Застосування бактерій роду deinococcus для одержання біопалива

Реферат: Винахід належить до способу виробництва біоенергії шляхом модифікації біомаси або її похідних з використанням бактерій роду Deinococcus і/або бактерій, що мають здатність наново збирати свій геном після стресового впливу. UA 103467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується композиції і способів виробництва біоенергії. Більш конкретно, винахід стосується застосування бактерій роду Deinococcus і/або родинних родів для модифікації біомаси або похідних біомаси з метою виробництва біоенергетичних продуктів і метаболітів. Рівень техніки винаходу Відомо що, мікроорганізми застосовують для проведення модифікації біомаси, особливо, рослинної біомаси, для виробництва біоенергетичних продуктів, наприклад етанолу. Існуючі в цей час виробничі процеси дозволяють здійснити тільки культивування і зростання мікроорганізмів для ферментації і витягання етанолу при температурах в зоні 30°С, внаслідок невеликої тривалості життя промислових мікроорганізмів, що використовуються (дріжджів). Такі процеси також спричиняють за собою основні витрати на біоенергію для того, щоб сконцентрувати етанол після ферментації, оскільки дріжджі, що використовуються в цей час для такої ферментації, не можуть перенести концентрації більше ніж 100 г/л. Додатково, при ферментації такими дріжджами використовується фактично тільки C6-цукор типу глюкози. Також відомо, що обробка біологічного матеріалу бактеріальними штамами додає їм серед іншого поліпшені властивості. Наприклад в патенті США № 6716631 S. Del Cardayre et al. описаний спосіб, оснований на циклах рекомбінації, що повторюються і вибору/скринінгу для придання необхідних властивостей цілим клітинам і цілим організмам. Додані властивості являють собою, наприклад підвищену здатність до генетичної рекомбінації, збільшене число копії геному, підвищену здатність експресувати і/або секретувати білки і повторні метаболіти. Вибравши підхід молекулярної генетики, автори пропонують способи модифікації відповідних геномів клітин і організмів для придання їм нових властивостей. У способі, що описується в патенті США 6716631, застосовують популяцію різних клітин, культивування даних клітин з утворенням гібридних клітин за допомогою злиття протопластів, потім скринінг і вибір клітин, які розвиваються з набуттям необхідної властивості, і повторення даних стадій доти, поки не одержують щонайменше одну клітину, яка має необхідну модифікацію. Даний спосіб представлений як вигідна альтернатива відомим способам, основаним на програмі удосконалення штамів. Протопласти, що піддаються вказаному злиттю, можуть походити з прокаріотичних організмів. Одним з наданих застосувань в даному патенті США є ферментація для одержання, наприклад етанолу, у якого вихід продукту і витрати, як пропонують, удосконалені із застосуванням вказаних способів рекомбінації за допомогою перестановки в ДНК мікроорганізмів, що використовуються. Як приклад, згадують гомологічну рекомбінацію Rhodococcus, яку, як відомо, каталізують двофазні реакції. У міжнародній патентній заявці № WO01/023526 описане одержання і застосування бактерій, стійких до дії іонізуючого випромінювання і здатних приводити в дію біоочистку, особливо, роду Deinococcus (а саме D. radiodurans і D. geothermalis), модифікованих так, щоб стати більш ефективними при метаболізмі, деградації або нейтралізаціях токсичної дії неорганічних і органічних забруднюючих речовин, таких як радіонукліди, важкі метали і органічні розчинники. Рекомендують, що дані бактерії потрібно обробляти з метою експресії гетерологічних ферментів, здатних нейтралізувати токсичну дію вказаних елементів. Бактерійні штами обробляють для об'єднання множини функцій, що кодуються різними генами, в одному організмі-господарі. У патентній заявці США I. Narumi et al., опублікованої 18 вересня 2003 року під № 2003/0175977, описана ендогенна плазміда, одержана з штаму D. radiopugnans, pUE30, який можна використати як вектор, здатний самостійно реплікуватися в бактеріях роду Deinococcus, і яку можна використати для конструювання човникового вектора, також що містить плазміду, здатну самостійно реплікуватися в Е. coli і її нащадках і здатній реплікуватися в бактеріях обох родів Deinococcus і Е. coli. У патенті США № 7160715 C. B. Fliermans описані способи визначення розподілу і частоти появи розривів ниток ДНК in vivo. Дані способи включають застосування білка PprA, що одержується з Deinococcus radiodurans. У патентній заявці США, опублікованій під № 2004/0224320 від імені K. Satoh et al, описана грампозитивна бактерія (№ доступу в ATCC BAA-149 або її мутанти), яку виділяють і очищують. Ізолят здатний розкладати велику множину органічних забруднюючих речовин і підходить для біоочистки множини органічних забруднюючих речовин в присутності іонізуючого випромінювання. 1 UA 103467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, нову монографію по виробництву етанолу з використанням ферментації штамами мікроорганізмів опублікував під назвою "Ethanol Fermentation Strains" J.R. Hettenhaus під егідою Міністерства енергетики Сполучених Штатів і Національної лабораторії відновлюваних джерел енергії (16 грудня 1998 року). У даному документі, в якому підсумовуються дані, одержані учасниками відповідного дослідження, вказано що: - єдині штами мікроорганізмів, які можна використати в існуючому обладнанні, повинні бути схожі на штами, що вже використовуються, а саме Saccharomyces, Zymomonas і E.coli; - найближчим часом збільшена ферментація ксилози і арабінози могла б стати наміченою метою, що визначається, проте, як малоцікавою для збільшення ефективності конверсії іншого цукру типу гексози або олігомерного типу; - протягом довгого часу можна було б досягти успіху відносно більш високих робочих температур і об'єднання стадій одержання ферменту, оцукрення і гідролізу. Отже, існувала необхідність в способі ферментації біомаси і одержання етанолу і, необов'язково, інших метаболітів, який можна було б здійснити в значно кращих робочих умовах, ніж в умовах існуючих в цей час способів, і яким в той же самий час можна було б більш просто керувати, ніж відомими способами, і здатним привести до одержання продуктів ферментації, який дешевше і легше модернізувати. Винахід здатний привести до реалізації таких вимог і здійснити вдосконалені способи для витягання користі від біомаси за допомогою виробництва альтернативних біоенергетичних продуктів, які стають все більш і більш необхідними через значне скорочення джерел енергії викопного походження. Суть винаходу Даний винахід стосується способів і композицій для виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів. Більш конкретно, винахід стосується застосування певних мікроорганізмів для виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів з біомаси або її похідних. Винахід серед іншого оснований на відкритті, що мікроорганізми роду Deinococcus мають несподівані і сприятливі властивості для модифікації або конверсії біомаси або похідних біомаси з метою одержання сполуки, яку можна використати для виробництва біоенергії, етанолу зокрема в промисловому масштабі і економічно, і надійно при експлуатації. Мета даного винаходу, отже, полягає в представленні способу виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів, що включає взаємодію з біомасою або похідними біомаси природної або модифікованої бактерії, що має здатність наново збирати свій геном, повністю або частково, при руйнуванні від стресового впливу, переважно, природної або модифікованої бактерії роду Deinococcus або її екстракту. Додатковою метою винаходу є здійснення способу конверсії біомаси або похідних біомаси в біоенергетичні продукти або метаболіти, що включає обробку вказаної біомаси або похідних біомаси в присутності бактерії роду Deinococcus або бактерії, що має здатність наново збирати свій геном, повністю або частково, при руйнуванні від стресового впливу, або її екстракту. У певному аспекті даний винахід стосується способу, що включає наступні стадії: a) культивування і/або зростання вказаної бактерії в аеробних і/або анаеробних умовах, b) модифікації біомаси або похідних біомаси в біоенергетичні продукти або метаболіти промислового значення (наприклад джерела біоенергії, такі як етанол, елементи хімічних структур, такі як янтарна кислота) використовуючи композицію, що містить вказану бактерію або її екстракт, і c) збирання щонайменше одного біоенергетичного продукту або метаболіту, що виходить внаслідок вказаної модифікації біомаси або похідного біомаси. Даний винахід також стосується застосування бактерії роду Deinococcus або її екстракту для виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів з біомаси або похідних біомаси. Винахід також стосується композиції, яка містить бактерію Deinococcus, і біомаси або похідних біомаси. Винахід також стосується біоенергетичним продуктів, що одержуються при використанні способу, як описано вище. Спосіб за винаходом можна здійснити, використовуючи різні природні або модифіковані види Deinococcus, такі як, не обмежуючи, Deinococcus geothermalis, Deinococcus radiodurans, Deinococcus murrayi або Deinococcus cellulosilyticus. У даному винаході показано, що бактерії Deinococcus можуть ефективно підтримувати виробництво біопалива, такого як етанол, пропанол, бутанол, гліцерин, бутандіол, пропандіол, або органічних кислот хімічного значення і їх солей, таких як оцтова кислота, пропіонова кислота, піровиноградна кислота, масляна кислота, молочна кислота і/або янтарна кислота або складний ефір, особливо, складний ефір, що утворюється із згаданих вище спиртів і кислот. 2 UA 103467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У винаході також несподівано показано, що Deinococcus може працювати в умовах, таких як підвищені температури, широкий діапазон величин pH, присутність розчинників, присутність неочищених субстрат, відповідних для виробництва великих кількостей біоенергетичних продуктів або метаболітів з різних субстрат. Винахід, таким чином, стосується нових способів і композицій для виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів дуже ефективним чином. Опис фігур Фігура 1: Бактерицидний ефект етанолу на Deinococcus geothermalis DSM11301 в експонентній фазі зростання: бактерицидна здатність етанолу значна при вмісті вище ніж 8,2% в експонентній фазі зростання. Фігура 2: Бактерицидний ефект етанолу на Deinococcus geothermalis DSM11301 в стаціонарній фазі: бактерицидна здатність етанолу значна при вмісті вище ніж 11,7% в стаціонарній фазі. Фігура 3: Бактерицидний ефект бутанолу на Deinococcus geothermalis DSM11301: бактерицидна здатність бутанолу значна при вмісті вище ніж 1,5% в експонентній фазі. Фігура 4: Бактерицидний ефект бутанолу на Deinococcus geothermalis DSM11301 в стаціонарній фазі: бактерицидна здатність бутанолу значна при вмісті вище ніж 2% в стаціонарній фазі. Фігура 5: Вплив етанолу на зростання Deinococcus geothermalis DSM11300: чорний квадрат, 0% етанолу; білий квадрат, 0,8% етанолу; чорний гурток, 1,2% етанолу; білий гурток 2,4% етанолу; чорний трикутник, 3,1% етанолу. Фігура 6A: Вплив величини pH на зростання D. geothermalis DSM 113000 (DRH05): чорний квадрат, pH 8; чорний гурток, pH 7; білий квадрат, pH 6; білий гурток, pH 5; чорний ромб, pH 4. Фігура 6B: Вплив величини pH на зростання D. geothermalis HAMBI 2481 (DRH37): чорний квадрат, pH 8; чорний гурток, pH 7; білий квадрат, pH 6; білий гурток, pH 5; чорний ромб, pH 4. Фігура 6C: Вплив величини pH на зростання D. geothermalis HAMBI 2480 (DRH38): чорний квадрат, pH 8; чорний гурток, pH 7; білий квадрат, pH 6; білий гурток, pH 5; чорний ромб, pH 4. Фігура 6D: Вплив величини pH на зростання D. geothermalis HAMBI 2411 (DRH39): чорний квадрат, pH 8; чорний гурток, pH 7; білий квадрат, pH 6; білий гурток, pH 5; чорний ромб, pH 4. Фігура 7: Ріст D. cellulosilyticus в різних рідких середовищах. Бактерії ростили, як описано в матеріалах і методах прикладу 9. Чорний гурток, зростання в повному середовищі; чорний квадрат, зростання в мінімальному середовищі, який містить CM-целюлозу; білий квадрат, зростання в мінімальному середовищі, позбавленому джерела вуглецю. Докладний опис винаходу Даний винахід стосується способів виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів з використанням бактерій Deinococcus. У винаході дійсно показано, що бактерії Deinococcus можуть продукувати біоенергетичні продукти або метаболіти з біомаси дуже ефективним чином. Визначення У контексті даної заявки термін «бактерії роду Deinococcus» включає в себе штами дикого типу або природних варіантів Deinococcus, а також рекомбінантні штами, штами, що одержуються за допомогою методик перестановки ДНК або за допомогою методик спрямованого розвитку. «Екстракт бактерії» означає будь-яку фракцію, що одержується з бактерії, таку як клітинну надосадну рідину, клітинний детрит, клітинні стінки, екстракт ДНК, ферменти або препарати ферментів, або будь-який препарат, що одержується з бактерії за допомогою хімічної, фізичної і/або ферментативної обробки, який, по суті, не містить живих бактерій. У контексті даного винаходу термін «біоенергія» означає енергію, що відновляється, що одержується з біомаси. Більш конкретно, термін «біоенергетичні продукти» означає «біопаливо» і всі кінцеві продукти модифікації біомаси або похідних біомаси, які можна використати як паливо, таке як етанол. Термін «метаболіти» означає всі можливі проміжні молекули, що одержуються під час модифікації біомаси або похідних біомаси в біоенергетичні продукти, включаючи як необмежуючі приклади декілька хімічних продуктів промислового значення, таких як органічні кислоти і структурні елементи. У контексті даного винаходу термін «біомаса» стосується живого і недавно омертвілого біологічного матеріалу, який можна використати як паливо або для промислового виробництва. Звичайно, біомаса стосується рослинного матеріалу, вирощеного для одержання електрики або виробництва біопалива, але також включає в себе рослинний або тваринний матеріал, що застосовується для одержання волокон, хімічних речовин або тепла. Біомаса також може включати в себе відходи, що біологічно розкладаються, які можна спалювати як паливо. Термін 3 UA 103467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 «біомаса» не включає в себе органічну речовину, яка перетворюється при геологічних процесах в речовини, такі як вугілля або нафта. Промислову біомасу можна виростити з множини типів рослин, що включають в себе китайську тростину, просо лозоподібне, коноплі, цукровий буряк, пшеницю, кукурудзу, тополю, вербу, сорго звичайне, цукрову тростину і множину видів дерев, в діапазоні від евкаліпта до олійної пальми. Біомаса за винаходом включає в себе сиру біомасу і/або повторну біомасу. Сира біомаса являє собою необроблений матеріал з біологічного матеріалу. Приклади включають в себе лісопродукти, такі як зрілі дерева, невідповідні для виробництва пиломатеріалів або паперу, сільськогосподарські продукти, такі як трави, зернові культури і гній тварин, і водні продукти, такі як водорості і морська водорость. Повторна біомаса являє собою будь-який матеріал, спочатку одержаний з сирої біомаси, яку піддали значним хімічним і фізичним змінам. Приклади включають в себе папір, шкіру, бавовну, коноплі, природні гумові продукти, побічні продукти харчової промисловості і кулінарні жири, що використовуються. Як застосовують в цьому документі, термін «похідні біомаси» означає всі молекули, одержані з сирої біомаси і/або з повторної біомаси, як визначено вище, і, зокрема будь-який матеріал, спочатку одержаний з сирої біомаси, який зазнавав значних хімічних і фізичних змін, такий як, наприклад крохмаль, целюлоза, геміцелюлози і лігнін. Як застосовують в цьому документі, «проміжні форми» являють собою молекули, що одержуються за допомогою фізико-хімічної або біохімічної конверсії похідних біомаси, такі як цукор, крохмаль і синтетичний газ на біологічній основі (сингаз). Докладний опис Даний винахід стосується застосування бактерій Deinococcus для виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів з біомаси. У даному винаході дійсно показано, що бактерії роду Deinococcus виявляють несподівані властивості, які дозволяють їм взаємодіяти при виробництві біоенергетичних продуктів або метаболітів, ферментувати біомасу або похідні біомаси. Бактерії Deinococcus, як було показано, мають здатність наново збирати свій геном, повністю або частково, при руйнуванні від стресового впливу (PCT/EP2006/005826 RadmanZahradka). Як згадувалося раніше, дані бактерії, особливо, D. radiodurans, були запропоновані для біоочистки. Однак ніколи не описували або передбачали, що бактерії Deinococcus будуть здатні продукувати біоенергетичні продукти або метаболіти з біомаси. Крім того, ніколи не передбачалося, що бактерії Deinococcus, що мають необхідні біологічні властивості, можна виділити і культивувати. У винаході в даний момент уперше показано, що можливо виділити або культивувати бактерії Deinococcus, що мають щонайменше одну з наступних нижче властивостей, і що вказані бактерії здатні продукувати біоенергетичні продукти або метаболіти: - життєздатні або функціональні при високих температурах (наприклад приблизно 40-70°С);) - життєздатні або функціональні в діапазоні величин pH приблизно від 3 до приблизно 9,5, переважно, в діапазоні приблизно від 4 до приблизно 8; - життєздатні або функціональні в присутності токсичних речовин, зокрема органічних розчинників, наприклад етанолу; - здатні конвертувати C6- і C5-цукор; - здатні активувати розщеплення целюлози з одержанням глюкози; - здатні активувати розщеплення геміцелюлози з одержанням ксилози; - здатні рости в аеробних і/або анаеробних умовах в присутності відповідного джерела вуглецю. Крім того, бактерії Deinococcus типово позбавлені будь-якій патогенності і, отже, їх можна використати без захисних заходів. У винаході, таким чином, уперше описана здатність бактерій Deinococcus виробляти біоенергетичні продукти або метаболіти з біомаси, а також їх несподівана здатність рости і культивуватися при певних умовах, адаптованих для такого застосування. Винахід також стосується застосування для виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів будь-яких бактерій, що мають здатність наново збирати свій геном, повністю або частково, при руйнуванні від стресового впливу. У переважному варіанті здійснення в способі за даним винаходом використовують термофільні види Deinococcus, переважно, вибрані з Deinococcus geothermalis, Deinococcus radiodurans і Deinococcus murrayi. У переважному варіанті здійснення винаходу в способі застосовують бактерії Deinococcus, життєздатні в присутності токсичних речовин, особливо, в присутності органічних розчинників, 4 UA 103467 C2 5 10 15 20 25 30 35 наприклад етанолу. У даний заявці дійсно показано, що штами Deinococcus можуть рости в присутності високих концентрацій розчинників, таких як етанол або бутанол, дозволяючи одержувати біотопливо більш ефективним чином. У іншому переважному варіанті здійснення винаходу в способі застосовують бактерію, яка може рости в діапазоні температур приблизно від 40 до 70°С, переважно, від 50°С до 60°С. У більш переважному варіанті здійснення в способі використовують бактерію, яка може рости як при підвищених температурах (вище 40°С), так і в присутності токсичної речовини або органічного розчинника, як описано вище. У додатковому певному варіанті здійснення даного винаходу в способі застосовують бактерії Deinococcus, які можуть бути життєздатними і функціональними в умовах концентрацій NaCl або еквівалентних солей, що можливо досягають приблизно 5% маси/об'єму. У іншому переважному варіанті здійснення винаходу в способі застосовують бактерію, яка життєздатна в інтервалі величин pH від приблизно 3 до 9,5, переважно, від 4 до 8. Дійсно, автори винаходу виявили, що штами Deinococcus можуть підтримувати життєдіяльність в таких суворих умовах, які особливо сприятливі для конверсії біомаси. У переважному варіанті здійснення у винаході застосовують бактерію Deinococcus, яка здатна конвертувати C6- і/або C5-цукор і/або забезпечувати розщеплення целюлози до одержання глюкози і/або забезпечувати розщеплення геміцелюлози до одержання ксилози. У певному варіанті здійснення винахід стосується способу, де вказана бактерія Deinococcus здатна рости в присутності ксилану і забезпечувати розщеплення ксилану. Про таку ферментативну активність, об'єднану з високої термостійкістю, стійкістю в широкому діапазоні величин pH і стійкістю до впливу токсичних речовин, раніше ніколи не повідомляли, і вони є видатними. Як показано в прикладах, бактерії Deinococcus, що мають вказані вище властивості, можна виділити, культивувати і вони можуть виробляти істотні кількості біоенергетичних продуктів або метаболітів з біомаси. У цьому відношенні, інша перевага винаходу полягає в способі, де вказані бактерії Deinococcus вирощують в мінімальному середовищі, що містить C6-цукор, переважно, глюкозу або більш складний цукор, переважно, сахарозу, целобіозу або крохмаль, або C5-цукор, переважно, ксилозу як джерело вуглецю. Додаткова перевага даного винаходу полягає в факті, що вказані бактерії Deinococcus можуть рости в присутності C3-вуглеводів, переважно, гліцерину або пірувату натрію. Певні приклади бактерій, придатних для використання в даному винаході, являють собою штами Deinococcus geothermalis під номерами доступу DSM11300, DSM11301, DSM11302, HAMBI2480, HAMBI2481 і HAMBI2411; штами Deinococcus murrayi під номерами доступу DSM11303 і DSM11305 або штам Deinococcus cellulosilyticus під номером доступу DSM18568T (перераховані в таблиці 1) або штами по суті схожі з ними або їх мутантів. Таблиця 1 Перелік штамів Deinococcus Рід Вигляд Посилання Код Темп. °С DRH 05 Deinococcus geothermalis DSM 11300 45-50 DRH 06 Deinococcus geothermalis DSM 11301 45-50 DRH 07 Deinococcus geothermalis DSM 11302 45-50 DRH 37 Deinococcus geothermalis HAMBI 2481 45-50 DRH 38 Deinococcus geothermalis HAMBI 2480 45-50 Позначення 5 Бібліографічна довідка Ferreira et al, 1997 Int J Svst Bacteriol, 47(4): 939-47 Ferreira et al, 1997 Int J Svst Bacteriol. 47(4):939-47 Ferreira et al, 1997 Int J Svst Bacteriol, 47(4): 939-47 Kolari et al, 2003 J Ind Microbiol Biotechnol, 30:225-238 Kolari et al, 2003 J Ind Microbiol Biotechnol 30:225-238 UA 103467 C2 Таблиця 1 Перелік штамів Deinococcus Позначення 25 30 35 40 Deinococcus geothermalis HAMBI 2411 Deinococcus murrayi DSM 11303 Deinococcus murrayi DSM 11305 DRH 46 20 Код DRH 10 15 Посилання DRH 08 10 Вигляд DRH 39 5 Рід Deinococcus cellulosilyticus DSM 18568T Темп. °С Бібліографічна довідка Vaisanen et al, 1997, 45-50 Applied Microbiology 84:1069-1084 Ferreira et al, 1997 Int J 45-50 Svst Bacteriol, 47(4): 939-47 Ferreira et al, 1997 Int J 45-50 Svst Bacteriol, 47(4): 939-47 Weon et al, 2007, Int J of Syst & Evolutionary 45 Microbiol, 57, 16851688 Всі штами, перераховані вище в таблиці, здатні рости в середовищі для культивування типу PGY при величині pH 7. Інші відповідні середовища для культивування описані в експериментальному розділі. Потрібно розуміти, що додаткові штами Deinococcus, що мають властивості, як в цьому документі продемонстровані і описані, фахівці в даній зоні можуть в цей час піддати скринінгу і ідентифікувати на основі ідей даної заявки, наприклад за допомогою подальших керівництва і тестів, як описано в експериментальному розділі. Як указано вище, штами Deinococcus, що застосовуються в даній заявці, можна використати або в природному вигляді, або модифікованими (наприклад хімічно або генетично) для набуття поліпшених властивостей. У цьому відношенні в конкретному варіанті здійснення в способі застосовують бактерію Deinococcus, яку модифікують за допомогою прискореного розвитку, або за допомогою методик перестановки ДНК, або за допомогою вставляння еукаріотичної, прокаріотичної або синтетичної, що не стосується Deinococcus ДНК, або за допомогою вставляння ДНК іншого штаму Deinococcus, причому вказана модифікація впливає на життєздатність, зростання або функції вказаної бактерії так, щоб стимулювати модифікацію біомаси. У іншому варіанті здійснення винаходу бактерія, що застосовується може являти собою рекомбінантний або модифікований бактерійний штам, переважно використовуючи спосіб, такий як описано в міжнародній патентній заявці № PCT/EP2006/005826. Як указано вище, у винаході показано, що бактерії роду Deinococcus або їх похідні, вибрані, наприклад з D. geothermalis, D. radiodurans або D. murrayi, виявляють сприятливі властивості і здатні продукувати біоенергетичні продукти або метаболіти з різних неочищених субстрат. Даний винахід, отже, стосується застосування бактерій роду Deinococcus для виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів з біомаси або похідних біомаси. Даний винахід також стосується способу виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів з біомаси або похідних біомаси, піддаючи впливу або культивуючи вказану біомасу в присутності бактерій роду Deinococcus або їх екстрактів, і витягуючи одержаний біоенергетичний продукт або метаболіт. Культивування або вплив можна здійснити в будь-яких відповідних умовах або навколишньому середовищі, що дозволяють провести модифікацію біомаси або похідного для того, щоб одержати біоенергетичний продукт. У цьому відношенні спосіб можна здійснити в реакторі, в ферментері, на відкритому повітрі в присутності придатних поживних речовин або добавок, якщо необхідно. Спосіб типово здійснюють в умовах величин pH, температури вище 40°С і в присутності придатних субстрат. Певна мета за даним винаходом полягає в здійсненні способу, який включає наступні стадії: a) культивування і/або зростання вказаної бактерії в аеробних і/або анаеробних умовах, b) модифікації (наприклад конверсія або обробка) біомаси або похідних біомаси в біоенергетичні продукти або метаболіти, використовуючи композицію, що містить вказану бактерію або її екстракт, і 6 UA 103467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 c) збирання щонайменше одного біоенергетичного продукту або метаболіту, що виходить внаслідок вказаної модифікації біомаси або похідного біомаси. Інша мета за винаходом полягає в здійсненні способу конверсії біомаси або похідних біомаси, використовуючи щонайменше одну бактерію або бактерійний екстракт, такий як визначено вище, або композицію, таку як описано вище, що включає комбінацію: - щонайменше однієї операції розміщення в культуру і розвиток вказаного бактерійного штаму або екстракту вказаного бактерійного штаму в умовах, відповідних для зростання і розвитку, - щонайменше однієї операції конверсії біомаси або похідних біомаси під дією відповідної кількості вказаного бактерійного штаму або екстракту вказаного бактерійного штаму в умовах, відповідних для вказаної конверсії біомаси або похідних біомаси і - збирання щонайменше одного біоенергетичного продукту або метаболіту, одержаного при вказаній конверсії біомаси або похідного біомаси, зокрема збирання етанолу, що одержується таким чином. У описаних вище способах першу стадію культивування і/або зростання вказаної бактерії і другу стадію модифікації біомаси або похідних біомаси в біоенергетичні продукти або метаболіти, використовуючи композицію, що містить вказану бактерію або її екстракт, можна здійснювати або одночасно, або послідовно; третю стадію збирання біоенергетичних продуктів або метаболітів можна здійснювати одночасно з першою і/або другою стадією або послідовно. У цьому відношенні, на біомасу можна впливати бактерією у відповідних умовах для того, щоб забезпечити розмноження вказаної бактерії, тим самим збільшуючи ефективність способу. Альтернативно, бактерійні штами можна розмножати окремо у відповідних для культивування умовах і згодом додати до біомаси. Потрібно розуміти, що точна кількість бактерій, що використовуються спочатку для того, щоб ефективно конвертувати біомасу по суті в біоенергетичні продукти або метаболіти, фахівці в даній зоні можуть підібрати в залежності від типу бактерій, типу біомаси або похідних і умов культивування. У конкретному варіанті здійснення способу за винаходом, бактерії Deinococcus вирощують окремо від конвертованої біомаси. У іншому конкретному варіанті здійснення в способі застосовують композицію, що містить бактерію Deinococcus або її екстракт і щонайменше одну відповідну добавку або ексципієнт, переважно щонайменше один засіб, вибраний з групи, що складається з антивспінюючих речовин і поживних речовин. Відповідні антивспінюючі речовини являють собою дисперсанти, детегренти і поверхово-активні речовини, зокрема і в загальному амфіфільні сполуки. У конкретному варіанті здійснення спосіб за винаходом здійснюють в реакторі для конверсії біомаси. Під «реактором» мають на увазі загальноприйнятий ферментаційний чан або будьякий пристрій або систему для конверсії біомаси, спеціально сконструйований для виконання винаходу і, отже, що перебувають, зокрема з ферментерів, біофільтрів, дискових біофільтрів і інших ферментерів з газовою і/або рідкою фазою для обробки біомаси або похідних біомаси. Пристрій, який можна використати за винаходом, можна використати безперервно або при завантаженні окремих порцій. У реакторі для виконання способу за винаходом застосовують щонайменше одну бактерію або бактерійний екстракт за винаходом і/або щонайменше одну композицію, таку як визначено вище, в той час як вказаний реактор влаштований і постачається так, щоб фізико-хімічні умови в ньому встановлювалися і підтримувалися таким чином, щоб вказана бактерія була активною для застосування, що розглядається і так, щоб в ньому, необов'язково, було можливе і, переважно, активізоване бактерійне зростання. У іншому варіанті здійснення способу за винаходом бактерії ростуть в реакторі під час конверсії біомаси або похідних біомаси, в той час як відповідні фізико-хімічні умови встановлюють і підтримують для того, щоб було можливе дане бактерійне зростання і, переважно, активізований. Наприклад можна використати колби Ерленмейера ємністю 500 мл в присутності 100 мл середовища Thermus 167 або мінімального середовища, що описується нижче, при температурі 50°С. У альтернативних варіантах здійснення винаходу конверсію біомаси або похідних біомаси проводять при аеробіозі, анаеробіозі або при мікроаеробіозі. Згідно з додатковим аспектом метою винаходу є реактор для конверсії біомаси або похідних біомаси, використовуючи щонайменше одну бактерію Deinococcus або бактерійний екстракт, такий як визначено вище, або таку композицію, як визначено вище. Спосіб за даним винаходом можна використати для виробництва біоенергії з різних типів біомаси. У переважному варіанті здійснення біомаса включає в себе деревину і деревні відходи, лісосічні відходи, відходи паперового виробництва, сільськогосподарські зернові культури, 7 UA 103467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 сільськогосподарські відходи, їстівні і/або неїстівні рослини або їх фрагменти, солома, відходи садівництва, водні рослини, відходи тваринництва, відходи тваринницького господарства, гній, органічні побутові відходи і/або промислові органічні відходи. Біомаса також може включати в себе відходи, що біологічно розкладаються. У конкретному варіанті здійснення винахід стосується способу модифікації біомаси або похідних біомаси або проміжних форм в біоенергетичні продукти або метаболіти, де похідні біомаси переважно являють собою лігнін, целюлозу, геміцелюлозу, крохмаль, і де проміжні форми переважно являють собою вуглеводи, такі як ксилан, глюкороноксилан, арабіноксилан, глюкоманан, ксилоглюкан, крохмаль, сахарозу, лактозу, мальтозу, трегалозу, глюкозу, ксилозу, манозу, арабінозу, рамнозу, галактозу і/або фруктозу. Певний об'єкт за винаходом являє собою спосіб для виробництва біопалива. У контексті даного винаходу термін «біопаливо» означає паливо, що одержується з живих або недавно омертвілих біологічних джерел вуглецю. Біопаливо можна одержувати з ресурсів, що відновляються, особливо, рослинної або тваринної біомаси або з побутових і промислових відходів. Біопаливо за винаходом включає в себе «біопаливо першого покоління» і/або «біопаливо другого покоління». Біопаливо першого покоління одержують з рослинного або тваринного органічного матеріалу, переважно, з цукру, крохмалю, рослинної олії або тваринних жирів. Основним джерелом для виробництва біопалива першого покоління є їстівні рослини або їх фрагменти. Біопаливо першого покоління включає в себе рослинну олію, біодизель, біоспирти, біогаз, сингаз і тверде біопаливо. Біоспирти включають в себе етанол, пропанол і бутанол. Більш переважно, спосіб за винаходом використовують для виробництва етанолу, пропанолу, бутанолу. Найбільш переважне біопаливо являє собою етанол. Біопаливо другого покоління проводять переважно з неїстівних рослин або фрагментів неїстівних рослин. Вони включають в себе нехарчові зернові культури, відходи біомаси, стеблі пшениці, зерна і дерев. Переважно, біопаливо за винаходом включає в себе целюлозне біопаливо. У залежності від вихідної біомаси для виробництва біоенергетичних продуктів або метаболітів, таких як біопаливо, може бути потрібні два послідовних етапи: стадія гідролізу, каталізованого ферментами, переважно, целюлазами або лаказами, які руйнують довгі ланцюги складних вуглеводів, таких як целюлоза або лігнін, відповідно, на більш дрібні ферментації цукру, що піддаються; і стадія ферментації, на якій додатково руйнуються органічні сполуки, такі як цукор, до спиртів. Потрібно зазначити, що штами Deinococcus за даним винаходом можна використати або для одної з двох, або для двох вказаних реакцій. Дійсно, у винаході показано, що Deinococcus можуть гідролізувати довгі вуглеводні ланцюги (наприклад ксилан або целюлозу) і також можуть продукувати метаболіти (наприклад етанол, гліцерин, бутандіол, пропандіол, а також оцтову, пропіонову, піровиноградну і масляну кислоти) з C3-, C5- або C6цукру. Проте, потрібно зазначити, що штами Deinococcus при бажанні можна використати в поєднанні з будь-якими іншими бактеріальними штамами. Наступні нижче приклади наведені з метою ілюстрації і ніяким чином не з метою обмеження. Приклади Приклад 1: Тести для відбору Для того щоб визначити, чи забезпечений мікроорганізм властивостями, необхідними для винаходу, визначені тести необхідно провести, щоб визначити, чи здатний рід, вигляд і/або бактерійний штам мати необхідні властивості і функціонувати в способі конверсії біомаси або похідних біомаси, і щоб визначити, які значні удосконалення можна одержати таким чином. Дані певні тести за винаходом проводять в наступних нижче умовах: Середа для культивування: D. geothermalis (D.G.) культивують при 50°С при перемішуванні в аеробному середовищі. Середовище для культивування 167 використовують для підтримання життєдіяльності штамів. Мінімальне середовище використовують в експериментах ферментації, зокрема щоб охарактеризувати метаболіти. У цьому випадку 500 мл середовище для культивування інкубують протягом від 1 до 7 днів при перемішуванні в колбі Ерленмейера ємністю 1 л після засівання 5 мл зливної культури 55 8 UA 103467 C2 Середовище 167 Thermus Тріптон Дріжджовий екстракт Агар Нітрилотриоцтова кислота CaSO4×2H2O MgCl2×6H2O 0,01 М цитрат Fe Розчин мікроелементів (дивись нижче) Фосфатний буфер (дивись нижче) H2O Довести при допомозі NaOH до величини рН 7,2, стерилізувати в автоклаві при 121°С протягом 15 хв. Фосфатний буфер стерилізувати в автоклаві окремо і додати в середовище 1 1 28 100 40 200 0,5 0,5 100 900 Фосфатний буфер КН2РО4 Na2НРO4×12H2O H2O Довести до величини рН 7,2 5,44 43 1000 г г мл Розчин мікроелементів Н2SO4 MnSO4×H2O ZnSO4×7H2O H3BO3 CuSO4×5H2O Na2MoO4×2H2O CoCl2×6H2O H2O 0,5 2,28 0,5 0,5 25 25 45,00 1000 мл г г г мг мг мг мл Мінімальне середовище MOPS-буфер MOPS-кислота NH4Cl NaOH KOH CaCl4 K2SO4 MgCl2 рН 7, фільтрований, стерилізований 400 200 100 100 5 276 5,28 мМ мМ мМ мМ М мМ мМ 5 Джерело вуглецю Глюкоза фільтрований, стерилізований 160 мМ 12,3 7,7 мМ мМ Фосфат K2НРO4 KH2PO4 фільтрований, стерилізований 9 г г г мг мг мг мл мл мл мл UA 103467 C2 Вітаміни D-біотин ніацин піридоксаль-HCl тіамін-HCl зберігати при рН 4, фільтрований, стерилізований 10 10 10 10 мкМ мкМ мкМ мкМ Розчин мікроелементів Н2SO4 MnSO4×H2O ZnSO4×7H2O H3BO3 CuSO4×5H2O Na2MoO4×2H2O CoCl2×6H2O H2O фільтрований, стерилізований 5 22,8 5 5 250 250 450 1000 мл г г г мг мг мг мл Джерело заліза FeCl3 Цитрат натрію фільтрований, стерилізований 200 200 М М Амінокислоти Ser Gln фільтрований, стерилізований 100 100 мМ мМ 5 10 15 Дані розчини для зберігання в концентрованому стані 10Х розбавляють безпосередньо перед використанням. Визначення лаказної активності бактерії Принцип: Сирінгалдазин + О2 (Окислений сирінгалдазин + 2Н2О) Лаказа Реагенти: А. 100 мM калій-фосфатний буфер, pH 6,5 при 30°С В. 0,216 мМ сирінгалдазин (3 мл приготовляють в абсолютному етанолі з сирінгалдазину, що одержується в Sigma Prod., № S-7896.) С. Фермент тест H2O Реагент А Реагент В Реагент С 20 0,50 мл 2,20 мл 0,3 мл Ферментувати середовище, 0,5 мл або розведення контроль Неферментувати середовище, 0,5 мл або розведення 2,20 мл 0,3 мл 0 Збільшення оптичної щільності реєструють при 530 нм. У даних умовах одна одиниця ферменту приводить до збільшення оптичної щільності на 0,001 в хвилину при pH 6,5 і при 30°С. Визначення целюлозної активності бактерії: Принцип: 10 UA 103467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Тест оснований на подальшому перетворенні NAD в NADH під час руйнування целюлози. Збільшення поглинаючої здатності потім відстежують при 340 нм, слідуючи інструкції постачальника, доступній по посиланню в Інтернеті: (http://wvvvv.sigmaaldrich.com/img/assets/18160/Cellulase.pdf). Визначення продукції етанолу: Етанол визначають кількісно, використовуючи два способи. Ферментний спосіб: ADH Етанол + NAD→Ацетальдегід + NADH Даний спосіб оснований на подальшому перетворенні NAD в NADH в присутності етанолу і алкогольдегідрогенази. Дану реакцію пояснюють по збільшенню поглинаючої здатності при 340 нм. Для даного вимірювання використали набір Sigma N7160, слідуючи інструкціям виробника, доступним по посиланню в Інтернеті: (http://www.sigmaaldrich.com/sigma/bulletin/N7160BUL.pdf). Вимірювання при допомозі звернено-фазової високоефективної рідкісної хроматографії Умови: HPLC Gilson з автоматичним вприскувачем, детекція за допомогою рефрактометрії, Колонка: Phenomenex Rezex ROA, 300 мм×7,8 мм Температура колонки: 65°С Рухома фаза: 0,005 N сірчана кислота Швидкість потоку: 0,600 мл/хв Спочатку будують калібрувальну криву, впорскуючи на колонку середовище для культивування, що містить відомі концентрації етанолу. Вимірюють площу піка, елюйованого на 22,26 хв., відповідного етанолу. Викреслюють графік калібрувальної кривої. Потім кількість етанолу, продукованого бактерією, вимірюють, впорскуючи надосадочну рідину культури на колонку. Площа піка, елюйованого на 22,26 хв. і відповідного етанолу, вимірюють. Концентрацію етанолу, присутнього в надосадочній рідині, визначають, порівнюючи з калібрувальною кривою. Виявлення і визначення кількості інших метаболітів, можливо продукованих в різноманітних співвідношеннях, можна здійснити, слідуючи звичайним способам аналізу і оцінки. Бактерії є гаплоїдними організмами, які відтворюються двійковим розподілом і які харчуються мінеральними і органічними речовинами, виявленими в навколишньому середовищі. Їх потреби в газах, особливо відносно кисню, розрізнюються, і культуру і способи ферментації, які будуть використовуватися, необхідно пристосувати згідно з тим, чи є вони суворими аеробними, суворими анаеробними або факультативними аеро-анаєробними мікроорганізмами. Активність целюлози, переважно необхідна за винаходом, має місце при розщепленні целюлози, в той час як активність лакази забезпечує або полегшує розщеплення лігніну. Виробництво при ферментації біомаси біоенергетичних продуктів, таких як етанол, особливо, і/або інших метаболітів, здійснюють, слідуючи робочим умовам, послідовно адаптованим в тестах, що повторюються до умов і параметрів методики за даним винаходом, які, зокрема являють собою кількості бактерійного середовища для культивування, робочі умови температури і/або тиску і варіантів аеробної, анаєробної або мікроаєробної ферментації. Після певних тестів і досліджень, описаних вище, відібрані природні або генетично модифіковані штами задіють згідно з способом за винаходом. Приклад 2: Одержання етанолу в присутності Deinococcus geothermalis У колбу Ерленмейера ємністю 500 мл, що містить 100 мл мінімальних середовищ при 50°С, інокулят D. geothermalis (DG) в кількості 1010 додають при 50°С. Культуру розміщують при перемішуванні, щоб забезпечити насичення повітрям. Дана культура потім готова до застосування в загальноприйнятому ферментаційному чані для біомаси, в якому при найкращих умовах можна одержувати етанол і інші метаболіти з чудовим виходом продукту при 55°С. Через 1-7 днів в реакторі з біомасою, яку необхідно обробити, наявність згаданих вище етанолу і метаболітів кількісно визначали за допомогою ВЕРХ (слідуючи протоколу, описаному вище). Спостерігали зникнення глюкози і супутнє виробництво етанолу, чию концентрацію оцінювали аналітично. Виявляли інші цікавлячі метаболіти. Заміна глюкози на ксилозу в середовищі для культивування також забезпечувала бактерійне зростання і одержання етанолу. 11 UA 103467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У одному варіанті здійснення даного прикладу схожі результати можна одержати при проведенні і бактерійному культивуванні, і ферментації в одному чані. Приклад 3: Бактерицидні ефекти етанолу і бутанолу на Deinococcus geothermalis Матеріали і методи Даний спосіб дозволяє провести оцінку бактерицидних ефектів органічних розчинників на бактерії при зростанні або в стаціонарній фазі. Розчинники, що Тестуються являють собою етанол і бутанол. Бактерії, які тестуються, що належать до роду Deinococcus: - розвиваються в діапазоні від 40 до 70°С - є активними в діапазоні від pH 3 до pH 9,5 - здатні наново збирати, повністю або частково, свій геном, зруйнований при стресовому впливі, особливо при опроміненні, зокрема УФ- або гамма-променями, обезводненні, під дією ферменту, ультразвука або при хімічному впливі. Тестування необхідно провести при оптимальній для зростання температурі для штаму, що досліджується. З попередньої культури в стаціонарній фазі в збагаченому поживному середовищі, 10 мл збагаченого поживного середовища засівали при 1% об./об. Збагачене поживне середовище містить: 2 г/л пептону, 5 г/л дріжджового екстракту і 10 г/л глюкози; розчин стерилізують автоклавіруванням (20 хвилин при 120°С). До даного розчину додають наступні нижче розчини: MOPS-буфер (10X) pH 7 [400 мМ MOPS-кислоти, 200 мМ NH4Cl, 1000 мМ NaOH, 100 мМ KOH, 5 мкМ CaCl2, 2,76 мМ Na2SO4, 5,28 мМ MgCl2]; мікрохарчові добавки (10000X) [300 мМ (NH4)6(Mo7)24, 4 мМ H3BO3, 0,3 мМ CoCl2, 0,1 мМ CuSO4, 2,5 мМ MnCl2, 0,1 мМ ZnSO4]; 20 мМ FeCl3 (100X) в 20 мМ C6H5Na3O7; 1 г/л K2HPO4: розчини стерилізують фільтрацією (45 мкм). 200 мкл культури розподіляють в 96-лунковий мікропланшет. Для того щоб уникнути будьякого явища випаровування розчинника, мікропланшет покривають непроникною стерильною плівкою. Як тільки досягають фази експонентного зростання (оптична щільність 0,5 при 600 нм), або стаціонарної фази (плато), додають розчинник. Вміст, що тестується становить від 0 до 31% етанолу і від 0 до 2,5% бутанолу. Культуру потім інкубують при перемішуванні протягом однієї години. Підрахунок: У кінці інкубації і для кожної концентрації розчинника 20 мкл культури переносять в інший мікропланшет і розбавляють по каскадній схемі (розведення 1/10 в 9 лунках). Середовище для культивування при розбавленні являє собою збагачене поживне середовище. 5 мкл при кожному розведенні вміщують в трьох повторах на агарове середовище PGY, 5 г/л пептону, 2,5 г/л дріжджового екстракту, 0,5 г/л глюкози, 14 г/л агару: середовище стерилізують автоклавіруванням 20 хвилин при 120°С. Як тільки забезпечується зростання, для кожного процентного співвідношення розчинника, що досліджується здійснюють підрахунок для того, щоб оцінити вплив органічних розчинників на штам. Результати Концентрація розчинника, що розглядається авторами винаходу, при якій має місце втрата бактерійної життєздатності, відповідає мінімальній концентрації розчинника, при якій автори винаходу спостерігають втрату одного логарифма відносно контролю. Штами (фігури з 1 по 4), що тестуються представляють задовільну стійкість до розчинників, виходячи з перспективи індустріального застосування в ферментері. Приклад 4: Зростання бактерій в присутності C3-, C5- і C6-джерел вуглецю Матеріали і методи Попереднє культивування здійснювали або в середовищі А, що містить пептон (2 г/л), дріжджовий екстракт (5 г/л), глюкозу (10 г/л) або в середовищі PGY. Після центрифугування середовища для культивування бактерійний осад двічі промивали мінімальним середовищем А, щоб видалити всі джерела поживних речовин в інокуляті. Даний інокулят використали для засівання (1/66) середовища для культивування А (200 мкл), що містить одне з наступних нижче джерел вуглецю при 1% (мас./об.): D(+)глюкоза, D(+)целобіоза, сахароза, крохмаль, D(+)ксилоза, ксилан з березняку, гліцерин, піруват натрію. У випадку штамів DRH07, DRH39, DRH08 і DRH10, в середовище для культивування додавали глутамат (10 мМ). Бактерійне зростання здійснювали при 45°С в 96-лункових мікропланшетах при перемішуванні, і після чого слідувало вимірювання оптичної щільності при 544 нм з використанням спектрофотометра (Chameleon multilabel detection Platform plate, ScienceTec) або при 600 нм з використанням зчитуючого пристрою для мікропланшетів Spectrostar OMEGA (BMG Labtech).) Джерела використовуваного вуглецю для порівняння: ксилан з березняку (95588, Fluka), целобіоза (22150, Fluka), D(+)ксилоза (95730, Fluka), глюкоза (G8270-1KG, Sigma), сахароза (S9378-1KG, Sigma), крохмаль (S9765-500G, Sigma), гліцерин (453752, CarloErba), піруват натрію (Sigma). 12 UA 103467 C2 5 10 15 20 Композиції і препарати середовища для культивування Середовище PGY: Пептон (10 г/л), глюкоза (1 г/л), дріжджовий екстракт (5 г/л), суміш стерилізували в автоклаві протягом 20 хвилин при 120°С. Середовище А: Різні розчини, що використовуються для одержання середовища А, готували з маточного розчину, простерилізованого фільтрацією: - Розчин (pH 7), що містить: буфер 40 мМ MOPS-кислоти, 20 мМ NH4Cl, 10 мМ KOH, 10 мМ NaOH, 0,5 мкМ CaCl2, 0,276 мМ Na2SO4, 0,528 мМ MgCl2. - Розчин мікрохарчових добавок (pH 5): 3 нМ (NH4)6(MO7)24, 400 нМ H3BO3, 30 нМ CoCl2, 10 нМ CuSO4, 250 нМ MnCl2, 10 нМ ZnSO4. - Розчин вітамінів, pH4, (кожний 1 мкг/л): D-біотин, ніацин, піридоксаль-HCl, тіамін-HCl, вітамін B12. - джерело фосфату: 5,7 мМ K2HPO4. - 20 мкМ FeCl3 (приготованого в розчині цитрату натрію, потім відфільтрованого). Результати Бактерії, перераховані в таблиці 2 (нижче), здатні розмножуватися в мінімальному середовищі для культивування (середовище А), що містить як єдине джерело вуглецю цукор C6, такий як глюкоза, сахароза, целобіоза і крохмаль. Потрібно зазначити, що штами DRH37 і DRH06 також здатні рости в присутності гліцерину і пірувату натрію (вуглеводи C3). Бактерії, перераховані в таблиці 3, також здатні розмножуватися в мінімальному середовищі для культивування, що містить як єдине джерело вуглецю цукор C5 (ксилозу або ксилан); за винятком штамів DRH06 і DRH07, які не здатні рости в присутності ксилану і ксилози, відповідно. Таблиця 2 Тестування засвоєння різних джерел вуглецю в C6 і C3 здійснювали для різних видів D. geothermalis і D. murrayi: --ΔOD