RBC). Цікаво відзначити, що рекомбінантний вірус ∆H5S223→N/04 володів слабкою здатністю викликати аглютинацію 1%-них кінських RBC, але приводив до аглютинації курячих RBC при високих титрах (1:1024). Для жодного з решти рекомбінантних вірусів реакції з курячими і кінськими RBC не розрізнялися між собою в такій мірі. Приклад 4: Вакцинація тхорів мутантними рекомбінантними вірусами H5-підтипу При створенні винаходу оцінювали імуногенність і захисну ефективність інактивованих вакцин шляхом вакцинації груп, що включають по 3 тхори, яку здійснювали шляхом внутрішньом’язової ін’єкції препаратів вірусів ∆H5N1/04, ∆H5/04, ∆H5S155→N, T156→A/04, ∆H5S120→N/04 и ∆H5S223→N/04, стандартизованих відносно вмісту їх HA. Для стандартизації ∆H5N1/03 застосовували метод простої радіальної імунодифузії (Webby та ін., Lancet, 363, 2004, С.1099). Решту рекомбінантних вірусів розділяли шляхом електрофорезу в 12%-ному ДСН-поліакриламідному гелі, забарвлені гелі аналізували за допомогою денситометрії на аналізаторі люмінісцентних зображень типу LAS-1000plus фірми FUJIFILM і кількісно оцінювали HA шляхом порівняння з препаратом еталонного білка. Після здійснення двох ін’єкцій по 7 мкг HA кожній тварині інокулювали A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Групи по 3 тхори вакцинували шляхом внутрішньом’язової ін’єкції 250 мкл стерильного ЗФР, що містить 7 мкг HA з інактивованих очищених вірусів. Вакцинні віруси інактивували, концентрували, очищали згідно описаного в літературі методу [Liu та ін., Virology, 314, 2003, С.580; Webby та ін., Lancet, 363, 2004, С.1099]. Трьом контрольним тваринам вводили шляхом ін’єкції 250 мкл тільки одного стерильного ЗФР. В день 21 після вакцинації брали зразки сироватки і здійснювали другу внутрішньом’язову ін’єкцію 7 мкг HA. За два тижні знову брали зразки сироватки і здійснювали контрольне зараження шляхом інокуляції вірусу. Вакцинованих і контрольних тварин інокулю6 вали як описано вище інтраназально 10 середніх інфікуючих доз для курячого ембріону (EID50) вірусу A/Vietnam/1203/04 [Govorkova та ін., Journal of Virology, 79, 2005, С.2191]. Протягом двох тижнів щодня здійснювали моніторинг клінічних ознак інфекції, вимір ваги тіла і температури. Тхорів, у яких були виявлені ознаки серйозного захворю 94717 30 вання, убивали. Для оцінки післяінфективної імунної відповіді додаткові групи тхорів інокулювали 6 10 EID50 ізолятів A/HK/213/03, A/Vietnam/3046/04, A/Vietnam/3062/04, A/chicken/Vietnam/39/04 і A/falcon/HK/D0028/04 людського і пташиного H5N1. В день 28 після інокуляції у тварин брали зразки сироватки. Для визначення титрів вірусу у верхніх дихальних шляхах в дні 3, 5 і 7 брали зразки за допомогою назального лаважа [Govorkova та ін., Journal of Virology, 79, 2005, С.2191]. Вірус, що міститься в зразках, титрували в 10-денних запліднених курячих яйцеклітинах і виражали у вигляді log10 EID50 на 0,1 мл. Титри вірусу в назальних змивах у всіх вакцинованих тварин складали від 2,5 до 4,5 log10 EID50 в день 3, від 0,5 до 2,5 log10 EID50 в день 5 і 0,25 log10 EID50 або менше в день 7 (фіг.2). У невакцинованих тхорів середній титр складав 4,0 log10 EID50 через один тиждень після зараження. У двох з трьох контрольних тхорів були виявлені ознаки серйозного захворювання (велика втрата ваги і параліч) і вони були вбиті, а один помер від інфекції. Серед вакцинованих тхорів тільки в одного розвинулося серйозне захворювання. У цього тхора, вакцинованого вірусом ∆H5S120→N/04, були виявлені серйозні неврологічні ознаки і він був убитий в день 7 після інокуляції. У цього тхора в день 4 був виявлений серйозний вірусний кон’юнктивіт з подальшим розповсюдженням вірусу в головний мозок. Мабуть, вірус був занесений в очі в процесі здійснення назального лаважа в день 3 і швидке розповсюдження по нейронах в головний мозок викликало енцефаліт. У решти вакцинованих тхорів протягом перших трьох днів після контрольного зараження вірусом була виявлена знижена активність, втрата ваги тіла і підвищена температура тіла. Ці ознаки зникли до п’ятого дня, і всі тварини швидко повернулися до норми. Таким чином, всі протестовані вакцинні віруси захищали тхорів від смертельного зараження A/Vietnam/1203/04. Вакцинація приводила до пониження титрів вірусу у верхніх дихальних шляхах і зменшувала тривалість виділення вірусу в середовище. Приклад 5: Оцінка за допомогою HI-аналізів і тестів з нейтралізації імуногенності рекомбінантних вірусів ∆H5-A/PR/8/34 Отриману від вакцинованих тхорів сироватку тестували відносно присутності рекомбінантних вірусів за допомогою HI-аналізу і аналізу нейтралізації вірусу (таблиці 3 і 4 відповідно). Зразки сироватки, узяті у тхорів, обробляли протягом ночі ферментом, що руйнує рецептор холерного вібріону (Vibrio cholerae) (фірма Denka-Seiken, Токіо, Японія), інактивували тепловою обробкою при 56°C протягом 30 хв. і абсорбували 0,5%-ною суспензією курячих еритроцитів (CRBC). Стандартний HIаналіз і аналіз нейтралізації вірусу в клітинах MDCK здійснювали згідно описаного в літературі методу [Palmer та ін., Immunology series no. 6. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention, вид-во US Department of Health, Education and Welfare, 1975; Kida та ін., Virology, 122, 1982, С.38]. У кожному HI-аналізі використовували по чотири гемаглютинуючі одиниці (HAU) вірусу і в кожному аналізі нейтралізації вірусу використовували 31 94717 по 100 середніх цитопатогенних доз (TCID50). Для сироватки, отриманої з організму тхорів, вакцинованих псевдовіріоном дикого типу з одним геном (∆H5/04, еталонний вірус) HI-титри складали 1:20. Конструкція, в якій був видалений сайт глікозирування (∆H5S155→N; T156→A/04), індукувала HI-титри, що складали від 1:10 до 1:20. Для мутантного ∆H5 HA S120→N/04 HI-титри складали від 1:20 до 1:80. На відміну від цього вакцинація з використанням ∆H5S223→N/04 приводила до HI-титру, що становить 1:640, а інші протестовані імунні сироватки вступали в реакцію з вірусом ∆H5S223→N/04 при високих HI-титрах (від 1:160 до 1:320). Таким чином, хоча вакцинація індукувала захисний імунітет, рівні виявлених антитіл були різними. Всі віруси ∆H5/04 після вакцинації індукували високі титри нейтралізуючих вірус антитіл (від 1:320 до 1:1280) (таблиця 4). Не було виявлено істотних відмінностей між гомологічними і гетерологічними нейтралізуючими титрами. Отже, виявлені відмінності між сироватками відносно розпізнавання HA не відображають здатності антитіл нейтралізувати вірус. Приклад 6: Реактивність рекомбінантних вірусів При створенні винаходу з метою додаткової оцінки реактивності рекомбінантних вірусів використовували HI-аналіз для тестування гіперімунної сироватки миші і курей, отриманої після вакцинації з використанням вірусів ∆H5N1/03 і A/HK/213/03, проти рекомбінантних вірусів із зміненими HA (таблиця 5). Середні HI-титри проти гомологічного вірусу ∆H5N1/03 складали 1:2560. HI-титри проти ∆H5/04 складали 1:160. HI-титри проти рекомбінантного вірусу ∆H5S223→N/04 перевищували щонайменше в два рази титри проти інших мутантів. Для одержання додаткової інформації про внесок амінокислоти, присутньої в положенні 223, в серологічну реактивність при створенні винаходу був сконструйований рекомбінантний вірус, в якому H5 був отриманий з A/HK/213/03, що має тільки точкову мутацію N223→S (таблиця 1a). Цей рекомбінантний вірус ∆H5N223→S/03 характеризувався нижчими HI-титрами в курячих і кінських RBC, ніж вірус ∆H5N1/03. Для додаткової оцінки впливу амінокислоти в положенні 223 на розпізнавання антигену антитілом при створенні винаходу був сконструйований рекомбінантний вірус, який містив HA дикого типу і мав HA з A/duck/Singapore/3/97 з мутацією S223→N (див. таблицю 1a). Ці віруси тестували за допомогою HI-аналізу з використанням панелі антисироватки до H5 і МАт (таблиця 6). Заміна S223→N в HA приводила до різкого підвищення HI-титрів (у 4 рази і більше). Проте ця мутація не приводила до значної зміни схеми реак 32 тивності HA A/duck/Singapore/3/97, перш за все в реакціях з МАт: ні вихідний, ні мутант HA не вступав в реакцію з МАт, що представляли собою HK03-3 і CP46, і обидва вступали в реакцію з CP46 з низькими титрами (таблиця 6). Ці результати свідчать про те, що заміна S223→N в HA підвищує чутливість HI-аналізу. Приклад 7: Друге покоління діагностичних еталонних вірусів, які повинні підвищувати чутливість HI-аналізу Вище в прикладі 3 вже було продемонстровано, що в результаті заміни амінокислоти в положенні 223 HA H5 на аспарагін підвищувалася чутливість HI-аналізу з використанням курячих еритроцитів. При створенні винаходу було доведено, що основою цього ефекту на молекулярному рівні є змінена рецепторна специфічність. Мутантний вірус з підвищеною чутливістю не викликає аглютинацію кінських еритроцитів, в яких присутній тільки альфа-2,3-зв’язок. Отже, амінокислотні заміни, які приводять до втрати здатності викликати аглютинацію кінських еритроцитів, є кандидатами для підвищення потенціалу чутливості HI-аналізу з використанням курячих еритроцитів. Цей принцип можна застосовувати до всіх 16 підтипів HA, перш за все вірусів грипу A птахів, які володіють специфічністю відносно 2,3-зв’язку. Зворотні генетичні методи дозволяють створювати рекомбінантні віруси, які мають мінімальні зміни своїх антигенних структур, але є "оптимізованими" з погляду розпізнавання різних клітинних субстратів. Переважно піддають мутації амінокислоти (91, 130-134, 149, 151, 179, 186, 190-191, 220225 в H5-підтипі), які розташовані поблизу від сайту зв’язування рецептору або є його частиною. Можна створювати плазміди, що містять сконструйовані генетичним шляхом HA, і шляхом котрансфекції створювати віруси. Рекомбінантні віруси можна тестувати шляхом аналізу HA з використанням паралельно курячих еритроцитів і кінських еритроцитів. Віруси, які викликають аглютинацію курячих еритроцитів і не викликають аглютинацію кінських еритроцитів, є кандидатами для тестування за допомогою HI-аналізів. За допомогою додаткових експериментів створюють віруси, які викликають аглютинацію кінських еритроцитів і не викликають аглютинацію курячих еритроцитів. Використання комбінації кандидатів, що мають одиночні амінокислотні заміни, може ще більше підвищити чутливість. Слід чекати, що виявлення кандидатів може привести до виявлення діагностичних еталонних вірусів із специфічною реактивністю до рецепторів, що володіють специфічністю відносно 2,3-зв’язку. Таблиця 1a Рекомбінантні віруси H5-PR/8/34, створені для застосування в дійсному дослідженні Рекомбінантний вірус: Повне позначення A/HK/213/03 ∆H5N1 x PR/8/34 A/Vietnam/1203/04 ∆H5N1 x PR/8/34 Скорочення* ∆H5N1/03 ∆H5N1/04 Положення амінокислоти в HA1 36 83 86 120 155 156 189 212 223 263 T A A N N A R K N A K T V S S T K R S T 33 94717 34 Продовження таблиці 1a Рекомбінантні віруси H5-PR/8/34, створені для застосування в дійсному дослідженні Рекомбінантний вірус: Повне позначення A/Vietnam/1203/04 ∆H5 x PR/8/34 A/Vietnam/1203/04 ∆H5S155→N, T156→A x PR/8/34 A/Vietnam/1203/04 ∆H5S120→N x PR/8/34 A/Vietnam/1203/04 ∆H5R212→K x PR/8/34 A/Vietnam/1203/04 ∆H5S223→N x PR/8/34 A/Vietnam/1203/04 ∆H5S120→N, S155→N, T156→A x PR/8/34 A/HK/213/03 ∆H5N223→S x PR/8/34 Положення амінокислоти в HA1 Скорочення* 36 83 86 120 155 156 189 212 223 263 ∆H5/04 K T V S S T K R S T ∆H5S155→N, T A V S N A K R S T T156→A/04 ∆H5S120→N/04 T A V N S T K R S T ∆H5R212→K/04 T A V S S T K K S T ∆H5S223→N/04 T A A S S T K R N A ∆H5S120→N, T A A N N A K R S A S155→N, T156→A/04 ∆H5N223→S/03 A/duck/Singapore/3/97 H5 x PR/8/34 A/duck/Singapore/3/97 H5S223→N x PR/8/34 † H5/97 H5S223→N/97 T A A N N A R K S A T T D D V V S S N N A A K K E E S N A A *: ∆ - багатоосновні амінокислоти в H5 видалені методом генної інженерії; † : Вірус A/duck/Singapore/3/97 дикого типу не містить багатоосновних амінокислот Таблиця 1б Відмінності послідовностей білка HA1 вірусів грипу H5N1 Вірус A/HK/213/03 A/Vietnam/1203/04 A/Vietnam /3046/04 A/Vietnam /3062/04 A/chicken/Vietnam /39/04 A/falcon/HK-D0028/04 A/duck/Singapore/3/97 A/HK/156/97 36 T K T T T T T T 83 A T A A A A D A 86 A V V V V A V A Положення амінокислот в HA1 120 155 156 189 N N A R S S T K S S T K S S T K S S T K S S A K S N A K S S A K 212 K R R R R K E E 223 N S S S S S S S 263 A T T T T A A T Таблиця 2 HI-аналіз рекомбінантних вірусів ∆H5 з використанням моноклональних антитіл до H5 Вірус ∆H5N1/03 ∆H5/04 ∆H5S155→N, T156→A/04 ∆H5S120→N/04 ∆H5R212→K/04 ∆H5S223→N/04 ∆H5S120→N, S155→N, T156→A/04 ∆H5N223→S/03 VN04-6* 51200 12800 3200 12800 12800 51200 Моноклональні антитіла до H5 ( HI-титри) HK03-3† CP24‡ CP46‡ CP58‡ 6400 1600 100 1600