Модифікований генно-інженерний злитий білок spa-cbd2, продукований бактеріями e. coli

1. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2, продукований бактеріями Escherichia coli, що містить 657 амінокислотних залишків, має молекулярну масу 72 кДа, ізоелектричну точку РІ 4,98 і відповідає загальній формулі NH2-SPA-спейсер-CBD- спейсер -CBD-COOH (13) U (21) u201109742 (22) 05.08.2011 (24) 10.02.2012 (46) 10.02.2012, Бюл.№ 3, 2012 р. (72) КОРДЮМ ВІТАЛІЙ АРНОЛЬДОВИЧ, ПАВЛОВА МАРИНА ВАЛЕРІЇВНА, ЦАПЕНКО МАРИНА ВІКТОРІВНА, ГОРБАТЮК ОКСАНА БОРИСІВНА ЗЛИТИЙ Корисна модель належить до розділу молекулярної біології, генної інженерії, медицини, біотехнології, хроматографії, а саме - до модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 який може бути використаний в біотехнології як біоліганд для афінної хроматографії. SPA - поверхневий білок S.aureus молекулярною масою 42 кДа, який складається із трьох фун кціональних частин: сигнального пептиду; 5 високогомологічних імуноглобулінзв'язувальних доменів (Е, D, А, В, С); та гідрофобної амінокислотної послідовності, яка забезпечує заякірування білка А в клітинній стінці бактерії [L. Abrahsmen, Т. Moks, В. Nilsson, U. Hellman, Μ. Uhlen, Embo J. 4, 3901, 1985.; T. Mob, L. Abrahsmen, B. Nilsson, U. Hellman, J. Sjoquist, M. Uhlen, Eur.J. Biochem. 156, 637, (11) 4. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 за п. 1, який відрізняється тим, що містить послідовність олігогістидинового пептиду із загальною формулою (His)n, де n дорівнює 3-10. 5. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 за п. 1, який відрізняється тим, що містить два гнучкі поліпептидні спейсери із загальною формулою "-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-Glu-Gly3-": перший між SPA та CBD, другий між CBD та CBD. (19) UA 2. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 за п. 1, який відрізняється тим, що він містить послідовність п'яти імуноглобулінзв'язувальних доменів (Е, D, А, В, С) білка А Staphylococcus aureus (SPA). 3. Модифікований генно-інженерний злитий білок SPA-CBD2 за п. 1, який відрізняється тим, що містить дві послідовності целюлозозв'язувального домена (CBD). 67302 . 3 1986]. Біологічна роль SPA полягає в тому, що за рахунок притаманної йому імуноглобулінзв'язувальної активності, забезпечується захисний панцир з IgG на поверхні S.aureus, що блокує розпізнавання бактерії Fc-рецепторами на поверхні нейтрофілів та перешкоджає подальшому фагоцитозу [Foster, T.J., Immune evasion by staphylococci // Nat. Rev. Microbiol. vol. 3, 2005. P. 948-958]. Крім цього, IgG зв'язані з SPA інгібують класичний шлях фіксації комплементу. В природі SPA представлений двома формами: секреторною і мембранозв'язаною, які володіють спорідненістю до різних ділянок молекул імуноглобулінів. Крім того, що кожен домен SPA може зв'язуватись з Fc-фрагментами антитіл (константна ділянка антитіла, яка відповідає за ефекторні функції), SPA володіє спорідненістю до Fabфрагментів антитіл, які відповідають за розпізнавання антигену. Завдяки здатності зв'язувати Fabфрагменти, SPA відіграє роль суперантигену для В-клітин імунної системи, індукуючи цим проліферацію та наступне виснаження популяції В-клітин [Silverman, G.J., Goodyear, C.S., Siegel, D.L.,. On the mechanism of staphylococcal protein A immunomodulation. Transfusion 45, 274-280, 2005]. Головну роль у зв'язуванні SPA з Fabфрагментами IgM людини відіграє домен D [Marc Graille, Enrico A. Stura, Adam L. Corper Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of an human IgM antibody: Structural basis for recognition ofB-cell receptors and superantigen activity // PNAS, vol. 97, no 10, 2000, 5399-5404]. SPA класифікують як IgG-Fc рецептор І типу, який містить LPXTG мотив, який забезпечує заякорювання білка в бактеріальній мембрані (Schneewind, О., Fowler, Α., Fault, K.F., Structure of the cell wall anchor of surface proteins in Staphylococcus aureus // Science vol. 268, 1995, P. 103-106). Імуноглобулінзв'язувальні домени SPA беруть участь у формуванні трьох антипаралельних αспіралей, стабілізованих за рахунок гідрофобних взаємодій. Кожен із доменів SPA складається з 58 амінокислотних залишків і здатний до зв'язування з Fc-фрагментами IgG1, IgG2, IgG4 людини з конс8 -1 тантою афінності 10 (М ), що дозволяє використовувати SPA для виділення таких антитіл із складних біологічних сумішей. Варто враховувати, що SPA володіє низькою спорідненість щодо IgG3 підкласу антитіл людини [LJenderberg, P. Nilsson, A. Larsson, P. Denker, Μ. Uhlen, В. Nilsson, P.A. Nygren J. Immunol. Metods 201, 25, 1997]. Здатність SPA взаємодіяти з антитілами в такий спосіб, що їх антигензв'язувальні сайти залишаються вільними, робить його привабливим для діагностики (кон'югати з ферментами), терапії (імуносорбція аутоантитіл та циркулюючих імунних комплексів з плазми крові хворих на аутоімунні захворювання) та як ліганд для хроматографічного очищення антитіл [Tashiro, Μ., Montelione, G.Т. Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 1995, P. 471-481; Partha Sarathi Chomdhury, Ashima Kushwaha, Smita Abrol, Vijay K. Chaudhary An expression system for secretion and purification of a genetically engineered 67302 4 thermostable chimera of protein A and alkaline phosphatase Protein expression and purification 5, 89-95, 1994 // ProteinExpr. Purif. - 1994. - 5. - P. 8995]. CBD виділений зі специфічного білкового комплексу - целюлосоми термофільної бактерії Clostridium thermocellum [Morag E., Lapidot Α., Govorko D., Lamed R., Wilchek M., Bayer E.A., Shoham Y. Expression, purification, and characterization of the cellulose-binding domain of the scaffoldin subunit from the cellulosome of Clostridium thermocellum II Appl. Envir. Microbiol. - 1995. - Vol. 61, №5. - P. 1980-1986]. Целюлосома вперше була описана як мультиферментний комплекс Clostridium thermocellum, що відповідає за ефективну деградацію целюлозного субстрату. Важливим її компонентом є відносно великий білок (210 кДа) - мультифункціональна некаталітична субодиниця, яку позначають S1. Основна функція цього компоненту організація каталітичної субодиниці (целюлозолітичної частини) у здатний до зв'язування з целюлозою комплекс. Власне CBD є безпосередньо асоційований з S1-субодиницею. Особливістю CBD є здатність утворювати стабільний комплекс з вуглеводним остовом целюлози в нативних та денатурувальних умовах (8 М сечовини або 6 М Гуанідин-гідрохлориду) та зберігати целюлозозв'язувальні властивості при утворенні генно-інженерних кон'югатів з білкамипартнерами. Останнє дає можливість використовувати CBD як адапторний білок для іммобілізації на целюлозі. Дослідження структурних особливостей CBD показали, що N-кінцева ділянка його молекули, яка забезпечує зв'язування з білком партнером і сайт зв'язування з вуглеводним остовом целюлози просторово віддалені. Таке розміщення активних центрів забезпечує максимально вигідну орієнтацію зв'язаного на матриці білка для взаємодії з лігандом. При необхідності, білок-партнер може бути відокремлений від CBD шляхом протеолітичної деградації та хроматографічного розділення. Відомо отримання генно-інженерного білка CBD-SPA в розчинному стані експресією в Е.соlі ("Білки злиті з целюлозозв'язувальним доменом", патент США №5,837,814, 17.11.1998, МПК С07К 1400; С07К 113). Однак рівень експресії CBD-SPA, 6 мг/л бактеріальної культури, є недостатнім для його подальшого використання в біотехнології. Крім того, описаний білок CBD-SPA не містить олігогістидинового пептиду із загальною формулою (His)n, де n дорівнює 3-10, що дозволяє проводити його хроматографічного очищення. Авторами під час проведення патентноінформаційних досліджень і підготовки заявки не виявлено модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2, продукованого бактеріями Е.соlі. В основу пропонованої корисної моделі поставлено задачу створення модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2, продукованого бактеріями Е.соlі. Поставлена задача вирішується пропонованим модифікованим генно-інженерним злитим білком SPA-CBD2, продукованим бактеріями Е.соlі, 5 який містить 657 амінокислотних залишків, має молекулярну масу 72 кДа, ізоелектричну точку РІ 67302 6 4,98, відповідає загальній формулі NH2-SPAcпейcep-CBD-cпейcep-CBD-COOH . Особливістю модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2 є те, що він містить послідовність п'яти імуноглобулінзв'язувальних доменів (Е, D, А, В, С) білка А Staphylococcus aureus (SPA). Особливістю модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2 є те, що він містить дві послідовності целюлозозв'язувального домена (CBD). Особливістю модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2 є те, що він містить послідовність олігогістидинового пептиду загальної формули (His)n, де n складає від трьох до десяти. Особливістю модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2 є те, що він містить два гнучкі поліпептидні спейсери із загальною формулою ''-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-Glu-Gly3-'': перший між SPA та CBD, другий між CBD та CBD. Особливостями пропонованого модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2 є наявність таких функціональних модулів як поверхневий білок A S.aureus (SPA), який здатний до специфічної взаємодії з константними (Fc) доменами імуноглобулінів та двох целюлозозв'язувальних доменів з целюлозолітичного комплексу Clostridium thermocellum (Cellulose binding domain, CBD), який володіє афінністю до целюлози та хітину. Два CBD та SPA з'єднані між собою за допомогою 13 амінокислотного спейсера у заданій орієнтації. Роль спейсера полягає у просторовому розділенні афінних центрів модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2, та забезпечення оптимального представлення SPA для взаємодії з імуноглобулінами, а CBD - з целюлозою. Крім того, два CBD забезпечують формування стабільнішого комплексу з целюлозою, ніж у випадку одного CBD, що дозволяє розширити діапазон умов роботи з біоафінним сорбентом, який може бути створений на основі модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2. Суть корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де: на Фіг.1 показана амінокислотна послідовність рекомбінантного злитого білка SPA-CBD2, 657 амінокислотних залишків, молекулярна маса якого 72 кДа. РІ=4,98 - ізоелектрична точка злитого рекомбінантного білка; на Фіг.2 - показана послідовність ДНК рекомбінантного злитого білка SPA-CBD2, 1970 п.н.; на Фіг.3 - показана послідовність олігонуклеотидних праймерів із сайтами унікальних рестриктаз для ампліфікації ДНК білка SPA із хромосомної ДНК і клонування в плазмідному векторі; на Фіг.4, 5 - показана послідовність олігонуклеотидних праймерів із сайтами унікальних рестриктаз для ампліфікації ДНК CBD з плазміди pCBD; на Фіг.6 - схема розміщення елементів експресійної касети SPA-CBD2 у векторі рЕТ-24. Пропонована корисна модель вирішує проблеми відомого рівня техніки і забезпечує джерело рекомбінантного білка, який зберігає притаманні нативним білкам-партнерам (SPA та CBD) сайти зв'язування, у разі використання технологій рекомбінантних ДНК. Послідовності ДНК CBD та SPA є загальнодоступними з банку генів (CBD-Gen-Bank Accession №Х68233, SPA-Gen-Bank Accession №EU695225.1) і можуть бути клоновані у плазмідному експресійному векторі. У відповідності до пропонованої корисної моделі для одержання ДНК модифікованого генноінженерного злитого білка SPA-CBD2 використовували модифіковану методику клонування ДНК, що передбачає раціональний дизайн молекули білка SPA-CBD2, розробку способу ампліфікації цільової ДНК і вбудовування в плазмідний вектор для експресії в бактеріях. Як вихідний матеріал для одержання ДНК SPA (яка є необхідною для одержання модифікованого генно-інженерного злитого білка SPA-CBD2) використовували хромосомну ДНК бактерії S.aureus, CBD-pCBD люб'язно надану для досліджень професором Y. Shoham (Ізраїль). Відповідно до корисної моделі ампліфікацію дволанцюгової ДНК здійснювали методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням спеціально розроблених для даної процедури ДНКпраймерів, що дозволило клонувати усі п'ять імуноглобулінзв'язувальних доменів SPA. Праймери для ампліфікації вводили до складу ДНК SPA унікальні фланкуючі сайти ендонуклеаз 7 рестрикції Ndel і NotI для вбудовування в плазмідний експресуючий вектор. Це може бути визначено з використанням стандартних методик для аналізу послідовностей ДНК спеціалістами даної галузі. Послідовності праймерів наведено на Фіг.3. Одержані в результаті полімеразної ланцюгової реакції фрагменти дволанцюгової ДНК розділяли електрофорезом в агарозному гелі і оцінювали порівнюючи з маркером молекулярної маси ДНК. Ампліфіковані фрагменти ДНК мали розмір 880 п.н., що відповідає амінокислотній послідовності п'яти доменів SPA. Сиквенування даної послідовності ДНК показало, що вона відповідає послідовності SPA, одержаній з бази даних NCBI. ПЛР-ампліфікацію послідовностей CBD проводили з використанням спеціально розрахованих для даної процедури двох пар специфічних праймерів: перша пара вводить до складу ДНК одного CBD послідовність спейсера ''-Gly3-Ser-Glu-Gly3Ser-Glu-Gly3-'', a також унікальні сайти ендонуклеаз рестрикції NotI, BamHI на 5'-кінці і Xhol на 3'кінці; друга пара вводить до складу другого CBD послідовність спейсера ''-Gly3-Ser-Glu-Gly3-SerGlu-Gly3-'', а також фланкуючі послідовності ендонуклеаз рестрикції NotI на 5'-кінці і BamHI 3'-кінці. Це дозволило послідовно ввести до плазмідного вектора pGEM-11 ДНК два домени CBD з одержанням pGEM-11 (CBD2). Як матрицю використовували плазміду pCBD. Одержані в результаті полімеразної ланцюгової реакції фрагменти дволанцюгової ДНК розділяли електрофорезом в агарозному гелі і оцінювали, порівнюючи з маркером молекулярної маси ДНК. Ампліфіковані фрагменти ДНК мали розмір 534 п.н. що відповідає амінокислотній послідовності CBD. Послідовності праймерів наведено на Фіг.4., Фіг.5. Очищений продукт ПЛР, а саме ДНК, що кодує SPA, а також pGEM-11 (CBD2) гідролізували відповідними рестриктазами і використовували для клонування у плазмідний експресуючий вектор рЕТ-24, який містив нуклеотидну послідовність афінної мітки 6His-tag, та отримували результуючий плазмідний вектор pET-24-SPA-CBD2, який забезпечував одержання SPA-CBD2 в бактеріях Е.соlі (Фіг.6). Приклад 1 Одержання ДНК, яка кодує тандем CBD-CBD ПЛР-ампліфікацію послідовностей CBD проводили з використанням двох пар специфічних праймерів (Фіг.4, Фіг.5). Перша пара вводить до складу ДНК одного CBD послідовність спейсера, а також унікальні сайти ендонуклеаз рестрикції NotI, BamHI на 5'-кінці і Xhol на 3'-кінці - ПЛР продукт 1. Друга пара вводить до складу іншого CBD послідовність спейсера ''-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-GluGly3-'', а також фланкуючі послідовності ендонуклеаз рестрикції NotI на 5'-кінці і BamHI 3'-кінці ПЛР продукт 2. Для ПЛР готували наступні суміші: (1) плазмідна ДНК (pCBD) - 5 мкл, 10-ти кратний концентрат буферу для ПЛР - 5 мкл, праймер 1 (20 гасМ) - 1 мкл, праймер 2 (20 пкМ) - 1 мкл, (Tag ДНКполімераза - 5 одиниць активності, 2 мМ dNTP - 5 млк, 25 MgCІ2 - 4 мкл, стерильна деіонізована вода - до загального об'єму реакційної суміші 50 мкл; (2) 67302 8 плазмідна ДНК (pCBD) - 5 мкл, 10-ти кратний концентрат буферу для ПЛР - 5 мкл, праймер 3 (20 пкМ) - 1 мкл, праймер 4 (20 пкМ) - 1 мкл, (Tag ДНКполімераза - 5 одиниць активності, 2 мМ dNTP - 5 млк, 25 MgCІ2 - 4 мкл, стерильна деіонізована вода - до загального об'єму реакційної суміші 50 мкл. Для ампліфікації ДНК проби використовували термоцикл ер, що програмується. ПЛР проводили за наступних умов: денатурація - 95 °C 30 сек., віджиг праймерів - 60 °C 1 хв., елонгація - 72 °C 1 хв. загалом 30 циклів ампліфікації. По завершенню інкубували 10 хв. при 72 °C. Одержані в результаті полімеразної ланцюгової реакції фрагменти дволанцюгової ДНК розділяли електрофорезом в 1 % агарозному гелі з наступним фарбуванням бромідом етидію і візуалізацією при 312 нм у вигляді дискретної полоси 534 п.н. та оцінкою у порівнянні з маркером молекулярної маси ДНК. Ампліфіковані фрагменти ДНК мали розмір 534 п.н. що відповідає амінокислотній послідовності спейсера ''Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-Glu-Gly3-CBD". Одержаний ПЛР-продукт 1 гідролізували NotI та Xhol. Для цього очищену за стандартною методикою ДНК (1 мкг) вносили в стерильну мікроцентрифужну пробірку і додавали 10-ти кратний конце+ + нтрат буфера (О -буфер для NotI, R -буфер для Xhol) виробництва "Fermantas" (Литва) - 5 мкл, рестриктази NotI ("Fermantas") - 2 мкл, рестриктази Xhol - 2 мкл, стерильної деіонізованої води - до загального об'єму реакційної суміші 50 мкл і інкубували на водяній бані 2 год. при 37 °C, після чого ДНК очищували та визначали концентрацію за стандартними методиками (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis - 2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1, p. 1.82-1.84) і використовували для лігування з ДНК-вектором pGEM-HZf (Promega), гідролізованого тими ж самими рестриктазами за вищенаведеною схемою. Для проведення лігування використовували очищені фрагменти ДНК CBD 534 п.н. (50 нг) і вектора (150 нг). Для цього збирали наступну суміш: фрагмент ДНК - 5 мкл, вектор - 10 мкл, 10-ти кратний концентрат буфера для лігування ДНК виробництва Fermantas-2 мкл, Т4 ДНК-лігаза (5 од/мкл) виробництва Fermantas-1 мкл, стерильна деіонізована вода - до загального об'єму реакційної суміші 20 мкл, 1 год. при 20 °C. Суміш інактивували прогріванням 10 хв. при 65 °C. В результаті отримали плазмідний вектор pGEM-11Zf (CBD). Одержану ДНК pGEM-11Zf (CBD) осаджували додаванням 100 мкл 96 % етанолу і 5 мкл 5 М ацетату калію з наступним центрифугуванням 5 хв. при 16 000g, розчиняли в 10 мкл стерильної деіонізованої води. Одержаний ПЛР-продукт 2 гідролізували NotI та ВаmНІ за методикою, описаною вище, але з використанням Original BamHI-буфер для рестриктази ВаmНІ. Після інкубування на водяній бані протягом 2 год. при 37 °C ДНК очищували та визначали концентрацію за стандартними методиками (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis - 2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1, p. 1.82-1.84) і використовували для лігування з ДНК-вектором pGEM-11Zf(CBD), 9 гідролізованого тими ж самими рестриктазами з одержанням плазміди pGEM-11Zf (CBD2) за схемою, описаною вище. Одержану плазміду pGEM-11Zf (CBD2) гідролізували NotI та Xhol. Для цього очищену за стандартною методикою (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis - 2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1, p. 1.82-1.84). ДНК (1 мкг) вносили в стерильну мікроцентрифужну пробірку і + додавали 10-ти кратний концентрат буфера (О + буфер для NotI, R -буфер для Xhol) виробництва "Fermantas" - 5 мкл, рестриктази NotI ("Fermantas") - 2 мкл, рестриктази Xhol - 2 мкл, стерильної деіонізованої води - до загального об'єму реакційної суміші 50 мкл і інкубували на водяній бані 2 год. при 37 °C, після чого ДНК очищували та визначали концентрацію за стандартними методиками (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis - 2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1, p. 1.82-1.84) і використовували для лігування з ДНК-вектором рЕТ24, гідролізованого тими ж самими рестриктазами за вищенаведеною схемою отримуючи результуючу плазміду pET-24CBD2. Методом електрофорезу в 1 %-му агарозному гелі з наступним фарбуванням бромідом етидію і візуалізацією при 312 нм було підтверджено наявність дискретної полоси 1064 п.н., яка відповідає ДНК тандему CBD-CBD, що було також підтверджено сиквенуванням. Приклад 2 Одержання дволанцюгової ДНК, яка кодує SPA Для одержання ДНК, що кодує SPA проводили полімеразно-ланцюгову реакцію з використанням олігонуклеотидних праймерів, які вводили до складу ДНК SPA фланкуючі сайти рестрикції Ndel і Notl. Послідовності праймерів приведено на Фіг.3. Як матрицю використовували хромосомну ДНК бактерії Staphylococcus aureus. Для ПЛР готували наступну суміш (у розрахунку на 1 реакцію): 10кратний концентрат Pfu-буферу для ПЛР - 5 мкл, 25мМ MgSO4-4 мкл, 25 мМ dNTP - 0,4 мкл, праймер 1 (20пкм) - 1,5 мкл, праймер asnSPA-1,5 мкл, 67302 10 Pfu-полімераза - 1 мкл, матриця (суспендовані в деіонізованій воді) - 2 мкл, вільна від ДНК деіонізована вода - до загального об'єму реакційної суміші 50 мкл. Для ампліфікації ДНК використовували термоциклер, що програмується. ПЛР проводили за наступних умов: денатурація - 95 °C 30 сек., віджиг праймерів - 55 °C 30 сек., елонгація - 72 °C 2 хв., загалом 30 циклів ампліфікації. Продукт ампліфікації виявлявся електрофорезом в 1 % агарозному гелі з наступним фарбуванням бромідом етидію та візуалізацією при 312 нм у вигляді дискретної смуги, яка відповідала розміру ДНК 880 п.н. В результаті з хромосомної ДНК Staphylococcus aureus було ампліфіковано дволанцюгову ДНК, яка кодує SPA. Приклад 3 Конструювання експресуючого вектора pSPACBD2 Одержаний ПЛР-продукт (SPA) гідролізували Ndel та Notl з використанням 10-тикратного буфе+ ра (О -буфер, "Fermentas") за методикою, описаною вище. Після інкубування на водяній бані протягом 2 год. при 37 °C ДНК очищували та визначавизначали її концентрацію за стандартними методиками (Sambrook, Joseph Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fitsch, T. Maniatis - 2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 V.1, p. 1.82-1.84) і використовували для лігування з ДНК-вектором pET-24-CBD2, гідролізованого тими ж самими рестриктазами. Для цього очищений фрагмент ДНК SPA розміром 880 п.н. (60 нг) і вектор pET-24-CBD2 (180 нг) об'єднували у реакції лігування: фрагмент ДНК - 5 мкл, вектор - 10 мкл, 10-ти кратний концентрат буфера для лігування ДНК виробництва Fermantas-2 мкл, Т4 ДНК-лігаза (5 од/мкл) виробництва Fermantas-1 мкл, стерильна деіонізована вода - до загального об'єму реакційної суміші 20 мкл, 1 год. при 20 °C. Суміш інактивували прогріванням 10 хв при 65 °C. В результаті отримали плазмідний вектор pETSPA-CBD2. Нуклеотидну послідовність SPA-CBD2 перевіряли методом Сенгера з використанням автоматичного секвенатора ІВІ Prism 3130 ("Applied Biosystems", США). 11 67302 12 13 Комп’ютерна верстка А. Рябко 67302 Підписне 14 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601