Синтетичний промотор, який індукується патогенами

Реферат: Винахід належить до синтетичного промотору, який не зустрічається в природі, що активується патогенами, містить мінімальний промотор та є придатним для регулювання транскрипції нуклеїнової кислоти, що спричиняє резистентність до патогенів, причому згаданий мінімальний промотор містить фрагмент послідовності dbrmwa розташований за ділянкою ТАТА та перед однією з точок початку транскрипції, яка знаходиться на мінімальному промоторі, з якої починається транскрипція нуклеїнової кислоти, яка підлягає регулюванню. UA 99439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується придатного для регулювання транскрипції нуклеїнової кислоти синтетичного промотору, який індукується патогенами та містить мінімальний промотор. Крім того, цей винахід стосується трансгенних рослинних клітин та трансгенних рослин. Далі, цей винахід стосується способу одержання рослин, стійких до патогенів. Відомі різноманітні способи одержання рослин, стійких до патогенів, таких как грибки, віруси, бактерії та нематоди. У деяких таких способах використовується гіперчутлива реакція (HR) рослин, при якій на місці безпосереднього контакту патогенного чинника з рослиною утворюються некрози. Внаслідок HR у сусідніх з ураженою ділянкою клітинах відбуваються різноманітні явища та події, які забезпечують захист від патогенів, які перешкоджають подальшому проникненню патогену у рослинну тканину. HR може виникати після експресії гена-ефектора, наприклад, гена авірулентності патогену, та взаємодії з продуктом кореспондуючого гена резистентності (R-гена). При цьому R-ген може бути наявним у рослині або введеним методами генної інженерії у відповідний рослинний геном (Стувер (Stuiver) та ін., 1998; Келлер (Keller) та ін., 1999; Белбахрі (Belbahri) та ін., 2001). Крім того, збудження HR може спричинятися надлишковою експресією або автоактивуванням R-гена (Тао (Тао) та ін., 2000; Танг (Tang) та ін., 1999; Бендахмейн (Bendahmane) та ін., 2002; Гоулз (Howies) та ін., 2005). Внаслідок надлишкової експресії R-гена перевищується граничне значення, яке спричиняє збудження сигнального каскаду, який звичайно збуджується лише у присутності патогену або продукту гена авірулентності цього патогену. Шляхом збудження цього каскаду можна досягти широкої та ефективної резистентності до патогену (Олдройд та Стаскавіч (Oldroyd and Staskawicz), 1998; Тао та ін., 2000; Гоулз та ін., 2005). Автоактивними Rгенами звуться R-гени, модифіковані таким чином, що для збудження сигнального каскаду не є необхідною присутність патогену або продукту гена авірулентності та одночасно для збудження сигнального каскаду є достатньою знижена інтенсивність експресії у порівнянні з немодифікованою формою. Стувер та ін. (1998) показали, що трансформування гена avr-9 з фітопатогенного гриба Cladosporium fulvum, регульованого протомором Gst-І з картоплі, який індукується патогеном, викликає широку та ефективну резистентність до грибів у рослинах томатів, які несуть кореспондуючий ген Cf9. Резистентності Nicotiana tabacum до овоміцетів Phytophthora parasitica var nicotianae вдалося досягти шляхом трансформування або еліцитору криптогеніну з P.cryptogeo, або бактеріального еліцитору рорА з фітопатогенної бактерії Ralstonia solanacearum у N. tabacum. Обидва гени регулюються промотором hsr203J з N. tabacum, який індукується патогенами (Келлер та ін., 1999; Белбахрі та ін., 2001). Система збудження HR вимагає жорсткого регулювання експресії гена-ефектора на місці інфекції. Нерегульована експресія гена-ефектора спричиняє негативний вплив на ріст рослин і, таким чином, на врожайність культурних рослин (Стувер та Кастерс (Custers), 2001). Звичайно, контрольована експресія може забезпечуватися вибором відповідних промоторів, які індукуються патогенами. Такі промотори мають забезпечувати відсутність експресії або дуже низьку експресію в умовах відсутності ураження, але помітне посилення експресії на місці інфекції в разі ураження. Після трансформування двох різних автоактивних форм регульованого природним промотором Fisl, який індукується іржею, гена L6 резистентності до іржі з льону (Linum usitatissimum) у льон, вдалося одержати два фенотипи. До одного з них належали рослини нормальної висоти, які не мали покращеної резистентності до патогенів, а до другого — малорослі рослини із широкою резистентністю до патогенів (Гоулз та ін., 2005). Ці результати показують, що залежно від застосованої форми автоактивного R-гена досягається активність промотору, яка перевищує значення порогу індукування сигнального каскаду, тоді як у рослинах, які не мають помітних фенотипічних відмінностей, індукція промотору Fisl є недостатньою для досягнення граничного значення. Таким чином, специфічність природного промотору Fisl є недостатньою для досягнення широкої та ефективної резистентності до патогенів без негативного впливу на ріст рослин. Природні промотори, які активуються патогенами, часто виявляють надто неспецифічну активність та активуються численними чинниками; отже, їх застосування для експресії вищезгаданих генів-ефекторів є нераціональним, оскільки збудження HR може відбуватися також в умовах відсутності інфекції. Ця неселективність промоторів спричиняє вплив на ріст рослин і, таким чином, на зниження врожайності культурних рослин. Тому розроблено синтетичні промотори, які містять фрагменти послідовностей (цис-регулювальні елементи), які мають відношення до індукції патогенами, з природних промоторів, які активуються патогенами. При цьому фрагменти послідовностей, які відповідають іншим збудникам, видалені. Ці цисрегуляторні елементи клонуються перед мінімальним промотором, причому утворюється функціональний промотор, який має підвищену специфічність у порівнянні з природним 1 UA 99439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 промотором, з якого виділено відповідні цис-регуляторні елементи (Раштон (Rushton) та ін., 2002). Як мінімальний промотор для дводольних рослин застосовується ділянка від -46 до +8 гена 35S вірусу мозаїки цвітної капусти. Крім того, відомим є застосування мінімального промотору з природного промотору, з якого клоновано відповідний цис-регуляторний елемент (Перл-Тревер (Perl-Trever) та ін., 2004). Для однодольних рослин описано застосування мінімального промотору з гена Actl рису (Лю (Lü) та ін., 2000). Хоча описані синтетичні промотори переважають природні промотори, однак вони виявляють певну фонову активність також і при відсутності ураження. Ця фонова активність змінюється від одного виду рослин до іншого. Так, хоча у всіх досліджених до цього часу видах рослин можна виявити можливість індукування патогенами, спостерігається змінність інтенсивності індукування та абсолютної активності промоторів. При надто високій фоновій активності виявляється низька здатність до індукування патогенами, яка визначається як відношення активності промотора в інфікованій тканині до активності промотора в неінфікованій тканині. До цього часу вважалося, що інтенсивність фонової активності синтетичного промотору визначається лише застосовуваними цис-регуляторними елементами. Вони дуже сильно впливають на силу дії промоторів (Раштон та ін., 2002). Вплив мінімальних промоторів до цього часу досліджено мало. За літературними даними, мінімальний промотор лише вкрай незначно впливає на регулювання активності промотора (Сінгх (Singh), 1998). Однак Бхуллар (Bhullar) та ін. (2003) спостерігали помітне зниження промоторної активності промотора 35S в разі заміни мінімального промотору (від -46 до +1) гетерологічними рослинними мінімальними промоторами. Ці зміни автори приписували відмінностям у послідовностях блока ТАТА, в той час як, на їхню думку, ділянки, розташовані з боків блока ТАТА мінімального промотору, не мали відношення до промоторної активності. Метою цього винаходу є створення синтетичнотого промотору з низькою фоновою активністю, який індукується патогенами. Згідно із цим винаходом, згадана мета досягається за допомогою синтетичного промотору, який активується патогенами, з мінімальним промотором, причому цей мінімальний промотор містить фрагмент послідовностей a) dbrmwa або b) twcccmt, розташований за ділянкою ТАТА та перед однією з точок початку транскрипції, які належать до мінімального промотору, з яких починається транскрипція нуклеїнової кислоти, яка підлягає регулюванню. При цьому фрагмент послідовностей dbrmwa є придатним передусім для дводольних рослин, а фрагмент twcccmt — для однодольних рослин. Символи у фрагментах послідовностей при цьому мають такі значення: d — нуклеотид а або g, або t/u; b — нуклеотид с або g, або t/u; г — нуклеотид g або а; m — нуклеотид а або с; w — нуклеотид а або t/u; а - нуклеотид а; t — нуклеотид t; c — нуклеотид c. В рамках цього винаходу "мінімальний промотор" означає послідовність ДНК промотору, необхідну для здійснення функції промотору. З цією послідовністю ДНК можуть бути зв'язані загальні транскрипційні фактори, наприклад, TFII-D, TFII-A, TFII-B, TFII-E та TFII-F, які утворюють платформу для зв'язування комплексу РНК-полімерази II/TFII-F. Оскільки в цій ділянці починається транскрипція ДНК у мРНК, то точка початку транскрипції (TS) знаходиться у межах мінімального промотору та позначається як позиція +1. Мінімальний промотор перекриває TS та може охоплювати, наприклад, проміжок від позиції -50 до позиції +15. Навколо позиції -30 часто знаходиться так званий блок ТАТА, який, однак, присутній не у всіх промоторах. Блок ТАТА є ділянкою послідовності основ тиміну та аденіну. Блок ТАТА є місцем приєднання протешу, який зв'язує блок ТАТА (позначається ТВР). Термін "синтетичні промотори" означає промотори, які не зустрічаються у природі, складаються з кількох елементів та містять мінімальний промотор, а також розташований перед мінімальним промотором щонайменше один цис-регуляторний елемент, який є місцем приєднання спеціальних транскрипційних факторів. Синтетичні промотори створюються відповідно до бажаних вимог та індукуються або запускаються різними чинниками. 2 UA 99439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "похідні" промотору означає скорочені, подовжені або частково ідентичні варіанти цього промотору або його гомологи з однаковими, модифікованими або окремими його властивостями. Термін "гомологія" означає в цьому описі гомологію щонайменше 70 % на площині ДНК, яку можна визначити відомими способами, наприклад, шляхом комп'ютеризованого зіставлення послідовностей (Альтшуль (Altschul) таін., 1990). Синтетичний промотор за цим винаходом, який індукується патогенами, після перехідної біолістичної трансформації у тканині листя відповідної рослини спричиняє зниження фонової активності у порівнянні з відомими застосовуваними промоторами з мінімальним промотором, наприклад, із мінімальним промотором 35S у дводольних рослинах та мінімальним промотором ubil маїсу в однодольних рослинах. Крім того, для синтетичного промотору за цим винаходом, який індукується патогенами, виявлено підвищення швидкості індукування. Синтетичні промотори за цим винаходом, які індукуються патогенами, можуть бути застосовані також для одержання трансгенних рослин, які відрізняються широкою резистентністю до численних патогенів, наприклад, до грибів, овоміцетів, бактерій, вірусів, комах та нематод. Фрагменти послідовностей dbrmwa та twcccmt з точки зору орієнтування розташовані на кодогенному пасмі між блоком ТАТА та точкою початку транскрипції та можуть повторюватися два або більше разів. Послідовності для мінімальних промоторів, яким віддається перевага, позначені у цьому описі як Послідовності № 1-9. Цис-регуляторними елементами для виготовлення синтетичних промоторів, які активуються патогенами, є передусім такі елементи, присутні у природних синтетичних промоторах, які активуються патогенами, і відповідають в таких випадках за індукцію патогенами. їх ідентифікація описана в публікації Раштона та ін. (2002). Цис-регуляторні елементи, яким віддається перевага, для виготовлення синтетичних промоторів, які активуються патогенами, із застосуванням мінімальних промоторів за цим винаходом описано також у WO 00/29592. Серед вказаних у згаданому документі цисрегуляторних елементів придатним є, у першу чергу, блок D (Послідовність № 10), зокрема, у комбінації 2xS/2xD (Послідовність № 11), а також елемент Gst1, переважно у комбінації 4xGst1 (Послідовність № 12). До особливо корисних комбінацій цис-елементів належать загальні комбінації блока D (Послідовність № 10) з блоком S або з елементом Gst1. Особливо корисними є, окрім вищезгаданої комбінації 2xS/2xD (Послідовність № 11), комбінації 2xS/4xD (Послідовність № 13), 4xS/2xD (Послідовність № 14) та 2xGst1/2xD (Послідовність № 15). Комбінація елементів 2xS/4xD (Послідовність № 13) з мінімальним промотором за Послідовністю № 2 у трансгенній картоплі після інфікування Phytopthora infestans забезпечувала середнє підвищення активності гена-репортера у 253000 разів у порівнянні з неінфікованим контролем. Клонування елемента 4xS/2xD (Послідовність № 14) перед мінімальним промотором (Послідовність № 2) дозволило досягти середнього підвищення активності гена-репортера у 2892 рази. З застосуванням елемента 2xGst1/2xD (Послідовність № 15) досягнуто середнє підвищення активності гена-репортера у 2967 разів у порівнянні з контролем. Таким чином, застосування промоторів за цим винаходом уможливлює одержання трансгенних рослинних клітин, які можна регенерувати у цілісні рослини з підвищеними характеристиками стійкості до патогенів. Посівний матеріал таких трансгенних рослин вже містить промотори за цим винаходом. Цей винахід не обмежується певними видами рослин. Таким чином, цей винахід стосується також способу одержання резистентних до патогенів рослин, який включає введення у рослинну клітину гена, придатного для створення захисту від патогенів, який регулюється синтетичним промотором, який індукується патогенами, а також подальшу регенерацію з цієї рослинної клітини рослини, який відрізняється тим, що синтетичним промотором, який індукується патогенами, є описаний вище синтетичний промотор, який індукується патогенами. Приклади На Фіг. 1 показано зіставлення послідовностей у мінімальних промоторах (Послідовності № 1-7), яким віддається перевага у випадках дводольних рослин, з фіксованими блоками ТАТА та фрагментами dbrmwa, _a також із місцями розриву Pstl та Xhol, які застосовуються для клонування у плазміді pMS231uc+. На Фіг. 2 показано зіставлення послідовностей у мінімальних промоторах (Послідовність № 8 та Послідовність № 9), яким віддається перевага у випадках однодольних рослин, які застосовуються для перехідної трансформації листя пшениці. Окрім блока ТАТА, показано як фіксований фрагмент послідовність twcccmt. 3 UA 99439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Було показано, що мінімальні промотори StGst (Послідовність № 6), NtTGAA (Послідовність № 5), StPSBR (Послідовність № 7), NpCABE (Послідовність № 2), NtRBS (Послідовність № 3), NpATP2 (Послідовність № 1) та Nt5EAS (Послідовність № 4) виявляють помітно знижену активність (