Спосіб модифікуванння заміщення 4-о-метилглюкуронової кислоти та/або глюкуронової кислоти ксилану в рослині

Реферат: Винахід належить до способу модифікування заміщення 4-O-метилглюкуронової кислоти та/або глюкуронової кислоти ксилану в рослині, що включає змінювання експресії ксиланглюкуронілтрансферази (XGAT) у вказаній рослині, де ксиланглюкоронілтрансфераза (XGAT) є At4g33330 та At3g18660 або їх ортологами. Винахід належить також до трансформованої рослинної клітини, що містить ксиланову структуру з патерном заміщення 4O-метилглюкуронової кислоти (MeGlcA) та/або глюкуронової кислоти компонента бічного ланцюга та незмінну кількість ксилану у порівнянні з рослинами дикого типу того самого виду. UA 104575 C2 (12) UA 104575 C2 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Область винаходу Представлений винахід розглядає методи скринінгу зміненого ксилану з компонентами заміщення в бічному ланцюзі сахаридного комплексу, ферментативної активності по заміщенню видозміненого бічного ланцюга сахариду ксилану та/або моделювання в матеріалі рослинних клітин, модифікованого матеріалу рослинних клітин і методів отримання модифікованих ксиланів у матеріалі рослинних клітин. Власне, винахід розглядає методи скринінгу ферментативної активності по заміщенню бічного ланцюгу сахариду модифікованого ксилану в рослинах, модифікованого матеріалу клітин рослин, який включає молекули ксилану, що містять змінений бічний ланцюг 4-0-метилглюкуронової кислоти та/або глюкуронової кислоти, в якій змінена активність ферментів глюкуронилтрансферази ксилану, методи виробництва модифікованих кcиланів присутніх у матеріалі рослинної клітини, генетичного матеріалу необхідного для цього, власне ДНК і РНК, векторів, клітин-господаря, методи введення генетичного матеріалу в рослинні клітини, а також використання зазначеного. Передумови винаходу Для цілей даного представленого тут винаходу "глюкуронова кислота" и "4-O-метилглюкуронова кислота" надалі позначаються відповідно "GlcA" і "MeGlcA". Термін "[Me]GlcA" у даній роботі застосовують як колективний іменник для позначення як GlcA, так і MeGlcA. Нативний ксилан являється гемицелюлозою, часто міжмолекулярно зв’язаний із лингіном через бічні ланцюги [Ме]GlcA (наприклад, Балакшин та інші, 2007, Holzforschung, 61, 1-7). Нативний ксилан також тісно пов’язаний із мікрофібрилами целюлози. Нативний ксилан являється цінним матеріалом у деяких галузях промисловості, але його отримання ускладнено низкою ковалентних і нековалентних хімічних зв’язків із іншими компонентами стінки клітини, наприклад, зв’язками з [Ме]GlcA. Як правило, щоб розірвати зв’язки бічного ланцюга, що дозволяє витягувати ксилан, серед іншого, використовують ферменти і хімічні речовини. В основному, процеси витягування являються затратними та призводять до утворення небажаних побічних продуктів. Ферментативні методи також використовують для деполімеризації целюлози до розчинної гексози та пентозних цукрів. Деполімеризація (відома у технології також як "оцукрювання") ксилану потребує великої кількості ферментів, щоб зруйнувати зв’язки основного та бічного ланцюгів. Деякі продукти ферментативної обробки не можуть бути використані для зруйнування зв’язків основного та бічного ланцюгів. Деякі продукти ферментативної обробки не можуть використовуватись багатьма мікроорганізмами, які застосовують у ферментації або біотехнологіях для виробництва рідкого палива для транспорту, наприклад етанолу та бутанолу. Видобутий природний ксилан використовують, між іншим, для виробництва паперу, а рослинний матеріал із вмістом модифікованого ксилану потенційно придатний для використання, серед іншого, у виробництві цукру й опосередковано у виробництві рідкого палива для транспорту, наприклад етанолу через бродіння цукру. Целюлозні волокна, що використовуються, серед іншого, у папері й інших матеріалах, зазнають пошкоджень у процесі витягування ксилану й інших гемицелюлоз із волокон. У попередній технології немає вказівок на чітку роль ферментів, модифікуючих бічний ланцюг сахариду в ксилані, наприклад ферментів XGAT, яку вони відіграють у структурі вторинної стінки клітини, а також відсутнє чітке пояснення їх функції. Brown D.M. et al The Plant Cell, Vol. 17, 2281-2295, 5 August 2005 описують дослідження, яке стосується мутанту рослин Arabidopsis thaliana, що містить включення так званого глікозил трансфераза 8-подібного гену, визначений як At3g18660, і можливо такий, що відповідає за слабке стебло рослини, особливість, яку вважали характерною для відомих мутантів вторинної стінки клітини. Однак, у роботі Brown D.M. et al відсутнє пояснення функції At3g18660 і ролі, яку він відіграє в синтезі вторинної стінки клітини. Насправді, у роботі немає опису At3g18660 як глюкуронилтрансферази кcилану і немає вказівок на можливість промислового використання At3g18660. Pena M.J. et al The Plant Cell, Vol.19:549-563, February 2007 описують дослідження мутанту рослин Arabidopsis thaliana в яких відмічається присутність "wood-associated GTs" (GT гени, що асоціюються з деревиною), наприклад IRX8. Головним чином, у роботі розглядають гени IRX8 і IRX9 та їх вплив на хімічний склад і структуру глюкороноксилану. Гени At4g33330 і At3g18660 Arabidopsis thaliana згадуються тут як гомологи (зазначених) "асоційованих із деревиною GT генів", але це й все, що говорять про них автори Pena M.J. et al. Zhong R. et al The Plant Cell Vol. 17, 3390-3408, December 2005 описують дослідження, серед інших і такі, що стосуються мутанту рослин Arabidopsis thaliana Fragile Fiber 8, який, на думку авторів, кодує глюкуронил трансферазу, учасника синтезу вторинної стінки. Zhong R et al 1 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відзначають відсутність компоненту ксилану GlcA. При цьому не зазначено, що загальний рівень заміщення [Me]GlcA не змінюється. Дані, представлені Zhong R et al, вказують, що їм не вдалося визначити, чи змінювався загальний рівень заміщення [Me]GlcA. У диких рослинах, ксилоза в ксилані на 7% заміщується MeGlcA і на 3% GlcA; в загальному 10%. Таким чином, загальна частина заміщення ксилози не відрізняється в диких рослинах. Модель загального заміщення на відміну від структур нового ксилану, отриманих із використанням генів XGAT, в яких абсолютний рівень заміщення [Me]GlcA на ксиланах, отриманих із використанням At4g33330 і/або At3g18660 може змінюватись залежно від рівня експресії або рівня сайленсингу (пригнічення) гену. Обидва процеси можуть бути згенерованими. Короткий огляд винаходу Рослини, отримані за методикою винаходу, містять кcилани з новою композицією [Me]GlcA, яка представляє собою сукупність MeGlcA та MeGlcA і відрізняється від такої композиції в диких рослинах або мутантах рослин, відомих науці. Більш того, рослини, які містять модифіковані кcилани, отримані за методикою даного винаходу, більше відповідатимуть цілям кінцевого застосування, як наприклад, отримання целюлози для виробництва паперу; кормів для травоїдних тварин, у тому числі свійських; продуктів харчування для людини з покращеною клітковиною; такі рослини можна використовувати в якості біомаси для виробництва рідкого палива; а також витягування потрібних вам продуктів рослини, наприклад цукрів, які можна легко модифікувати до цукрів здатних до бродіння, оскільки витягування рослинних продуктів видається більш простим порівняно з методами витягування, які застосовують для традиційних рослин. Ці та інші переваги винаходу, що включає модифіковані ксилани, стануть більш очевидними з подальшого опису і прикладів. У відповідності з даним винаходом отримуємо трансформовану рослинну клітину з ксиланом, у структурі якого для ненативної частини сахариду з компонентом заміщення бічного ланцюгу, таким компонентом являється [Me]GlcA. Також область дії винаходу передбачає трансформовані рослини, трансформовані частини рослини, або трансформовані рослинні клітини, які можна одержати із трансформованої тканини рослини, наприклад, трансформованого каллюса, трансформованої соматичної зав'язі, трансформованих до-ембріогенних мас, трансформованої кореневої верхівки культур і т.п. «Ненативний» у контексті даного винаходу означає, що структура ксилану має модифікований сахарид з компонентом заміщення бічного ланцюгу, таким як [Me]GlcA, який не зустрічається або не встановлено, що зустрічається в нативній рослині того ж виду, що і компонент трансформованої рослинної клітини або трансформованої рослини. Термін «ненативний» застосовують для мутантних рослин відомих науці, іншими словами мутантної рослини того ж виду, трансформацію якого проводили без використання відомих у молекулярній біології, а особливо у молекулярній біології рослин класичних методів вставки або видалення ДНК або РНК. У такому сенсі, значення терміну «ненативний» подібне до того, що було зазначене для трансформованої рослини (дивись вище). Таким чином, під відомим науці мутантом рослини, розуміють мутанти, що зустрічаються у природі, а також мутанти, отримані з використанням етилметансульфонату (ЕМС), або фізичних методів, наприклад гама опромінення, в яких зазвичай не застосовують відомі науці технології вставки та видалення ДНК або РНК. Мутантні рослини можна розпізнати, наприклад, за допомогою технологій направленого введення індукованих локальних пошкоджень у геном ("TILLING"), як представлено у роботі Colbert et al Plant Physiol, June 2001, Vol 5 126, pp. 480-484. Для технології TILLING отримують ДНК популяцій рослин, які мають випадкову точку мутацій, що може бути результатом природних змін або штучно викликану впливом людини. Шляхом вибіркового групування зразків ДНК і їхньої зміни маркованими праймерами, одержують незв'язані гетеродуплекси між нитками дикої ДНК і ДНК мутанту. Після чого, гетеродуплекси можна інкубувати з ендонуклеазою, що має здатність розщеплювати гетеродуплекс у місцях неузгодженості й одержувані в результаті продукти визначають, наприклад, у гелі-секвенування. Аналізуючи дані, можна визначити рослини, які дають притулок мутаціям у генах, які, як відомо, беруть участь у схемі заміщення сахариду на ксиланах або передбачається, що вони залучені в таку активність. Надалі, з використанням описаних тут методів, можна вивчити схеми заміщення сахариду на ксиланах таких рослин. Переважно, трансформовані рослинні клітини отримують там, де ненативний компонент заміщення сахаридної частини бічного ланцюгу становить до 50% на каркасі ксилозних залишків структури ксилану. Можна зауважити як такі компоненти сахаридного бічного ланцюгу, наприклад бічні ланцюги GlcA і MeGlcA ксилану в рослинах даного винаходу заміщують каркас 2 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ксилозних залишків у співвідношенні, що відрізняється від розмірів заміщення, що спостерігаються при використанні вже відомих технологій, для відповідної рослини того ж виду. Відповідні розміри заміщення сахаридного комплексу (наприклад [Me]GlcA), які можливі завдяки даному винаходу, складають 50%, 30%, 20%, тобто від 0.001% до 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, або 15% і так далі, за умови, що таке нове заміщення сахаридної частини (наприклад, модель заміщення для компоненту [Me]GlcA), не відома у сучасних технологіях для відповідного виду рослин. Далі винахід представляє нуклеотидну послідовність, яка кодує антисмислову молекулу РНК, яка являється комплементарною до смислової молекули іРНК і яка кодує протеїн, що проявляє ферментативну активність у заміщенні бічного ланцюгу ксилану, нуклеотидна послідовність в якому перебуває під транскрипційним контролем активатору та термінатору. Як активатор, так і термінатор можуть функціонувати у рослинних клітинах. Нуклеотидна послідовність, яка кодує антисмислову молекулу РНК, може бути довільної довжини за умови, що антисмислова молекула РНК, яка може бути звідти транскрибована, є достатньої довжини для утворення комплексу зі смисловою молекулою іРНК, що кодує протеїн із ферментативною активністю у заміщенні бічного ланцюгу ксилану. Відповідні протеїни, які проявляють ферментативну активність у реакціях заміщення бічного ланцюгу ксилану включають глюкуронил трансферази (XGATs), наприклад послідовності Arabidopsis thaliana, At4g33330 і At3gl8660, Atlg77130, Atlg08990, Atlg54940 (виділені з Arabidopsis thaliana), PttGT8A, PttGT8B и PttGT8C (виділені з тополі), CAK29728 (часткова послідовність із Pica abies, хвойні), та інші гомологи XGAT або її ортологи з інших видів, наприклад Os03g0184300, Os01g0880200, Os05g0426400, OsІ_010047, AAK92624 (з рису) AK250038 (з ячменю), AY110752, (з кукурудзи), і ABE88903 (з Medicago truncatula). Таким чином, вважають, що антисмислова молекула РНК або короткі послідовності, її похідні, отримані in planta, in vivo, або in vitro, наприклад, коротка інтерферуюча РНК (siRNA), утворює комплекси, що здатні інтерферувати з іРНК протеїну. І таким чином запобігають або фактично пригнічують синтез функціонального протеїну/протеїнів, таких як протеїни XGAT, що характеризуються ферментативною активністю в заміщенні бічного ланцюгу ксилану. У результаті інтерференції антисмислової РНК, ферментативна активність протеїна/протеїнів XGAT, що приймають участь у заміщенні бічного ланцюгу ксилану знижується. Для цілей представленого тут опису під «нуклеотидною послідовністю» будуть розуміти ДНК, якщо не буде визначено інакше. ДНК, що кодує антисмислову РНК, може складатись із майже 20 ділянок нуклеотидів, по довжині співставима з продукованою клітиною релевантної іРНК. Бажано, щоб довжина ДНК, що кодує антисмислову РНК складалась із 20 до 1500 нуклеотидів, ще більш оптимальна довжина – від 20 до 1000 нуклеотидів. Коли, інтерферуюча антисмислова РНК являється інтерферуючою кіРНК, довжину ланцюга кіРНК складають від 20 до 30 нуклеотидів, и може бути кіРНК в основі якої 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30. Бажано, щоб джерелом антисмислової РНК для конструктів ДНК даного винаходу була ДНК, ідентична або схожа з генами або фрагментами протеїнів, що мають ферментативну активність XGAT. Таким чином, ДНК що кодує конструкти, представленого тут винаходу, можна відібрати з молекул нуклеїнової кислоти кодуючих XGATS, наприклад протеїни селектовані з групи At4g33330, At3gl8660, Atlg77130, Atlg08990, Atlg54940 (виділені з Arabidopsis thaiiana), PttGT8A, PttGT8B і PttGT8C (виділені з тополі), CAK29728 (часткова послідовність виділена з Pica abies, хвойні), та інші гомологи XGAT або її ортологи з інших видів, наприклад Os03g0184300, Os01g0880200, Os05g0426400, OsІ_010047, AAK92624 (з рису) AK250038 (з ячменю), AY110752, (з кукурудзи), і ABE88903 (з Medicago truncatula) та їх фрагменти, ферментативно активні фрагменти, або їх ортологи з іншого виду рослин або їх фрагменти, що являються ферментативно активними фрагментами. Далі винахід представляє нуклеотидну послідовність (нуклеотидна послідовність згідно винаходу) із транскрипційною регуляторною послідовністю. Послідовність із транскрипційним контролем, яка кодує РНК, що складається з великої кількості субпослідовностей, особливістю яких є те, що субпослідовності РНК являються антисмисловими РНК стосовно іРНК протеїнів із ферментативною активністю у заміщенні бічного ланцюгу ксилану у рослинних клітинах. Нуклеотидна послідовність здатна кодувати в антисмислову орієнтацію РНК, що складається з будь-якої кількості субпослідовностей, які можуть включати більше однієї послідовності кіРНК, можуть включати хоча б одну послідовність кіРНК й одну, більш довгу, послідовність РНК; можуть включати хоча б одну більш довгу послідовність РНК. Бажано, щоб субпослідовностей було 6, ще більш оптимальний варіант - від 1 до 3. Нуклеотидна послідовність винаходу також включає комплементарні смислові полінуклеотидні послідовності антисмислових послідовностей винаходу, транскрибування яких 3 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 у рослинний матеріал призводить до збільшення заміщення бічного ланцюгу ксилану і далі до диспропорційно високого загального рівня заміщення бічного ланцюгу ксилану порівняно з рівнем, що спостерігається в нативних рослинах того ж виду або відповідного виду. Зацікавленим спеціалістам буде зрозуміло, що надлишкова експресія таких послідовностей для протеїнів XGAT здатна також викликати сайленсінг, обумовленого кіРНК, гену XGAT, збільшуючи заміщення бічного ланцюгу ксилану, там, де загальний рівень заміщення бічного ланцюгу ксилану нижчий порівняно з нативними рослинами того ж виду. Бажано, щоб РНК, кодована зв’язаною послідовністю включала сайт розщеплення, такий як рібозим або сайт рестрикції ферменту, наприклад Xbal, Sail, Kpnl або подібні, між двома субпослідовностями для забезпечення проникнення РНК у ділянки, що включають зазначені субпослідовності, або навіть у самі по собі субпослідовності. Звичайно, спеціаліст зрозуміє, що послідовності, які містяться в РНК, яка кодована зв’язаною послідовністю у результаті такого розщеплення не будуть містити кепа розміром 5’ або сайту зв’язування рібозоми, і таким чином не будуть транслюватись, у разі присутності в еукаріотній клітині, такої як рослинна клітина. Більш того, винахід представляє нуклеотидну послідовність, подібну до зазначених вище антисмислових послідовностей РНК. Під «подібна» розуміють контрольну послідовність, яка піддається гібридизації до послідовності, що являється комплементарною до нуклеотидної послідовності з ознаками винаходу. Коли контрольна та винахідницька послідовності представлені подвійним ланцюгом, нуклеїнова кислота, що складає контрольну послідовність, показники Tm якої, бажано щоб знаходилися у межах 20°C у порівнянні з винахідницькою послідовністю. У випадку, коли проводять одночасне змішування та денатурування контрольної та винахідницької послідовностей, оптимальні значення Tm для послідовностей відрізняються в межах 10°C. Оптимально проводити гібридизацію в жорстких умовах, із підложкою/носієм контрольної або винахідницької ДНК. Таким чином, або денатурована контрольна послідовність, або винахідницька послідовність, у першу чергу зв’язуються з носієм і гібридизація відбувається в певний період часу при температурах від 50°C до 70°C у буферному сольовому розчині з подвійною концентрацією SSC (2x NaCl 17.5 г/л і натрію цитрату дигідрат (SC), 8.8 г/л) що містить 0.1% додецилсульфату натрію (SDS), із наступним відмиванням носія при аналогічній температурі, але у буферному розчині SSC із пониженою концентрацією. Залежно від ступеня необхідної жорсткості умов, а відповідно й ступеню схожості послідовностей, такі буферні розчини з пониженою концентрацією зазвичай являються SSC нормальної концентрації з вмістом 0.1% SDS, SSC половини концентрації з вмістом 0.1% SDS, SSC з однією десятою концентрації з вмістом 0.1% SDS. Встановлено, що послідовності з найбільшим ступенем схожості являються такими послідовностями, на гібридизацію яких найменшим чином впливає відмивання в буферних розчинах із пониженою концентрацією. Найбільш оптимально, коли контрольна й винахідницька послідовності схожі настільки, що на їх гібридизацію практично не впливає відмивка або інкубація в буферному розчині дігидрат натрію цитрату в одній десятій концентрації, з вмістом 0.1% SDS. Далі, винахід представляє нуклеотидну послідовність, комплементарну до послідовності, гібридизація якої проходить у жорстких умовах із зазначеними вище нуклеотидними послідовностями. Далі, винахід представляє, застосування послідовності згідно з винаходом, або власне послідовності, або представленої в конструкті ДНК або біологічному векторі для отримання еукаріотних клітин, а саме рослинних клітин із вмістом модифікованого ксилану, як зазначено у даному винаході. Далі, винахід представляє метод стимулювання пониженої експресії ферментативного протеїну заміщення бічного ланцюгу ксилану в рослинних клітинах, включаючи введення в такі клітини нуклеотидної послідовності, що відповідає винаходу, або конструкту або вектору, що містить такий конструкт. Далі, винахід представляє пригнічення продукції, щонайменше, одного ферменту XGAT в еукаріотній клітині, що включає введення в таку клітину нуклеотидної послідовності з транскрипційною регуляторною послідовністю та неперервною послідовністю у ній і транскрипційним контролем кодування неперервної послідовності РНК, що складається з однієї або множини послідовностей. При цьому така послідовність або послідовності мають послідовності антисмислової РНК до іРНК протеїнів із ферментативною активністю в заміщенні бічного ланцюгу ксилану в рослинах. Далі представлені приклади нуклеотидних послідовностей винаходу. Ці приклади стосуються отримання рослин, наприклад рослина Arabidopsis thaliana , який вже мають змінений компонент ксилану, що є предметом винаходу. 4 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. Нуклеотидна послідовність даного винаходу здатна кодувати іРНК, яка складається – у напрямку від 5’ до 3’ – з (i) активатору, (ii) хоча б однієї кДНК у зворотній орієнтації, тобто орієнтації від 3’ до 5’, (III) термінатору, (iv) додаткового активатору, що необов’язково, (v) ділянки кодування маркера-гена, наприклад GFP і (vi) додаткового стоп кодону, що необов’язково. При введенні такої послідовності у рослинні клітини, транскрибується послідовність, яка кодує іРНК. Ділянка, транскрибованої у такий спосіб іРНК, яка кодує маркерген транслюється, у той час як ділянка іРНК, яка кодує кДНК – ні. 2. Нуклеотидна послідовність даного винаходу здатна кодувати іРНК, яка складається – у напрямку від 5’ до 3’ – з (i) активатору, (ii) ділянки кодування маркера-гена, наприклад GFP, (III) трансляційного стоп кодону, (iv) додаткового старт кодону, що необов’язково, (v) ділянки кодування хоча б однієї кДНК у зворотній орієнтації, тобто орієнтації від 3’ до 5’, і (vi) додаткового стоп кодону, що необов’язково. При введенні такої послідовності у рослинні клітини, транскрибується послідовність, яка кодує іРНК. Ділянка, транскрибованої у такий спосіб іРНК, яка кодує маркер-ген транслюється, у той час як ділянка іРНК, яка кодує кДНК у зворотній послідовності, тобто в орієнтації від 3’ до 5’– ні. 3. Нуклеотидна послідовність даного винаходу здатна кодувати іРНК, яка у напрямку від 5’ до 3’ включає (i) активатор, (ii) кДНК у зворотній орієнтації, тобто орієнтації від 3’ до 5’, (III) термінатору, (iv) активатору, (v) ділянки кодування маркера-гена, наприклад GFP, (vi) термінатору, (vii) активатору, (viii) другу кДНК у зворотній орієнтації, тобто орієнтації від 3’ до 5’, (ix) термінатору. При введенні такої послідовності у рослинні клітини, транскрибуються послідовності, які кодують (ii) і (viii). Ділянка, транскрибованої у такий спосіб іРНК, яка кодує маркер-ген транслюється, у той час як ділянка іРНК, яка кодує кДНК – ні. Відповідні кДНК, які можуть бути використані в рослинах і конструктах винаходу включають XGAT кДНК, що кодує протеїни селектовані з групи At4g33330 і At3g18660 або Atlg77130, Atlg08990, Atlg54940(з Arabidopsis thaliana), PttGT8A, PttGT8B і PttGT8C (з тополі), (часткова послідовність із Pica abies, хвойні), та інші гомологи XGAT або її ортологи з іншого виду, такі як Os03g0184300, Os01g0880200, Os05g0426400, OsІ_010047, AAK92624 (з рису) AK250038 (з ячменю), AY110752, (з кукурудзи), і ABE88903 (з Medicago truncatula) здатні змінювати заміщення бічного ланцюгу сахариду на ксилані при введенні в рослинну клітину. Антисмислові послідовності At4g33330 і/або At3g18660 можуть бути введені в інший вид рослини, наприклад представники сімейства Brassicaceae: кучерява капуста, качанна капуста, цвітна капуста, брокколі і т.п. кДНК, які кодують протеїн, що застосовують у винаході, At4g33330 і/або At3g18660, у векторі з хоча б одним типом активатору, що працює у клітині рослини, наприклад індуцибельний або конститутивний активатор операційно пов’язаний із першою та/або другою послідовністю нуклеїнової кислоти або компонент нуклеїнової кислоти, що відповідає визначенню даного винаходу й який отримають у даному винаході. Як зазначалось, це забезпечує контроль експресії полінуклеотиду винаходу. Винахід також включає рослини, які внаслідок трансформації мають полінуклеотидні послідовності або конструкти й методи введення таких полінуклеотидних послідовностей нуклеїнової кислоти або конструктів у рослинну клітину та/або індукцію експресії, згаданої тут, першої або другої послідовності нуклеїнової кислоти або конструкту в рослинній клітині, наприклад, шляхом застосування належного стимулу, такого як ефективний екзогенний індуктор. Термін «індуцибельний», відносно до активатору, добре зрозумілий спеціалістам у даній галузі. Власне, експресія, яка контролюється індуцибельним активатором «запускається» або зростає у відповідь на задіяний стимул (такий стимул може генеруватись як у самій клітині, так і бути екзогенного походження). Природа стимулу відрізняється між активаторами. Деякі індуцибельні активатори викликають незначні або такі, що не піддаються визначенню рівні експресії (або експресія відсутня), якщо немає належного стимулу. Інші індуцибельні активатори викликають експресію, що визначається, при відсутності стимулу. Незалежно від рівню експресії, при відсутності стимулу, рівень експресії, обумовлений індуцибельним активатором, зростає при наявності належного /правильного стимулу. Бажаною є така ситуація, при якій рівень експресії при застосуванні релевантного стимулу зростає на величину достатню для зміни генотипної характеристики. Відповідно, може бути використаний індуцибельний (або «такий, що переключається») активатор, у результаті дії якого отримують базовий рівень експресії при відсутності стимулу, рівень такої експресії надто низький, щоб призвести до бажаного фенотипу (і насправді може бути нульовим). При застосуванні стимулу, експресія зростає (або запускається) до рівня, який призводить до отримання бажаного фенотипу. Одним із прикладів індуцибельного активатору являється включення етанол індуцибельного гену, 5 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 представленого в роботі in Caddick et al (1998) Nature Biotechnology 16: 177-180. На сьогодні у розпорядженні є низка індуцибельних активаторів. Активатори, які регулюються хімічним шляхом, можна використовувати для модулювання експресії гену або полінуклеотидної послідовності цього винаходу у рослині за допомогою екзогенного хімічного регулятору. Залежно від задач, активатором може виступати хімічно індуцибельний активатор, коли за рахунок хімічної активності відбувається індукція експресії гену, або хімічно репресивний активатор, коли за рахунок хімічної активності пригнічується експресія гену. Химично індуцибельні активатори відомі науці і включають, але не лише, активатор In2-2 кукурудзи, що активується сафенерами бензолсульфонамідного гербіциду, активатор кукурудзи GST, що активується за рахунок електрофільних сполук, які застосовують у якості досходових гербіцидів, и активатор тютюну PR-la, що активується саліциловою кислотою. Інші активатори, що представляють тут інтерес, включають стероїд чутливі активатори (дивись, наприклад, активатор індукований глюкокортикоїдом у роботі Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 и McNellis et al. (1998) Plant J. 14 (2):247-257), индуцибельні тетрациклін-залежні активатори (дивись, наприклад, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229237, и U.S. Patent Nos. 5,814,618 and 5,789,156), тут об’єднані за посиланням. Якщо у певних тканинах бажано отримати посилену експресію послідовностей XGAT даного винаходу (в антисмисловій орієнтації, або у смисловій орієнтації), можуть бути застосовані тканино-специфічні активатори. Тканино-специфічні активатори, включають активатори, опис яких представлено в роботах Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254 (3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112 (3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90 (20):9586-9590; and Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4 (3):495-505. Так звані конститутивні активатори також можуть бути застосовані у методах, представленого винаходу. Конститутивні активатори включають, наприклад, активатор CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); рисовий актин (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163171); убівікитин (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 and Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); активатор АЛС (U.S. Application Serial No. 08/409,297), і т.п.. Інші конститутивні активатори включають запантеновані у США активатори U.S. Patent Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5, 399, 680; 5, 268, 463; and 5, 608, 142. Звичайно, спеціалістам буде зрозумілою присутність термінатору ДНК послідовностей у конструктах винаходу. Термінатор розглядається як послідовність ДНК на кінці транскрипційної одиниці, яка сигналізує про термінацію транскрибування. Ці елементи являються 3’нетрансльованими послідовностями, що включають сигнали поліаденилювання, дія яких направлена на добавлення послідовностей поліаденеліну на кінець 3’ первинних транскриптів. Для експресії в рослинних клітинах послідовність транскрипційного термінатору нопалін синтази (A. Depicker et al., 1982, J. of Mol. & Applied Gen. 1:561-573) виконує функцію термінуючого сигналу транскрипції. Спеціалісти зможуть сконструювати вектори та дизайн протоколів для послідовностей рекомбінантної нуклеїнової кислоти або експресії гену. Відповідні вектори можна вибрати або сконструювати. Вони включають належні регулюючі послідовності активатору, ділянки термінатору, послідовності поліаденелювання, послідовності підсилювача, маркер-гени й інші послідовності, якщо необхідно. Більш детальні дані можна знайти, наприклад, у роботі Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Багато відомих технік і протоколів по управлінню нуклеїновою кислотою, наприклад, із приготування конструктів нуклеїнової кислоти, мутагенезу, секвенуванню, введення ДНК у клітини й експресії гену, а також щодо аналізу протеїнів детально описані в Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Публікації Sambrook et al. і Ausubel et al. об’єднані тут за посиланням. Специфічні методи аналізу і вектори, успішно застосовані раніше на рослинах, описані Bevan (Nucl. Acids 15 Res. 12, 87118721 (1984)) і Guerineau and Mullineaux (1993) (Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed.) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148). Звичайно, спеціалістам буде зрозуміло, що кожна введена послідовність нуклеїнової кислоти, така як послідовність геному ДНК або послідовність кДНК, які кодують щонайменше один протеїн, модифікуючий компонент бічного ланцюгу сахариду, наприклад смислова 6 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовність XGAT, і розроблена для надмірної експресії XGAT і, таким чином запускає активацію механізмів пригнічення гену кіРНК рослинної клітини, тобто послідовність орієнтована у напрямку 5’ до 3’ після активатору (наприклад, смислова At4g33330 і/або смислова At3gl8660), перебуватиме під регуляторним контролем власного екзогенного активатору та термінатору. Селектовані генетичні маркери можуть сприяти селекції трансгенних рослин і можуть складатись із химерних генів, що викликають селектовані фенотипи, наприклад, із резистентністю до антибіотиків, таких як, канацимін, неоміцин, гідроміцин, пураміцин, фосфінотрицин, хлорсульфурон, метотрексат, гентаміцин, спектиноміцин, імідозолінони і гліфозат або вони можуть складатись із інших маркерів, наприклад протеїнів, здатних до флюоресценції, наприклад зелений флуоресцентний протеїн (GFP). Згідно з винаходом, при введенні відібраних послідовностей нуклеїнової кислоти у клітину, слід мати на увазі деякі міркування, відомі спеціалістам. Нуклеїнова кислота, призначена для вставки, має бути вбудована у конструкт із активними регуляторними елементами, які будуть стимулювати транскрибування. Також необхідно мати метод транспортування конструкта у клітину. Після введення конструкту в клітинну мембрану, інтегрування в ендогенний хромосомний матеріал або відбувається, або ні. Нарешті, що стосується рослин, тип клітини цілі, має бути таким, щоб забезпечити регенерування клітин у всі рослини. Рослини, трансформовані сегментами ДНК із послідовностями даного винаходу, можна отримувати за допомогою стандартних технік, які вже відомі для маніпуляції з генами рослин. ДНК можна трансформувати у рослинні клітини за допомогою відповідної технології, наприклад, ’обезброєний’ вектор на основі Ті-плазміду, що переноситься Agrobacterium за рахунок природної здатності до переносу генів (EP-A-270355, EP-A-0116718, NAR 12(22) 8711 -87215 1984), опромінення частинками та налітаючими мікрочастинками (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616) мікроін’єкції (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al. (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press), електропорації (EP 290395, WO 8706614) інших форм прямого захоплення ДНК (DE 4005152, WO 9012096, US 4684611), ліпосомного захоплення ДНК (наприклад, Freeman et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)), або вихрового методу (наприклад, Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d). Фізичні методи трансформації рослинних клітин розглянуті Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11. Таким чином, як тільки послідовність нуклеїнової кислоти або гену розпізнали, її можна повторно вводити у рослинні клітини з використанням відомої спеціалістам технології для отримання трансгенних рослин відповідного фенотипу. Добре відома серед спеціалістів Агробактеріальна (Agrobacterium) трансформація для трансформування представників виду dicotyledonous. Отримання стабільних, плодоносних трансгенних рослин для практично усіх економічно доцільних односім’ядольних рослин на сьогоднішній день звичайна практика: (Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, 379-384; Zhang, et al. (1988) Theor. Appl. Genet 76, 835-840; Shimamoto, et al. (1989) Nature 338, 274-276; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, 736-740; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957-962; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618; D'Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505; Walters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200; Vasil, I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925937; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594; W092/14828). Власне, агробактеріальна трансформація сьогодні являється високоефективним альтернативним методом трансформації в односім’ядольних рослинах (Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6, 271-282). Генерування плодоносних трансгенних рослин було досягнуто з зернами рису, кукурудзи, пшениці, вівса й ячменю (огляд Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158162.; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 page 702). Wan and Lemaux (1994) Plant Physiol. 104: 37-48 описують технологію генерування великої кількості незалежно трансформованих плодоносних рослин ячменю. Генерування плодоносних трансгенних дерев отримали з тополею (Halpin, C et al. TREE GENETICS & GENOMES 3 (2): 101-110 APR 2 0 07, Song JY, PLANT AND CELL PHYSIOLOGY 47 (11): 1582-1589 NOV 2006), сосною ладанною (огляд Boerjan W CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY 16 (2): 159-166 APR 2005), сосною білою східною (Pinus strobus L.) Tang W PLANT CELL REPORTS 26 (5): 673-682 MAY 2007). 7 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У разі неефективності або відсутності результату Агробактеріальної трансформації, кращими являються технології опромінення мікрочастинками, електропорації та прямого захоплення ДНК. Як альтернативу, можна використовувати комбінацію різних технологій для підвищення ефективності процесу трансформування, наприклад опромінення мікрочастинками з агробактеріальним покриттям (EP-A-486234) або опромінення налітаючими мікрочастинками, щоб викликати пошкодження з наступною культивацією Agrobacterium (EP-A-486233). Після трансформації, рослина може бути регенерована, наприклад із простих клітин, каллюсних тканин або дисків листя, що являється стандартом технології. Практично можна провести повну регенерацію любої рослини з клітин, тканин або органів рослини. Існуючі техніки розглянуті у роботі Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, и Weiss Bach and Weiss Bach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989. Конкретний вибір технології трансформації буде визначатися ефективністю такої технології по трансформуванню певного виду рослини, а також досвідом і вибором особи, яка практикує винахід за вибраною методологією. Для спеціаліста, буде зрозумілим, що конкретний вибір системи трансформування для введення нуклеїнової кислоти в клітини рослини не являється критичним для винаходу, або таким, що його обмежує. Це також стосується і вибору техніки регенерації рослини. Далі винахід розглядає клітину-господаря, трансформованої за допомогою векторів або конструктів, як зазначалось попередньо, особливо клітини-господаря рослини або мікробної клітини. Таким чином, у винаході, представляємо клітину-господаря, наприклад рослини, яка включає нуклеотидні послідовності представленого тут винаходу. У клітині нуклеотидна послідовність може бути інкорпорована у хромосому. Також, у відповідності з даним винаходом, представляємо рослинну клітину з інкорпорованим геном, щонайменше, нуклеотидної послідовності, власне гетеро логічних нуклеотидних послідовностей винаходу під операційним контролем регуляторних послідовностей для управління експресією. Кодуюча послідовність може оперативно зв’язуватися з однією або більшим числом регуляторних послідовностей, які можуть являтися гетерологами або чужими по відношенню до послідовностей нуклеїнової кислоти, які використовують у даному дослідженні, наприклад, не пов’язані натурально з послідовністю(послідовностями) нуклеїнової кислоти в її/їх експресії. З метою здійснення контрольованої користувачем експресії, нуклеотидну послідовність даного винаходу можна помістити під контроль активатору індукованого зі зовнішнього джерела. Ще одним аспектом винаходу являється метод отримання такої рослинної клітини з включенням послідовності (послідовностей) нуклеїнової кислоти, яка призначена для використання у винаході або відповідного вектору, що включає послідовність(послідовності), призначені для застосування у даному винаході в рослинній клітині, і такі, що викликають або дозволяють рекомбінацію між вектором і геном клітини рослини для введення зазначених послідовностей у геном. Винахід поширюється на рослинні клітини, що містять нуклеотидну послідовність, яка відповідає винаходу, отримані у результаті введення такої нуклеотидної послідовності у клітину предка. Термін «гетерологічний» можна застосовувати для зазначення, що ген/послідовність нуклеотидів, вводили у клітину рослини або клітину предка шляхом генної інженерії, тобто шляхом втручання людини. Може бути отримана трансгенна рослинна клітина, тобто трансгенна для нуклеотидної послідовності. Трансген може перебувати на поза генному векторі або бути інкорпорованим, бажано стабільно, в геном. Гетерологічний ген може замінювати ендогенно еквівалентний ген, наприклад, такий ген, який у нормі виконує аналогічну або подібну функцію, або вставлена послідовність може бути додатковою до ендогенного гену або до іншої послідовності. Перевагою введення гетерологічного гену являється можливість забезпечити контроль над експресією послідовності за допомогою вибраного активатору, що забезпечить управління експресією у відповідності з бажаним результатом. Більш того, замість ендогенного гену можуть застосовуватися мутанти, різновиди, похідні вихідного гену, наприклад, із більшою або меншою активністю порівняно з вихідним типом. Нуклеотидні послідовності, що виступають гетерологічними або екзогенними або чужими для рослинної клітини, можуть неприродно з’являтися у клітинах такого типу, різновиду або виду. Тому нуклеотидна послідовність може включати кодуючу послідовність або бути похідною певного типу рослинної клітини або виду, або різновиду рослини, поміщеної у контекст клітини рослини іншого типу або виду або різновиду рослини. Існує ще одна можливість для введення нуклеотидної послідовності у клітину, де її знаходження або гомологу являється природнім, однак, там, де нуклеотидна послідовність зв’язана та/або прилягає до нуклеїнової кислоти, яка не являється природною в клітці або клітинах такого типу або виду або різновиду рослини, наприклад операційно зв’язана 8 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з однією або більшим числом регуляторних послідовностей, такої як послідовність активатору для управління експресією. Послідовність у рослині або іншій клітині господаря може бути гетерологічною, екзогенною або чужою. Також представлені рослини, які включають рослинну клітину, що відповідає винаходу, а також будь-якої їх частини пагінець, насіння, власне або гібридне потомство. Окремо представляємо рослини польових культур і трансгенні види дерев, які були отримані шляхом інженерії для переносу зазначених вище генів. Приклади відповідних рослин включають Nicotania tabacum та інші види Nicotiana, цукровий буряк, цукрову тростину, пшеницю, ячмінь, кукурудзу, рис, Miscanthus, просо прутєвидне (Panicum virgatum) сорго, і бавовну. Приклади видів дерев, що піддаються трансформації у відповідності з винаходом включають тополю, сосну ладану, гібрид осини: Populus tremula x Populus tremuloides, гібрид тополі: P. tremula x P. alba, види евкаліпту, такі як Eucalyptus globulus (Southern Blue gum), Eucalyptus camaldulensis x Eucalyptus globulus, Eucalyptus grandis, Eucalyptus gunnii, шишковидні види, піхту благородну, піхту бальзамічну, піхту японську, піхту сибірську, модрину європейську, модрину західну, модрину сибірську, смереку європейську, смереку білу, смереку ситхінську, сосну білу західну, сосну чорну європейську, сосну болотяну, жовту сосну, сосну Radiata, сосну смолисту, сосну жорстку, сосну білу європейську, сосну звичайну, ногоплідник волотковий, піхту дугласія, березу пушисту європейську, березу японську, липу американську, вербу білу, вербу чорну, американський берест, берест шершавий. Особливо виділяються трансформовані рослини і/або трансформовані рослинні клітини винаходу, селектовані з тополі, сосни ладанної, шишковидних видів, селектовані з перерахованих вище видів евкаліпту, отриманих від Eucalyptus globulus(евкаліпт шаровидний), Eucalyptus camaldulensis x Eucalyptus globulus, Eucalyptus grandis, Eucalyptus gunnii, пшениці, ячменю, кукурудзи, рису, Miscanthus, проса прутєвидного (Panicum virgatum), цукрової тростини. Крім рослини, даний винахід представляє будь-який клон такої рослини, насіння, власний або гібридний пагін і потомство, і будь-яку їх частину, наприклад живець, насіння. Винахід також представляє будь-який пагін рослини, тобто любу частину рослини, яка може бути використана для відтворення або розмноження черенкуванням, іменами і т.п. Також винахід включає рослини, які являються потомками при статевому або безстатевому розмноженні, клоном або потомком такої рослини, або будь-якою частиною або пагоном зазначеної рослини, клоном або потомком. Також можна проводити скринування й аналіз нативних нетрансформованих рослин щодо природних мутацій у таких, що представляють для нас інтерес, послідовностях нуклеїнової кислоти, які задіяні у заміщенні сахаридної частини ксиланів у нативних популяціях диких рослин. Більш того, в яких були викликані мутації, наприклад, шляхом традиційного мутагенезу, або шляхом вставки ТДНК, як зазначалося попередньо, також можуть бути скриновані на предмет змін у нуклеотидних послідовностях, які приймають участь або очікується, що приймають участь у заміщенні сахаридної частини ксиланів, інакше кажучи, у популяціях рослин, які зазнали традиційного мутагенезу. Більш того, за допомогою процедур, які подібні до викладених тут, можна скринувати рівень заміщення сахариду, що може мати місце у рослинах, що включають мутації у послідовностях нуклеїнової кислоти, а також можна визначити рівень заміщення сахаридної частини ксилану. Спочатку, популяції рослини, що становить інтерес, можуть бути екрановані з використанням належних послідовностей нуклеїнової кислоти, які, як відомо задіяні у заміщенні сахаридної частини ксиланів, наприклад послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують протеїни XGAT групи селектовані з At4g33330, At3g18660, Atlg77130, Atlg08990, Atlg54940(з Arabidopsis thaliana), PttGT8A, PttGT8B and PttGT8C (з тополі), CAK29728 (часткова послідовність з Pica abies, хвойні), та інші гомологи XGAT або її ортологи з іншого виду, такі як Os03g0184300, Os01g0880200, Os05g0426400, OsІ_010047, AAK92624 (з рису) AK250038 (з ячменю), AY110752, (з кукурудзи), і ABE88903 (з Medicago truncatula). Тому, наступним аспектом винаходу являється метод скринування рослин у взятій популяції на мутантні алелі, задіяні у заміщенні сахаридної частини ксиланів, які включають: і) Отримання зразків нуклеїнової кислоти з рослин; іі) Скринування зразків нуклеїнової кислоти, хоча б однією відомою послідовністю-маркером послідовності нуклеїнової кислоти, Яка задіяна у заміщенні сахариду ксилану; ііі) Визначення рослин, які містять щонайменше одну мутантну алель відносно відомої послідовності маркера ii). Послідовність-маркер може бути вибрана у залежності від виду рослини, що вивчається, серед послідовностей нуклеїнової кислоти, які як встановлено, задіяні у заміщенні сахаридної частини ксиланів, наприклад послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують протеїни XGAT групи селектовані з At4g33330, At3g18660, Atlg77130, Atlg08990, Atlg54940(з Arabidopsis 9 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 thaliana), PttGT8A, PttGT8B and PttGT8C (з тополі), CAK29728 (часткова послідовність з Pica abies, хвойні), та інші гомологи XGAT або її ортологи з іншого виду, такі як Os03g0184300, Os01g0880200, Os05g0426400, OsІ_010047, AAK92624 (з рису) AK250038 (з ячменю), AY110752, (з кукурудзи), і ABE88903 (з Medicago truncatula). Після того як ідентифіковані рослини з мутантними алелями, можна визначити вміст ксилану у них, і власне, паттерн заміщення сахариду їх ксиланів, наприклад методами, зазначеними у даній роботі (Goubet et al; Vicky Wong, PhD thesis, University of Cambridge 2005). Таким чином, даний винахід включає ізольований, модифікований продукт ксилану нових мутагенезованих рослин і/або ізольований, модифікований продукт ксилану природних мутантних рослин, який може бути виявлений у рослинних популяціях завдяки зазначеним тут методам. На додаток до зазначених вище методів скринуваня та/або визначення рослин, що включають нові паттерни заміщення сахаридної частини на їх ксиланах, тут може бути використана бібліотека Т-ДНК для створення ліній рослин із метою отримання нових паттернів заміщення сахаридної частини на їх ксиланах. Можна використовувати технології генерування мутантних рослин, що включають вставки Т-ДНК у послідовностях нуклеїнової кислоти або локалізації мутантних рослин, що включають вставки Т-ДНК. Відповідно, наступним аспектом винаходу являється метод виявлення мутантних рослин, які включають і) Витягнення нуклеїнової кислоти; іі) Скринування витягнутої нуклеїнової кислоти на предмет вставок нативної ДНК і Т-ДНК із використанням праймерів; ііі) Зміна скринованої нуклеїнової кислоти ii) за рахунок полімеразної ланцюгової реакції; та іv) Порівняльну оцінку ПЛР зі стандартом порівняння. Спеціалістам буде зрозуміло, що як тільки методами даного винаходу, рослину мутант встановлено, за допомогою таких методів як PACE можна вивчати паттерн заміщення сахаридної частини у структурі ксилану. Наступним аспектом винаходу являється метод генерування рослини мутанту, що включає паттерн заміщення сахаридної частини в структурі ксилану. Метод включає: і) вставку послідовності ДНК у послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує фермент із ферментативною активністю у заміщенні сахаридної частини на ксилані в життєдіяльній рослинній клітині; і іі) генерування рослини з такою рослинною клітиною. Вставлена послідовність ДНК може бути послідовністю Т-ДНК або несмисловою послідовністю ДНК, яка або передає цільову послідовність нуклеїнової кислоти (послідовність «гену»), яка хоча б частково є неробочою, або практично неробоча, тобто така послідовність, яка нездатна викликати повно функціональний фермент, здатний викликати нативний паттерн заміщення сахариду на структурі ксилану. Такі неробочі нуклеїнові кислоти можуть бути повністю нефункціональними. Бажано, щоб неробочі нуклеїнові кислоти являлись цілком нефункціональними, інакше кажучи, нездатними викликати нативний паттерн заміщення сахариду на структурі ксилану. Такі рослини можна генерувати з використанням стандартних протоколів і процедур, як зазначено у тексті, й які можуть бути застосовані для отримання рослин із, цікавими для нас, антисмисловими послідовностями нуклеїнової кислоти, які викликають «ко-супресію», такі послідовності звичайно зв’язані з генеруванням виду кіРНК. Даний винахід також включає модифікований продукт ксилану трансформованої рослини, у відповідності з винаходом і наданою інформацією або такий, що може бути отриманий, виходячи з інформації та припущень розглянутих тут. Спеціалісти можуть побудувати вектори і розробити протоколи та системи, за допомогою яких можна зреалізувати даний винахід. Застосування якого-небудь із термінів «гомологія» і «гомологічний» у цій роботі не передбачає якого-небудь необхідного еволюційного зв’язку між порівнюваними послідовностями, дотримуючись, наприклад, стандартного застосування термінів, як наприклад «гомологічна рекомбінация» навряд чи обов’язково передбачає, щоб дві нуклеотидні послідовності були практично подібні для рекомбінування у належних умовах. Детальний опис винаходу Далі наведені приклади і малюнки, без обмежень, що пояснюють винахід. Малюнок 1: PACE gel (електрофорез у поліакриламідному гелі) показує зниження заміщення ксилану в xgat. У мутанті xgatl-2 і подвійному мутанті xgatl/xgat2, кількість (Xyl)3 і (Xyl)4 зростає при зниженні [Me]GlcA(Xyl)4. Відмічається зниження Xgat2-1 в [Me]GlcA(Xyl)4 (*) неспецифічна пляма Малюнок 2: Кількість каркасу ксилану в мутантах xgat не змінюється у порівнянні з дикими рослинами. N=2 - 4 біологічні реплікації 10 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Малюнок 3: Зменшується заміщення ксилози на [Me]GlcA в xgatl, і таке заміщення відсутнє у подвійних мутантах xgatl/xgat2, встановлено методом PACE за результатами двох незалежних експериментів (WT n=3) Малюнок 4: Метод MALDI-TOF MS (мас-спектрометрія з матричною лазерною десорбцією/іонізацією) ксиланази Xylll-стінки засвоєної клітини підтверджує, що [Me]GlcA(Xyl)4 визначається в простих мутантах xgat, але відсутній у подвійному мутанті. Як GlcA(Xyl) 4 так і [Me]GlcA(Xyl)4 відсутні у подвійному мутанті. (A) дикий тип; (B) xgatl-2; (C) xgat2-l; (D) xgatl-2 xgat2-l. Малюнок 5: Аналіз HPLC (ВЕРХ) моносахаридів у стінці де-пектинованої клітини вказує на відсутність GlcA у мутанті. Полісахариди стінок гідролізували 2 M трифтороцетовою кислотою при температурі 120°C протягом 3 годин. Малюнок 6: Заміщення [Me]GlcA суттєво впливає на можливість витягнення ксилану зі стінок. Загалом ксилан витягають за допомогою 1M NaOH з подвійного мутанту xgat. Стінки були успішно екстраговані за допомогою CDTA, Na2C03, 1M KOH, 4M KOH. Після чого провели аналіз ксилану та нерозчинного залишку методом PACE. Малюнок 7: RT-PCR (метод зворотного транскрибування полімеразної ланцюгової реакції) показує, що xgat1-1, xgatl-2, xgat2-l і xgat2-2 являються транскрипційними пастками. Для підтвердження якості кДНК використовували Histone HI. Приклад 1: Аналіз рослин Arabidopsis thaliana plants на присутність вставки в генах At4g33330 або At3gl8660. Для виділення мутантних рослин із відсутністю активності генів xgat, визначили інсерційні лінії. ДНК виділили і скринували методом PCR на предмет вставки Т-ДНК. Рослини Arabidopsis thaliana cv Columbia усіх генотипів були стратифіковані шляхом інкубації у воді при температурі 4°C без світла протягом 72 годин. Після чого рослини висівали у грунт і залишали рости у контрольованих умовах (25/20°C, 16-годин-при освітленні / 8-годин-без осітлення). Ідентифікацію мутантів із Т-ДНК вставкою проводили за допомогою програми SIGnAL "TDNA Express" Arabidopsis Gene Mapping Tool розміщеної на веб-порталі SIGnAL (http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress). Були виділені наступні інерційні лінії рослини за генами, що становлять інтерес, At3gl8660 (xgatl) і At4g33330 20 (xgat2): (xgatl-1, SALK_063763 (NASC stock number N563763); xgatl-2, SALK_046841 (NASC stock number N546841) і xgat2-l, GK722F09 (NASC stock number N469285); xgat2-2, SM_3.16768 (NASC stock number N104457). Для витягнення ДНК зі всіх чотиритижневих рослин усіх очікуваних ліній ТДНК, збирали по одному розетковому листку і заморожували у рідкому азоті, після чого перемелювали до дрібнозернистого порошку. Подрібнену ткань листя інкубували у попередньо підігрітому буферному розчині для екстрагування ДНК (20 % м/м CTAB, 1.4 M NaCl, 0.02 M EDTA, 0.1 M Tris-HCL pH 8.0) β-меркаптоетанолу протягом 30 хвилин при температурі 60°C. Після чого проводили інкубацію у середовищі хлороформ :ізоаміловий спирт 24 : 1, і далі зразки перегортали пропускали через центрифугу при 10,000 g протягом 30 хв., і збирали рідкий шар. До отриманого матеріалу добавляли охолоджений ізопропанол, змішували і повторно пропускали через центрифугу при 10,000 g протягом 30 хв., після чого видаляли надосадову рідину. Пеллети ДНК промивали 70 % етанолом, пропускали через центрифугу при 10,000 g протягом 5 хв., видаляли надосадову рідину і ДНК повторно осаджували в буферній суспензії ДНК (із вмістом 0.1 мM Tris-HCL и 0.02 мкМ EDTA). Зразки ДНК, які представляють різноманітні передбачувані мутанти сканували на дикий ген і Т-ДНК вставку. Використовували наступні набори праймерів для ампліфікації дикого гену (відкритий контур зчитування) xgatl-1: (R(правий)-праймер) 5'-CAATGCCGCAGCATACTTTTC-3' (Seq. Id. No.l) і (L(лівий)-праймер) 5'-GCAAGAGGAGATTCCGGAGAA-3' (Seq. Id. No. 2) (продукт ампліфікації = 2.5 kb) і для ампліфікації вставки T-ДНК : (L-праймер) 5'GCAAGAGGAGATTCCGGAGAA-3' (Seq. Id. No.2) і (праймер L-межі) 5'TTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAG-3' (Seq. Id. No.3) (продукт ампліфікації= 2 kb).xgatl-2: (Rпраймер) 5'- CAATGCCGCAGCATACTTTTC-3' (Seq. Id. No. 1) і (L- праймер)5'GCAAGAGGAGATTCCGGAGAA-3' (Seq. Id. No.2) (продукт ампліфікації = 2.5 kb) і для ампліфікації вставки T-ДНК: (L- праймер) 5'-GCAAGAGGAGATTCCGGAGAA-3' (Seq. Id. No.2) і (праймер L (лівої)- межі) 5'-TTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAG-3' (Seq. Id. No.3) (продукт ампліфікації праймера L- межі /L- праймер = 0.9 kb) . xgat2-l: (R- праймер) 5'TATGATGTCTAAATACAAGGA-3' (Seq. Id. No.4) и (L- праймер) TACGCTTTAATCTAGTCTTGTT-3' (Seq. Id. No.5) (продукт ампліфікації = 2.9 kb) і для ампліфікації вставки T-ДНК: (R-праймер) 5'TATGATGTCTAAATACAAGGA-3' (Seq. Id. No.4) і (праймер2 L-межі) 5'ATATTGACCATCATACTCATTGC-3' (Seq. Id. No.6) (продукт ампліфікації = 0.9 kb) . xgat2-2: (R 11 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 праймер) 5' -TATGATGTCTAAATACAAGGA-3' (Seq. Id. No. 4) і (L- праймер) TACGCTTTAATCTAGTCTTGTT-3' (Seq. Id. No. 5) (продукт ампліфікації = 2.9 kb) і для ампліфікації вставки T-ДНК: (R- праймер) 5'-TATGATGTCTAAATACAAGGA-3' (Seq. Id. No.4) і (праймер3 L- межі) 5'-GGTGCAGCAAAACCCACACTTTTACTTC-3' (Seq. Id. No.7) 5 (продукти ампліфікації праймер L- межі = 1.2 kb). Зразки ДНК (2 мкл) використовували для реакцій ПЛР и поміщали в аліквоті у пробірки ПЛР із 10 мкл Sigma REDTaq, готова суміш з MgCl2 (Кат. № R2523), праймером 1 мкл (L, R або Left (ліва) межа), доводили водою до об’єму 20 мкл. Для контролю навантаження та позитивного контролю використовували праймери Histone замість ген / ген або ген / праймери Left (лівої) межі. Для негативного контролю, 5 мкл стерильної води використовували замість ДНК. Використовували наступну програму ПЛР із більшою або меншою тривалістю випалу в залежності від довжини продукту ПЛР: 94°C 2 хв (1 цикл), далі 94°C на 15 сек, 55°C на 30 сек, 68°C на 3 хв (15 циклів), 94°C на 15 сек, 55°C на 30 сек, 68°C на 3 хв (25 циклів), 68°C на 10 хв (1 цикл), і нарешті реакцію проводили при 4°C. Продукти ПЛР, 8-10 мкл/зразок і 5 мкл Нyperladder переносили далі на 0.8% агарозний гель у буфері IX TAE (0.04M ацетат Tris, 0.001 M EDTA), що містить бромід етидію (5 мкл/100 мл). Зразки розділяли зарядом 100 В при кімнатній температурі протягом 45 хв. Гелі візуалізували під УФ і отримували зображення на цифрову камеру. Приклад 2: Аналіз рослин Arabidopsis thaliana на присутність модифікованого ксилану. Методом PACE визначали кількість бічних ланцюгів [Me]GlcA на ксилані в мутантних рослинах. Аналіз включає гідроліз ксилану з ферментом ксиланази, дериватизацію олігосахаридів із фторфором, і розділення олігосахаридів електрофорезом у поліакриламідному гелі (Goubet et al. 2002). Рослину Arabidopsis thaliana вирощували при 22°C у контрольованих умовах із 16-годинним -2 11 режимом денного освітлення від 150 до 180 мкмоль m s . Фракції стебла інкубували протягом 30 хвилин у 95% етанолі (о/о) при температурі 65 °C для інактивації ферментів, після чого висаджували у Mixer Mill MM200 (Glen Creston, Middlesex, Великобританія). Гомогенат центрифугували при 4, 000 g в протягом 15 хв. Пеллети промивали в 60 % етанолі (о/о) (3-4 рази), метанол/хлороформ (2:3 (о/о); на ніч), 100% ацетоні, етанол/вода [6:4 (о/о)] і етанол/вода [9:1 (о/о)]. Остаточну пеллету, що містить стінку клітини, сушили протягом ночі при температурі 80°C. Висушений матеріал стінки клітини (50 мкг) обробляли 4 M NaOH (20 мкл) протягом 1 години при кімнатній температурі перед доведенням pH до рівня 5-6 за допомогою HC1 (1 M). Гідроліз ксилану проводили в 0.1M ацетат амонію pH 6 з 20 мО ксиланази протягом ночі. Ендо-p-1, 4ксиланаза, Xyll0A (сімейство глікозилгідролази 10 із Cellvibzio japonicus) або Xyill (сімейство глікозилгідролази 11 із Neocallimastix patriciarum) надав Harry Gilbert (University of Newcastle, Великобританія). Для визначення любої неспецифічної сполуки у ферментах, полісахаридах/ стінках клітини або маркованих реагентах проводили контролі в аналогічних умовах. Реакції зупиняли кип’ятінням протягом 30 хвилин, після чого зразки сушили. Дериватизацію цукрів у присутності АNTS (АНТС)(8-амінонафталін-1, 3, 6-трисульфонова кислота) проводили у 10 мкл буферного розчину (DMSO:вода:оцетова кислота, 20:17:3). ANTS була куплена у Molecular Probes (Leiden, Нідерланди). Дериватизацію проводили в пробірках наповнених полісахаридами у сухому вигляді, олігосахаридами або моносахаридами. Для приготування стандартів моносахариду або олігосахариду, 5 мкл 1 мМ цукрів добавляли в пробірку та сушили перед дериватизацією, ANTS готували у розведенні оцтова кислота /вода (3/17, о/о) при молярності 0.2 M – кінцева концентрація (свіжо приготований або за умов зберігання при температурі 20°C). NaCNBH3 (1 M, використовують відразу після приготування) розчиняли в DMSO для дериватизації з ANTS. 5 мкл розчину ANTS і 5 мкл відповідного розчину NaCNBH3 добавляли до кожного сухого зразка. Реагенти змішували, центрифугували та витримували при температурі 37 °С протягом ночі. Сублімаційне висушування розчину проводили у вакуумному випарювачі протягом 3 годин при температурі 40°C. Дериватизовані цукри повторно осаджували в 100 мкл 3M сечовини і зберігали до використання при температурі 20°C. Розділення ANTS-дериватних цукрів, із застосуванням 1 мкл зразку на смугу гелю, проводили на апараті Hoefer SE 660 для електрофорезу в гелі з вертикальною пластиною (Amersham, Bucks, Великобританія) з чашами 24 см, 0,75 мм прокладкою і лункою, ширина якої 0.25 см. Використовували чашки зі стандартного скла або низько-флюоресцентного пірекса. У всіх випадках електрофорез проводили при 10 °C. 20% (м/о) поліакриламідний гель містив 0.5% (м/о) N,N'-метиленебисакриламід із концентруючим гелем (2 см) 8% (м/о) поліакриламіду та 0.2% (м/о) N,N'- метиленебисакриламіду. Поліакриламід із вмістом акриламіду / N, N' 12 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 метиленебисакриламіду у співвідношенні 29:1 отримували з Severn Biotech Ltd, (Worcs, Великобританія). Буферна система для електрофорезу представляла собою 0.1 M розчин Tris з рН 8.2, борна кислота (Tris-borate). Спочатку електрофорез проводили при 200 В, 20 хвилин і далі при 1000 В, 90 хвилин. Гелі сканували за допомогою камери Master Imager CCD, система (Amersham, Bucks, Великобританія) з фільтром активізації 400 нм і фільтром виявлення 530 нм. Витримку підбирали таким чином, щоб збільшити чутливість без насичення інтенсивності плям. Отримували зображення гелю (роздільна здатність, 100 мікрон) й експортували в 16 бітний файл для проведення підрахунку. Гель візуалізували за допомогою стандартного приладу для УФ просвічування (при довжині хвилі 360 нм). Підрахунок проводили за допомогою програмного забезпечення GeneTools (Syngene, Cambridge, Великобританія), із застосуванням техніки ’rolling ball background detection’. Для кожного гелю використовували стандарти (одноразово чи багаторазово) для отримання стандартної кривої підрахунку цукрів у зразках. Стандарти для підрахунку [Xylose, (Man) 2 и (Man)3] розділювали вздовж зразків у кожному гелі для отримання стандартної кривої кількості pmol фторфор-маркованого олігосахариду. Для проведення оцінки з Xylll, кількість Xyl, (Xyl)2 (Xyl)3 і [Me]GlcUA(Xyl)4 в 1мкл зразку розраховували по стандартній кривій. Для співвідношення Xyl і Glc/Me-Glc знаходили суму відносного внеску плям що містять Xyl = (Xyl)1 xl + (Xyl)2 x2 +(Xyl)3 x3 + ([Me]GlcUA (Xyl)4) x4 порівняно з GlcUA / Me GlcUA =([Me]GlcUA(Xyl)4) х1. Структуру ксилану вивчали у стеблах 25 простих мутантів, xgat1-2 и xgat2-1 і подвійного мутанту. На малюнку 1 показані гелі дайджестів PACE ксилану зі стебла з Xylll, в основному Xyl, (Xyl)2, (Xyl)3 і [Me] GlcAXyl4. Методом РАСЕ MeGlcAXyl4 і GlcAXyl4 чітко не визначались. Для простих мутантів, інтенсивність плям [Me] GlcAXyl4 знижувалася. Для двох ліній мутантних рослин xgatl-2 xgat2-l, [Me] GlcAXyl4 була відсутня. Загальну кількість каркасу ксилану вимірювали в мутантах xgat та диких рослинах, і була встановлена їх ідентичність (малюнок 2). Частина залишків ксилози в каркасі ксилану заміщених [Me]GlcA оцінювали в мутантах xgat і диких рослинах. Було встановлено зниження в 5 простих мутантах і по суті відсутність у подвійних мутантах (Малюнок 3). Все вищезазначене вказує, що маніпуляція активністю XGAT може бути використана для зменшення заміщення ксилану [Me]GlcA, без якої-небудь суттєвої зміни його кількості. Приклад 3: Отримання «відбитку» структури ксилану модифікованих рослин за допомогою ферментативної активності ксиланази та мас-спектрометрії. Присутність GlcA і MeGicA на ксилані досліджували шляхом вивчення оліхосахаридів, що вивільнюються через ксилонази методом мас-спектрометрії. Матеріал стінки клітини (500 мкг), приготований по аналогії з прикладом 2, обробляли 4M NaOH (50 мкл) протягом 1 г при кімнатній температурі, після чого доводили pH до рівня 5-6 за допомогою HC1 (1 M). Протягом ночі проводили гідроліз ксилану в 0.1M ацетата амонію pH 6 з 100 мО ксиланази, наприклад Xyll0A або Xylll. Реакції зупиняли шляхом 30 хвилинного кип’ятіння. Зразки фільтрували з використанням системи Nanosep (маркер молекулярної маси 10 kDa, Pall, New York, США) і висушували. Отримані олігосахариди очищували на картриджах HyperSep Hypercarb (ThermoHypersil-Keystone, Runcorn, Cheshire, Великобританія), після чого проводили аналіз методом MALDI-TOF-MS. У зв’язку з присутністю забруднюючих сигналів, які ускладнювали нативні спектри, залишок кожного зразку був попередньо ’perdeuteromethylated’ (з використанням суспензії NaOH метод представлений у роботі Dell et. al, 1989) перед проведенням повторного аналізу MALDI-TOF-MS. Отримані мас-спектри записували у режимі позитивних іонів на пристрої 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosysterns, Foster City, Канада). Такий тандем мас-спектрометра MALDI використовує 200-Гц частотний лазер Nd-YAG, що працює при довжині хвилі 355 нм. 2,5-дигідроксибензойну кислоту (DHB) (Fluka), розводили в 50% рідкому метанолі, і використовували в якості матриці. У середньому використовували 2500 зарядів для отримання всіх мас-спектрів. Отримані результати аналізу МС олігосахаридів, які вивільнюються через ксилоназу в + простих мутантах xgat і подвійних мутантах (Малюнок 4). 963 і 966 Da [M + Na] відповідають MeGlcA Xyl4 і GlcAXyl4 відповідно, вони відрізняються за молекулярною масою на 3 Da після ’deuteropermethylation’. В простих мутантах і надалі присутні обидва олігосахариди, однак відмічається несуттєве збільшення частки MeGlcA Xyl4 порівняно з GlcA Xyl4. Значно більше збільшення частки MeGlcA порівняно з GlcA відмічали раніше в мутантах синтезу ксилану, irx7/fza8, irx8 і irx9 (Pena et al. 2007, Zheng et al, 2005). Слід відмітити, що в подвійних мутантах було відсутнє заміщення MeGlcA і GlcA, рівень не перевищував фонового. Враховуючи результати кількісного аналізу PACE рівня заміщення, мас-спектрометрія вказує, що маніпуляції 13 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 активністю XGAT приводять до отримання ксилану, в якому відсутні бічні ланцюги [Me]GlcA, та можуть бути застосовані для управління заміщенням як MeGlcA, так і GlcA ксилану. Приклад 4: Композиція цукру гемицелюлоз модифікованих рослин Arabidopsis thaliana. Для визначення GlcA в гемицелюлозах, клітинні стінки готували, як зазначено вище. Видаляли пектин, залишаючи гемицелюлози, що містять ксилан у нерозчиненому матеріалі ("гемицелюлозний матеріал"). Матеріал клітинної стінки (50 мкг) суспендували в 1 мл 0.05 M 1, 2-циклогександиамінтетраоцетової кислоти (CDTA) (pH 6.5) протягом 24 годин при кімнатній температурі. Суспензію пропускали через центрифугу, після чого пеллету промивали один раз дистильованою водою. Залишок екстрагували за допомогою 0.05M Na2CO3 з вмістом 0.01M NaBH4 протягом 24 годин при температурі 4°C. За допомогою льодяної оцтової кислоти доводили рівень рН залишку до 5. Після чого проводили екстенсивний діаліз із деіонізації води протягом 5 днів і ліофилізацію. Гемицелюлозний матеріал гідролізували кислотою, 400 мкл 2M трифтороцтової кислоти, при температурі 120°C протягом трьох годин, сушили і осаджували в 100 мкл дистильованої води. Аналіз моносахариду проводили на системі Dionex DX-500 BioLC, що складається з електрохімічного детектору (ED40), градієнтного насосу (GP50), інжекторної системи (LC30) і детектору УФ/видимої частки спектру (UVD 170U), з використанням аналітичної колонки CarboPac™ PA20 (3 x 150 мм) в комбінації з захисною колонкою CarboPac™ PA20 (3 x 30 мм), Dionex Corp., Канада, США. Інтерпритацію даних проводили з використанням програмного забезпечення Chromeleon. Аналіз HPAEC-PAD проводили при 30°C, швидкості потоку 0.5 мл/хв з використанням ізократичного градієнту трьох елюювань приготованих із деіонізованої води дегазованої газом гелію: елюент A: 100 мM NaOH, 5.23 мл з 46/48% (м/м) вихідного розчину NaOH (Fisher Scientific, Великобританія) для мінімізації вмісту карбонату; елюент B, 1 M NaOH, 52.3 мл вихідного розчину NaOH; елюент D, деіонізована-дегазована вода. Колонку промивали 200 мM NaOH протягом 10 хвилин і повторно врівноважували 1.5 мМ NaOH протягом 10 хвилин для наступного хроматографування. Хроматографували 20 мкл зразку і проводили моніторинг на імпульсно-амперометричному детекторі з одноразовим золото-вмісним електродом і електродом порівняння Ag/AgCl2 (Dionex, Канада, США). GlcA визначали по відношенню до стандарту. Аналіз диких рослин і подвійних мутантів xgat показав зниження GlcA порівняно з рівнями слідів у геміцелюлозі модифікованих рослин (Малюнок 5). Це вказує на втрати GlcA ксиланом у модифікованих рослинах. Приклад 5: Можливість хімічного витягування модифікованого ксилану в Aravidopsis thaliana. Кількість ксилану, екстрагованого з використанням основного розчину 0,05 M CDTA (pH 6.5), 1 M NaOH (слабкий) або 4 M NaOH (сильний), вимірювали методом PACE як зазначено у роботі Brown et al (2007). Висушений матеріал клітинної стінки (500 мг) спочатку екстрагували 0.05 M CDTA (pН 6.5) протягом 24 годин при кімнатній температурі. Суспензію пропускали на центрифузі (48 000 g), і пеллету промивали один раз дистильованою водою. Над осадову рідину об’єднували як розчинну фракцію CDTA. ПОВІТРЯ послідовно видаляли у без кисневому середовищі з використанням 0.05 M Na2CО3 із вмістом 0.01 M NaВH4 протягом 24 годин при 4ºC (Na2C03розчинна фракція), 1 M KOH з вмістом 0.01 M NaBH4 протягом 24 годин при кімнатній температурі (1M KOH- розчинна фракція) і нарешті 4 M KOH з вмістом 0.01 M NaBH 4 протягом 24 годин при кімнатній температурі (4 M KOH- розчинна фракція). Кожну фракцію пропускали через скловолокнистий фільтр GF/C фільтр (Whatman). Фракції Na 2C03 і KOH також охолоджували на льоді і за допомогою льодяної оцтової кислоти доводили рівень pH до 5. Після чого проводили екстенсивний діаліз по деіонізації води протягом 5 днів і ліофілізацію кожної фракції клітинної стінки. Ксилан 1/20-ій усіх зразків (екстракт і залишок) гідролізували протягом ночі в 0.1 M ацетату амонію pH 6 з 20 мЕ ксиланази. Дериватизацію зразків проводили з використанням ANTS, і моно- й олігосахариди розділяли електрофорезом у поліакриламідному гелі, як зазначалось у Прикладі 2. Частину ксилану диких рослин розчиняли 1 M NaOH, залишок з’єднували з целюлозним залишком (Малюнок 6). У подвійних мутантах xgat рослин, більшу частину ксилану екстрагували екстрактом 1 M NaOH, відзначаючи зміну взаємодії з лігніном або целюлозою в стінці. Відсутність [Me]GlcA в модифікованих рослинах покращує здатність до екстрагування ксилану в слабких основних розчинах. Це вказує, що управління заміщенням [Me]GlcA може бути використано для зміни розчинності ксиланів. Приклад 6: Модифікація ксилану в видах тополі 14 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Ксилан модифікують у деревах, наприклад видах тополі, шляхом створення транс генних рослин із підвищеною експресією генів XGAT, або зниженням активності XGAT за допомогою анти смислових методів, як зазначено в тексті. Гени XGAT клонують за допомогою праймерів, специфічних для даних генів, кодуючи гени XGAT зазначеними методами. Для тополі, послідовності PttGTb і pttGT8C посилюють за рахунок полімеразної ланцюгової реакції з використанням кДНК с праймерів гібриду осики наприклад: PttGT8C, з використанням послідовності AY935503, F 5'-GTGCAACCCTTGTTGCTAAGA-3' (Seq Id No.8) R 5'-GCCTCTTTAGTCAAATGAAACAGAAC-3' (Seq Id No.9) PttGT8B з використанням послідовності AY935502 B F 5'-ACGGAAGCGGAAGAAGATAA-3' (Seq Id No.10) R 5'-TCATTTCCCATTAGTCTCACCATAT-3' (Seq Id No.11) Послідовності вставляють у клонуючий вектор, наприклад клонуючий вектор pBIN під управлінням належного промотору, наприклад посилений тандем конституційного промотору CaMV 35S, або під управлінням промотору зі специфічною активністю в клітинах, синтезуючих вторинні стінки клітини, наприклад 2kb промотору 5' до кодуючої послідовності гену XGAT двудольної рослини, наприклад Arabidopsis thaliana. Для підвищення активності XGAT, послідовність клонують у смисловій орієнтації. Для зниження активності XGAT, послідовність клонують у зворотній (антисмисловій) орієнтації. Послідовність також може бути використана для створення інших конструктів, які приводять до утворення двохниткових РНК для пригнічення експресії генів XGAT, використовуючи методи, які добре відомі спеціалістам. Для підтвердження вставки промотору та гену в бінарний вектор, визначають нуклеотидну послідовність конструкту. Гібрид тополі трансформують за допомогою вірулентного Agrobacterium tumefaciens із використанням стандартних методів, наприклад інокуляції диску листка, як зазначено в тексті. Наприклад, зрізають диски листя тополі і со-культивують із Agrobacterium tumefaciens протягом 1 години при кімнатній температурі, промокають насухо, і кладуть нижньою стороною в чашки для агару з твердим середовищем із додаванням 0.1 мкМ нафталін оцтової кислоти (NAA), 6бензиламінопуріна (BA), і тіадіазурону (TDZ). Через три дні диски переносять у чашки для агару -1 -1 з додаванням карбеніцилін двонатрієвої солі (500 мг 1 ) і солі натрій цефотаксиму (250 мг 1 ). Ще через три дні диски переносять в чашки для агару з середовищем, що містить карбеніцилін, -1 цефотаксим і канаміцин (25 мг 1 ). Через 5 тижнів матеріал пагінців и каллюсу переносять в середовище збагачене, як зазначалося вище, плюс 0.01 мкМ BA. Після появи окремих паростків, проростки переносять у тверде середовище з 0.01 мкМ NAA і антибіотиком вибору для стимулювання укорінення. Через два послідовних 5-тижневих періодів у цьому середовищі, верхівки пагінців ізолюють у тверде середовище без антибіотиків із 0.01 мкМ NAA. Підтвердження того, що рослини являються трансформантами, проводять скринуванням ПЛР геномної ДНК з участю гена и промотора - специфічних олігонуклеотидів, як зазначали вище. Проростки у тканини культури переносять у 7.5-літрові горщики з земельною сумішшю торфу, подрібненої кори, пемзи і вирощують в оранжереї до висадки в поле. Клони і рослини з покращеними властивостями ксилану визначають шляхом витяжки ксилану 1M NaOH і порівнянням його кількості з кількістю у нетрансформованих рослинах, або аналізуючи розгалуження ланцюгу ксилану методом PACE як зазначено в тексті. Література 1. Goubet, F, P Jackson, M Deery ana P Dupree (2002) Polysaccharide Analysis using Carbohydrate gel Electrophoresis (PACE): a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry, 300, 53-68. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 55 1. Трансформована рослинна клітина, що містить ксиланову структуру з патерном заміщення 4O-метилглюкуронової кислоти (MeGlcA) та/або глюкуронової кислоти компонента бічного ланцюга та незмінну кількість ксилану у порівнянні з рослинами дикого типу того самого виду, де рослинна клітина містить геторологічну послідовність ДНК, що кодує антисмислову молекулу РНК, функціонально зв’язану з промотором та термінатором, вказаний промотор і термінатор здатні функціонувати в рослинній клітині, де вказана молекула антисмислової РНК є комплементарною частині кодуючої послідовності для ксиланглюкуронілтрансферази (XGAT); або 15 UA 104575 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рослинна клітина містить геторологічну послідовність ДНК, що кодує смислову молекулу РНК, функціонально зв’язану з промотором та термінатором, вказаний промотор і термінатор здатні функціонувати в рослинній клітині, де вказана молекула смислової РНК є кодуючою послідовністю для ксиланглюкуронілтрансферази (XGAT), де ксиланглюкоронілтрансфераза (XGAT) є At4g33330 та At3g18660 або їх ортологами. 2. Трансформована рослинна клітина згідно з п. 1, що містить ксиланову структуру, де змінений патерн заміщення 4-O-метилглюкуронової кислоти та/або глюкуронової кислоти знаходиться в розгалуженому бічному ланцюзі та/або нерозгалуженому бічному ланцюзі сахаридного компонента. 3. Трансформована рослинна клітина згідно з п. 1 або 2, де змінений патерн заміщення 4-Oметилглюкуронової кислоти та/або глюкуронової кислоти знаходиться на включно до 50 % залишків ксилози головного ланцюга ксиланової структури. 4. Трансформована рослинна клітина згідно з будь-яким з пп. 1-3, де змінений патерн заміщення 4-O-метилглюкуронової кислоти та/або глюкуронової кислоти знаходиться на включно до 30 % залишків ксилози головного ланцюга ксиланової структури. 5. Трансформована рослинна клітина згідно з будь-яким з пп. 1-4, що є вибраною з трансформованих клітин тополі, сосни ладанної, бавовни, пшениці, ячменю, жита, цукрового буряка, китайської тростини, верби, проса та цукрової тростини. 6. Спосіб модифікування заміщення 4-O-метилглюкуронової кислоти та/або глюкуронової кислоти ксилану в рослині у порівнянні з рослинами дикого типу того самого виду без зміни кількісного вмісту ксилану, що включає змінювання експресії ксиланглюкуронілтрансферази (XGAT) у вказаній рослині. 7. Спосіб продукування рослини із зміненим патерном заміщення 4-O-метилглюкуронової кислоти (MeGlcA) та/або глюкуронової кислоти компонента бічного ланцюга ксилану та незміненим кількісним вмістом ксилану у порівнянні з рослинами дикого типу того самого виду, що включає змінювання експресії ксиланглюкуронілтрансферази (XGAT) у рослинній клітині та регенерування рослини з вказаної рослинної клітини. 8. Застосування нуклеотидної послідовності для забезпечення зміненого патерну заміщення 4O-метилглюкуронової кислоти (MeGlcA) та/або глюкуронової кислоти в компоненті бічного ланцюга на ксилановій структурі в рослиннійклітині без змінення кількісного вмісту ксилану у порівнянні з рослинами дикого типу того самого виду згідно з будь-яким з пп. 1-5, де нуклеотидна послідовність містить: (i) послідовність ДНК, що кодує антисмислову молекулу РНК, функціонально зв’язану з промотором та термінатором, вказаний промотор і термінатор здатні функціонувати в рослинній клітині, де вказана молекула антисмислової РНК є комплементарною частині кодуючої послідовності протеїну з активністю ксиланглюкуронілтрансферази (XGAT) в рослинних клітинах; або (ii) послідовність ДНК, що кодує смислову молекулу РНК, функціонально зв’язану з промотором та термінатором, вказаний промотор і термінатор здатні функціонувати в рослинній клітині, де вказана молекула смислової РНК кодує кодуючу послідовність протеїну з активністю ксиланглюкуронілтрансферази (XGAT) в рослинних клітинах. 9. Застосування нуклеотидної послідовності за п. 8, де молекула РНК є молекулою антисмислової РНК, комплементарною молекулі смислової mРНК, що кодує протеїн, вибраний з групи At4g33330, At3g18660, Atlg77130, Atlg08990, Atlg54940 (з Arabidopsis thaliana), PttGT8A, PttGT8B та PttGT8C (з тополі), CAK29728 (підпослідовність з Pica abies, хвойні), Os03g0184300, OsOlg0880200, Os05g0426400, Osl_010047, AAK92624 (з рису) AK250038 (з ячменю), AYII0752, (з маїсу) та ABE88903 (з Medicago truncatula) або їхніх ензиматично активних фрагментів. 10. Застосування нуклеотидної послідовності за п. 8 або 9, де молекула смислової РНК є молекулою смислової mРНК, що кодує протеїн, вибраний з групи At4g33330, At3g18660, At1g77130, At1g08990, At1g54940 (з Arabidopsis thaliana), PttGT8A, PttGT8B та PttGT8C (з тополі), CAK29728 (неповна підпослідовність з Pica abies, хвойні), Os03g0184300, OsOlg0880200, Os05g 0426400, Osl_010047, AAK92624 (з рису), AK250038 (з ячменю), AY110752 (з маїсу) та ABE88903 (з Medicago truncatula) або їхніх ензиматично активних фрагментів. 11. Застосування нуклеотидної послідовності за будь-яким з пп. 8-10, де промотор є вибраним з групи, що складається з конститутивних, індуцибильних та регульованих з розвитком промоторів. 12. Застосування нуклеотидної послідовності за п. 11, де вказана нуклеотидна послідовність також містить послідовність ДНК, що кодує маркерний протеїн, вказаний маркерний протеїн 16 UA 104575 C2 5 10 функціонально зв’язаний з промотором та термінатором, вказані промотор і термінатор функціонують в рослинній клітині. 13. Рослина, що містить рослинну клітину згідно з будь-яким з пп. 1-4. 14. Насіння або потомство рослини за п. 13. 15. Рослина, яка експресує в своїх клітинах антисмислову РНК, що є комплементарною частині кодуючої послідовності протеїну з ензиматичною активністю в заміщенні бічного ланцюга ксилану, де вказаний протеїн є вибраним з групи At4g33330, At3g18660 та їх ортологів. 16. Рослина за п. 15, яка походить з трансформованих клітин, вибраних з трасформованих клітин тополі, сосни ладанної, бавовни, пшениці, ячменю, жита, цукрового буряка, китайської тростини, верби, проса та цукрової тростини. 17 UA 104575 C2 18 UA 104575 C2 Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 19