Модифікований генно-інженерний злитий білок spa-cbd2, продукований бактеріями e. coli, днк розміром 1970 п.н. модифікованого генно-інженерного злитого білка spa-cbd2, плазмідний експресуючий вектор з геном мод

Реферат: Винахід належить до розділу молекулярної біології, генної інженерії, медицини, біотехнології, хроматографії, більш конкретно до модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, ДНК, що відповідає модифікованому генно-інженерному злитому білку SPA-CBD2, плазмідного експресуючого вектора з ДНК, яка відповідає за синтез модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, штаму-продуцента Е. соlі BL21 SPA-CBD2 модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, способу його суперсинтезу та способів одержання та використання біофінного сорбенту на основі модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2. В основу пропонованого винаходу поставлено задачу створення модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, продукованого бактеріями Е. соlі, та його використання як біоліганда для афінної хроматографії. Пропонований модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2, продукований бактеріями Escherichia соlі, який містить 657 амінокислотних залишків, має молекулярну масу 72 кДа, ізоелектричну точку РІ 4,98. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 містить послідовність п'яти імуноглобулінзв'язувальних доменів (Е, D, А, В, С) білка А Staphylococcus aureus (SPA), а також дві послідовності целюлозозв'язувального домена (CBD), послідовність олігогістидинового пептиду із загальною формулою (His)n, де n дорівнює 3-10, два гнучкі поліпептидні спейсери із загальною формулою "-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-Glu-Gly3-": перший між SPA та CBD, другий між CBD та CBD. Пропонована ДНК розміром 1970 п.н. відповідає модифікованому генно-інженерному злитому білку SPA-CBD2 . ДНК вбудована у плазмідний вектор для експресії в бактеріях Е. соlі. Пропонований плазмідний експресуючий вектор pET-24SPA-CBD2 містить послідовність ДНК, яка відповідає за експресію в Е. соlі модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2. Пропонований спосіб орієнтованої іммобілізації модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 на мікрокристалічній целюлозі СС31 реалізується шляхом генетичного введення двох послідовностей CBD. Використання біоафінного сорбенту з іммобілізованим модифікованим генно-інженерним злитим білком SPA-CBD2 для очищення імуноглобулінів із складних сумішей включає упаковку біоафінного сорбенту в хроматографічну колонку для FPLC, урівноваження сорбенту буфером PBS, нанесення на сорбент зразків, які містять імуноглобуліни, промивання сорбенту від неспецифічно зв'язаних білків буфером PBS та селективну елюцію зв'язаних імуноглобулінів гліциновим буфером з кислим значенням рН. Особливостями пропонованого модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 є наявність таких функціональних модулів як поверхневий білок A S. aureus (SPA), який здатний до специфічної взаємодії з константними (Fc) доменами імуноглобулінів та двох целюлозозв'язувальних доменів з целюлозолітичного комплексу Clostridium thermocellum (Cellulose binding domain, CBD), який володіє афінністю до целюлози та хітину. Два CBD та SPA з'єднанні між собою за допомогою 13 амінокислотного спейсера у заданій орієнтації. Роль спейсера полягає у просторовому розділенні афінних центрів модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2, та забезпечення оптимального представлення SPA для взаємодії з імуноглобулінами, a CBD - з целюлозою. Крім того, два CBD забезпечують формування стабільнішого комплексу з целюлозою, ніж у випадку одного CBD, що дозволяє розширити діапазон умов роботи з біоафінним сорбентом на основі модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2. UA 102135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пропонований винахід стосується розділу молекулярної біології, генної інженерії, медицини, біотехнології, хроматографії, а більш конкретно до модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, ДНК, що відповідає модифікованому генно-інженерному злитому білку SPACBD2, плазмідного експресуючого вектора з ДНК, яка відповідає за синтез модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, штаму-продуцента Е. соlі BL21 SPA-CBD2 модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, способу його суперсинтезу та способів одержання та використання біофінного сорбенту на основі модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2. SPA - поверхневий білок S. aureus молекулярною масою 42 кДа, який складається із трьох функціональних частин: сигнального пептиду; 5 високогомологічних імуноглобулінзв'язувальних доменів (Е, D, А, В, С); та гідрофобної амінокислотної послідовності, яка забезпечує заякорювання білка А в клітинній стінці бактерії [L. Abrahsmen, Т. Moks, В. Nilsson, U. Hellman, M. Uhlėn, Embo J. 4, 3901, 1985.; T. Mob, L. Abrahsmen, B. Nilsson, U. Hellman, J. Sjöquist, M. Uhlėn, Eur.J.Biochem. 156, 637, 1986]. Біологічна роль SPA полягає в тому, що за рахунок притаманної йому імуноглобулінзв'язувальної активності, забезпечується захисний панцир з IgG на поверхні S. aureus, що блокує розпізнавання бактерії Fc-рецепторами на поверхні нейтрофілів та перешкоджає подальшому фагоцитозу [Foster, T.J., Immune evasion by staphylococci // Nat. Rev. Microbiol. vol. 3, 2005. P. 948-958]. Крім цього, IgG зв'язані з SPA інгібують класичний шлях фіксації комплементу. В природі SPA представлений двома формами: секреторною і мембраннозв'язаною, які мають спорідненість до різних ділянок молекул імуноглобулінів. Крім того, що кожен домен SPA може зв'язуватись з Fc-фрагментами антитіл (константна ділянка антитіла, яка відповідає за ефекторні функції), SPA має спорідненість до Fab-фрагментів антитіл, які відповідають за розпізнавання антигена. Завдяки здатності зв'язувати Fab-фрагменти, SPA відіграє роль суперантигена для В-клітин імунної системи, індукуючи цим проліферацію та наступне виснаження популяції В-клітин [Silverman, G.J., Goodyear, C.S., Siegel, D.L… On the mechanism of staphylococcal protein A immunomodulation. Transfusion 45, 274-280, 2005]. Головну роль у зв'язуванні SPA з Fab-фрагментами IgM людини відіграє домен D [Marc Graille, Enrico A. Stura, Adam L. Corper Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of an human IgM antibody: Structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity // PNAS, vol. 97, no 10, 2000, 5399-5404]. SPA класифікують як IgG-Fc рецептор І типу, який містить LPXTG мотив, який забезпечує заякорювання білка в бактеріальній мембрані (Schneewind, О., Fowler, A., Faull, K.F., Structure of the cell wall anchor of surface proteins in Staphylococcus aureus //Science vol. 268, 1995, P. 103106). Імуноглобулінзв'язувальні домени SPA беруть участь у формуванні трьох антипаралельних α-спіралей стабілізованих за рахунок гідрофобних взаємодій. Кожен із доменів SPA складається з 58 амінокислотних залишків і здатний до зв'язування з Fc-фрагментами IgG1, IgG2, IgG4 8 -1 людини з константою афінності 10 (М ), що дозволяє використовувати SPA для виділення таких антитіл із складних біологічних сумішей. Варто враховувати, що SPA має низьку спорідненість щодо IgG3 підкласу антитіл людини [L.Jenderberg, P. Nilsson, A. Larsson, P. Denker, M. Uhlėn, B. Nilsson, P.A. Nygren J.Immunol. Metods 201, 25, 1997]. Здатність SPA взаємодіяти з антитілами в такий спосіб, що їх антигензв'язувальні сайти залишаються вільними, робить його привабливим для діагностики (кон'югати з ферментами), терапії (імуносорбція аутоантитіл та циркулюючих імунних комплексів з плазми крові хворих на аутоімунні захворювання) та як ліганду для хроматографічного очищення антитіл [Tashiro, М., Montelione, G. Т. Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 1995, P. 471-481; Partha Sarathi Chomdhury, Ashima Kushwaha, Smita Abrol, Vijay K. Chaudhary An expression system for secretion and purification of a genetically engineered thermostable chimera of protein A and alkaline phosphatase Protein expression and purification 5, 89-95, 1994 // Protein Expr. Purif.-1994.-5. - P. 89-95]. При створенні афінних сорбентів застосовують різні стратегії іммобілізації лігандів на хроматографічних матрицях. Зазвичай використовують непряму іммобілізацію на хімічно активованих матрицях (активація бромціаном, карбонілдіімідазолом, N-гідроксисукцинімідом). Такий спосіб іммобілізації білкових лігандів має ряд недоліків: 1) заряджені групи на матриці можуть стати причиною неспецифічного зв'язування білка; 2) нестабільні зв'язки між лігандом та активованими групами на матриці спричиняють часткове "підтікання" іммобілізованих лігандів в елюат; 3) відсутність спейсера між білковим лігандом і матрицею створює стеричні перешкоди, які призводять до зниження біологічної активності ліганду; 4) критичним недоліком є те, що зв'язування первинних амінів стохастичне і може, в ряді випадків, включати специфічні сайти ліганду. Для вирішення цієї проблеми використовують пряму іммобілізацію, наприклад, вводять 1 UA 102135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 до складу білка додаткову тіогрупу або адапторну молекулу. Встановлено, що хоча ємність сорбента залежить від щільності посадки ліганду, велику роль відіграє саме стеричний ефект. Показано, що динамічна ємність сорбента залежить саме від орієнтації іммобілізованого ліганду [С. Ljungquist, В. Jansson, Т. Moks, M. Uhlėn, Eur.J.Biochem. 186, 557, 1989; M. Linhalt, S. Gulich, T. Grasland, P.A Hygren, S. Nober, Protein Eng 16, 1147, 2003]. Целюлозозв'язувальний домен з целюлозолітичного комплексу Clostridium thermocellum (Cellulose binding domain, CBD) було вибрано як білок-партнер для орієнтованої іммобілізації SPA на целюлозі. CBD виділений зі специфічного білкового комплексу - целюлосоми термофільної бактерії Clostridium thermocellum [Morag E., Lapidot A., Govorko D., Lamed R., Wilchek M., Bayer E.A., Shoham Y. Expression, purification, and characterization of the cellulose-binding domain of the scaffoldin subunit from the cellulosome of Clostridium thermocellum // Appl. Envir. Microbiol.-1995. Vol. 61, № 5. - P. 1980-1986]. Целюлосома вперше була описана як мультиферментний комплекс Clostridium thermocellum, що відповідає за ефективну деградацію целюлозного субстрату. Важливим її компонентом є відносно великий білок (210 кДа) - мультифункціональна некаталітична субодиниця, яку позначають S1. Основна функція цього компоненту організація каталітичної субодиниці (целюлозолітичної частини) у здатний до зв'язування з целюлозою комплекс. Власне CBD є безпосередньо асоційований з S1-субодиницею. Особливістю CBD є здатність утворювати стабільний комплекс з вуглеводним остовом целюлози в нативних та денатурувальних умовах (8М сечовини або 6М Гуанідин-гідрохлориду) та зберігати целюлозозв'язувальні властивості при утворенні генно-інженерних кон'югатів з білками-партнерами. Останнє дає можливість використовувати CBD в якості адапторного білка для іммобілізації на целюлозі. Дослідження структурних особливостей CBD показали, що Nкінцева ділянка його молекули, яка забезпечує зв'язування з білком партнером і сайт зв'язування з вуглеводним остовом целюлози просторово віддалені. Таке розміщення активних центрів забезпечує максимально вигідну орієнтацію зв'язаного на матриці білка для взаємодії з лігандом. При необхідності, білок-партнер може бути відокремлений від CBD шляхом протеолітичної деградації та хроматографічного розділення. Відомо отримання генно-інженерного білка CBD-SPA в розчинному стані експресією в Е. соlі ("Білки, злиті з целюлозозв'язувальним доменом", патент США № 5,837,814, 17.11.1998, МПК С07K 14/00; С07K 1/13). Однак рівень експресії CBD-SPA, 6 мг/л бактеріальної культури, є недостатнім для його подальшого використання в біотехнології. Крім того, описаний білок CBDSPA не містить олігогістидинового пептиду із загальною формулою (His)n, де n дорівнює 3-10, що дозволяє проводити його хроматографічного очищення, Крім того, не описано створення афінного сорбенту на основі генно-інженерного білка CBD-SPA та способу його використання для очищення антитіл. Авторами під час проведення патентно-інформаційних досліджень і підготовки заявки не виявлено модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, продукованого бактеріями Е. соlі та біоафінного сорбенту для очищення імуноглобулінів, створеного на його основі. В основу пропонованого винаходу поставлено задачу створення модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2, продукованого бактеріями Е. соlі, та його використання як біоліганду для афінної хроматографії. Пропонований модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2, продукований бактеріями Escherichia соlі, який містить 657 амінокислотних залишків, має молекулярну масу 72 кДа, ізоелектричну точку РІ 4,98 і відповідає загальній формулі NH2-SPA-cпeйcep-CBD-cпeйcepCBD-COOH 2 UA 102135 C2 5 10 15 Особливістю модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 є те, що він містить послідовність п'яти імуноглобулінзв'язувальних доменів (Е, D, А, В, С) білка А Staphylococcus aureus (SPA). Особливістю модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 є те, що він містить дві послідовності целюлозозв'язувального домену (CBD). Особливістю модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 є те, що він містить послідовність олігогістидинового пептиду із загальною формулою (His) n, де n дорівнює 3-10. Особливістю модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 є те, що він містить два гнучкі поліпептидні спейсери із загальною формулою "-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-GluGly3-": перший між SPA та CBD, другий між CBD та CBD. Пропонована ДНК розміром 1970 п.н. відповідає модифікованому генно-інженерному злитому білку SPA-CBD2 3 UA 102135 C2 4 UA 102135 C2 5 Особливістю ДНК є те, що вона вбудована у плазмідний вектор для експресії в бактеріях Е. соlі. Пропонований плазмідний експресуючий вектор pET-24SPA-CBD2 містить послідовність ДНК, яка відповідає за експресію в Е. соlі модифікованого генно-інженерного злитого білка SPACBD2. 5 UA 102135 C2 5 10 15 20 25 30 Пропонований штам Е. coli BL2JSPA-CBD2 - продуцент модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 є трансформованим плазмідним експресуючим вектором pET-24SPACBD2. Пропонований спосіб одержання модифікованого генно-інженерного злитого білка SPACBD2 синтезом в бактеріях Е. coli включає культивування продуцента на середовищі, що містить лактозу, глюкозу, мінеральні солі та гліцерол; осадження бактеріальних клітин після завершення біосинтезу центрифугуванням, руйнування бактеріальних клітин і хромосомної ДНК на ультразвуковому дезінтеграторі в присутності лізоциму та ДНК-ази; осадження отриманого лізату центрифугуванням та виділення розчинної фракції білків клітини, яка і є джерелом модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2. Пропонований спосіб орієнтованої іммобілізації модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 на мікрокристалічній целюлозі СС31 реалізується шляхом генетичного введення двох послідовностей CBD. Використання біоафінного сорбенту з іммобілізованим модифікованим генно-інженерним злитим білком SPA-CBD2 для очищення імуноглобулінів із складних сумішей включає упаковку біоафінного сорбенту в хроматографічну колонку для FPLC, урівноваження сорбенту буфером PBS, нанесення на сорбент зразків, які містять імуноглобуліни, промивання сорбенту від неспецифічно зв'язаних білків буфером PBS та селективну елюцію зв'язаних імуноглобулінів гліциновим буфером з кислим значенням рН. Особливостями пропонованого модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 є наявність таких функціональних модулів як поверхневий білок A S. aureus (SPA), який здатний до специфічної взаємодії з константними (Fc) доменами імуноглобулінів та двох целюлозозв'язувальних доменів з целюлозолітичного комплексу Clostridium thermocellum (Cellulose binding domain, CBD), який має афінність до целюлози та хітину. Два CBD та SPA з'єднані між собою за допомогою 13 амінокислотного спейсера у заданій орієнтації. Роль спейсера полягає у просторовому розділенні афінних центрів модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2, та забезпечення оптимального представлення SPA для взаємодії з імуноглобулінами, a CBD - з целюлозою. Крім того, два CBD забезпечують формування стабільнішого комплексу з целюлозою, ніж у випадку одного CBD, що дозволяє розширити діапазон умов роботи з біоафінним сорбентом на основі модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2. Суть винаходів пояснюється графічними матеріалами, де: 6 UA 102135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на фіг. 1 показана амінокислотна послідовність модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, 657 амінокислотних залишків. Молекулярна маса модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2 72 кДа. Ізоелектрична точка пропонованого білка РІ=4,98; на фіг. 2 показана послідовність ДНК модифікованого генно-інженерного злитого білка SPACBD2, 1970 п.н.; на фіг. 3 - послідовність олігонуклеотидних праймерів із сайтами унікальних рестриктаз для ампліфікації ДНК білка SPA із хромосомної ДНК Staphylococcus aureus і клонування в плазмідному векторі; на фіг. 4, 5 - послідовність олігонуклеотидних праймерів із сайтами унікальних рестриктаз для ампліфікації ДНК CBD і клонування в плазмідному векторі; на фіг. 6 - схема розміщення елементів експресійної касети SPA-CBD2 у векторі рЕТ-24; на фіг. 7 - рестрикційна карта плазмідного експресуючого вектора pETSPA-CBD2; на фіг. 8 - представлений електрофоретичний аналіз експресії модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2 штамом-продуцентом Е. coli BL21SPA-CBD2, де 1 сумарний лізат клітин продуценту після культивування протягом 20 год. у присутності індуктора експресії, 2 - фракція нерозчинних білків клітин, 3 - фракція розчинних білків клітин, 4 - маркер молекулярної маси білків; на фіг. 9 - представлено схематичне зображення біоафінного сорбенту на основі іммобілізованого SPA-CBD2, який може бути використано для очищення імуноглобулінів; на фіг. 10 - представлена хроматограма очищення на біоафінному сорбенті з іммобілізованим SPA-CBD2 поліклональних антитіл з сироваток імунізованих кролів, де 1 - білки сироваток крові імунізованих кролів, які наносились на сорбент; 2 - білки, які не зв'язалися із сорбентом і видаляються при промивання буфером; 3 - очищені поліклональні антитіла одержані елюцією з колонки при рН 2.9. на фіг. 11 - представлено електрофоретичний аналіз фракцій білків, де 1 - білки сироваток крові імунізованих кролів, які наносились на сорбент, 2 - білки, які не зв'язалися із сорбентом, 3 очищені поліклональні антитіла одержані елюцією з колонки при рН 2.9, 4 - маркер молекулярної маси білків. Пропонований винахід вирішує проблеми відомого рівня техніки і забезпечує джерело рекомбінантного білка, який зберігає притаманні нативним білкам-партнерам (SPA та CBD) сайти зв'язування, у разі використання технологій рекомбінантних ДНК. Послідовності ДНК, які кодують CBD та SPA є загальнодоступними з банку генів (клонована послідовність SPA є гомологічною послідовності SPA з Gen-Bank Accession № EU695225.1, CBD-Gen-Bank Accession № X68233,) і можуть бути клоновані у плазмідному експресійному векторі. У відповідності до пропонованого винаходу для одержання ДНК модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2 використовували модифіковану методику клонування ДНК, що передбачає раціональний дизайн молекули білка SPA-CBD2, розробку способу ампліфікації цільової ДНК і вбудовування в плазмідний вектор для експресії в бактеріях. Як вихідний матеріал для одержання ДНК SPA (яка є необхідною для одержання модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2) використовували хромосомну ДНК бактерії S. aureus, CBD – pCBD, люб'язно надану для досліджень професором Y. Shoham (Ізраїль). Відповідно до винаходу ампліфікацію дволанцюгової ДНК здійснювали методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням спеціально розроблених для даної процедури ДНК-праймерів, що дозволило клонувати усі п'ять імуноглобулінзв'язувальних доменів SPA. Праймери для ампліфікації вводили до складу ДНК, яка кодує SPA унікальні фланкуючі сайти ендонуклеаз рестрикції Ndel і NotI для вбудовування в плазмідний експресуючий вектор. Це може бути визначено з використанням стандартних методик для аналізу послідовностей ДНК спеціалістами даної галузі. Послідовності праймерів наведено на (Фіг. 3). Одержані в результаті полімеразної ланцюгової реакції фрагменти дволанцюгової ДНК розділяли електрофорезом в агарозному гелі і оцінювали порівнюючи з маркером молекулярної маси ДНК. Ампліфіковані фрагменти ДНК мали розмір 880 п.н., що відповідає амінокислотній послідовності п'яти доменів SPA. Сиквенування даної послідовності ДНК показало, що вона відповідає послідовності SPA, одержаній з бази даних NCBI. ПЛР-ампліфікацію послідовностей CBD проводили з використанням спеціально розрахованих для даної процедури двох пар специфічних праймерів: перша пара вводить до складу ДНК одного CBD послідовність спейсера "-GlyS-Ser-Glu-GlyS-Ser-Glu-GlyS-", a також унікальні сайти ендонуклеаз рестрикції NotI, BamHI на 5'-кінці і Xhol на 3'-кінці; друга пара вводить до складу другого CBD послідовність спейсера "-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-Glu-Gly3-", а також фланкуючі послідовності ендонуклеаз рестрикції NotI на 5'-кінці і BamHI 3'-кінці. Це 7 UA 102135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дозволило послідовно ввести до плазмідного вектора pGEM-11 ДНК два домени CBD з одержанням pGEM-11(CBD2). Як матрицю використовували плазміду pCBD. Одержані в результаті полімеразної ланцюгової реакції фрагменти дволанцюгової ДНК розділяли електрофорезом в агарозному гелі і оцінювали порівнюючи з маркером молекулярної маси ДНК. Ампліфіковані фрагменти ДНК мали розмір 534 п.н., що відповідає амінокислотній послідовності CBD. Послідовності праймерів наведено на Фіг. 4, 5. Очищений продукт ПЛР, а саме ДНК, що кодує SPA, а також pGEM-11(CBD2) гідролізували відповідними рестриктазами і використовували для клонування у плазмідний експресуючий вектор рЕТ-24, який містив нуклеотидну послідовність афінної мітки 6His-tag, та отримували результуючий плазмідний вектор pET-24-SPA-CBD2, який забезпечував одержання SPA-CBD2 в бактеріях Е. соlі (фіг. 6, 7). Способи одержання ДНК модифікованого генно-інженерного рекомбінантного білка SPACBD2 буде легко оцінений спеціалістами даної галузі на основі прикладів і наступного опису. На Фіг. 1, 2 представлено послідовності ДНК і поліпептидного продукту SPA-CBD2 який вона кодує, відповідно до теперішнього винаходу. Молекулярно-генетична характеристика вектора. Розмір вектора SPA-CBD2 становить 7181 п.н. Вектор містить наступні елементи: клоновану ДНК розміром 1970 п.н., кодуючу рекомбінантний білок SPA-CBD2 промоторно-операторну ділянку, ген резистентності до канаміцину, сайт реплікації в бактеріях, сайти унікальних ендонуклеаз рестрикції Ndel, NotI, BamHI і Xhol. Вектор pET-24SPA-CBD2 був виділений з описаного нижче штаму-продуцента Е. coli BL21 SPA-CBD2 за стандартною методикою виділення плазмідної ДНК (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis-2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1 p. 1.25-1.28). Виділений вектор pET-24SPA-CBD2 після гідролізу рестриктазою XhoI і електрофорезу в 1 % агарозному у присутності 0,001 % броміду етидію гелі виявляється у вигляді дискретної полоси розміром близько 7181 п.н. Способи одержання та виділення плазмідного експресуючого вектора pET-24SPA-CBD2 будуть легко оцінені спеціалістами даної галузі на основі прикладів і наступного опису. На Фіг. 5 представлено рестрикційну карту вектора рSPA-CBD2. Пропонований штам-продуцент Е. соlі BL21SPA-CBD2, одержували шляхом трансформації штаму прототипу BL21(DE3) плазмідним експресуючим вектором рЕТ-24-SPA-CBD2, що має нуклеотидну послідовність ДНК розміром 1970 п.н., яка відповідає модифікованому генноінженерному злитому білку SPA-CBD2. Із застосуванням генно-інженерних підходів штам Е. соlі BL21(DE3) став придатним для продукування модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, який по завершенню біосинтезу накопичується у розчинній фракції білків цитоплазми клітини. Культурально-морфологічна характеристика штаму-продуцента. Продуцент добре культивувався на рідких та агаризованих поживних середовищах на основі дріжджового екстракту та бактотриптону. На поживних середовищах за температури 37 °C час подвоєння бактеріальних клітин у логарифмічній фазі росту становив близько 20 хвилин. Фізіолого-біохімічна характеристика. Оптимальна для росту температура складає 30-37 °C та рН 7,2-7.8. Маркерні характеристики. Штам-продуцент є резистентним до антибіотику канаміцину. Біотехнологічна характеристика. Нарощування клітин відбувалося на середовищі що містило 1-2 % глюкози та 50 мкг/мл канаміцину. Суперсинтез рекомбінантного білка проходив за процедурою, що наведена нижче. Штам продукував модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2, який по завершенню біосинтезу накопичувався у розчинній фракції білків клітини. Вихід цільового продукту становив близько 500 мг на 1 л клітинної суспензії. Спосіб одержання штаму-продуцента буде легко оцінений спеціалістами даної галузі на основі прикладів і наступного опису. Оскільки вихідний штам є загальнодоступним, процедура депозитування не проводилась. Білок SPA-CBD2 може бути синтезований і виділений з клітин продуценту відповідно до способів суперсинтезу та одержання очищеного і розчинного модифікованого генно-інженерного рекомбінантного білка SPA-CBD2, які приведено нижче. Пропонований винахід вирішує проблеми відомого рівня техніки і використовується для створення бактеріального штаму-продуцента модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2. Спосіб одержання модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 проводили синтезом в бактеріях Е. соlі, в якому культивування продуценту проводили на середовищі, що містить лактозу і глюкозу. Послідовність дій та перелік використаних реактивів наведені в прикладі 4. Продукування рекомбінантного білка SPA-CBD2 в бактеріальних клітинах здійснювали з використанням методик, відомих спеціалістам даної галузі [Studier F.W. Protein 8 UA 102135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 production by auto-induction in high density shaking cultures // Protein Expr. Purif.-2005.-41(1). - P. 207-234]. Використання лактози, яка є значно дешевшою ніж загальновживаний індуктор експресії ізопропіл-бета-D-галактопіранозид (ІПТГ) не вимагає дорогих культуральних середовищ та спеціального обладнання, а пролонгований час культивування (до 24 годин) забезпечує максимальні виходи рекомбінантного білка у лабораторних умовах. Відповідно до винаходу спосіб одержання модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 штамом-продуцентом Е. соlі BL21(DE3) полягає в інокулюванні аліквоти бактеріальної культури із вихідного її стоку безпосередньо у поживне рідке середовище, що містить лактозу і глюкозу у кінцевих концентраціях, 0,2 % і 0,05 % відповідно. Культивування проводили при 30 або 37 °C і інтенсивній аерації протягом 20-24 год., кінцева оптична щільність культури продуценту індукованої у такий спосіб складала OD 600=14-18. Вихід рекомбінантного білка SPA-CBD2, який становить близько 500 мг на 1 л клітинної суспензії, визначали електрофоретичним розділенням сумарних білків продуценту в 12 %-му поліакриламідному гелі з наступним денситометруванням електрофореграм і порівнянням цільового білка із білком відомої концентрації відповідно до стандартної методики денситометрії білків, відомої спеціалістам даної галузі (ImageMaster TotaILab v.2.01 "Amersham Biosciences") Авторами показано, що при вищезазначених умовах культивування штаму-продуцента і суперсинтезі рекомбінантний білок SPA-CBD2 накопичується у фракції розчинних білків цитоплазми, що виявлено після індукування експресії за вищенаведеним способом у вигляді дискретної полоси розміром 72 кДа (Фіг. 8). Пропонований спосіб одержання очищеного і розчинного модифікованим генно-інженерного рекомбінантного білка SPA-CBD2 включає осадження бактеріальних клітин після завершення біосинтезу центрифугуванням, руйнування бактеріальних клітин і хромосомної ДНК у присутності лізоциму та ДНК-ази, осадження фракції нерозчинних білків клітини центрифугуванням для супернатанту, який містить розчинний модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2. Для створення біоафінного сорбенту було вибрано попередньо декантовану гранулярну мікрокристалічну целюлозу СС31, яку урівноважували відповідним буфером, інкубували протягом години при постійному перемішуванні із супернатантом, який містив розчинний модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 та відмивали від неспецифічно зв'язаних білків. Отриманий біоафінний сорбент з іммобілізованим SPA-CBD2 був стабільним у разі зберігання на +4 °C у вигляді 50 % суспензії у 20 % етанолі протягом декількох місяців. Для очищення імуноглобулінів 1 мл біоафінного сорбенту упаковували в поліпропіленову колонку, яку під'єднували до автоматизованої хроматографічної системи FPLC ("Amersham Biosciences") та проводили хроматографічне розділення відповідно до стандартної методики, відомої спеціалістам даної галузі (Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.-536 с.). Пропонований спосіб очищення імуноглобулінів є ефективним, оскільки дозволяє отримувати імуноглобуліни з чистотою близько 95 %. Крім того не спостерігалося значного підтікання біоліганду в елюат при кислих умовах елюції (фіг. 10, 11). Приклад 1. Одержання ДНК, яка кодує тандем CBD-CBD. ПЛР-ампліфікацію послідовностей CBD проводили з використанням двох пар специфічних праймерів (фіг. 4, фіг. 5). Перша пара вводить до складу ДНК одного CBD послідовність спейсера, а також унікальні сайти ендонуклеаз рестрикції NotI, BamHI на 5'-кінці і Xhol на 3'-кінці - ПЛР продукт 1. Друга пара вводить до складу іншого CBD послідовність спейсера "-Gly3-SerGlu-Gly3-Ser-Glu-Gly3-", а також фланкуючі послідовності ендонуклеаз рестрикції NotI на 5'-кінці і BamHI 3'-кінці - ПЛР подукт 2. Для ПЛР готували наступні суміші: (1) плазмідна ДНК (pCBD) - 5 мкл, 10-ти кратний концентрат буферу для ПЛР - 5 мкл, праймер 1 (20 пкМ) - 1 мкл, праймер 2 (20 пкМ) - 1 мкл, (Tag ДНК-полімераза - 5 одиниць активності, 2 мМ dNTP-5 млк, 25 MgC12-4 мкл, стерильна деіонізована вода - до загального об'єму реакційної суміші 50 мкл; (2) плазмідна ДНК (pCBD) - 5 мкл, 10-кратний концентрат буферу для ПЛР - 5 мкл, праймер 3 (20 пкМ) - 1 мкл, праймер 4 (20 пкМ) - 1 мкл, (Tag ДНК-полімераза - 5 одиниць активності, 2 мМ dNTP-5 млк, 25 MgCl-2-4 мкл, стерильна деіонізована вода - до загального об'єму реакційної суміші 50 мкл. Для ампліфікації ДНК проби використовували термоциклер, що програмується. ПЛР проводили за наступних умов: денатурація - 95 °C 30 сек., віджиг праймерів – 60 °C 1 хв., елонгація - 72 °C 1 хв. загалом 30 циклів ампліфікації. По завершенню - інкубували 10 хв. при 72 °C. Одержані в результаті полімеразної ланцюгової реакції фрагменти дволанцюгової ДНК розділяли електрофорезом в 1 % агарозному гелі з наступним фарбуванням бромідом етидію і візуалізацією при 312 нм у вигляді дискретної полоси 534 п.н. та оцінкою у порівнянні з маркером молекулярної маси ДНК. 9 UA 102135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ампліфіковані фрагменти ДНК мали розмір 534 п.н. що відповідає амінокислотній послідовності спейсера "-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-Glu-Gly3-CBD". Одержаний ПЛР-продукт 1 гідролізували NotI та XhoI. Для цього очищену за стандартною методикою ДНК (1 мкг) вносили в стерильну мікроцентрифужну пробірку і додавали 10-ти + + кратний концентрат буфера (О -буфер для NotI, R -буфер для XhoI) виробництва "Fermantas" (Литва) - 5 мкл, рестриктази NotI ("Fermantas") - 2 мкл, рестриктази XhoI-2 мкл, стерильної деіонізованої води - до загального об'єму реакційної суміші 50 мкл і інкубували на водяній бані 2 год. при 37 °C, після чого ДНК очищували та визначали концентрацію за стандартними методиками (посилання) і використовували для лігування з ДНК-вектором pGEM-11Zf (Promega), гідролізованого тими ж самими рестриктазами за вищенаведеною схемою. Для проведення лігування використовували очищені фрагменти ДНК CBD 534 п.н. (50 нг) і вектора (150 нг). Для цього збирали наступну суміш: фрагмент ДНК - 5 мкл, вектор - 10 мкл, 10-кратний концентрат буфера для лігування ДНК виробництва Fermantas-2 мкл, Т4 ДНК-лігаза (5 од/мкл) виробництва Fermantas-1 мкл, стерильна деіонізована вода - до загального об'єму реакційної суміші 20 мкл, 1 год. при 20 °C. Суміш інактивували прогріванням 10 хв при 65 °C. В результаті отримали плазмідний вектор pGEM-11Zf(CBD). Одержану ДНК pGEM-11Zf(CBD) осаджували додаванням 100 мкл 96 % етанолу і 5 мкл 5М ацетату калію з наступним центрифугуванням 5 хв при 16 000 g, розчиняли в 10 мкл стерильної деіонізованої води. Одержаний ПЛР-продукт 2 гідролізували NotI та ВатНІ за методикою, описаною вище, але з використанням Original BamHI-буфер для рестриктази ВатНІ. Після інкубування на водяній бані протягом 2 год. при 37 °C ДНК очищували та визначали концентрацію за стандартними методиками (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis-2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1 p. 1.25-1.28) і використовували для лігування з ДНК-вектором pGEM-11Zf(CBD), гідролізованого тими ж самими рестриктазами з одержанням плазміди pGEM-11Zf(CBD2) за схемою, описаною вище. Одержану плазміду pGEM-11Zf(CBD2) гідролізували NotI та XhoI. Для цього очищену за стандартною методикою (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis-2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1, p. 1.82-1.84). ДНК (1 мкг) вносили в стерильну мікроцентрифужну пробірку і додавали 10-кратний концентрат + + буфера (О -буфер для NotI, R -буфер для XhoI) виробництва "Fermantas" - 5 мкл, рестриктази NotI ("Fermantas") - 2 мкл, рестриктази XhoI-2 мкл, стерильної деіонізованої води - до загального об'єму реакційної суміші 50 мкл і інкубували на водяній бані 2 год. при 37 °C, після чого ДНК очищували та визначали концентрацію за стандартними методиками (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis-2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1 p. 1.25-1.28) і використовували для лігування з ДНК-вектором рЕТ24, гідролізованого тими ж самими рестриктазами за вищенаведеною схемою отримуючи результуючу плазміду pET-24-CBD2. Методом електрофорезу в 1 %-му агарозному гелі з наступним фарбуванням бромідом етидію і візуалізацією при 312 нм було підтверджено наявність дискретної полоси 1064 п.н., яка відповідала ДНК тандему CBD-CBD, що було також підтверджено сиквенуванням. Приклад 2. Одержання дволанцюгової ДНК, яка кодує SPA. Для одержання ДНК, що кодує SPA проводили полімеразно-ланцюгову реакцію з використанням олігонуклеотидних праймерів, які вводили до складу ДНК SPA фланкуючі сайти рестрикції NdeI і NotI. Послідовності праймерів приведено на фіг. 3. У якості матриці використовували хромосомну ДНК бактерії Staphylococcus aureus. Для ПЛР готували наступну суміш (у розрахунку на 1 реакцію):10-кратний концентрат Pfu-буферу для ПЛР - 5 мкл, 25мМ MgSO4-4 мкл, 25 мМ dNTP-0,4 мкл, праймер 1 (20 пкм) - 1,5 мкл, праймер asnSPA-1,5 мкл, Pfuполімераза - 1 мкл, матриця (суспендовані в деіонізованій воді) - 2 мкл, вільна від ДНК деіонізована вода - до загального об'єму реакційної суміші 50 мкл. Для ампліфікації ДНК використовували термоциклер, що програмується. ПЛР проводили за наступних умов: денатурація – 95 °C 30 сек., віджиг праймерів – 55 °C 30 сек., елонгація – 72 °C 2 хв., загалом 30 циклів ампліфікації. Продукт ампліфікації виявлявся електрофорезом в 1 % агарозному гелі з наступним фарбуванням бромідом етидію та візуалізацією при 312 нм у вигляді дискретної смуги, яка відповідала розміру ДНК 880 п.н. В результаті з хромосомної ДНК Staphylococcus aureus було ампліфіковано дволанцюгову ДНК, яка кодує SPA. Приклад 3. Конструювання експресуючого вектора pSPA-CBD2 Одержаний ПЛР-продукт (SPA) гідролізували NdeI та NotI з використанням 10-тикратного + буфера (О -буфер, "Fermentas") за методикою, описаною вище. Після інкубування на водяній бані протягом 2 год. при 37 °C ДНК очищували та визначали її концентрацію за стандартними методиками (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis-2 10 UA 102135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1 p. 1.25-1.28) і використовували для лігування з ДНК-вектором рЕТ-24-СВD2, гідролізованого тими ж самими рестриктазами. Для цього очищений фрагмент ДНК SPA розміром 880 п.н. (60 нг) і вектор pET24-CBD2 (180 нг) об'єднували у реакції лігування: фрагмент ДНК - 5 мкл, вектор - 10 мкл, 10-ти кратний концентрат буфера для лігування ДНК виробництва Fermantas-2 мкл, Т4 ДНК-лігаза (5 од/мкл) виробництва Fermantas-1 мкл, стерильна деіонізована вода - до загального об'єму реакційної суміші 20 мкл, 1 год. при 20 °C. Суміш інактивували прогріванням 10 хв. при 65 °C. В результаті отримали плазмідний вектор pET-SPA-CBD2. Нуклеотидну послідовність SPA-CBD2 перевіряли методом Сенгера з використанням автоматичного секвенатора ІВІ Prism 3130 ("Applied Biosystems", США). Приклад 4. Створення штаму-продуцента рекомбінантного білка SPA-CBD2 Компетентні клітини Е. соlі BL23(DE3) готували, використовуючи хлор-кальцієвий метод відповідно до стандартного протоколу, описаного (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis-2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1, p. 1.82-1.84). До 50 мкл суспензії компетентних клітин вносили 5 мкл (10 нг/мкл) експресуючого вектора pET-SPA-CBD2 і інкубували 10 хв. на льоду. По завершенню суміш інкубували на водяній бані при 42 °C протягом 2 хв., додавали 1 мл середовища 2YT (17 г/л бактотриптону; 10 г/л дріжджового екстракту; 5 г/л NaCl), інкубували 1 год. при 37 °C при постійному перемішуванні і висівали на агаризоване середовище 2YT, що містило 1 % глюкози і 50 мкг/мл канаміцину (2YT-KG). Індивідуальні колонії нарощували на середовищі 2YT-KG і використовували для створення музею культури штаму-продуцента рекомбінантного білка SPACBD2 відповідно до стандартного методу (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis-2-nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989, V.3, p. A5). В результаті було одержано штам-продуцент модифікованого генноінженерного білка SPA-CBD2. Приклад 5. Спосіб одержання модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 синтезом в бактеріях Е. соlі Для одержання SPA-CBD2 використовували штам Е. соlі BL21(DE3)-SPA-CBD2, трансформований плазмідою pET-SPA-CBD2, яка має канаміцин як маркер для селекції. Плазміда забезпечує індукований аналогами лактози синтез цільового білка, який накопичується в цитоплазмі клітин бактерій в ранній стаціонарній фазі росту культури. Культивування бактерій проводили у колбах об'ємом 1 л при 37 °C на середовищі 2xYT (17 г/л бактотриптону; 10 г/л дріжджового екстракту; 5 г/л NaCl), яке містило 50 мкг/мл канаміцину, 25 мМ (NH4)2SO4, 50 мМ KН2РО4, 50 мМ Na2HPO4, 1 мМ MgSO4, 0,05 % глюкозу, 0,2 % а-лактозу, 0,5 % гліцерол, протягом 16-24 годин в умовах інтенсивної аерації при постійному перемішуванні. Після закінчення культивування клітини осаджували центрифугуванням при 4000 g 10 хвилин при 4 °C, над осадову рідину видаляли, а осад суспендували в 10 мМ буфері Тріс-НСl, рН 8 (10 мл буферу на 1 г клітинного осаду), який містив 1 мг/мл лізоциму і 50 мкг/мл ДНК-ази і інкубували 20 хвилин за кімнатної температури. Суспензію клітин обробляли ультразвуком на ультразвуковому дезінтеграторі і центрифугували 15 хвилин при 10000 g. Супернатант та осад використовували для подальшого аналізу методом електрофоретичного розділення в поліакриламідному гелі (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis-2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V. 3 p. 18.49-18.57). Для приготування проб білків використовували розведений у 6 разів концентрат буфер складу: 0,3 М тріс-НСl; 25 % гліцерин; 3,5 % додецилсульфат натрію; 0,2 М дитіоеритроїтол, 0,5 % бромфеноловий синій рН (6,8). Електрофорез білків проводили за методом U. Laemmli (Westermeier R. Electrophoresis in practice: a guide to methods and applications of DNA and protein separations. - Weinheim: VCH, 1997. - P. 331), використовуючи для їхнього розділення 12-15 %-й поліакриламідний гель з 0,1 % додецилсульфату натрію. Кількість сумарного білка у різних фракціях клітин визначали методом М. Bradford (Дарбре А. Практическая химия белка: Пер. с англ. -М: Мир, 1989.-623 с, - С. 297-298). Рівень експресії SPA-CBD2 штамом-продуцентом визначали за допомогою сканування і денситометрії електрофореграм, використовуючи як стандарт БСА з відомою концентрацією для одержання калібрувальної кривої. Представлена на фіг. 8 електрофореграма показує суперсинтез рекомбінантного білка SPA-CBD2 бактеріальним штамом-продуцентом і його накопичення у розчинній фракції білків клітин. В результаті було отримано модифікований генно-інженерний білок SPA-CBD2 експресією в бактеріях Е. соlі. Запропонований авторами підхід дозволив підвищити вихід розчинного модифікованого генно-інженерного білка SPA-CBD2 у 80 разів порівняно з даними попередніх авторів (до -500 мг білка на 1 літр бактеріальної культури). 11 UA 102135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Приклад 6. Спосіб орієнтованої іммобілізації SPA на мікрокристалічній целюлозі СС31, який реалізується шляхом генетичного введення двох послідовностей CBD. Для іммобілізації SPA через два CBD було вибрано гранулярну мікрокристалічну целюлозу СС31. Приготування целюлози проводили шляхом її декантування - видалення мілких гранул. Для цього 10 г мікрокристалічної целюлози СС31 ресуспендували в 100 мл дистильованої води та залишали при кімнатній температурі для осідання гранул більшого розміру. Час осідання розраховували за формулою: Т=hхп, де h - висота стовпця рідини у циліндрі, n=0,7. Після проходження розрахованого часу, супернатант, що містив дрібні гранули целюлози видаляли та додавали наступні 100 мл дистильованої води. Декантування проводили до того часу, поки супернатант не став повністю прозорим. Для розриву водневих зв'язків, до целюлози додавали 0,5 н розчин NaOH, витримували в суспензії 30 хв. та промивали дистильованою водою до нейтрального значення рН. Декантовану мікрокристалічну целюлозу СС31 урівноважували буфером 20 мМ Тріс, 500 мМ NaCl 1 мМ ЕДТА, та інкубували з профільтрованим через 0.45 мкм білковий фільтр супернатантом, який містив модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 (приклад 5), протягом 1 години в умовах постійного перемішування при кімнатній температурі та осаджували центрифугуванням. Отриманий біоафінний сорбент (мікрокристалічна целюлоза СС31 з іммобілізованим через два CBD SPA) промивали від білків, які не зв'язалися з целюлозою три рази буфером 20 мМ Тріс, 500 мМ NaCl 1 мМ ЕДТА, один раз деіонізованою водою та зберігали при +4 °C у вигляді 50 % суспензії у 20 % етанолі. В результаті одержали біоафінний сорбент для очищення імуноглобулінів, який базується на іммобілізації через два CBD SPA на мікрокристалічній целюлозі СС31 (його схематичне зображення наведено на фіг. 9). Приклад 7. Використання біоафінного сорбенту з іммобілізованим модифікованим генноінженерним злитим білком SPA-CBD2 для очищення імуноглобулінів. Для очищення антитіл 1 мл біоафінного сорбенту упаковували в поліпропіленову колонку відповідного розміру та під'єднували її до автоматизованої хроматографічної системи FPLC. Урівноважували колонку 5 мл буфера 50 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl, pH 8,0. (PBS) та наносили 200 мкл попередньо розведених в 10 разів буфером PBS та профільтрованих через 0,45 мкм мембранний фільтр сироваток крові імунізованих кролів. Колонку промивали від білків, які не зв'язалися буфером PBS до виходу пера самописця FPLC на ізолінію. Елюцію очищених антитіл проводили буфером 0,1 М Гліцин, 0.5 М NaCl, рН 2,9. Елюйовані антитіла одразу ж нейтралізували 1/50 від об'єму елюату розчином 1 М Тріс/НСI рН 10,0, додавали гліцерол до кінцевої концентрації 50 % та зберігали при -20 °C. Нанесення та елюцію білків проводили при швидкості потоку 0,2 мл/хв. Урівноважували та промивали колонку при швидкості потоку 0,5 мл/хв. Кількість сумарного білка у різних фракціях білків, які були отримані в результаті хроматографічного процесу визначали методом М. Bradford (Дарбре А. Практическая химия белка: Пер. с англ. - М: Мир, 1989. -623 с., С. 297-298). Чистоту та концентрацію антитіл визначали за допомогою сканування і денситометрії електрофореграм, використовуючи як стандарт БСА з відомою концентрацією для одержання калібрувальної кривої. На фіг. 8 показано чистоту антитіл, одержаних при проведенні процесу їх очищення на біоафінному сорбенті. Кінцевий продукт - очищені антитіла - були представлені важкими та легкими ланцюгами імуноглобулінів молекулярною масою 55 кДа та 25 кДа відповідно, і був гомогенним при електрофорезі в ПААГ. Також не спостерігалося підтікання афінного сорбенту при кислих умовах елюції. В результаті отримано фракцію імуноглобулінів з чистотою понад 95 %. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 1. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2, продукований бактеріями Escherichia coli, який містить 657 амінокислотних залишків, має молекулярну масу 72 кДа, ізоелектричну точку РІ 4,98 і відповідає загальній формулі NH2-SPA-cпейcep-CBD-cпейcepCBD-COOH 12 UA 102135 C2 5 10 2. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 за п. 1, який відрізняється тим, що містить послідовність п'яти імуноглобулінзв'язувальних доменів (Е, D, А, В, С) білка A Staphylococcus aureus (SPA). 3. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 за п. 1, який відрізняється тим, що містить дві послідовності целюлозозв'язувального домена (CBD). 4. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 за п. 1, який відрізняється тим, що містить послідовність олігогістидинового пептиду із загальною формулою (His)n, де n дорівнює 3-10. 5. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 за п. 1, який відрізняється тим, що містить два гнучкі поліпептидні спейсери із загальною формулою "-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-GluGly3-": перший між SPA та CBD, другий між CBD та CBD. 6. ДНК розміром 1970 п.н., яка відповідає модифікованому генно-інженерному злитому білку SPA-CBD2 за будь-яким з пп. 1-5: 13 UA 102135 C2 5 . 7. ДНК за п. 6, яка відрізняється тим, що є вбудованою у плазмідний вектор для експресії в бактеріях Е. соlі. 8. Плазмідний експресуючий вектор pET-24SPA-CBD2, який містить послідовність ДНК, яка відповідає за експресію в Е. соlі модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, охарактеризованого в будь-якому з пп. 1-6: 14 UA 102135 C2 5 10 15 20 . 9. Штам Е. coli BL21SPA-CBD2 - продуцент модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що є трансформованим плазмідним експресуючим вектором за п. 8. 10. Спосіб одержання модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 за п. 1 синтезом в бактеріях Е. соlі, який включає культивування продуцента на середовищі, що містить лактозу, глюкозу, мінеральні солі та гліцерол; осадження бактеріальних клітин після завершення біосинтезу центрифугуванням, руйнування бактеріальних клітин і хромосомної ДНК на ультразвуковому дезінтеграторі в присутності лізоциму та ДНК-ази; осадження отриманого лізату центрифугуванням та виділення розчинної фракції білків клітини, яка і є джерелом модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2. 11. Спосіб орієнтованої іммобілізації модифікованого генно-інженерного злитого білка SPACBD2 за п. 1 на мікрокристалічній целюлозі СС31, який реалізується шляхом генетичного введення двох послідовностей CBD. 12. Використання біоафінного сорбенту з іммобілізованим модифікованим генно-інженерним злитим білком SPA-CBD2 за п. 1 для очищення імуноглобулінів із складних сумішей, що включає упаковку біоафінного сорбенту в хроматографічну колонку для FPLC, урівноваження сорбенту буфером PBS, нанесення на сорбент зразків, які містять імуноглобуліни, промивання сорбенту від неспецифічно зв'язаних білків буфером PBS та селективну елюцію зв'язаних імуноглобулінів гліциновим буфером з кислим значенням рН. 15 UA 102135 C2 16 UA 102135 C2 17 UA 102135 C2 18 UA 102135 C2 Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м.Київ – 42, 01601 19