Спосіб одержання позаклітинних лектинів бактерій роду bacillus та лікарський засіб на їх основі для лікування хворих, уражених віл-інфекцією

1. Спосіб одержання позаклітинних лектинів бактерій роду Bacillus, що включає вирощування C2 2 (13) 1 3 77477 4 інфекції [Favero J., Corbeau P., Nicolas M. et al. The Лікарський засіб може бути виконано у lectin jacalin interacts with CD4 cell surface antigen пероральній або ін'єкційній формах. and prevents HIV infection of limphoid cells // 13th Int. При використанні способу, що пропонується, Lectin Meeting INTERLEC 13 Aug. 11-17, 1991, Berотримують сухий стерильний препарат, що має lin, Abstracts. Part 1. - 1991. - p.8]. велику питому активність та значний ступінь очиЧерез велику токсичність цього лектину він не щення. Крім того, він не втрачає своєї активності може бути застосований у медичній практиці, протягом 10 років (терміну спостереження). навіть у дозі 1мг/мл. Лікарський засіб на основі препарату, отримаВідомо також препарат азидотимідин, який виному за способом, що заявляється, є користовують для лікування людей, інфікованих ефективнішим у порівнянні зі способом прототипу вірусом імунодефіциту [Mitsuya Н., Weinhold K.J., для лікування хворих, уражених ВІЛ-інфекцією. Він не втрачає своєї активності протягом тривалого St.Clair M.H. et al. 3 -azido-3 -deoxythymidine (BW часу. A509U): an antiviral agent that inhibits the infectivity Спосіб одержання позаклітинних лектинів and cytopathic effect of human T-lymphotropic virus бактерій роду Bacillus, що мають анти-ВІЛtype III lymphadenopathy-associated virus in vitro // активність, здійснюють наступним чином. Proc. Natl. Acad. USA - 1985 - 82. - P.7096-7100]. Бактерійну культуру вирощують на Як і попередній аналог, він має велику оптимізованій для синтезу позаклітинних лектинів токсичність. Крім того, при застосуванні бацил середовищі Гаузе. Препарати виділяють із азидотимідину, навіть у дозі 1мг/мл, виникає звільненої від клітин культуральної рідини осаджурезистентність вірусу імунодефіциту до даного ванням сульфатом амонію при насиченні 40-90% препарату. протягом 30-60 хвилин, діалізують проти Найближчим до винаходу, що заявляється, є дистильованої води протягом 24-48 годин, тричі позаклітинний пектин Bacillus IMB 668, який інгібує прогрівають при температурі 60-95°С протягом 30 репродукцію ВІЛ у дозі 5,0мкг/мл [рішення від хвилин, відділяють баластні білки центрифугуван18.05.2004 про видачу патенту на винахід за заявням при 6000-20000g протягом 20-30 хвилин, кою №2000095282 від 14.09.2000]. стерилізують та ліофілізують. Даний препарат не має недоліків попередніх Збереження препарату здійснюють у висушеаналогів, проте, він втрачає свою активність до 50ному стані при температурі від +4°С до -20°С. 60% вже за перший місяць зберігання та втрачає її Порівняльні дані препаратів бактерійних повністю протягом наступних 5-6 місяців. лектинів, одержаних за способом-прототипом, та В основу винаходу поставлено задачу удоскоспособом, що пропонується, надані в таблиці 1 і налення способу, прийнятого за прототип, шляхом свідчать про досягнення значного збільшення зміни відомих та введення нових етапів для отриактивності - в 3,63 рази та ступеню очищення - в мання високоефективних препаратів пектинів зі 2,93 рази. стійкою активністю протягом тривалого часу, велиДля виявлення стійкості лектинів до різних ким ступенем очищення та вираженою анти-ВІЛфакторів зовнішнього середовища ставили РГА в дією. різних буферних системах при рН від 2,8 до 10,0 у Другу задачу, яку поставлено в основу винаприсутності або відсутності детергентів та іонів ходу, - це створення ефективного лікарського заметалів. При визначенні термостабільності пектисобу на основі препарату, отриманого за спосони інкубували на водяній бані при температурі від бом, що заявляється, для лікування хворих, 40 до 100°С Препарати зберігали свою активність уражених ВІЛ-інфекцією, який би не втрачав свою протягом 3-х років. активність протягом тривалого часу. Дослідження показали, що лектини, одержані Поставлену задачу вирішують тим, що в способом, який пропонується, стійкі до різних способі одержання позаклітинних лектинів Bacillus, факторів зовнішнього середовища (рН, дії металів який включає вирощування бактерійної культури, і детергентів) та зберігають активність при тривавиділення препаратів із звільненої від клітин лому зберіганні. культуральної рідини осаджуванням сульфатом Порівняльне вивчення анти-ВІЛ-активності наамонію, очищення діалізом, згідно з винаходом, дане в таблиці 2. Одержані дані вказують на те, після очищення діалізом одержаний розчин що використання способу, який пропонується, прогрівають, відділяють баластні білки, приводить до зменшення дози препарату в 2 рази стерилізують та ліофілізують. у порівнянні зі способом - прототипом при Прогрівання здійснюють тричі при температурі збереженні однакового рівня анти-ВІЛ-активності. 60-95°С протягом 30 хвилин. При вивченні дозозалежного ефекту накопиБаластні білки відділяють центрифугуванням чення препаратів пектину, отриманих за новим при 6000-20000g протягом 20-30 хвилин. способом, встановлено, що лектин інгібує Другу поставлену задачу вирішують тим, що репродукцію вірусу на 5,5 lg у дозах від 1,0 до лікарський засіб на основі позаклітинних лектинів 250мкг/мл (таблиця 3). бактерій роду Bacillus для лікування хворих, уражених ВІЛ-інфекцією, згідно з винаходом містить активну речовину у дозі від 1,0 до 250мкг/мл. 5 77477 6 Таблиця 1 Характеристика препаратів позаклітинних лектинів бактерій роду Bacillus, одержаних різними способами Назва препаратів Питома активність лектину, титр-1 РГА/(мг білка/мл) Ступінь очищення, раз Вихід кінцевого продукту, мг/л КР 5,4±0,5 90,0±7,0 15,8±0,1 70,0±5,0 Препарат, отриманий за способом-прототипом 3760,0±1,0 Препарати, отримані за способом, що пропонується 13653,0±15,5 КР - культуральна рідина, РГА - реакція гемаглютинації. Таблиця 2 Характеристика анти-ВІЛ-активності препаратів бактерійних лектинів бактерій роду Bacillus, одержаних різними способами Назва препаратів мкг/мл Доза ГАО/мл Експресія білка ВІЛ р24 Інфекційний титр, lg ID50 Титр інгібіції, lg ID50 Препарат, отриманий за способомпрототипом 5,0 32,8