Чистий 3r-3’r стереоізомер зеаксантину для лікування дегенерації жовтої плями у людини

1 Застосування 3R-3'R-CTepeoi3OMepy зеаксантину як інгредієнта лікарського засобу для лікування дегенерації жовтої плями у людей 2 Застосування за п 1 як інгредієнта лікарського засобу у вигляді дозованої форми, придатної для введення людям та такої, що містить зеаксантин у КІЛЬКОСТІ, достатній для забезпечення сприятливого терапевтичного впливу на людину, яка страждає дегенерацією жовтої плями, а також містить фізіологічно прийнятний ексципієнт, розчинник або НОСІЙ 3 Застосування за п 2 як інгредієнта лікарського засобу у вигляді дозованої форми, що містить щонайменше приблизно 1 мг 3R-3'R-CTepeoi3OMepy зеаксантину 4 Застосування 3R-3'R-CTepeoi3OMepy зеаксантину як інгредієнта харчової добавки, придатної для перорального приймання людиною, для зниження ризику виникнення дегенерації жовтої плями 5 Застосування за п 4 як інгредієнта харчової добавки для лікування пацієнтів, що страждають на хворобу Старгарта, хворобу Беста, хворобу Баттона, синдром Шегрена-Ларссона, дистрофію колбочок-паличок, овечий воскоподібний ліпофусциноз, якесь захворювання, зумовлене проблемами накопичування в лізосомах або підвищеною генетичною вразливістю до дегенерації жовтої плями 6 Застосування за п 4 або 5 як інгредієнта харчової добавки у вигляді дозованої форми, яка містить щонайменше приблизно 0,1 мг 3R-3'Rстереоізомеру зеаксантину 7 Композиція, ЩО МІСТИТЬ 3R-3'R-CTepeoi3OMep зеаксантину в КІЛЬКОСТІ, яка є терапевтично корисною для людей, причому цей 3R-3'R-CTepeoi3OMep зеаксантину складає щонайменше приблизно 9 0 % від загальної КІЛЬКОСТІ зеаксантину в цій композиції, a S-S- та S-R-стереоізомери складають менше приблизно 10% від загальної КІЛЬКОСТІ зеаксантину в цій композиції 8 Композиція за п 7 у вигляді дозованої форми, причому кожна дозована форма містить щонайменше приблизно 0,1 мг 3R-3'R-crepeoi3OMepy зеаксантину 9 Композиція за п 7 у вигляді дозованої форми, причому кожна дозована форма містить щонайменше приблизно 1 мг 3R-3'R-crepeoi3OMepy зеаксантину 10 Композиція за п 7, яка відрізняється тим, що носій являє собою харчовий продукт, що може прийматися всередину людьми 11 Композиція за будь-яким з пп 7-10, яка відрізняється тим, що зеаксантин має захисну оболонку, призначену для уповільнення розкладу зеаксантину в шлунку 12 Композиція за будь-яким з пп 7-10, яка відрізняється тим, що містить непатогенні мікробні клітини, які містять 3R-3'R-crepeoi3OMep зеаксантину в концентрації щонайменше 2% (мас), у вигляді фракції мікробної клітинної маси 13 Композиція, ЩО МІСТИТЬ 3R-3'R-crepeoi3OMep зеаксантину в носи або розчиннику, призначеному для перорального приймання людиною, в КІЛЬКОСТІ, яка є терапевтично ефективною для застосування при лікуванні або для попередження дегенерації жовтої плями у людей 14 Композиція за П 13, яка відрізняється тим, що 3R-3'R-crepeoi3OMep зеаксантину складає щонайменше приблизно 9 0 % від загальної КІЛЬКОСТІ зеаксантину в цій композиції, a S-S- та S-Rстереоізомери складають менше приблизно 10% від загальної КІЛЬКОСТІ зеаксантину в цій композиції 15 Композиція за П 13, яка відрізняється тим, що практично не містить ані S-S-, ані R-Sстереоізомерів зеаксантину 16 Композиція за будь-яким з пп 13-15 у вигляді дозованої форми, причому кожна дозована форма містить щонайменше приблизно 0,1 мг 3R-3'R О 00 (О 61899 стереоізомеру зеаксантину 17 Композиція за будь-яким з пп 13-15 у вигляді дозованої форми, причому кожна дозована форма містить щонайменше приблизно 1 мг 3R-3'Rстереоізомеру зеаксантину 18 Композиція за будь-яким з пп 13-15, яка відрізняється тим, що носій являє собою харчовий продукт, що може прийматися всередину людьми 19 Композиція за будь-яким з пп 13-18, яка відрізняється тим, що зеаксантин має захисну оболонку, призначену для уповільнення розкладу зеаксантину в шлунку 20 Композиція за будь-яким з пп 13-18, яка відрізняється тим, що містить непатогенні мікробні клітини, які містять 3R-3'R-crepeoi3OMep зеаксантину в концентрації щонайменше 2% (мас), у вигляді фракції мікробної клітинної маси 21 Застосування 3R-3'R-crepeoi3OMepy зеаксантину як інгредієнта харчової добавки, придатної для лікування людей, у вигляді дозованої форми, придатної для перорального введення людям та такої, що містить 3R-3'R-CTepeoi3OMep зеаксантину в КІЛЬКОСТІ, достатній для того, щоб зумовити відкладення на СІТКІВЦІ такої КІЛЬКОСТІ додаткового зеаксантину при прийманні однієї дозованої форми на добу, що може бути виявленою, причому цей 3R-3'K-CTepeoi3OMep зеаксантину складає щонайменше приблизно 90% від загальної КІЛЬКОСТІ зеаксантину в зазначеній харчовій добавці, a 3S3'S- та 3S-3'R-CTepeoi3OMepH складають менше приблизно 10% від загальної КІЛЬКОСТІ зеаксантину в зазначеній харчовій добавці 22 Харчова добавка у вигляді дозованої форми, придатної для використання людиною, яка містить 3R-3'R-crepeoi3OMep зеаксантину і фізіологічне прийнятний носій, причому одна дозована форма містить 3R-3'R-CTepeoi3OMep зеаксантину в КІЛЬКОСТІ, достатній для того, щоб зумовити таке підвищення концетрацм зеаксантину на СІТКІВЦІ при прийманні однієї дозованої форми на добу, що може бути виявленим Даний винахід відноситься до біохімії, зокрема до певного ізомеру жовтого пігменту, який називається зеаксантином (скорочено ZX) При уведенні людям як ліки або вітамін цей пігмент може лікувати або відвертати захворювання, яке називається дегенерацією жовтої плями, що пошкоджує сітківку і може призводити до сліпоти Сітківка являє собою тканину, яка вистилає задню стінку очного яблука Вона має складну будову і складається з безлічі різноманітних шарів Вона описана і проілюстрована в багатьох медичних посібниках, таких, як Gittinger, 1988 та Vaughn і Asbury, 1992 (повний перелік посилань наведений нижче в КІНЦІ опису) В центрі СІТКІВКИ у людей знаходиться особлива округла ділянка, що має діаметр приблизно 11,5мм і називається жовтою плямою Жовта пляма має дві характерні особливості, що відрізняють її від іншої частини СІТКІВКИ По-перше, жовта пляма містить відносно небагато паличок, більша частина и фоторецепторів має форму колбочок (в ямці, розташованій в самому центрі жовтої плями, палички повністю відсутні) По-друге, жовта пляма має чітко виражений жовтий колір, якого надають йому два пігменти, котрі називаються лютеїном та зеаксантином Обидва цих пігменти відносяться до класу молекул, які називаються "каротиноїдами" ХІМІЯ ЦИХ каротиноідних пігментів описана нижче, після стислого викладення особливостей дегенерації жовтої плями Існує декілька типів дегенерації жовтої плями Тип, що зустрічається найбільш часто, називається "віковою дегенерацією жовтої плями", що звичайно скорочено називається в англомовній літературі AMD (або в деяких публікаціях ARMD) AMD може викликати порушення зору в діапазоні від слабкої втрати зору до повної сліпоти Існує дві форми AMD, які часто називаються "вологою" та "сухою" формами При вологій формі відбувається інтенсивне зростання капілярів та інших кровоносних судин в СІТКІВЦІ аж до того, що кровоносні судини порушують і руйнують відповідну будову шарів СІТКІВКИ Хоча інколи ця форма AMD піддається лікуванню з використанням лазера, що дозволяє закупорювати знов утворені кровоносні судини, таке лікування може лише уповільнити на деякий час зростання кровоносних судин і звичайно не може відвернути з часом майже повну втрату зору, волога AMD майже завжди призводить до повної або майже повної сліпоти Волога форма зустрічається тільки у приблизно 5-10 ВІДСОТКІВ пацієнтів, що страждають від AMD Дегенерація жовтої плями Поняття "дегенерація жовтої плями" відноситься до будь-якого стану, який включає прогресуюче пошкодження клітин СІТКІВКИ або фоторецепторних колбочок в ДІЛЯНЦІ жовтої плями в центрі СІТКІВКИ Воно описане та проілюстроване в багатьох публікаціях і посібниках, таких, як Taylor, 1993, Gittinger, 1988 та Vaughan і Asbury, 1992 Інша форма AMD називається "сухою" формою AMD Оскільки вона зустрічається щонайменше в 90% всіх випадків захворювання, и часто називають просто AMD Хоча ця форма AMD звичайно не призводить до повної сліпоти, вона може призвести до серйозного порушення зору пацієнта і до того, що пацієнт виявляється нездатним читати або розпізнавати добре ВІДОМІ предмети або обличчя людей, наприклад, обличчя друзів або родичів В цьому випадку хвороба часто призводить до функціональної сліпоти, роблячи людей неспроможними керувати автомобілем або впевнено здійснювати прогулянки в громадських місцях та неспроможними вести нормальний активний спосіб життя Також відомо декілька захворювань, при яких 61899 як симптом виявляється дегенерація жовтої плями, включаючи хворобу Старгарта, хворобу Беста, хворобу Баттона, синдром Шегрена-Ларссона, дистрофію колбочок-паличок і овечий воскоподібний ліпофусциноз Посилання на статті, в яких описане кожне з цих захворювань, наведені у DoreyTam, 1993 Крім того ІНШІ захворювання, які зумовлені проблемами накопичування в лізосомах (наприклад, хвороба Тея-Сакса), або прогресивна дегенерація нервових клітин (наприклад, хвороба Альцгеймера), також пов'язані з дегенерацією жовтої плями Багато з цих захворювань мають генетичні складові, що доводиться спадкоємністю, були виділені декілька генів, викликаючих ці захворювання, і за допомогою тестів, що грунтуються на генетичному скринінгу, можна встановити, чи має пацієнт дефектний ген Кожна людина, котра має або напевно може мати такий ген, що встановлюється на основі генетичного тестування або родинного анамнезу, наражається на підвищений ризик дегенерації жовтої плями В результаті поступового погіршення зору AMD завдає сильні страждання Це коштує мільярди доларів кожного року, що виражається як у вигляді втрати продуктивності, так і у важкому тягарі, що лягає на членів родини, страхові агентства, соціальні служби та інших, хто повинен забезпечувати або допомагати оплачувати медичний догляд й ІНШІ види допомоги людям, які страждають від сліпоти або серйозного порушення зору У СВІТЛІ проблем, що викликаються AMD, вчені й лікарі протягом десятиліть шукали способи лікування або запобігання сліпоти та інших порушень зору, викликаних дегенерацією жовтої плями Однак незважаючи на всі ці зусилля протягом більш ніж половини сторіччя, в НИНІШНІЙ час відсутні ефективні засоби лікування Діагноз друзи та ліпофусцин Звичайно дегенерацію жовтої плями виявляють за допомогою спеціальних фотографій СІТКІВКИ При проведенні однієї з діагностичних процедур пацієнту ін'єкують флуоресцентні ліки, після цього протягом деякого проміжку часу лікам дають проникнути в кровоносну систему пацієнта і роблять збільшений фотографічний знімок СІТКІВКИ, який називається ангіограмою Після цього фотографічний знімок аналізують для визначення наявності та концентрації якогось одного або обох типів клітинного дебриса Один тип клітинного дебриса, який відомий і піддавався вивченню протягом декількох десятиріч, називається друзами Він зустрічається у двох різних формах Звичайно в очах будь-якої людини старше 40 років є невелика КІЛЬКІСТЬ твердих друзів (малих часток діаметром менше бЗмкм) До тих пір, доки їхня КІЛЬКІСТЬ не перевищує нормальний рівень, наявність твердих друзів не свідчить про пошкодження СІТКІВКИ На відміну від цього утворення значної КІЛЬКОСТІ більших м'яких друзів (які також називаються вологими друзами) свідчить про те, що відбулося або відбувається істотне, пошкодження СІТКІВКИ, ОСКІЛЬКИ більші утворення м'яких друзів можуть руйнувати і порушувати організацію шарів СІТКІВКИ та перешкоджати отриманню клітинами СІТКІВКИ потрібної КІЛЬКОСТІ харчових речовин з крові Пацієнт, сітківка якого містить значну КІЛЬКІСТЬ М'ЯКИХ друзів, звичайно відноситься до страждаючих від дегенерації жовтої плями Інший тип дебриса СІТКІВКИ, ЯКИЙ звичайно присутній у пацієнтів, що страждають від дегенерації жовтої плями, називається ліпофусцином Кореляція між ліпофусцином і AMD стала очевидною лише нещодавно (див , наприклад, Welter та ш , і DoreyTa ін , 1993) ХІМІЯ каротиноїдів "Каротиноїди" включають великий клас молекул, в природі було виявлено понад 600 каротиноїдів Ці молекули володіють декількома характерними особливостями, якими є наступні 1 Каротиноїди утворюються шляхом злиття молекул ізопрену, що містять 5 атомів вуглецю Оскільки "будівельний блок" містить 5 атомів вуглецю, більшість каротиноїдів містить багато блоків, що складаються з 5 атомів вуглецю 2 Каротиноїди мають багато ненасичених зв'язків Це дозволяє їм поглинати високоенергетичні СВІТЛОВІ хвилі в блакитній та близькій до ультрафіолетової частинах спектра 3 Оскільки каротиноїди поглинають хвилі з довжиною хвилі, що відповідає блакитній та близькій до ультрафіолетової частинам спектра, не поглинаючи більш довгі хвилі в інших частинах спектра, звичайно каротиноїди мають жовтий, оранжевий, коричневий або червоний колір Назва "каротиноїд" утворилася від слова "морква" (carrot), першими відомими каротиноїдами, що були виявлені як пігменти, є такі, які придають моркві оранжевий колір Колір, який каротиноїди надають розчину, може залежати від різних чинників, в тому числі від концентрації та присутності інших ХІМІЧНИХ сполук 4 Каротиноїди мають "кон'юговані" ПОДВІЙНІ зв'язки Це означає, що ПОДВІЙНІ ЗВ'ЯЗКИ чергуються з простими зв'язками, тому кожний атом вуглецю в ланцюзі сполучений подвійним зв'язком з одним іншим атомом вуглецю, але жоден атом вуглецю не сполучений подвійним зв'язком з двома іншими атомами вуглецю Таке розміщення показане на фіг1, де наведені будови р-каротину, ZXTa лютеїну Різноманітні каротиноїди мають різні рівні кон'югації, а більш високо кон'юговані молекули в цілому забезпечують кращий захист від "фототоксичного" пошкодження високоенергетичним світловим випромінюванням Наприклад, в трьох каротиноїдах, наведених на фіг1, вся частина прямого ланцюга кон'югована навперемінно за допомогою подвійних та простих зв'язків В р-каротині і ZX кон'югація сягає перших зв'язків на обох кінцевих кільцях На противагу цьому лютеїн має менший рівень кон'югації, оскільки подвійний зв'язок в одному з його кінцевих кілець не розміщений таким чином, щоб забезпечити повну кон'югацію Єдина ВІДМІННІСТЬ між ZX і лютеїном полягає в розташуванні подвійного зв'язку в одному (а не в обох) з кінцевих кілець Оскільки каротиноїди утворюються і піддаються селекції (шляхом еволюції) таким чином, щоб поглинати потенційно шкідливу енергію блакитного і близького до ультрафіолетового світла, в при 61899 родних умовах вони використовуються як захисні пігменти їх виявляють у великій КІЛЬКОСТІ в рослинах, оскільки одна з основних функцій рослин полягає в максимально можливому поглинанні сонячного світла, мінімізуючи при цьому пошкодження клітин блакитним, ультрафіолетовим і близьким до ультрафіолетового випромінюванням Пошкодження ультрафіолетовим випромінюванням рослин являє собою важливу проблему, і каротиноїди допомагають мінімізувати таке пошкодження Оскільки каротиноїди добре пристосовані для захисту від фототоксичного пошкодження, тварини також придбали певні здатності (в процесі еволюції) використовувати каротиноїди як світлозахисні пігменти Тварини не можуть синтезувати каротиноїди в своїх організмах, тому вони повинні поглинати каротиноїди (або попередників каротиноїдів) з рослинних джерел Одним з прикладів є ркаротин, ссавці мають одержувати його з рослин або з їжі Потрапивши до організму ссавця, ркаротин перетворюється в ІНШІ молекулярні форми, у тому числі у вітамін А (ретинол), який утворюється в результаті розщеплення р-каротину на дві половини Каротиноїди поділяють на два основних класи каротини і ксантофіли Каротини не містять атомів кисню і являють собою справжні вуглеводні, що складаються тільки з вуглецю і водню На відміну від цього ксантофіли (такі, як ZX і лютеїн) містять також і кисень На фіг 1 показана нумерація атомів вуглецю в лівому та правому кінцевих кільцях ZX Атомам вуглецю в лівому кінцевому КІЛЬЦІ прийнято присвоювати номери від 1 до 6, а в правому кінцевому КІЛЬЦІ їм присвоюють номери "зі штрихом", наприклад, З'-атом вуглецю (читається "три штрих") Оскільки ZX повністю симетричний по відношенню до лівого і правого КІНЦІВ, ПОНЯТТЯ "ЛІВИЙ" І "правий" є чисто умовними і служать для спрощення опису Однак слід відзначити, що лютеїн не є симетричним положення подвійного зв'язку в "лівому" КІЛЬЦІ не таке ж, як положення подвійного зв'язку в "правому" КІЛЬЦІ Оскільки ZX утворюється шляхом додання в структурі р-каротину двох гідроксильних груп до атомів вуглецю в положенні 3 на обох кінцях, то він має хімічну назву 3,3'-дипдрокси-р-р-каротин, деякі ХІМІКИ називають його каротиндюлом Цій молекулі була дана назва "зеаксантин", тому що первісно вона була ідентифікована як пігмент, що надає кукурудзі її жовтий колір, а наукова назва кукурудзи Zea mays Як було відзначено вище, в природі було виявлено понад 600 каротиноїдів Декілька десятків мають важливе біохімічне і комерційне значення Для даного винаходу особливо важливі ZX і лютеїн, оскільки вони присутні в сітківках ссавців та більшості інших тварин Лютеїн є комерційно важливим, оскільки його широко використовують як кормову добавку (у вигляді рослинних екстрактів, в основному на основі календули) для курчат, що надає їхній шкірі і яєчному жовтку більш жовте забарвлення, що приваблює продавців і споживачів ZX може справляти такий самий ефект, до того ж він є більш сильним в порівнянні з лютеїном, 8 однак джерела ZX занадто дорогі для застосування в кормах для домашньої птиці Патенти США 5308759 і 5427783 (на ім'я Gierhart, передані Applied Food Biotechnology, Inc , тієї ж самої компанії, яка є правонаступником і заявником по даній заявці) були спрямовані на вирішення проблеми, яка полягає в тому, що ZX є надто дорогим для застосування в кормах для тварин Ці патенти пов'язані із застосуванням бактерій для виробництва ZX в промислових кількостях, щоб його можна було додавати в корм для домашньої птиці та риби Окрім рослин, деякі каротиноїди синтезуються певними бактеріями Еволюція цих бактерій відбувалася в місцях, підпадаючих під пряме сонячне світло, і їхні каротиноїди виконують ту ж саму світлозахисну функцію, що і в рослинах Публікації, в яких описані каротиноїди з бактерій, включають McDermott та ш , 1972, патент США 5429939 (Misawa та ш , 1995) та ІНШІ статті, вказані в цих посиланнях В патенті США 5429939 (Misawa та ш , 1995) перелічені ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК великої КІЛЬКОСТІ генів, які кодують ферменти, що беруть участь в біосинтезі різноманітних каротиноїдів, включаючи ZX Також описана роль кожного з основних генів (включаючих crtE, crtB, crtl, crtY i crtZ) у створенні ZX Клітини, ЩО МІСТЯТЬ плазміди, які несуть ці гени, були депоновані в Американській колекції типових культур (такі, як Erwmia uredovora, ATCC 19321, і Erwmia herbicola, ATCC 39368) та в Fermentation Research Institute в Японії (наприклад, Е coh PERM BP 2377) Стереохімія та ізомери зеаксантину Важливими поняттями в хімії каротиноїдів є "стереохімія" та "стереоізомери" Вони пояснюються в будь-якому підручникові з органічної хімії Якщо органічна молекула має атом вуглецю, до якого приєднані чотири різноманітних типи атомів або молекулярних груп, то такий атом вуглецю називається "хіральним" атомом вуглецю Якщо в органічній молекулі присутній хіральний атом вуглецю, то чотири різних групи, що приєднані до такого хірального атома вуглецю, можуть бути розміщені за будь-якій з двох схем Ці дві різні схеми називаються стереоізомерами Один з цих стереоізомерів буде повертати площину поляризації світла "за годинниковою стрілкою", а інший стереоізомер буде повертати площину поляризації світла "проти годинникової стрілки" Ізомер, що викликає обертання за годинниковою стрілкою, називається R-стереоізомером (він також називається D-стереоізомером) Ізомер, що викликає обертання проти годинникової стрілки, називається S-стереоізомером (він також називається L-стереоізомером) Оскільки обидва атоми вуглецю в положенні З і 3' в ZX є хіральними, існує чотири можливих стереоізомери В 3R-3'R-i3OMepi обидва атоми вуглецю в положенні 3 і 3' мають R-конфігурацію В 3SЗ'Б-ізомері обидва атоми вуглецю в положенні 3 і З' мають L-конфігурацію Для зручності ці два стереоізомери в даному описі називаються R-Rізомером і S-S-ізомером Третій і четвертий ізомери являють собою "змішані" або "мезо"- (один R- і один S-J-ізомери 3R-3'S-i3OMep і 3S-3'R-i3OMep Оскільки ZX повню 61899 10 Після ТОГО, ЯК була встановлена фотозахисна тю симетричний відносно своєї середини, ці два роль каротиноїдів у тварин, почалося вивчення ізомери ідентичні в усіх відношеннях, якщо 3R-3'Sхімії та ролі каротиноїдів в СІТКІВЦІ В одній серії ізомер намалювати на аркуші паперу, то, переверекспериментів проводили тести, в яких тваринам таючи аркуш паперу, його можна перетворити в давали корм, який не містив жодних каротиноїдів і 3S-3'R-i3OMep Фактично простий "мезо"-ізомер був приготований із зерен або насіння, що не місскладається як з S-R -, так і з R-S-ізомерів тили жодних каротиноїдів (таких, як насіння проЯкщо для отримання ZX використовуються са) Результати показали, що в СІТКІВЦІ лабораторстандартні методи ХІМІЧНОГО синтезу, то вміст кожних тварин, позбавлених каротиноїдів, не утворюного з чотирьох можливих ізомерів буде складати валися ділянки жовтої плями, а ці СІТКІВКИ мали приблизно 25% від загальної КІЛЬКОСТІ Однак, аномально високі рівні м'яких друзів, що свідчило оскільки S-R- і R-S-ізомери в ДІЙСНОСТІ ідентичні, про пошкодження СІТКІВКИ (Malmow та ш , 1980, їхній "мезо"-ізомер буде становити 50% від загаKirschfeld, 1982, Ham та ш , 1984 і SnodderlyTa ш , льної КІЛЬКОСТІ, тоді як на частку кожного з R-R - і 1984) В СВІТЛІ цих відкриттів було висловлене S-S-ізомерів буде припадати приблизно по 25% припущення, що каротиноїди, напевне, мають ісСуміш всіх трьох стереоізомерів називають "рацетотне значення для здорової СІТКІВКИ Було одермічною" сумішшю жано підтвердження на молекулярному рівні стаОднак специфічність каротиноїдів по віднорої істини, що морква та зелені овочі корисні для шенню до клітини і ферменту в тканині СІТКІВКИ Є очей Однак до даного часу не відомо, повинні настільки точною, що різноманітні ізомери або жовті пігменти в СІТКІВЦІ бути одержані з їжею в стереоізомери не є взаємозамінними Лютеїн і ZX остаточній формі чи вони можуть бути синтезовані сприймаються клітинами СІТКІВКИ ЯК абсолютно в організмі тварин з інших попередників, таких, як різні і різноманітні молекули, незважаючи на те, Р-каротин аболікопен що за звичайною ХІМІЧНОЮ термінологією вони можуть розглядатися як ізомери один одного (оскільЛютеїн був ідентифікований в 1949р як один із ки вони мають однакову КІЛЬКІСТЬ атомів вуглецю, жовтих пігментів жовтої плями (Wald, 1949) ZX водню і кисню) ідентифікували як другий пігмент жовтої плями лише через багато років (Bone та ш , 1985) ПубліВнаслідок наявності біологічних чинників єдикації, в яких узагальнені ВІДОМІ знання про пігмент ними ізомерами, що розглядаються в даному опижовтої плями до середини або до кінця 80-х років, сі, є стереоізомери Будь-яке посилання в даному включають Handelman і Dratz, 1986, Werner та ін , описі на "ізомер" зеаксантину відноситься до конкретного стереоізомеру ZX і не включає лютеїн 1987, Pease та ш , 1987, Haegerstrom-Portnoy, Лютеїн та ZX розглядаються як абсолютно різні 1988, і Handelman та ш , 1988 Крім того, згідно з каротиноїди цими публікаціями було встановлено, що ZX (який Стереоізомерні ВІДМІННОСТІ каротиноїдів, що є повністю кон'югованим, а отже, забезпечує дещо можуть показатися малими, ледь помітними і небільш кращий захист від пошкодження, викликанозначними, фактично виявляються виключно важго світловим випромінюванням, ніж лютеїн) є доливими, якщо це стосується тканини СІТКІВКИ Певмінуючим пігментом в ямці, малій ДІЛЯНЦІ В самому но, єдиним стереоізомером ZX, що ВІДПОВІДНИМ центрі жовтої плями КІЛЬКІСТЬ ZX поступово змечином сприймається та використовується клітинаншується, а КІЛЬКІСТЬ лютеїну збільшується у міру ми СІТКІВКИ людини, є R-R-ізомер (3R-3^-crepeoвіддалення в радіальному напрямі від ямки до ізомер) ЗОВНІШНІХ країв жовтої плями, тому на ЗОВНІШНІЙ периферії жовтої плями лютеїн є домінуючим жовВ літературі є повідомлення, що в тканині СІТтим пігментом До більш сучасних публікацій, що КІВКИ були виявлені СЛІДОВІ КІЛЬКОСТІ мезо-ізомеру присвячені різноманітним аспектам старіння і по(R-S-ізомеру) ZX Однак ці СЛІДОВІ КІЛЬКОСТІ, напевшкодження СІТКІВКИ і в яких спеціально обговорюне, зумовлені певними молекулярними перетвоється роль каротиноїдів як захисних агентів в СІТКІреннями, що можуть відбуватися спонтанно в деВЦІ, ВІДНОСЯТЬСЯ роботи Sperduto та ш , 1990, яких умовах, призводячи до утворення мезоGerster, 1991, Schalch, 1992 і Seddon та ін , 1994 зеаксантину з попередників лютеїну (Bone та ш , 1993і 1994) В цілому вже понад 10 років відомо, що лютеїн В лабораторних умовах стереоізомери ZX моі ZX являють собою два пігменти, присутніх в жовжуть бути відділені один від одного з використантій плямі, і понад десять років в науковому сереням таких методів, як хіральна хроматографія на довищі обговорюється питання про те, що ці пігколонках (Bone та ш , 1993) або аналіз кругового менти можуть сприяти захисту жовтої плями від дихроїзму (Bntton, 1994) фототоксичного пошкодження Зеаксантин і лютеїн в жовтій плямі Однак незважаючи нате, що ці відкриття були До 1970 року роль каротиноїдів в захисті росзроблені, а гіпотези висловлені понад 10 років толин від фототоксичного пошкодження була добре му, до цього часу не розроблено жодного типу відома Було також відомо, що каротиноїди присуЛІКІВ, харчової добавки або добавки до харчового тні в тканині тварин і що всі каротиноїди, присутні раціону чи іншої форми лікування, які виявилися б в організмі тварин, мають походження з рослин, ефективними для дійового попередження або упооскільки тварини не можуть синтезувати каротиновільнення (не кажучи вже про реверсії) поступовоїди На основі цієї інформації в різних публікаціях го розвитку дегенерації жовтої плями відзначалася схожість між каротиноїдами в органіПопередня фраза потребує деякого уточнензмі тварин та в рослинах і був зроблений висновок ня, оскільки відомо, що і р-каротин, і вітамін А, і про те, що каротиноїди захищають тварин від фовітамін Е можуть чинити деякий сприятливий тотоксичного пошкодження вплив, сприяючи захисту тканини СІТКІВКИ (ДИВ , 12 11 61899 наприклад, патент США 5310764, Baranowitz та ін , щодавно опублікувала дві статті, названі 1994 і дві статті Eye Disease Case Control Study "Antioxidant status and neovascular age-related Group, зазначені нижче) В цих патентах і статтях macular degeneration", Arch Ophtalmol,11 104-109 говориться, ВІДПОВІДНО припускається, що і р(1993) та "Risk factors for neovascular age-related каротин, і вітамін А, і вітамін Е можуть справляти macular degeneration", Arch Ophtalmol, 10 1701 помітну дію щодо попередження або зменшення 1708 (1992) Як і в офіційних звітах NIH, в жодній з пошкодження, пов'язаного з дегенерацією жовтої цих статей не обговорюється і не пропонується плями використання зеаксантину як ЛІКІВ ДЛЯ лікування AMD, і цей консорціум також припинив або відмоТакі ствердження можуть бути правильними, вився фінансувати будь-які дослідження ZX як зважаючи на загальну антюксидантну роль каропотенційного агента для лікування або поперетиноїдів, вітаміну А і вітаміну Е Однак, на жаль, дження AMD також вірним є й те, що корисний вплив, що чиниться р-каротином, вітаміном А і вітаміном Е на Слід також відзначити, що каротиноїди являсітківку, є дуже обмеженим і не досягає рівня, ВІДють великий інтерес для лікування або попереПОВІДНОГО ефективному лікуванню В усіх практичдження раку (починаючи з робіт Peto та ш , 1981) і них ситуаціях дегенерацію жовтої плями не можна для попередження утворення холестерину та змевідвернути, зупинити і повернути Будь-які антюкншення відкладень бляшок в артеріях (Jialal та ш , сиданти широкого спектра (такі, як р-каротин, ві1991) Є величезна КІЛЬКІСТЬ наукової літератури, тамін А і вітамін Е) є лише паліативними засобами де досліджуються різноманітні види активності Оскільки В розпорядженні не малося дійсно ефеккаротиноїдів, і існує великий інтерес в розробці тивних ЛІКІВ, застосовували ці вітаміни (з дуже обзасобів ХІМІЧНОГО синтезу каротиноїдів, включаючи меженим і незадовільним успіхом), щоб спробувалютеїн і ZX Однак незважаючи на всі дослідження ти уповільнити неминуче пошкодження, що виклив галузі каротиноїдів і зусилля по розробці синтекається дегенерацією жовтої плями зу, зроблені в останні десятиріччя, досі не було опубліковано жодного ефективного засобу лікуВІДПОВІДНО ДО ВІДОМОГО рівня техніки слід тавання або попередження дегенерації жовтої плякож відзначити, що продається багато каротиноідми Зважаючи на величезні видатки і страждання, них препаратів з маркіруванням, вказуючим, що що завдаються людям і суспільству захворюванвони корисні для очей і зору Таке маркірування на ням, пов'язаним з дегенерацією жовтої плями, йокаротиноїд них сумішах може бути допустимим, го слід визнати величезною проблемою, що пооскільки (як вказано вище) відомо, що р-каротин і требує свого вирішення вітамін А в цілому корисні як загальні антюксиданОтже, даний винахід дозволяє зробити істотти Однак жодна з наявних в продажу каротиноідний крок вперед у створенні як (1) безпечних та них сумішей не містить ZX в кількостях, більших, ефективних ЛІКІВ для лікування пацієнтів, у яких ніж виключно малі "СЛІДОВІ" КІЛЬКОСТІ Величезна було діагностовано дегенерацію жовтої плями, так більшість каротиноїдів в каротиноідних сумішах, і (2) харчової добавки типу пілюлей з вітамінами, наявних в продажу, є каротиноїдами не зеаксантиякі можуть вживатися кожною людиною, бажаюновоготипу (в основному р-каротин і вітамін А) чою знизити ризик дегенерації жовтої плями по Пильної уваги також заслуговують позиція і досягненні або при перевищенні середнього віку ДОСЛІДНІ ЦІЛІ деяких важливих урядових агентств і Синтез лютеїну і зеаксантину прототипи дослідних консорціумів В Сполучених Штатах В різноманітних роботах, що відносяться до Америки Національними інститутами здоров'я рівня техніки, описані способи одержання ZX Ці (National Institutes of Health), ((діючими через Націроботи можуть бути згруповані у дві категорії феональний інститут ока (National Eye Institute (NEI) рментативні способи, в яких мікроби відіграють та Національну консультативну раду з ока ключову роль в процесі виробництва, і нефермен(National Advisory Eye Council)), нещодавно були тативні способи синтезу, в яких використовуються опубліковані два звіти під назвою "Vision Research чисто ХІМІЧНІ реакції В більшості таких робіт приA National Plan 1994-1998", NIH Publication №93пускається, що ZX повинен використовуватися з 3186 (1994) (див зокрема crop 55-65) та "Age відомою метою, наприклад, у вигляді кормових related eye disease study", NIH Publication 93-2910 добавок для домашньої птиці або риби з метою (1993) В обох публікаціях і описаних в них дослінадати більш темного кольору м'ясу і зробити його дженнях увагу сконцентровано на р-каротині (а не більш привабливим Очевидно, що жоден з цих на ZX) як сполуки, якій віддається найбільша песпособів не призвів до виробництва або продажу ревага при лікуванні AMD За відомостями, які має ZX в промислових кількостях заявник, після обговорення питання з офіційними особами з NEI, ані NEI, ані будь-яка інша організаЩе в жовтні 1995р єдиний спосіб придбання ція, пов'язана з Національними інститутами здороZX або в очищеній формі, або в напівконцентров'я, не бажає фінансувати або не фінансувала в ваній формі, де ZX становить більше приблизно недавньому часі якісь дослідження зеаксантину як 5мас %, полягав в придбанні міліграмових кількопотенційних ЛІКІВ для AMD Замість цього NIH та стей ZX у спеціалізованих ХІМІЧНИХ компаній, таких, ІНШІ державні організації асигнують мільйони дояк Atomergic Chemicals Corporation (Farmmgdale, ларів на проведення досліджень р-каротину як NY) або Spectrum Chemical Manufacturing Company найбільш багатообіцяючого потенційного агента (Gardena, CA) В 1995р ціни у цих спеціалізованих для лікування або попередження AMD виробників на очищений ZX у вигляді синтезованих рацемічних сумішей, що містять небажані S-SІнші визнані дослідники, котрі заслуговують та S-R-ізомери, складали від 90$ до 125$ за міособливої уваги, входять в організацію "Eye ліграм Це відповідає приблизно 100000$ (в долаDisease Case Control Study Group" Ця група не 14 13 61899 pax США) за грам ZX у вигляді рацемічної суміші рм продукують певний тип ЛІПІДІВ, що називаються Очевидно, що такі препарати потенційно не мають сфінголіпідами, АТСС перекласифікувала ці бакреальної можливості для їхнього використання як терії як Sphmgobactenum multivorum і внесла ці ЛІКІВ або харчових добавок як внаслідок їхньої ваклітини в свій каталог під цією назвою Назва ртості, так і внаслідок того, що вони містять більші Sphmgo-bactenum яка фігурує в каталозі АТСС, КІЛЬКОСТІ небажаних і можливо небезпечних S-S досі не з'явилася в жодній з цитованих робіт, що та мезо-ізомерів До даного винаходу очищений відносяться до офіційних посібників з таксономії або напівочищений R-R-зеаксантин просто не був мікроорганізмів Bergy's Manual of Systematic доступний в будь-якому його вигляді Bacteriology, доповнене та переглянуте в International Journal of Systematic Bacteriology Серед відомих публікацій, в яких описано одержання ZX з використанням мікробної ферментаПро роботи по одержанню ZX шляхом стандації, слід назвати наступні ртного-хімічного синтезу (без використання мікроорганізмів) повідомлялося протягом останніх 20 (1) Counngton і Goodwin, 1955, найбільш ранроків, в тому числі в патентах США 4153615 ню відому роботу, в якій описано одержання ZX за (Sausy, 1979), 4952716 (Lukas та ш , 1990) і допомогою бактерій з роду Flavobacter 5227507 (Lukas та ш , 1993) Однак ці способи ма(2) Патент США 3891504 (Schocher і Wiss, ють серйозні недоліки 1975, переданий фірмі Hoffman LaRoche), в якому також описано одержання ZX за допомогою клітин Звичайно вони потребують численних стадій Flavobacter Ці клітини, що містять ZX, додавали в реакції і на кожній стадії досягається вихід менше корм курчатам, викликаючи потрібне забарвлення 100%, тому залишковий вихід ZX в КІНЦІ багатостадійного процесу виявляється відносно малим (3) Патент США 3841967 (DasekTa ш , 1974) та Крім того, ХІМІЧНИЙ синтез звичайно дає небажані патент США 3951743 (Shepherd та ш , 1976) ОбиS-S - і S-R-стереоізомери ZX, а також різноманітні два патенти передані фірмі Nestle В них описані продукти перетворення або розкладу, такі, як окиспособи та харчові речовини, що можуть бути виснений зеаксантин і молекули зеаксантину, що користані для збільшення КІЛЬКОСТІ ZX, продуковавтратили один або більше подвійних зв'язків в ного бактеріями прямому ланцюзі і/або в кінцевих кільцях (4) Два більш сучасних патенти США (США 5308759 та 5427783, обидва на ім'я Gierhart), пеВ цілому до створення даного винаходу не буредані Applied Food Biotechnology, Inc , тому ж ло відоме джерело очищеного R-R-зеаксантину, правонаступнику і заявнику, що і у випадку даної придатного для споживання людиною або як ЛІКІВ, заявки В цих патентах описаний штам бактерій або як харчової добавки (Flavobactenum multivorum), виділений з русла ріки Отже, одним з об'єктів даного винаходу є відМіссурі Було виявлено, що ці бактерії продукують криття того факту, що штам F multivorum фірми ZX, не продукуючи при цьому значних кількостей AFB (реєстраційний номер АТСС 55238) і його муінших каротиноїдів Це було важливим при ствотовані нащадки продукують R-R-стереоізомер ZX у ренні корму для домашньої птиці і риби, який довигляді єдиного ізомеру, що виявляється, без кільзволяв би одержувати м'ясо і яєчний жовток більш костей, що виявляються, небажаних S-S- або S-Rтемного кольору, оскільки каротиноїди конкурують стереоізомерів один з одним при надходженні в кровотік після Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб припотрапляння до організму тварин Тому відсутність готування лікарського засобу для лікування пацієінших каротиноїдів, продукованих штамом F нтів, у яких було діагностовано дегенерацію жовтої rnulfivorum, що було встановлено Gierhart, може плями, зокрема вікова, заснований на використанзробити ZX більш придатним як пігмент для тканині клітин, що походять з штаму F multivorum фірми ни тварин і, отже, збільшити його потенційні можAFB (реєстраційний номер АТСС 55238) ливості та продуктивність Ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб виготовлення харчової добавки для людей в форВ патенті США 5308759 описані способи одемах типу пілюлей з вітамінами або у вигляді добаржання ZX для корму домашньої птиці і риби з вки до продуктів харчування, таких, як маргарин, використанням F multivorum фірми AFB В патенті для зменшення ризику виникнення дегенерації США 5427783 описані кормові суміші В обох патежовтої плями в більш пізньому ВІЦІ, заснований на нтах застосування ZX обмежене його використанвикористанні клітин, що походять з штаму F ням в кормі для домашньої птиці або риби і в жодmultivorum фірми AFB (реєстраційний номер АТСС ному з них не зроблено ніяких пропозицій з вико55238) ристання ZX для лікування людей В жодному з патентів, автором яких є Gierhart, Далі, об'єктом даного винаходу є препарати на не висловлено ніяких міркувань з приводу специоснові зеаксантину, що містять R-R-стереоізомер фічних стереоізомерів ZX з двох причин (1) харакяк єдиний або виразно домінуючий ізомер, у витеристики стереоізомерів ZX, продукованих F гляді композицій, призначених для орального приmultivorum фірми AFB, не були ВІДОМІ В 1989р, йому людиною або як ЛІКІВ ДЛЯ лікування захворюколи були подані заявки, та (2) оскільки в патентах вань чи дегенерації СІТКІВКИ, або як харчової добарозглядається виключно продуковані ZX для завки для зменшення ризику втрати зору в літньому стосування в кормі для домашньої птиці або риби, ВІЦІ не було видимої причини для розгляду різноманітЦі та ІНШІ об'єкти більш докладно пояснюютьних стереоізомерів ся в наведених нижче розділах "Стислий виклад" та "Опис винаходу" Штам дикого типу F multivorum фірми AFB був депонований в АТСС і йому був присвоєний реСтислий виклад суті винаходу єстраційний номер АТСС 55238 Оскільки ці бактеЗгідно З даним винаходом пропонується спосіб 16 15 61899 одержання зеаксантину, що містить 3R-3'Rізомерів Такі препарати подані в даному описі стереоізомер зеаксантину (також називається R-RНині З використанням аналізу на основі хіраізомером або R-R-зеаксантином) як такий, що єдильної хроматографії на колонках (як описано у но виявляється, або виразно домінуючий ізомер, Bone та ш , 1993) було підтверджено, що штам призначений для прийому всередину людиною як бактерії F multivorum (реєстраційний номер АТСС ліки або харчова добавка ZX, жовтуватий пігмент, 55238), виділений фірмою Applied Food що міститься в клітинах жовтої плями в СІТКІВЦІ Biotechnology (AFB), продукує R-R-ізомер у вигляді людини, поглинає блакитне і близьке до ультрафієдиного ізомеру ZX, що виявляється, при ферменолетового світлове випромінювання, захищаючи тації, як описано в прикладах ВІДПОВІДНО ДО призавдяки цьому сітківку від фототоксичного пошкокладу 4 аналіз, зроблений професором Landrum, дження Препарати ZX, що містять тільки потрібпоказав, що в препаратах ZX, одержаних шляхом ний R-R-ізомер, продукуються штамом клітин ферментації з використанням цих клітин із зазнаFlavobactenum multivorum (реєстраційний номер ченого штаму F multivorum, не виявлено помітних АТСС 55238) Ці бактерії не продукують ніяких кількостей ані S-S-ізомеру, ані R-S-мезоізомеру помітних кількостей небажаних S-S - або S-RВІДМІННОСТІ МІЖ R-R -, R-S - або S-S-ізомерами стереоізомерів і не синтезують значних кількостей зеаксантину можуть бути дуже важливими, якщо інших каротиноїдів, таких, як р-каротин або лютеїн, препарати на основі ZX уводять людям як лікарсьякі можуть конкурувати з ZX щодо аліментарного кий засіб або харчову добавку, оскільки єдиний поглинання після орального уведення Після синізомер ZX, який присутній в природних умовах в тезу з використанням цих бактерій ZX може бути СІТКІВЦІ людини, є R-R-ізомер Напевне, уведення очищений такими методами, як екстракція розчинвсередину значних кількостей R-S - і S-S-ізомерів ником, і його можуть вживати орально або як тебуде дуже небажаним і шкідливим з медичної точрапевтичний лікарський засіб пацієнти, котрі страки зору, оскільки (1) R-S - і S-S-ізомери не зустріждають від дегенерації жовтої плями, або як харчаються в природних умовах в СІТКІВЦІ ока людини чову добавку людиною, котра хоче зменшити риза винятком можливості їхньої присутності в надзик вікової дегенерації жовтої плями, яка дуже звичайно незначних слідових кількостях як побічпоширена серед людей у ВІЦІ ВІД приблизно 50 або них продуктів, які утворюються при розкладі люте60 років Також пропонуються призначені для приїну всередині клітин СІТКІВКИ, та (2) R-S - і S-Sйому всередину композиції, такі, як (1) водонепроізомери можуть конкурентно заміщати потрібний никні капсули, що містять R-R-зеаксантин, змішаR-R-ізомер в тканині СІТКІВКИ, певно, призводячи до ний з носієм, таким, як рослинна олія, (2) різномасерйозного пошкодження клітин та медичних нітні харчові продукти (такі, як маргарин, молочні ускладнень продукти, сироп, тісто для домашнього випікання і Стереоізомерно чисті препарати ZX, одержані м'ясні напівфабрикати, які не піддають сильній шляхом ферментації з використанням штаму F тепловій обробці), що містять R-R-зеаксантин як multivorum ВІДПОВІДНО ДО даного опису, є виключно добавку, та (3) гранульовані композиції, які можна цінними, оскільки розподіл стереоізомерів ZX, додавати в супи, салати, напої або в іншу їжу одержаного шляхом ХІМІЧНОГО синтезу, є дуже складним і дорогим Хоча розподіл стереоізомерів На фіг 1 подані будови молекул р-каротину, може бути здійснений в невеликих кількостях на лютеїну і зеаксантину, показані будови всіх трьох лабораторних установках, він виявляється надміркаротиноїдів і система нумерації для кінцевих кіно дорогим при виробництві в промислових обсялець Ці будові ВІДОМІ з аналогів гах На фіг 2 подана технологічна схема, що опиЗастосування як ліки, що призначаються пацісує стадії ферментації і очищення ZX, продуковаєнтам, страждаючим AMD ного мікроорганізмами, що синтезують чистий 3RВІДПОВІДНО ДО першого об'єкта даного винахо3'R-CTepeoi3OMep зеаксантину ду препарат на основі R-R-зеаксантину, наведений Опис більш прийнятних варіантів здійснення в даному описі, може бути виготовлений і застосовинаходу вуватися як ліки, тобто як лікарський засіб, який В даній заявці описаний спосіб виготовлення може бути призначений лікуючими лікарями для лікарського засобу або харчової композиції, прилікування пацієнтів, у яких було діагностовано дезначеної для уведення людям для попередження генерацію жовтої плями або захворювання, що або зменшення дегенерації жовтої плями, хворобможе викликати дегенерацію жовтої плями як симливого стану, яка порушує зір і може призвести до птом або проявлення, наприклад, такі захворюсліпоти Препарати на основі зеаксантину, признавання, як хвороба Старгарта, хвороба Беста, хвочені для прийому всередину людьми, повинні місроба Баттона, синдром Шегрена-Ларссона, дистити 3R-3'R-CTepeoi3OMep ZX (що також називаєтьтрофія колбочок-паличок, овечий воскоподібний ся для зручності R-R-ізомером або R-Rліпофусциноз, або захворювання, пов'язане з назеаксантином) як "виразно домінуючий" ізомер В копичуванням в лізосомах, наприклад, хвороба контексті даного опису "виразно домінуючий ізоТея-Сакса мер" відноситься до препарату, що містить щонайменше 90% або більше R-R-ізомеру, а небажаПри використанні для такого лікування препані S-S- або S-R-ізомери складають менше 10% рат на основі ZX повинен включати достатню КІЛЬвсієї КІЛЬКОСТІ зеаксантину в препараті Більш приКІСТЬ R-R-ізомеру ZX для досягнення рівня терапейнятно будь-які препарати, призначені для виковтичного агента в носи або в формі (такій, як капристання людиною, повинні містити R-R-ізомер ZX сула), придатній для уведення людям, як описано як єдиний ізомер, що виявляється, та не містити нижче В більш прийнятному варіанті ZX, признапомітних кількостей небажаних S-S - або S-Rчений для медичного лікування, упаковують у ви 17 гляді стандартної дозованої форми, такої, як капсули або таблетки, при цьому кожна доза більш прийнятно повинна містити принаймні приблизно 1 міліграм (мг) R-R-зеаксантину і може при необхідності для досягнення кращої терапевтичної ефективності містити зеаксантин в діапазоні від приблизно Змг до приблизно Юмг ВІДПОВІДНО ДО другого об'єкта даного винаходу препарат на основі R-R-зеаксантину, наведений в даному описі, може бути виготовлений і застосовуватися як профілактичний лікарський засіб для пацієнтів, у яких було діагностовано підвищену чутливість до дегенерації жовтої плями внаслідок як родинного анамнезу, так і генетичної діагностики будь-якого з перерахованих вище захворювань Стандартні дози, приготовані для уведення таким пацієнтам, для яких характерний підвищений ризик захворювання AMD, але які ще не страждають гострою формою AMD, можуть містити менші КІЛЬКОСТІ, такі, як від приблизно 0,1 мг до приблизно 2мг на дозу З використанням даного опису будь-які з цих доз можуть мати доступну комерційну ціну Капсули, що містять 25 міліграмів (або будь-яку меншу КІЛЬКІСТЬ) В олійному рідкому носи, можуть бути виготовлені економічним способом з використанням мікробної ферментації в поєднанні зі стадією екстракції розчинником Порошкоподібні композиції, що містять навіть більш високі КІЛЬКОСТІ (наприклад, ЮОмг або більше на дозу) також можуть бути виготовлені при використанні більш екстенсивного очищення, наприклад, за допомогою методів, описаних в прикладі 4 Застосування як вітамінну або харчову добавку ВІДПОВІДНО ДО третього об'єкта даного винаходу ZX може бути виготовлений і упакований у вигляді вітамінної чи харчової добавки або добавки до харчових продуктів для прийому людьми, які в даний час не страждають від дегенерації жовтої плями, але хочуть зменшити ризик виникнення у них дегенерації жовтої плями в більш старшому ВІЦІ При прийомі всередину з цією метою ВІДПОВІДНІ дози повинні істотно перевищувати СЛІДОВІ КІЛЬКОСТІ, що містяться в порошках, які нині широко продаються, але вони повинні бути нижче, ніж у тому випадку, коли ZX застосовують як терапевтичні ліки для людини, щодо якої було встановлено, що вона страждає AMD Такі дози, що рекомендувалися для прийому всередину як добові дози, певно, повинні перебувати в діапазоні від приблизно 0,05мг до приблизно 5мг Наприклад, доза від 0,05 до 1,0мг може виявитися прийнятною, коли RR-зеаксантин є одним з десятка або більшого числа агентів в мультивітамінній капсулі або таблетці, тоді як доза від 1 до 5мг може бути прийнятною з метою роздрібного продажу людям, що бажають одержати більш високу дозу Безвідносно до того, чи використовується він як терапевтичні ліки або харчова добавка, препарат на основі ZX, призначений для використання людиною, повинен містити R-R-ізомер як єдиний або "виразно домінуючий стереоізомер" ZX В контексті даного опису поняття "виразно домінуючий ізомер" використовують для опису препарату на основі ZX, в якому потрібний R-R-ізомер ZX скла 61899 18 дає щонайменше приблизно 90% від всієї КІЛЬКОСТІ ZX в суміші, а небажані S-S- або S-R-ізомери складають менше приблизно 10% Більш прийнятно R-R-ізомер повинен бути єдиним ізомером ZX, що виявляється, в будьякому препараті, призначеному для прийому всередину людиною При здійсненні даного винаходу це стало можливим в промислових обсягах і за доступною ціною, оскільки ЛІНІЯ бактерії F multivorum, наведена в даному описі, продукує RR-ізомер у вигляді єдиного стереоізомеру ZX, що виявляється Якщо будь-який з S-S- або S-Rізомерів присутній в підданих ферментації сумішах після очистки, їх КІЛЬКІСТЬ виявляється занадто малою, щоб їх можна було виявити методами, описаними в прикладі 4 Крім того, на відміну від більшості бактеріальних штамів клітини F multivorum, наведені в даному описі, не продукують суміші каротиноїдів, ці клітини утворюють R-R-зеаксантин як єдиний каротиноїд, що виявляється Оскільки ZX повинен конкурувати з іншими каротиноїдами при аліментарному поглинанні і накопичуванні в тканині, це може виявитися корисним для збільшення поглинання ZXTa відкладення в СІТКІВЦІ ПІСЛЯ орального уведення, особливо у випадках, коли ZX застосовують як ліки для лікування діагностованих випадків дегенерації жовтої плями Промислове виробництво за допомогою бактеріальної ферментації Як відомо фахівцям з даної галузі техніки, способи, які використовуються для бактеріальної ферментації в лабораторних умовах, можуть бути дуже дорогими і погано піддаються контролю при їхній адаптації до великомасштабного виробництва Тому згідно з винаходом були розробрені поліпшені живильні середовища та способи промислового застосування виявлених авторами клітин F multivorum Поліпшені живильні середовища та способи істотно легше застосовувати, і вони істотно більш дешеві в перерахунку на один грам одержаного ZX порівняно із середовищами і умовами, описаними раніше в патентах США 5308759 і 5427783 Більш прийнятні живильні середовища та умови описані в прикладі 1 Після ферментації одна або декілька стабилізуючих сполук можуть бути додані до клітин з метою відвернути розклад ZX в процесі очистки Стабілізатори можуть бути додані в той час, коли клітини ще перебувають в судині для ферментації, до початку пастеризації або інших процесів Заявниками були вивчені різноманітні потенційні стабілізатори В даний час найкращі результати одержані з використанням комбінації стабілізаторів, зазначених в прикладі 2 Після додання стабілізаторів бактерії можуть бути піддані пастеризації шляхом нагрівання до 55°С протягом 25хв з метою вбити бактерії, не пошкоджуючи ZX Після ЦЬОГО культури охолоджують до кімнатної температури і механічними способами, такими, як мікрофільтрація з поперечним потоком, вилучають рідину з клітинної культури Це може збільшити концентрацію клітин і твердих часток від початкової величини, що складає приблизно 10об% до приблизно 60-80об % в фільтраті Цей процес дозволяє одержати клітинну пас 19 ТУ Певно, інтактні і такі, що перебувають в життєздатному стані, клітини F multivorum можуть бути придатні для безпосереднього прийому всередину людьми так само, як і ІНШІ продукти харчування (сир, йогурт, пиво і т п), що містять життєздатні або вбиті, але неушкоджені клітини мікроорганізмів Для клітин F multivorum відсутні дані про їхню патогенність Вони були виділені з холодного водотоку і, оскільки вони пристосовані до життя в холодній воді, не можуть нормально виживати або розмножуватися при температурі людського тіла Крім того, ці клітини не мають ніяких відомих токсичних складових, вони є грамнегативними і не мають будови стінок клітини, характерних для грампозитивних бактерій При їх безпосередньому скормлюванні птахам або рибам у формі клітинної пасти бактеріальні клітини, певно, є прийнятними як добрі носи ZX вивільнювався при поглинанні клітин тваринами та абсорбувався в кровотік і відкладався у ВІДПОВІДНИХ місцях в різноманітних тканинах (включаючи сітківку) Таким чином, інтактні клітини F multivorum, що містять R-R-зеаксантин, можуть бути придатні для безпосереднього прийому людиною при необхідності у вигляді будь-якої з трьох форм (1) у вигляді інтактної життєздатної форми, (2) у вигляді інтактної мертвої форми після пастеризації або (3) у вигляді композиції, в якій бактеріальні клітини були знищені і їхні мембрани були зруйновані з метою відкрити клітини і зробити ZX більш доступним Це може бути здійснене такими способами, як опромінення ультразвуком (з використанням високочастотних звукових хвиль), обробка високим тиском або подрібнення В іншому варіанті ця стадія може бути пропущена, якщо використовують процес екстракції розчинником, що руйнує КЛІТИННІ мембрани При необхідності спосіб одержання ZX може включати стадію промивання клітин, під час якої після ферментації вилучають залишки живильного середовища та відходи, що утворюються в результаті метаболізму, шляхом промивання клітин розчином, що містить будь-які потрібні інгредієнти, такі, як стабілізатори, консерванти, коригенти і т д Очистка При необхідності клітинна паста (що складається або з інтактних, або зі зруйнованих клітин) може бути висушена з метою подальшого концентрування клітин і збільшення концентрації ZX в сухій масі Це може бути здійснене механічними способами, такими, як сушіння при розпорошенні (з використанням нагрівання) або люфілізація (сушіння шляхом заморожування під вакуумом) Якщо застосовують сушіння, то твердий залишок, що утворився, звичайно називають висушеною біомасою, і вона звичайно містить приблизно 1-10% мас % ZX поряд з іншими твердими частками клітин, залишковими твердими частками середовища для ферментації та описаними вище стабілізаторами Для концентрування ZX, який в основному накопичується в клітинних мембранах, перед або після (або замість) зруйнування або сушіння може бути проведена стадія екстракції Прийнятні розчинники для екстракції звичайно включають поля 61899 20 рні органічні розчинники ВІДПОВІДНО ДО одержаних даних найкращим розчинником є тетрапдрофуран (ТГФ), що справляє активний вплив на клітини і робить зайвою окрему стадію руйнування мембран Хоча перемішування не є необхідним у випадку використання ТГФ при здійсненні процесу в лабораторних умовах, напевне, при промисловому виробництві перемішування під час стадії змішування з розчинником є необхідним Також були досліджені ІНШІ розчинники, і вони продовжують вивчатися і оцінюватися, але до даного часу не виявлений більш прийнятний розчинник, ніж ТГФ Досліджені до нинішнього часу органічні розчинники, які не мають циклічної будови (такі, як ацетон і діетиловий ефір), мали більш низький рівень розчинності в них ZX, а ІНШІ розчинники, такі, як метанол, етанол і гексан, мали ще більш низький рівень розчинності в H H X Z X Розчинник змішують з клітинною пастою або з висушеної біомасою в умовах, за яких розчинник здатний розчинити максимально можливу КІЛЬКІСТЬ ZX Розчинену рідку фракцію після цього ВІДДІЛЯЮТЬ ВІД твердих часток, використовуючи такі способи, як центрифугування або фільтрація Тверді частки можуть бути відкинуті або можуть використовуватися як вихідний матеріал для інших стадій процесу (включаючи при необхідності повторні цикли екстракції розчинником) Рідку фракцію обробляють для вилучення розчинника звичайно шляхом упарювання Після цього залишається в'язке масло, що містить R-R-зеаксантин, а також ІНШІ розчинні компоненти, проекстраговані з клітинної пасти розчинником Коли для однократної екстракції клітин, що містять 1-3мас% ZX, використовують ТГФ і коли далі ТГФ вилучають випарюванням, утворена рідина містить приблизно від 5 до 20мас % ZX Інший тип екстракції розчинником, для якого одержано попередні добрі результати, включає застосування суперкритичної рідини (тобто сполуки, яка звичайно при атмосферному тиску являє собою газ, але при підвищеному тиску перетворюється в рідину, діючу як розчинник) Двоокис вуглецю є найбільш широко застосовуваним розчинником для суперкритичної екстракції, а системи екстракції, засновані на застосуванні СОг в промислових масштабах, є найбільш доступними В таких системах зріджений двоокис вуглецю змішують з клітинною пастою або з висушеною біомасою в реакційній судині високого тиску Після цього рідину пропускають через серії камер, в яких тиск знижується ступінчастим способом ZX осаджується з розчину при досить високому тиску, тому він може бути зібраний на ранній стадії зниження тиску, в той час як основна частина домішок залишається розчиненою в двоокисі вуглецю і повинна йти в ІНШІ реакційні камери з ще більш низьким тиском Ефективність екстракції суперкритичним розчинником може бути додатково збільшена з використанням виборчо захоплюючих агентів (таких, як етанол, пропіленгліколь або етилацетат) Деякі з цих виборчо захоплюючих агентів були заздалегідь досліджені і було показано, що вони істотно збільшують розчинність ZX в суперкритичному розчиннику - двоокисі вуглецю Хоча двоокис вуглецю широко використовують 22 21 61899 для суперкритичної екстракції, також застосовують або іншими випадковими прийомами завдяки чинй ІНШІ сполуки (включаючи різноманітні азот- або никам "завантаження", які підтверджуються концехлорфторвуглецевмісні сполуки) В принципі можнтраціями в крові на досліджувати будь-який розчинник, що має гаОскільки засвоєння каротиноїдів після оральзоподібний або рідкий стан в залежності від тиску, ного уведення звичайно є відносно низьким для з метою визначити, чи є він придатним для очипацієнтів, що страждають серйозною формою дещення ZX з бактерій ВІДПОВІДНО до даного опису генерації жовтої плями, може виникнути необхідність застосовувати ІНШІ форми уведення, такі, як При необхідності масляниста рідина, що місвнутрішньом'язова або внутрішньовенна ІН'ЄКЦІЯ тить ZX, одержана після екстракції розчинником або імплантація пристрою з повільним вивільненабо за допомогою суперкритичної екстракції, може ням ЛІКІВ Носи для композицій, призначених для бути змішана з носієм, таким, як рослинна олія, і ІН'ЄКЦІЙ, можуть включати воду, забуферуючий після цього включена в капсулу, призначену для агент і органічну сполуку, що має декілька гідроприйому всередину людиною, що не потребує ніксильних груп, наприклад, такі сполуки, як пропіякого додаткового очищення ZX Такий спосіб є ленгліколь, декстран або циклодекстрин економічно вигідним способом одержання напівочищеної легко засвоюваної форми R-RДля орального уведення можуть застосовувазеаксантину, придатної для прийому людиною, тися різноманітні упаковки, що дозволяють триваабо як лікарський засіб, призначений для стражлий час захищати ZX від окиснення і ВІДПОВІДНІ даючих дегенерацією жовтої плями, або як харчомаслянистій природі ZX Прикладами прийнятних ва добавка для тих, хто хоче знизити ризик виниккомпозицій для орального уведення є наступні нення дегенерації жовтої плями в більш старшому (а) Легко засвоювана водонепроникна капсула з вміщеною в ній рідиною, причому капсула і рідиВІЦІ на мають розмір, який дозволяє проковтувати їх, В альтернативному варіанті R-R-зеаксантин в не пошкоджуючи, вони є фармакологічно прийнятнапівочищеній маслянистій рідині може бути доданими, і рідина містить R-R-зеаксантин, змішаний з тково очищений з метою підвищити концентрацію придатним носієм або розчинником, таким, як росZX та вилучити будь-які домішки Це може бути линна олія При необхідності псевдозріджений ZX здійснене такими способами, як (1) застосування може бути мікрокапсульований або включений в систем двох розчинників, в яких використовують міцели, як описано в прикладах 9 або 10, з метою комбінацію двох різних розчинників, (2) адсорбція захисту ZX від розкладу в шлунку Такі капсули на субстраті (такому, як фільтрувальний шар ткаможуть бути виготовлені з відносно твердого, ненини), яка сприяє кристалізації ZX, або (3) хромаеластичного матеріалу або з пластичного матеріатографія в протитоці Метод хроматографії, що лу, який звичайно використовують для капсул, що застосовується для очищення ZXTa який дозволяє містять вітамін Е Якщо капсула виготовлена з одержати ZX з чистотою приблизно 98%, описаний матеріалу, який є стійким до дії кислого середовив прикладі 4 ща шлунка і переварюється ферментами кишечСпособи очищення інших каротиноїдів описані нику, ZX може бути захищений від розкладу в в патентах США 5382714 (Khachik, 1995) та шлунку, а біологічна доступність ZX може бути 4851339 (Hills, 1989) Враховуючи їхню хімічну збільшена Однак відомо, що принаймні частина схожість, будь-який метод, придатний для очиZX, що потрапляє до шлунка у вигляді компонента щення р-каротину або лютеїну, напевне, може прожованої рослинної маси, може проходити чедати добрі результати при очищенні ZX рез шлунок без зміни, отже, захист ZX від кислого Способи уведення середовища шлунка не має вирішального значенОральне уведення є більш прийнятним спосоня, і вибір матеріалу капсули насамперед повинен бом уведення ZX людям для захисту СІТКІВКИ З вибути економічно вигідним, а не науково обгрунтокористанням таких форм орального уведення, як ваним, капсули, призначені для щоденного або щотижневого прийому, або застосування ZX у вигляді про(б) Таблетка, призначена для орального уведуктів харчування з доданням ZX чи добавок до дення людиною, причому таблетка містить R-Rпродуктів харчування, як описано нижче Лікування зеаксантин і здатну до пресування зв'язувану рене вимагає регулярного прийому всередину через човину, сумісну з зеаксантином, і яка дозволяє певні інтервали часу (як у випадку пілюль, признатаблетці зберігати свою форму після пресування чених для щоденного або щотижневого прийому), під ВІДПОВІДНИМ тиском, при цьому таблетка є фаале замість цього припускає випадковий перериврмакологічно прийнятною і має розмір, що дозвочастий прийом всередину, при якому між прийоляє проковтувати и без пошкодження При необмами доз повинен минути певний період часу (нахідності таблетка може мати покриття, сприятливе приклад, один або декілька днів, більш прийнятно захисту ZX від кислого середовища шлунка, менше тижня), що дозволяє поступово накопичу(в) Композиція, ЩО МІСТИТЬ харчовий продукт, ватися невеликим кількостям ZX в тканині жовтої призначений для споживання людиною та який є плями Як і у випадку будь-якої вітамінної добавки, прийнятним для використання як їжа і приємним також може виявитися прийнятною однократна на смак, а також придатний як носій зеаксантину і доза, однак прийом у вигляді однократної дози не містить R-R-зеаксантин як добавку ZX являє собуде настільки ж ефективний, як періодичний прибою жовто-оранжевий пігмент з такими ж загальйом невеликих доз при прийомі протягом ряду ними гідрофобними характеристиками, що і росроків Дослідження всмоктування каротиноїдів линна олія, шортенінг (комбіжир для хлібопекарсьссавцями показало, що щоденний прийом всерекої промисловості) або курячий жир, він також дину більш прийнятний у порівнянні з щотижневим аналогічний іншим каротиноідним харчовим заба 23 61899 рвникам, таким, як р-каротин Таким чином, він може бути доданий як харчовий забарвник до різноманітних харчових продуктів, таких, як маргарин, молочні продукти, сироп, печені вироби, тісто для домашнього випікання, обжарене тісто, м'ясні напівфабрикати, які не піддаються високотемпературній тепловій обробці, та інгредієнти для супів Інші прийнятні харчові продукти можуть включати гранульовані композиції, такі, як суміші речовин для підсолювання або надання запаху прянощів, що застосовуються як добавки до супів, салатів, печива тощо Гранульовані композиції можуть при необхідності мати захисне покриття для зниження розкладу ZX кислим середовищем шлунка ВІДОМІ численні приклади застосування р-каротину та інших каротиноїдів як харчових забарвників і харчових добавок, вони описані у Klaui та ін , 1970, КІаиі і Bauernfemd, 1981, Colombo і Gerber, 1991, та в патентах США 4522743 (Horn та ш , 1985), 5180747 (Matsuda та ш , 1993), 5350773 (Schweikert та ін , 1994) і 5356636 (Schaneider та ш , 1994) Внаслідок їхніх однакових ХІМІЧНИХ характеристик будь-який метод додання р-каротину або лютеїну в харчовий продукт, призначений для людей, напевне, також може безпосередньо застосовуватися і для R-Rзеаксантину, (г) Композиція, ЩО МІСТИТЬ харчовий продукт, призначений для споживання людьми, причому харчовий продукт включає клітини мікроорганізму, які безпечні для людей та які містять R-R-ізомер зеаксантину Харчові продукти можуть бути вибрані з сиру, йогурту, молока і пива При необхідності клітини мікроорганізму можуть бути життєздатними, або вони можуть бути знищені такими методами, як пастеризація або фрагментація Також можуть використовуватися ІНШІ форми пакування, і вони можуть виявитися більш прийнятними для різноманітних цілей Тестування R-R-зеаксантину на тваринах ZX, який синтезували, використовуючи клітини F multivorum, одержані з лінії АТСС 55238, тестували щодо спроможності захищати сітківку у птахів виду Cotumix cotumix japomca, яких звичайно називають японською куріпкою Ці ВИДИ Є зручною тваринною моделлю для вивчення дегенерації жовтої плями у людей внаслідок ряду чинників, вказаних нижче (1) Уся сітківка японських куріпок схожа на жовту пляму людини з цілого ряду важливих параметрів Наприклад, сітківка куріпки містить як ZX, так і лютеїн і подібно жовтій плямі людини в ній більше фоторецепторів у вигляді колбочок, ніж у вигляді паличок (2) Для СІТКІВКИ японської куріпки характерні деякі вияви патологи, властиві СІТКІВЦІ ЛЮДИНИ, наприклад, СІТКІВКИ японської куріпки накопичують м'які друзи та ліпофусцин, що значною мірою корелює з початковими проявами AMD у людей (3) Хоча СІТКІВКИ куріпки істотно менші за розмірами, ніж СІТКІВКИ у людей, уся сітківка куріпки забарвлена в жовтий колір внаслідок присутності ZXTa лютеїну Це дозволяє ефективно використовувати усю сітківку куріпки як модель невеликої ділянки жовтої плями в центрі СІТКІВКИ людини, що істотно полегшує аналіз та спостереження 24 (4) Сітківка японської куріпки не містить судин і має будову, схожу із зоною ямки СІТКІВКИ ЛЮДИНИ (5) Тривалість життя самок японської куріпки складає приблизно 1-1,5 року, а самців - 3-4 роки Це дозволяє вивчити процеси старіння, що може бути дуже ускладнене для інших видів, які мають більшу тривалість життя Ці ЧИННИКИ більш докладно обговорюються у FiteTa ін , 1991 тау FiteTa ш , 1993 Ці ДОСЛІДИ описані в прикладах 5-8 Стримано чудові результати, які ясно показують, що R-Rзеаксантин, продукований клітинами F multivorum, (1) потрібним чином відкладається в СІТКІВЦІ ПІСЛЯ орального уведення і (2) має високу ефективність щодо захисту клітин СІТКІВКИ ВІД фототоксичного пошкодження Крім того, як це описано в прикладі 8, попередні результати показують, що R-R-зеаксантин є істотно більш сильнодіючим і ефективним у порівнянні з р-каротином відносно до захисту СІТКІВКИ ВІД фототоксичного пошкодження Коли р-каротин скормлюють дослідним тваринам у високій дозі, незначна захисна дія р-каротину не досягає навіть рівня статистичної вірогідності На відміну від цього, коли R-R-зеаксантин скормлюють дослідним тваринам в такій самій дозі, він повністю блокує і відвертає прояви пошкодження СІТКІВКИ, ЩО піддаються виміру Мікробні джерела R-R-зеаксантину Клітини Flavobactenum multivorum наведені в даному описі, депоновані в АТСС (реєстраційний номер АТСС 55238, як відзначалося вище, в реєстраційному каталозі вони відповідають Sphingobactenum multivorum, однак їхня назва не була змінена в Bergy's Manual) Ця ЛІНІЯ КЛІТИН надає фахівцям в даній галузі декілька шляхів мікробіологічного синтезу ізомерно чистого R-Rзеаксантину По-перше, безпосередні і немодифіковані нащадки цих клітин можуть застосовуватися для синтезу R-R-зеаксантину без помітних кількостей інших небажаних стереоізомерів 3 усієї КІЛЬКОСТІ каротиноідов, продукованих цими клітинами, більше 90% припадає на частку потрібного каротиноїду ZX По-друге, потомство штаму АТСС 55238 може застосовуватися після його модифікації способами, які збільшують виробництво R-R-ізомеру ZX Мутантні або ІНШІ змінені лінії клітин можуть бути створені за допомогою будь-якого з декількох методів, таких, як (1) обробка потомства штаму дикого типу АТСС 55238 мутагенними агентами, такими, як ультрафіолетове опромінення або опромінення рентгенівськими променями, або відомими ХІМІЧНИМИ мутагенами, такими, як М-метил-N'HiTpo-N-нітрозогуанідин, (2) одержання статевих комбінацій шляхом змішування клітин F multivorum з іншими типами бактерій, що активно посилює кон'югацію та обмін ДНК між бактеріальними клітинами, (3) обробка клітин F multivorum бактеріальними транспозонами або вірусами, які можуть викликати перебудову відносно великих ділянок ДНК Ці методи дозволяють внести випадкові зміни в клітини потомства, а після цього потомство аналізують з використанням методів скринінгу з метою ідентифікації та виділення клітин 26 25 61899 потомства, які продукують більш високі рівні ZX ництва ZX під час зростання та репродукції клітин, а після цього різке збільшення виробництва ZX Методи скринінгу можуть бути полегшені за клітинами під час ферментації та (2) вбудовування допомогою ХІМІЧНИХ речовин (таких, як дифеніла(інсерція) генів в нові типи клітин-господарів, які мін, нікотин або ловастатин), які приглушують можуть виявитися більш прийнятними для промиодин або декілька ферментів, що беруть участь в слового застосування, такі, як клітини Е соїі або процесі біосинтезу, в результаті якого утворюється клітини дріжджів, які можуть застосовуватися для ZX Для нефахівця слід пояснити, що ці отрутидобре відомих та значною мірою оптимізованих супресори створюють перешкоди або завади, які методів ферментації, виготовлення та очищення можуть переборюватися тільки мутантними клітинами, продукуючими аномально високі КІЛЬКОСТІ Гени, продукуючі ZX та виділені з клітин лінії ZX Однак досліди, які можуть використовуватися АТСС 55238, також можуть бути посилені за доподля виявлення високопродуктивних мутантів або могою інших добре відомих методів Наприклад, варіантів, є простими, швидкими і легкими в здійсгени бактерій часто використовують "непереважні" ненні Оскільки ZX являє собою жовтий пігмент, кодони, які знижують і регулюють КІЛЬКІСТЬ протеїпросте візуальне дослідження культурального ну, синтезованого геном 3 метою зниження цих планшета може застосовуватися для виявлення обмежувальних механізмів непереважні коди в колоній мутантів, які мають потрібні ознаки (1) вигені, синтезуючому ZX, в клітинах лінії АТСС сокої швидкості клітинного зростання та (2) здат55238 можуть бути заміщені "переважними" кодоності продукувати аномально високі КІЛЬКОСТІ ЖОВнами, які можуть збільшувати експресію ферменТОГО пігменту В методах скринінгу після обробки ту, продукуючого ZX, в обраній клітині-господарі мутагеном при необхідності може також викорисВ іншому прикладі залишки цистеїну можуть товуватися автоматичне пристосування (таке, як перешкоджати активності або стабільності фермеавтоматичний планшет-ридер або пристрій для нту, утворюючи непотрібні дисульфідні місточки з автоматичного сортування клітин, сполучені з циіншими залишками цистеїну або в цій самій, або в тометрами потоку) інших молекулах протеїну Отже, активність або стабільність ферменту може бути інколи збільшеЦі методики мутагенезу і скринінгу є загальнона шляхом заміщення одного або декількох залиприйнятими і добре ВІДОМІ в даній галузі Будь-які шків цистеїну залишками інших амінокислот (наклітини, що є прямими нащадками штаму дикого приклад, див патент США 4737462 на ім'я Mark) типу АТСС 55238, розглядаються як потомство цих Крім того, експресія протеїну часто може бути збіклітин, навіть якщо вони були модифіковані, підльшена шляхом вбудовування кодонів для загальдані мутації або статевому об'єднанню з іншими них амінокислот, таких, як гліцин, замість кодонів, ЛІНІЯМИ клітин будь-яким з перерахованих вище які кодують метіонін і триптофан, які є менш пошиспособів реними та які мають тенденцію уповільнювати і В третьому альтернативному ПІДХОДІ можуть знижувати експресію протеїну Після створення бути створені мікробні клітини, що не є потомстсинтетичного гена, який призводить до заміщення вом та які містять гени, виділені або такі, що похоамінокислоти такої природи, модифікований продять з лінії клітин АТСС 55238, які експресують теїн можна досліджувати з метою визначити, чи ферменти, що сприяють синтезу R-R-зеаксантину зберігає він потрібну ферментативну активність, Такі гени можуть бути виділені та ідентифіковані з чи експресується в більших кількостях або в більш використанням відомих методів Наприклад, ПОстабільній формі СЛІДОВНОСТІ ДНК генів продукуючого каротиноїди штаму "crt", вказані в патенті США 5429939 Вище перелічені приклади відомих методів ге(Misawa та ш , 1995, описано вище), можуть виконетичної інженери, які можуть бути оцінені на геристовуватися як зонди гібридизації для пошуку нах, продукуючих ZX, виділених з клітин лінії АТСС продукуючих каротиноїди генів, що мають ГОМОЛО55238, з метою визначити, чи буде будь-яка інша ГІЧНІ ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК, в геномі клітин лінії АТСС модифікація посилювати вироблення ZX клітинами 55238 Продукуючі каротиноїди гени, виділені з цих F multivorum або іншими типами клітинклітин, після цього можуть вбудовуватися в плазгосподарів міди, косміди, фаги або ІНШІ прийнятні вектори, які Використовуване в формулі винаходу поняття можуть використовуватися для генетичної транс"клітини, ЯКІ були піддані генетичній інженери для формації будь-якого потрібного типу клітинистворення принаймні одного гена, синтезуючого господаря, такої, як клітини Е соїі, клітини дріжзеаксантин та який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ ДНК, джів, клітини комах або клітини ссавців Контроодержану з штаму Flavobactenum multivorum, якольована генетична інженерія такого типу може му був присвоєний реєстраційний АТСС 55238", забезпечити продукування трансформованими включає клітини, що містять гени, які мають ПОСЛІклітинами R-R-зеаксантину, використовуючи гени, ДОВНОСТІ ДНК, синтезовані ХІМІЧНИМ ШЛЯХОМ З виодержані з клітин АТСС 55238 користанням ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК або мРНК, які бу Крім того, протешкодуючі частини генів, продукуючих ZX з клітин АТСС 55238 (тобто частини генів, які транскрибуються в матричній РНК, а після цього транслюються в ферменти, синтезуючі ZX), можуть бути вміщені під контроль сильних і/або таких, що індукуються, промоторів Такі "химерні" гени, що містять промотори генів, одержані з різних генів, можуть застосовуватися для різноманітних цілей, таких, як (1) приглушення вироб ли визначені шляхом аналізу клітин лінії АТСС 55238 або їхнього потомства Пристрої для автоматичного синтезу ДНК добре ВІДОМІ і можуть використовуватися для копіювання будь-якої відомої ПОСЛІДОВНОСТІ гена без необхідності здійснювати реплікацію вихідної клітини-господаря Поняття "гени, синтезуючі зеаксантин" включає будь-які гени, експресуючі фермент або інший протеїн, який бере участь в шляху біосинтезу ZX та який 27 може застосовуватися для збільшення виробництва ZX при вбудовуванні в придатні клітинигосподарі незалежно від того, який конкретний фермент в шляху біосинтезу ZX кодує цей ген Приклад 1 Ферментація в промислових масштабах Живильне середовище, яке на думку заявників було більш прийнятним для початкового маломасштабного тестування Flavobactenum multivorum в лабораторних умовах, являє собою живильне середовище Е, описане в прикладі 3 в патентах США 5308759 (Gierhart, 1994) та 5427783 (Gierhart, 1995) Це живильне середовище містило декілька інгредієнтів, які були дорогими і з якими було важко працювати Для зниження вартості і для підвищення зручності після дати подачі цих заявок було проведено широке дослідження з метою створити живильне середовище, більш придатне для промислових масштабів 3 живильних середовищ, які в даний час є більш прийнятними для ферментації в промислових масштабах, були виключені кукурудзяне борошно і декілька інших інгредієнтів Ці більш прийнятні середовища містять або кукурудзяний сироп з високим вмістом мальтози, або бурякоцукрову мелясу в діапазоні концентрацій від 1 до 10% мас /об поряд з екстрактом замоченої кукурудзи в концентрації 0,5-4% мас /об , гептапдрат сульфату амонію в концентрації 0,5% мас /об , хлорид натрію в концентрації 0,5% мас /об , гептапдрат сульфату магнію в концентрації 0,1% мас /об, ацетат натрію в концентрації 0,1% мас /об , гептапдрат сульфату заліза в концентрації 0,001% мас /об , дріжджовий екстракт в концентрації 0,2% мас /об, тіамш-НСІ в концентрації 0,01% мас /об , від 1 до 6% мас /об пдролізованого казеїну (наприклад, марки NZ Amme HD, що постачається фірмою Sheffield Products, Division of Quest International, Norwich, NY), та рослинна олія в концентрації 1об% Після змішування цих інгредієнтів додають таку КІЛЬКІСТЬ NaOH, яка є достатньою для підвищення значення рН до 6,5, на противагу цьому, коли значення рН живильного середовища доводили до 7,5, як це описано для лабораторних експериментів в патентах США 5308759 та 5427783, з екстракту замоченої кукурудзи осаджувалося занадто багато твердих часток Культуральне середовище стерилізують автоклавуванням при 121 °С протягом ЗОхв , після цього його охолоджують до 27°С й інокулюють за допомогою 5-10об% "рідкої попередкультури", що містить штам F multivorum, який продукує R-Rзеаксантин та не продукує S-S- або R-Rстереоізомери Клітини, ЩО застосовуються для одержання рідкої попередкультури, вирощують у пробірці зі скошеним агаром, призначеним для визначення КІЛЬКОСТІ мікроорганізмів Ці культури, одержані на скошеному агарі, інокулюють тональними колоніями F multivorum, отриманими з штаму, депонованого заявниками в АТСС (реєстраційний номер АТСС 55238) Після інкубації протягом 48год при 28°С ВИХІДНІ культури на скошеному агарі зберігають в холодильнику при 4°С до їх використання як шокулят для рідкого середовища Життєздатні клітини також можуть бути заморожені для тривалого зберігання з використанням звичайних камер заморожування, сухого льоду 61899 28 або рідкого азоту Рідку попередкультуру одержують, використовуючи клітини, взяті зі скошеного агару, для інокуляції ЗОмл рідкого середовища, одержаного за описаною вище методикою та яке міститься в колбі з перегородкою об'ємом ЗООмл Використовують наступні умови для зростання 28°С, значення рН від 7,2 до 7,6, аерація шляхом перемішування при 250об/хв та культивування протягом 24год Після початкових 24год інкубації клітини, що містяться в одній або декількох колбах для попереднього культивування об'ємом ЗОмл, використовують для інокуляції в десять разів більшу КІЛЬКІСТЬ ЖИВИЛЬНОГО середовища в судині для ферментації ВІДПОВІДНОГО розміру Після ЦЬОГО КЛІТИНИ шкубують протягом 48-72год при 28°С Значення рН підтримують на рівні 6,80-7,20, використовуючи NaOH і/або фосфорну кислоту Концентрацію розчиненого кисню підтримують на рівні 30-40% від насичувальної концентрації шляхом барботування відфільтрованого повітря через судину зі швидкістю 1 об'єм повітря на 1 об'єм рідини за хвилину при струшуванні судини на мішалці зі швидкістю 4001000об/хв Досліди З використанням періодичного відбору зразків та рідинної хроматографії високого розрішення показали, що максимальні КІЛЬКОСТІ ZX звичайно продукуються протягом приблизно 72год при ферментації клітин в зазначених умовах Приклад 2 Додання стабілізаторів Утворюваний в процесі ферментації ВІДПОВІДНО до прикладу 1 ZX потребує стабілізації для того, щоб полегшити наступне очищення і виготовлення композиції, та для гарантії чистоти Стабілізуючі сполуки можуть бути додані до клітин F multivorum (або до клітинного екстракту, що містить ZX) в будь-який момент часу в процесі одержання або очищення, звичайно один або декілька первинних стабілізаторів можуть бути додані до клітин, коли вони ще перебувають в судині для ферментації Заявниками були вивчені різноманітні потенційні стабілізатори До цього часу найкращі результати одержані з використанням комбінації стабілізаторів, які перед доданням до клітин змішують в невеликій КІЛЬКОСТІ прийнятного розчинника (наприклад, з приблизно 2мл етанолу в судині для ферментації об'ємом 20л) Більш прийнятна суміш стабілізаторів містить трет-бутилпдрохінон (скорочено ТБГХ, що також називається 2-(1,1диметилетил)-1,4-бензолдюлом) в КІЛЬКОСТІ, яка дозволяє після змішування з клітинами одержати кінцеву концентрацію від приблизно 250мкг/л (мікрограмів на літр) до приблизно 50мг/л, етоксихін, концентрація якого після змішування перебуває в діапазоні від приблизно 250мкг/л до приблизно 250мг/л, а-токоферол в концентрації від приблизно 250 мкг/л до приблизно 250 мг/л, та ЕДТК (етилендіамштетраоцтова кислота) в концентрації від приблизно 500мкг/л до приблизно 500мг/л Прийнятні концентрації можуть істотно варіюватися і повинні залежати від різноманітних чинників, таких, як стадії наступного очищення та передбачуваний спосіб пакування і шлях уведення Більш прийнятні концентрації цих стабілізаторів, що застосовуються при використанні однократної екстракції ТГФ з наступним змішуванням з рослинною 29 олією та капсулюванням у водонепроникну пілюлю, аналогічну такій, що застосовується для вітамінів, складають приблизно 25-50мг/л ТБГХ, 250500мкг/л етоксихшу, 250-500мкг/л а-токоферолу та 500-1 ОООмкг/л ЕДТК Після додання стабілізаторів клітинну культуру пастеризують, нагріваючи до 55°С протягом 2550хв Ця процедура знищує бактерії, не пошкоджуючи ZX, який вони продукували Після цього культуру охолоджують до кімнатної температури і клітини, що містять ZX, та ІНШІ тверді частки, присутні в культуральному бульйоні, ВІДДІЛЯЮТЬ ВІД рідкої фази за допомогою системи мікрофільтрації з поперечним потоком, яка підвищує концентрацію клітинил'верді частки від початкового значення приблизно 10-15об% до концентрації в фільтраті приблизно 60-80об % Цей процес призводить до одержання клітинної пасти, яка також містить деяку залишкову КІЛЬКІСТЬ твердих часток з живильного середовища Для одержання препаратів на основі ZX, що скормлювали японській куріпці для дослідження СІТКІВКИ, як описано в прикладах 5-7, клітинну пасту заморожують до -70°С, після цього висушують за допомогою люфілізацм при 25°С в глибокому вакуумі, одержуючи висушену біомасу, що містить приблизно 1-10мас% ZX У вищезазначених дослідах КІЛЬКІСТЬ ZX в кожній порції оцінювали окремо і порції, які мали різні концентрації, об'єднували та змішували, щоб в дослідах на японській куріпці забезпечити використання співставних концентрацій Для одержання ZX, призначеного для прийому всередину людиною, застосовують екстракцію розчинниками для одержання в'язкої маслянистої рідини, як описано в прикладі З Приклад 3 Неповне очищення маслянистої рідини Після одержання клітинної пасти аналогічно прикладу 2 вона може бути оброблена будь-яким з численних способів Як вказано вище, при необхідності КЛІТИННІ мембрани можуть бути зруйновані з тієї метою, щоб відкрити клітини і зробити ZX більш доступним, за допомогою таких способів, як опромінення ультразвуком (з використанням високочастотних звукових хвиль), обробка високим тиском або подрібнення, підтримуючи температуру клітин нижче приблизно 30°С для запобігання окиснення Однак ця стадія не є необхідною, коли на стадії екстракції розчинником застосовують тетрапдрофуран (ТГФ), оскільки ТГФ дуже ефективно руйнує КЛІТИННІ мембрани без механічного втручання Перемішування не є необхідним, коли в лабораторних дослідах застосовують ТГФ, однак, певно, при промисловому виробництві перемішування під час стадії змішування з розчинником може виявитися доцільним В дослідах, що проводилися, екстракція ТГФ включала змішування приблизно 8-20 об'ємів очищеного відфільтрованого ТГФ з одним об'ємом клітинної пасти, що містить 60-80% твердих часток, при температурі нижче 25°С протягом 2-24год ТГФ активно впливає на клітини, призводячи до одержання рідини, в якій суспендовані пластівчасті тверді частки Після центрифугування при 20000д протягом декількох хвилин більша частина ТГФ 61899 ЗО може бути вилучена шляхом декантації ТГФ, що залишився, може бути випарений під вакуумом, в результаті чого утворюється в'язке масло Коли клітинну пасту, що містить 1-3% ZX, обробляли за допомогою однократної екстракції ТГФ, утворене масло звичайно містило приблизно 5-20мас % ZX Приклад 4 Одержання високоочищеного зеаксантину в сухій порошкоподібній формі зі 100%ним вмістом R-R-ізомеру Препарат на основі високоочищеного ZX в сухій порошкоподібній формі одержували шляхом обробки підданої екстракції ТГФ маслянистої рідини, описаної в прикладі 3, за допомогою рідинної хроматографії наступним чином Маслянисту рідину, що містить ZX, розчиняли в гексані, після цього пропускали через хроматографічну колонку, що містить нейтральний алюмінієвий порошок 3 метою вилучення домішок каротиноїдів, таких, як ркаротин та лікопен, а також ЛІПІДІВ та інших забруднювачів для промивки колонки використовували гексан в обсязі, дорівнюючому двом об'ємам колонки Після ЦЬОГО ДЛЯ виділення ZX через колонку пропускали суміш гексан ацетон у співвідношенні 80 20 Отриманий розчинений ZX сушили під вакуумом Хроматографічний аналіз показав, що він являє собою ZX з чистотою щонайменше 98%, були виявлені лише СЛІДОВІ КІЛЬКОСТІ будь-яких ДОМІШОК Після зберігання протягом приблизно шести МІСЯЦІВ у відносно незахищеному стані (як правило, при звичайному заморожуванні з середньою частотою взяття зразків та без використання будьяких антюксидантів і без вжиття будь-яких запобіжних заходів для недопущення контакту з атмосферним киснем) зразок цього препарату ZX відсилали для стереоізомерного аналізу професору John Landrum (одному зі співавторів статей Bone, Landrum та ш) в університет Florida International University, Майамі, шт Флорида Виконаний ним аналіз з використанням хіральної хроматографії на колонках з дикарбаматною дериватизацією показав, що незахищений препарат, що зберігався протягом шести МІСЯЦІВ, містив 92% ZX Домішки, напевне, являли собою в основному кетокаротиноіди, що елюювалися раніше ZX, кетокаротиноіди мають додатковий атом кисню, приєднаний до каротиноїду в будь-якому з положень, і вони є звичайними побічними продуктами, що з'являються при зберіганні каротиноїдів без захисту від окиснення Хіральний аналіз, проведений професором Landrum, показав, що потрібний R-R-ізомер складав 100% від загальної КІЛЬКОСТІ ZX в препараті Не було виявлено помітних кількостей небажаних S-S- або S-R-стереоізоерів Встановлено, що описане вище хроматографічне очищення, хоча воно є повністю здійсненним і високоефективним, не є ідеально придатним для одержання високоочищеного ZX в промислових кількостях Як метод, потенційно прийнятний для промислового виробництва, можна назвати альтернативний метод, розроблений для очищення лютеїну і описаний в патенті США 5382714 (Khachik, 1995, також див у Khachik та ш , 1991), в якому використовується суміш холодний етанол вода в системі екстракції, що складається з двох розчинників, з наступною люфілізацією 31 61899 Приклад 5 Дослідження зеаксантину з використанням як модель груп японської куріпки з різним раціоном харчування Усі дослідження з використанням японської куріпки проведені в Schepens Eye Research Institute of Harvard Medical School (Boston, Massachusetts) за контрактом з Applied Food Biotechnology, Inc (правонаступником по даній заявці) КІЛЬКІСТЬ птахів в усіх підданих обробці або в контрольних групах була такою, яка необхідна для одержання статистично вірогідних даних В більшості випадків КІЛЬКІСТЬ птахів в контрольних групах відповідала КІЛЬКОСТІ птахів в підданих обробці групах Корми для птахів з дефіцитом каротиноїдів одержували від фірми Purina Mills (St Louis, Missouri) Такі корми для птахів продавали виключно для експериментального використання і одержували з зерна (такого, як насіння проса), в якому в природних умовах відсутні каротиноїди Всі препарати на основі ZX, якими кормили японських куріпок, являли собою висушену біомасу клітин F multivorum, яку ферментували, стабілізували агентами ВІДПОВІДНО ДО прикладу 2, піддавали пастеризації з метою знищення клітини та висушували за допомогою люфілізацм Ці стадії ферментації та виготовлення препарату здійснювалися фірмою Applied Food Biotechnology, Inc на и обладнанні в O'Fallon, Missouri Всіх ДОСЛІДНИХ птахів виводили з яєць з дефіцитом каротиноїдів їх одержували шляхом викормлювання батьківської генерації (позначеної як птахи генерації Р1) по досягненні птахами статевої зрілості виключно з використанням раціону з дефіцитом каротиноїдів їхні яйця розбивали і аналізували на вміст каротиноїдів до тих пір, доки в яйцях не виявлявся дефіцит каротиноїдів Яйця, що після цього відкладалися птахами батьківської генерації з дефіцитом каротиноїдів, використовували для виведення птахів усіх дослідних та контрольних груп Дослідних та контрольних птахів поділяли на чотири основні групи, які утримували на різних раціонах Ці групи позначали як група С+, група С-, група ВС+, група ZX (+5) та група ZX (+50) в залежності від того, які каротиноїди вони одержували в своєму раціоні Птахів групи С+ утримували на стандартному харчовому раціоні, що надходить в продаж, включаючому декілька каротиноїдів, цей харчовий раціон також містив як добавку синтетичний атокоферол (вітамін Е) 32 Птахів групи С- утримували на харчовому раціоні, в якому були відсутні практично всі каротиноїди, як описано вище Однак цей харчовий раціон включав всі ІНШІ необхідні харчові речовини, і він як добавку мав синтетичні вітаміни А та Е Птахів групи ВС+ утримували на харчовому раціоні, в якому були відсутні всі каротиноїди, але як добавку в нього вводили р-каротин в такій самій дозі, яку застосовували для групи, що перебувала на раціоні з високим вмістом ZX (тобто додавали 50мг р-каротину на кілограм корму) Птахів групи ВС+ переводили на харчовий раціон, що містив ркаротин, за сім (7) днів до початку процедури пошкодження СІТКІВКИ світлом Ця група дозволяє провести безпосереднє порівняння між групою, що перебувала на раціоні з добавкою р-каротину, і однією з підгруп птахів, що перебувала на раціоні з доданням ZX, яку також переводили з харчового раціону з дефіцитом каротиноїдів на раціон з доданням ZX за сім днів до початку пошкодження СІТКІВКИ світлом Як описано в прикладі 8, це безпосереднє порівняння показало, що ZX має високу ефективність щодо попередження фототоксичного пошкодження, тоді як захисні дії р-каротину виявилися настільки слабкими, що одержані результати не досягли статистично вірогідного рівня Птахів групи ZX+ утримували на харчовому раціоні, в якому були відсутні всі ІНШІ каротиноїди, але який включав висушену біомасу, що містила R-R-зеаксантин з клітин F multivorum фірми AFB Харчовий раціон цих птахів включав дві різних дози ZX, що дозволяє оцінити залежність дії від дози і виявити кореляцію з різноманітними проявами пошкодження СІТКІВКИ Птахів групи ZX (+5) утримували на харчовому раціоні з відносно невеликою КІЛЬКІСТЮ ZX, в середньому додаючи 5мг ZX на кілограм корму Оскільки японська куріпка з'їдає приблизно 25-35г корму на день, в групі з низькою дозою ZX на птаха в день припадало приблизно 0,125-0,175мг ZX Птахів групи ZX (+50) утримували на харчовому раціоні з десятиразовою збільшеною КІЛЬКІСТЮ ZX (50мг ZX на кілограм корму), при цьому кожен з птахів з'їдав приблизно 1,251 , 7 5 M T Z X на день Концентрації каротиноїдів в контрольному кормі, в кормі з дефіцитом каротиноїдів та в кормі для групи ZX+ аналізували за допомогою рідинної хроматографії високого розрішення (РХВР) з використанням методів, описаних у StacewiczSapuntzakis та ш , 1993 Результати наведені в таблиці 1 Таблиця 1 Харчовий раціон Контроль (С+) Дефіцит (С-) Зеаксантин (ZX+50) Зеаксантин (ZX+5) ZX 0,59 0,26 67,60 6,74 лютеїн 1,55* 0,59* 0,59* 0,06* Концентрація каротиноїдів (мкг/г) Р-крип Р-кар кантокс 0,00 0,11 0,24 0,00 0,00 0,00 0,00 1,90 3,00 0,00 0,20 0,28 ЛІКОП 0,00 0,00 2,90 0,27 Пояснення ZX означає 3R-3'R-3eaKcaHTHH, р-крип означає р-криптоксантин, р-кар означає р-каротин, кантакс означає кантоксантин, лікоп означає ЛІКОПІН, "*" означає попереднє визначення, також може являти собою цис-ізомер зеаксантину 33 61899 Усіх птахів вирощували і утримували в звичайних брудерних клітках За винятком зазначених нижче випадків, їх утримували при звичайному освітленні з широким спектром хвиль, тривалість якого складала від 10 до 14год на добу Приклад 6 Відкладення в СІТКІВЦІ зеаксантину, уведеного оральним шляхом ХІМІЧНИМ ШЛЯХОМ аналізували концентрації ZX (та інших каротиноїдів), накопичені в сітківках птахів в кожній з груп, що утримувалися на різних харчових раціонах, описаних в прикладі 5 Для здійснення цих аналізів птахів, що вилупились з яєць з дефіцитом каротиноїдів і яких утримували на відповідному харчовому раціоні протягом принаймні 6 МІСЯЦІВ, умертвляли шляхом скручування шиї Тканину СІТКІВКИ вилучали шляхом розсікання енуклейованого ока, і тканину окремої СІТКІВКИ розтирали до практично гомогенного стану в 250мкл дистильованої деюнізованої води, використовуючи скляний пестик або пестик з політетрафторетилену (TEFLON®) 3 цього гомогенату відбирали Юмкл і використовували для аналізу вмісту протеїнів в гомогенаті з метою стандартизувати результати, одержані для різних зразків СІТКІВКИ До 240мкл суспензії тканини СІТКІВКИ, що залишилися, додавали 250мкл метанолу, що містив 2% мас /об пірогалолу та 50мкл гідроксиду калію в концентрації 60% мас /об Суміш витримували у водяній бані при 70°С протягом 34 1год, після цього додавали 500мкл 50об %-ного етанолу, а після цього 2мл гексану Суміш інтенсивно перемішували для ретельного змішування, потім залишали відстоюватися для розподілу при 5°С Вилучали епіфазу (тобто більш легку фазу, яка спливала на поверхню рідини, що залишилася), що містила гексан та проекстраговані каротиноїди, токофероли і ретиноли До гомогенату тканини додатково додавали 2мл гексану і суміш інтенсивно перемішували та знов давали поділитися Цю епіфазу вилучали і об'єднували з першою Цей процес повторювали ще раз, використовуючи третій цикл екстракції, з метою забезпечити повну екстракцію каротиноїдів, токоферолів і ретиноідів Об'єднані гексанові екстракти після цього промивали 1мл води для вилучення залишкових кількостей гідроксиду калію До суміші гексан-вода додатково додавали 1мл гексану, після цього гексановий шар (епіфазу) обережно вилучали піпеткою Після ЦЬОГО гексан випарювали в постійному потоці газоподібного азоту Отриманий залишок містив каротиноїди, токофероли і ретиноли та ІНШІ неідентифіковані екстраговані гексаном сполуки Далі цей залишок розчиняли в розчиннику (метанол хлороформ триетиламш) і аналізували за допомогою РХВР, як описано вище Результати наведені нижче в таблиці 2, в якій також показані рівні пошкодження після світлового опромінення з високою інтенсивністю Таблиця 2 Тип дієти Каротиноїди СІТКІВКИ (нг/мг протеїну) зеаксантин Контроль (С+) Дефіцит (С-) р-кар (+50) Зеаксантин (ZX+5) Зеаксантин (ZX+50) лютеїн 30,18 10,29 10,01 31,00 104,17 10,41 8,03 7,83 3,64 н в Середні значення (п=6) КІЛЬКІСТЬ апоптознихядер колбочок в центральній ДІЛЯНЦІ СІТКІВКИ (400-кратне збільшення поля зору) пошкоджені несвітловими пошкоджені світлом чинниками 0 60 0 120 0 109 0 15 0 0 н в = не визначено в цих зразках Було виявлено лютеш-подібну сполуку, яка, напевне, не є лютеїном, що було визначено за часом витримування при РХВР і скануванням піка, що розглядується, з використанням набору фотодюдів Слід відзначити, що р-каротин не був виявлений в усіх сітківках, взятих у птахів, що перебували на будь-якому з описуваних харчових раціонів Наведені в таблиці 2 концентрації каротиноїдів в СІТКІВЦІ свідчать про те, що при оральному уведенні R-R-зеаксантин, одержаний при ферментації клітин, які є нащадками Flavobactenum multivorum (реєстраційний номер АТСС 55238), справді відкладається в сітківках дослідних тварин, які одержували R-R-зеаксантин в харчовому раціоні у вигляді харчової добавки Це є важливим відкриттям, оскільки ZX повинен бути переварений звичайним чином, повинен подолати кишковий бар'єр, потрапити до кровотоку і повинен бути поглинений клітинами СІТКІВКИ очей птахів в достатній КІЛЬКОСТІ, щоб забезпечити захист тканин СІТКІВКИ ВІД фототоксичного пошкодження Усі ЦІ бар'єри були по долані при використанні наведених в даному описі препаратів R-R-зеаксантину, одержаного шляхом бактеріальної ферментації Приклад 7 Захист СІТКІВКИ R-R-зеаксантином Частину птахів в кожній з груп, що перебували на різному харчовому раціоні, піддавали високоштенсивному опроміненню світлом видимої частини спектра при 2000-ЗОООлюкс протягом 28год , використовуючи цикли, що складалися з одногодинного світлового періоду з наступним двугодинним періодом практично повної темряви Після періоду циклічного освітлення птахів вміщували в практично повну темряву на 14год , після чого умертвляли Таке високоштенсивне світлове опромінення, як було встановлено в попередніх дослідах, викликає вірогідне серйозне пошкодження у птахів групи з дефіцитом каротиноїдів і пошкодження 36 35 61899 середньої тяжкості у птахів контрольної групи Ця неспроможність р-каротину здійснювати (яких утримували на нормальному харчовому рабільш надійний захист від фототоксичного пошкоціоні) В попередніх дослідах також було встановдження тканини СІТКІВКИ в той час, як R-Rлено, що після опромінення світлом потрібний 14зеаксантин в такій же дозі викликав практично годинний період, щоб зміряти максимальну КІЛЬ100%-не зниження того ж самого показника поКІСТЬ апоптозних ядер колбочок у незахищених (з шкодження та загибелі клітин, ясно демонструє дефіцитом каротиноїдів) птахів важливість даного відкриття R-R-зеаксантин, синтезований за допомогою мікробної ферментації, є У птахів, яких утримували на контрольному істотним досягненням, переважаючим будь-які харчовому раціоні, максимальний апоптоз виявлераніше ВІДОМІ агенти но приблизно через 24годпісля опромінення, в той час як у птахів, яких утримували на харчовому Приклад 9 Одержання підсилювачів абсорбції раціоні з доданням ZX, максимальний апоптоз "Міцели", що містять зеаксантин, діаметром виявлено через істотно більш тривалий період менше 1мкм, які включають тільки потрібний R-Rчасу, ніж 24год Збільшення проміжку часу перед ізомер зеаксантину, можуть бути одержані або з тим, як пошкодження може бути виявлене, є наекстракту біомаси, одержаного за допомогою роздійним показником захисних дій ZX чинника, або з маслянистої рідини, описаної в прикладі 3, з використанням певних типів солей жовчСІТКІВКИ ЦИХ птахів вилучали шляхом мікророзних кислот, як описано у Olson, 1994 Масляниста сікання, фіксували в ксилолі та обезводнювали в рідина, що містить R-R-зеаксантин, може бути етанолі перед включенням в парашар (Oxford, змішана з прийнятною сіллю жовчної кислоти, та56°С) Після ЦЬОГО робили зрізи тканин СІТКІВКИ, ЩО кою, як фосфатні солі гліко- або таурохолату, які перебували в парашарі, і забарвлювали за спосопостачаються фірмою Marcor Development бом Gallyas, 1990 або пропідіййодидом для візуаCompany of Hackensack, New Jersey, або з викорилізацм пікнозних ядер, характерних для апоптозу станням екстрактів жовчного міхура, що містять Підраховували КІЛЬКІСТЬ ПІКНОЗНИХ ядер, яка може солі жовчних кислот, які постачаються фірмою бути виявлена в одному полі зору мікроскопу при Salzman Corporation of Davenport, Iowa Цей про400-кратному (лінійному) збільшенні Для кожної дукт жовчного міхура може бути змішаний або з дослідної групи підраховували ядра принаймні в 6екстрактом, одержаним за допомогою розчинника, 8 окремих полях зору і одержані значення усередабо з маслянистою масою та з іншими певними нювали солями, включаючими хлорид натрію, хлорид Результати, наведені в таблиці 2, ясно покакальцію або хлорид калію Цю суміш після цього зують, що загибель і пошкодження клітин СІТКІВКИ піддають обробці в механічному гомогенізаторі, (1) дуже знижувалися і/або уповільнювалися за що містить пристосування для змішування, такі, як допомогою синтезованого бактеріями R-Rобертальні лопаті, швидкість і тривалість обертанзеаксантину навіть при низькій дозі ZX (+5) у поріня яких можуть бути оптимізовані за допомогою внянні з птахами, які утримувалися на нормальностандартного експерименту шляхом аналізу діапаму контрольному харчовому раціоні, та (2) вони зону розміру міцел, одержаних з використанням зменшувалися в ще більшій мірі при використанні різноманітних комбінацій розмірів та форми лопабільш високої дози ZX (+50) Повна відсутність тей, швидкості і тривалості обертання При необбудь-яких пікнозних ядер в СІТКІВЦІ групи, оброблехідності утворені міцели висушують, вивільняючи ної ZX (+50), є безумовним доказом того, що R-Rвід розчинника, після цього розбавляють до будьзеаксантин з клітин лінії F multivorum (реєстраційякої потрібної концентрації з використанням носія ний номер АТСС 55238) являє собою значний крок або рідини для розрідження, такої, як рослинна вперед в галузі захисту клітин СІТКІВКИ ВІД фототоколія Після ЦЬОГО ЦЯ суміш може бути включена в сичного пошкодження За відомостями, які мають капсулу або інше пристосування, яке повинно заявники, та по їхньому переконанню жоден інший сприяти ковтанню і захисту утворених міцел від з будь-коли вивчених агентів не дозволяв досягнурозкладу в кислому середовищі шлунка ти цього рівня захисту або хоча б наблизитися до нього Приклад 8 Пряме порівняння ефективності RR-зеаксантинута р-каротину щодо захисту тканини СІТКІВКИ Як вказано вище, птахи, які утримувалися на харчовому раціоні ВС+, одержували дозу ркаротину (50мг на кілограм корму), яка є еквівалентною дозі зеаксантину в групі ZX (+50) Це дозволяє провести пряме порівняння ефективності ркаротину і ZX щодо захисту тканини СІТКІВКИ ВІД фототоксичного пошкодження Отримані результати показали, що фототоксичне пошкодження в групі ВС+ було знижене тільки в дуже незначній мірі (в середньому приблизно на 10% або менше) Порівняно зі стандартними відхиленнями в контрольній групі це зниження виявилося статистично невірогідним, імовірність того, що невеликі зниження були зумовлені виключно випадковими коливаннями, складала 0,12-0,14 Для одержання емульсій з невеликими розмірами часток можуть також бути використані ІНШІ емульгатори та ЛІПІДИ Можуть застосовуватися неюногенні поверхнево-активні речовини, такі, як твіни та спани, як описано у Olson, 1994, а також ЛІПІДНІ матеріали, такі, як фосфоліпіди та сфінголіпіди, які можуть утворювати ЛІПІДНІ пухирці невеликого (менше 1мкм) розміру Приклад 9 Мікрокапсулований зеаксантин В цьому прикладі описано одержання зеаксантину в мікрокапсулованій формі Мікрокапсули являють собою тверді частки розміром 10-1000мкм, що складаються з матеріалу ядра (такого, як R-Rзеаксантин), капсулованого за допомогою матеріалу покриття або оболонки, який може бути одержаний з різноманітних сполук, таких, як желатин, гуміарабік, крохмаль, зеїн (протеїн з кукурудзи) і т п В процесі виготовлення матеріалу оболонки також можуть додаватися ІНШІ сполуки, сприяючі 37 61899 збереженню форми, струїсгури, стабільності або інших необхідних хараісгеристик одержуваного препарату Такі сполуки можуть включати емульгатори, сорбіт, антюксиданти, такі, як ТБГХ або 2(1,1-диметилетил)-1,4-бензолдюл, або гелеутворюючі агенти, такі, як карапнан Чистий або частково очищений зеаксантин розчиняють у відповідному розчиннику, такому, як етанол, ацетон або ТГФ В розчині при доданні розчиненого зеаксантину у воду утворюються мікрокристали діаметром менше Юмкм Цей процес поліпшується, якщо в процесі додання воду і кристали зеаксантину в розчиннику обробляють ультразвуком з високою частотою в присутності емульгаторів, таких, яктвін 80 Після утворення мікрокристалів до суміші води, зеаксантину та розчинника додають матеріал оболонки Для деяких матеріалів оболонки, таких, як желатин, необхідно підтримувати температуру на рівні 60°С протягом приблизно 2год Після повного розчинення матеріалу оболонки всю суміш вміщують в пристрій для ультразвукового опромінення (сонікатор) на 5-10хв з метою повторно емульгувати кристали Формування мікрокапсул здійснюють шляхом сушіння суміші ядра та матеріалу оболонки з використанням будь-якого прийнятного методу сушіння, такого, як сушіння при розпорошенні, або з використанням обертального диска ВІДПОВІДНО ДО способу Sparks та ш , описаному в патенті США 4675140 Розпорошувальні сушарки широко використовуються в харчовій промисловості та при виробництві кормів Обертальний диск являє собою пристрій, який складається з диска (діаметром приблизно 4 дюйма), який може витримуватися при певній температурі в контрольованих умовах Він може працювати при різних швидкостях в діапазоні від 1000 до 10000об/хв Суміш матеріалів ядра і оболонки додають в центр диска при його обертанні зі швидкістю, наприклад, 4000об /хв Мікрокапсули утворюються при контактуванні рідини з нагрітим обертальним диском Мікрокапсули відкидаються від центру диска під дією відцентрової сили і збираються на рівній поверхні, яку заздалегідь покривають "збиральним" або "уловлювальним" агентом, таким, як гідрофобний крохмаль або декстрин Після ЦЬОГО мікрокапсули ВІДДІЛЯЮТЬ ВІД уловлювального агента шляхом просіювання через калібрувальне сито Мікрокапсули вміщують в контейнер для їх захисту від світла та повітря і зберігають в охолодженому стані до їх розфасування в капсули для орального уведення Таким чином, вище описані нові способи створення лікарських засобів, які містять R-Rзеаксантин, призначених для прийому всередину людиною, а також композицій, що містять синтезований мікроорганізмами R-R-зеаксантин та які призначені для запобігання або лікування дегенерації жовтої плями Хоча даний винахід пояснений на конкретних прикладах та описаний з посиланням на певні конкретні варіанти здійснення, для фахівців з даної галузі техніки очевидно, що можливі різні модифікації, зміни та еквівалентні заміни ілюстративних прикладів Припускається, що будьякі такі зміни, що випливають безпосередньо з даного опису та які не відхиляються від суті і обся 38 гу винаходу, підпадають під обсяг винаходу Бібліографія 1 Bauernfeind J С (ред ) Carotenoids as Colorants and Vitamin A Precusors Technological and Nutritional Applications, (Academic Press, New York, 1981) 2 Bone R A , "The role of the macular pigment in the detection of polarized light", Vision Research 20 213220(1980) 3 Bone R А та IH , "Preliminary identification of the human macular pigment", Vision Res , 25 1531-1535 (1985) 4 Bone R А та IH , "Analysis of the macular pigment by HPLC retinal distribution and age study", Invest Ophthal Vis SCI 29 843-849(1988) 5 Bone R А та IH , "Stereochemistry of the macular carotenoids", Invest Ophthal Vis Sci 34 2033-2040 (1993) 6 Bone R А та IH , "Distribution of macular pigment stereomers in individual eyes, including those with age-related macular degeneration (AMD)", ARVO Abstracts Invest Ophtalmol Vis Sci 35 1502(1994) 7 di Mascio P та IH , "Lycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxigen quencher", Archives of Biochemistry and Biophysics, 274 532538(1989) 8 Dorey С К та ін , "Lipofuscm in aged and AMD eyes", в Retinal Degeneration (ред Hollyfield та ш , Plenum Press, New York, 1993) 9 Eye Disease Case Control Study Group, "Antioxidant status and neovascular age-related macular degeneration", Arch Ophthalmol , 11 104109(1993) 10 Eye Disease Case Control Study Group, "Risk factors for neovascular age-related macular degeneration", Arch Ophthalmol, 10 1701-1708 (1992) 11 Foote С S та IH , "Chemistry of singlet oxigen XI Cis-Trans isomenzation of carotenoids by singlet oxigen and a probable quenching mechanism", J Amer Chem Soc 92 5218-5219(1970) 12 Foote С S та IH , "Chemistry of singlet oxigen X Carotenoid quenching parallels biological protection", J Amer Chem Soc 92 5216-5218(1970) 13 Gallyas F , Acta Neuropathologica 79 620 (1990) 14 Gerster H , "Review antioxidant protection of the ageing macula", Age and Aging 20 60-69 (1991) 15 Gittmger J W , Manual of Clinical and Problem Ophtalmology (Little-Brown, Boston, 1988) 16 Haegerstrom-Portnoy G , " Short-wavelengthsensitive-cone sensitivity loss with aging a protective role for macular pigment?", J Opt Soc Am A5 2140-2144(1988) 17 Ham W T, Jr, та ш , "Basic mecanisms underlying the production of photochemical lesions in mammalian retina", Current Eye Research 3 165-174 (1984) 18 Handelman G J та Dratz E A, "The role of antioxidants in the retina and retinal pigment epithelium and the nature of prooxidant-mduced damage", Adv in Free Radical Biology & Medicine 2 1-89(1986) 19 Handelman G J та ш , "Carotenoids in the human macula and whole retina", Invest Ophthalmol Vis Sci 29 850-855(1988) 39 61899 20 Jialal I та IH , "p-Carotene inhibits the oxidative modification of low-density hpoprotem", Biochimica et Biophysica Acta 1086 134-138 (1991) 21 Khachik та ш , "Separation, identification and quantification of carotenoids in fruits, vegetables and human plasma hy high performance liquid chromatography", Pure and Applied Chemistry 63 71-80(1991) 22 Kirschfeld К "Carotenoid pigments their possible role in protecting against photooxidation in eyes and photoreceptor cell", Proc R Soc Lond В 216 71-85 (1982) 23 Malmow M R та ш , "Diet-related macular anomalies in monkeys", Invest Ophthalmol Vis Sci 19 857-863(1980) 24 Pease P L та ш , "Optical density of human macular pigment", Vision Res 27 705-710(1987) 25 Peto R та IH , "Can dietary beta-carotene materially reduce human cancer rates'?", Nature 290 201-208(1981) 26 Schalch W , "Carotenoids in the retina - - a review of their possible role in preventing or limiting damage caused by light and oxigen", EXS 62 280-298 (1992) 27 Seddon J M та ш , "Dietary carotenoids, vitamins 40 А, С and E, and advanced age-related macular degeneration", JAMA 272 1413-1420 (1994) 28 Snodderly D M та ш , "The macular pigment I Absorbance spectra, localization and discrimination from other yellow pigments in primate retinas", Invest Ophthalmol Vis Sci , 25 660-673 (1984) 29 Sperduto R D та ш , "Do we have a nutritional treatment for age-related cataract or macular degeneration'?" Arch Ophthalmol 108 1403-1405 (1990) 30 Taylor А та IH , "Oxidation and aging impact on vision", Journal of Toxicology and Industrial Health, 9 349-371, (1993) 31 Vaughn D та Asbury T General Ophthalmology, 13-е вид (Appleton and Lange, Norwalk, CT, 1992) 32 Wald G , "The photochemystry of vision", Doc Ophthalmol 3 94(1949) 33 Waiter J J та IH , "Central sparing in annular macular degeneration", Am J Ophthalmol 106 286292(1988) 34 Werner J S та IH , "Aging and human macular pigment density", Vision Res 27 257-268(1987) CH, OH (R або S) Нумерація каротиноїдного кільця ФІг. 1 н,с en 41 42 61899 Концентрування клітин та твердих часток Одержання вихідних (центрифугування або фільтрація) Руйнування клітин Інокуляція в рщку допередкультуру Екстракція розчинника промислової ферментації Відкидання або повторне використання твердих Ферментація протягом 4S-72 годин Додання стабілізатора Випарювання розчинника Неповністюочищене в'язке масло, що містить % X Пастерізація Фіг. 2 Комп'ютерна верстка О Гапоненко Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119