Застосування специфічних молочнокислих бактерій для одержання імуномодулюючих композицій

1. Застосування щонайменше однієї лактобактерії, яку вибирають з Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei І 1688 та їх суміші, для одержання композиції, придатної для модуляції імунної системи. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що суміш Lactobacillus salivarius I 1794 та Lactobacillus paracasei I 1688 застосовують у будь-яких пропорціях. 3. Застосування за п. 2, яке відрізняється тим, що зазначена суміш (також названа "PS МІХ", заявка на товарний знак) включає 8 % Lactobacillus salivarius I 1794 та 92 % Lactobacillus paracasei I 1688. 4. Застосування за пп. 1-3 для одержання композицій, які можна застосовувати для профілактики та лікування патологій, пов'язаних зі змінами в імунній системі. 2 (19) 1 3 94056 4 інфекції шкіри або, у всякому разі, для лікування всіх інфекцій, що виникають як наслідок станів імунодефіциту. 15. Застосування за одним з пп. 1-11, яке відрізняється тим, що зазначені композиції є дієтични ми композиціями, харчовими композиціями або нутрицевтичними композиціями, що містять корисні для здоров'я добавки. Область техніки, до якої належить винахід Даний винахід має відношення до застосування деяких особливих лактобактерій для одержання імуномодулюючих композицій, особливо, винахід має відношення до застосування наступних двох штамів Lactobacillus salivarius I 1794 and Lactobacillus paracasei I 1688, самостійно або у вигляді суміші двох штамів. Рівень техніки, до якого належить винахід Описано вплив на імунітет тварин і людей деяких продукуючих молочну кислоту бактерій (LAB), які присутні, головним чином, у молочнокислих продуктах харчування та у пробіотичних лікарських препаратах. Зокрема, було доведено, що деякі з бактерій LAB здатні взаємодіяти з імунною системою, змінюючи спосіб і ступінь захисту від патогенів і пухлинних перероджень; було також показано посилення імунної реакції на рівні слизової оболонки (Int. J. Immunopathol, Pharmacol., 2004; 17:127-134; Infection and Immunity, 2000; 68(2)75259). Опис винаходу Відомо також, що не всі лактобактерії є пробіотичними і лише деякі з них мають вплив на імунну систему. Імунологічні дослідження in vitro, проведені з різними штамами LAB, привели до суперечливого і, в деяких відношеннях, до протилежних результатів, показавши, таким чином, що неможливо не тільки передбачити, чи будуть бактерії LAB активні по відношенню до імунної системи, але, також показавши і те, що деякі штами здатні інгібувати активність інших видів того ж роду (J. Immunol., 2002, 168:171-178). Зараз встановлено, що два специфічних штами лактобактерій мають сильний імуномодулюючий ефект, окремо або спільно, і, отже, можуть бути застосовані для лікування патологій, пов'язаних з перебудовами імунної системи. Зокрема, було несподівано виявлено, що два штами лактобактерій Lactobacillus salivarius I 1794 та Lactobacillus paracasei I 1688 безпосередньо впливають на імунну систему, стимулюючи відповіді, головним чином, відповіді лімфоцитів, Трегуляторів і природних клітин-кілерів (NK-клітин), які приводять до позитивного результату у суб'єктів зі схильністю до патологій імунної системи, особливо, але не тільки, у суб'єктів, що страждають алергією, та/або суб'єктів з імунодефіцитом. Таким чином, відповідно з одним зі своїх втілень, винахід має відношення до застосування, щонайменше, однієї лактобактерії, вибраної з Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 та їх суміші, для одержання композиції, застосовної для модулювання імунної системи. Lactobacillus paracasei I 1688 та Lactobacillus salivarius I 1794 уперше були описані в Європейському патенті № 0861905, виданому 24.11.2004, на ім'я того ж заявника, для лікування порушень кишкової системи. Термін "суміш" відповідно до даного винаходу означає об'єднання двох зазначених вище штамів лактобактерій в будь-якій пропорції по відношенню один до одного. Вираз "модулювати імунну систему" означає, відповідно до даного винаходу, що композиція відповідно до винаходу здатна стимулювати певні відповіді імунної системи, роблячи її більш активно реагуючою, наприклад, втручаючись через утворення специфічних цитокінів у розвиток клітин, залучених в імунну відповідь. Відповідно до кращого втілення, суміш за винаходом включає дві визначені вище лактобактерії в співвідношенні приблизно 10:1, краще, у таких відповідних пропорціях: 92% Lactobacillus paracasei I 1688 та 8% Lactobacillus salivarius I 1794. Суміш, яка включає 92% Lactobacillus paracasei I 1688 та 8% Lactobacillus salivarius I 1794, є відомою сама по собі, як лікарський засіб, застосовуваний при лікуванні порушень шлунковокишкового тракту, таких як дисбактеріоз, і має загальноприйняте та комерційне найменування "PS MIX" (заявка на товарний знак). Інші суміші, що включають різні відношення кількості двох лактобактерій, які, якщо необхідно, комбінують з іншими лактобактеріями або придатними активними речовинами, можуть бути також застосовані відповідно до винаходу. Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 та їх суміші, такі як були визначені вище, далі в цьому документі також називані "активними компонентами", особливо були корисними як лікарські засоби для попередження та лікування патологій, пов'язаних з перебудовами імунної системи. Насправді було показано, що зазначені активні компоненти здатні стимулювати імунні клітини різного типу, особливо, при патологіях, у які залучені реакції лімфоцитів, головним чином, Т-хелперів і цитотоксичних Т-лімфоцитів з CD25, природних клітин-кілерів, В-лімфоцитів, дендритних клітин і цитокінів, включаючи, наприклад, TNF, IFN, IL-10 та IL-12. Докладний опис проведених тестів і несподівані результати, отримані з активними компонентами винаходу, наведені в експериментальному розділі даного опису. Отже, Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 та їх суміші можуть 5 бути застосовані, наприклад, при лікуванні та попередженні алергій і викликуваних ними патологій. Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 та їх суміші можуть бути також застосовані при лікуванні та попередженні імунодефіцитів будь-якого походження та викликуваних ними патологій. Таким чином, відповідно до інших своїх втілень, винахід має відношення до застосування композицій за винаходом, краще, композицій у пероральній формі, для лікування бактеріальних та вірусних інфекційних захворювань, таких як інфекції дихальних шляхів, інфекції шлунковокишкового тракту, інфекції слизових оболонок, інфекції шкіри та всі інфекції, що виникають як наслідок станів імунодефіциту. В умовах імунодефіциту захист організму від патогенів знижений з наступною зміною у співвідношенні Th1/Th2, наприклад, так, як при фізіологічних імунодефіцитах (новонароджені немовлята, вагітність), уроджених імунодефіцитах (генетичні захворювання) і придбаних імунодефіцитах (СНІД, автоімунні захворювання). Композиції за винаходом можуть також бути корисні для підтримання природних імунних захисних сил організму, особливо, наприклад, у станах стресу, таких як психофізичний стрес, який, за умови надмірного посилення або тривалості, може привести до ситуації імунодефіциту, що клінічно виражається в інфекційних захворюваннях різної інтенсивності. Активні компоненти за винаходом, тобто Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 та їх суміші, для того, щоб вони могли робити свою дію, краще вводять системно, переважно перорально, у вигляді композицій, можливо, але не необов'язково, об'єднаних з одним або декількома фізіологічно та/або фармацевтично прийнятними наповнювачами або середовищами-розчинниками. Термін "композиції" відповідно до даного винаходу означає будь-яку композицію, фармацевтичну, дієтичну, харчову композицію або нутрицевтичну композицію, що містить корисні для здоров'я добавки, краще, пероральну композицію, яка включає описані вище лактобактерії або їх суміші. Зазначені композиції одержували відповідно до відомих методик, беручи до уваги, зокрема, природу активних компонентів за винаходом, що складаються з живих матеріалів, тобто лактобактерій, які, отже, повинні піддаватися обробці таким чином, щоб вони могли вижити в процесі виробництва, зберігання та введення. Відповідно до кращого втілення композиції для застосування відповідно до винаходу мають форму одиничних доз для введення один або кілька разів на день, відповідно до типу та тяжкості патології, яку передбачається лікувати, і з урахуванням віку та ваги пацієнта. Загалом, зазначені одиничні дози містять від 103 до 1012, краще, від 105 до 1010, наприклад, від 108 до 1010 КУО (колонієутворювальних одиниць) активних компонентів на грам композиції. Для адекватного лікування звичайно вводять, наприклад, від 1-єї до 3-х одиничних доз на день. 94056 6 Активні компоненти для застосування відповідно до винаходу краще вводять перорально та в ліофілізованій формі, включаючи їх у придатні композиції, можливо, але необов'язково з наповнювачами та загальноприйнятими стабілізаторами, у відповідності зі способами, добре відомими фахівцям в цій області техніки. Таким чином, для застосування відповідно до винаходу композиції, що містять активні компоненти, вводять протягом відповідного періоду часу, який, якщо необхідно, встановлюється фахівцем, відповідальним за проведення лікування, і який, загалом, може змінюватися від 1-ого тижня до 1-го місяця чи навіть більше. Можливо також більш коротке або більш тривале лікування, тому що активні компоненти є нетоксичними компонентами, це дозволяє застосовувати їх навіть у надлишку без шкідливих побічних ефектів для здоров'я суб'єкта, що приймає лікування. Фармацевтичні, дієтичні, харчові композиції або нутрицевтичні композиції, що містять корисні для здоров'я добавки, відповідно до винаходу включають будь-який лікарський засіб, продукти харчування, дієтичний продукт або нутрицевтичний продукт, що містить корисні для здоров'я добавки, здатний забезпечити середовищерозчинник для описаних вище лактобактерій в організмі. Як більш точна ілюстрація вони включають, наприклад, лікарські засоби; дієтичні продукти харчування; продукти харчування, одержувані з молока, такі як йогурт, сир, вершки; кондитерські вироби; фруктові соки і т.д. Зазначені композиції можуть включати інші корисні для організму речовини, наприклад, такі, як вітаміни, мінеральні солі та/або інші сумісні активні компоненти, наприклад, пребіотичні сполуки, такі як інуліни, фосфоолігосахариди (FOS), волокна і т.д. Винахід також має відношення до способу профілактики та лікування патологій імунної системи, таких, як було визначено вище, який включає введення ссавцю ефективних доз активного компонента, вибраного з Lactobacillus salivarius I 1794, Lactobacillus paracasei I 1688 та їх сумішей. Наступні приклади ілюструють винахід без яких-небудь обмежень. Приклад 1 Оцінка прямого впливу суміші Lactobacillus salivarius I 1794 та Lactobacillus paracasei I 1688 на клітини соматичної імунної системи Оцінювали проліферативну відповідь лімфоцитів периферичної крові деяких суб'єктів, як реакцію на наступні дози Lactobacillus salivarius I 1794 та Lactobacillus paracasei I 1688 і на дві суміші цих же бактерій. Перед виконанням різних описаних нижче визначень бактерії піддавали гамма-опроміненню протягом 24 годин за допомогою джерела цезію з метою повного блокування мимовільне розмноження цих бактерій. Лімфоцити 15-ти здорових суб'єктів ізолювали центрифугуванням у градієнті густини FycollHypaque (Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway), ресуспендували в середовищі RPMI 1640 (Gibco BRL, Life Technologues, Paisley, Scotland), до якого були додані 2 мМ L-глутамін, 50 мкг/мл 7 94056 гентаміцин (Gibco) і 10% фетальної сироватки теляти (FCS, Euroclone-Celbio, Milan, Italy) (RPMIFCS), і культивували (1х105/200 мкл) у трьох повторах, на 96-ямкових мікропланшетах з Uподібним дном (не стимульовані культури) або (стимульовані культури) з Lactobacillus salivarius (I 1794) (1х105/200 мкл), Lactobacillus paracasei (I 1688) (1х105/200 мкл), PS MIX (заявка на товарний знак) (1х105/200 мкл) або Candida albicans (2х105/200 мкл), як позитивний контроль, при 37 °С у вологій атмосфері в присутності 5% СО2. Через вісімнадцять годин накопичення в кожну лунку вносили 1 мкКі [3H]TdR (Amersham Pharmacia Biotec, Milan, Italy). Для проліферативних тестів застосовували такі співвідношення бактерії/лімфоцити периферичної крові: бактерії:лімфоцити 200:1 100:1 20:1 10:1 5:1 1:1 0,5:1 0,1:1 0,01:1 0,005: 1 0,001: 1 і порівнювали із проліферативною реакцією Candida Albicans при двох співвідношеннях (0,2:1 та 2:1) у шестиденній культурі, при 37 °С в атмосфері з 5%-ним СО2. Результати виражали як індекс стимуляції (SI: cpm стимульованих культур /срm не стимульованих культур, де cpm означає "число імпульсів за хвилину"), який відбиває визначення впізнавання лімфоцитами бактеріальних антигенів та їх здатність реагувати шляхом проліферації на розпізнавання антигену. Результати Спостерігали відмінну проліферативну відповідь на спільну культуру бактерії/клітини, що означав розпізнавання лімфоцитами антигенних детермінант лактобактерій та активацію лімфоцитів в результаті зазначеного розпізнавання. Приклад 2 Фенотип лімфоцитарних субпопуляцій Фенотип лімфоцитарних субпопуляцій визначали в нульовий момент часу, перед культивуванням бактерій, і після 6-ти днів культивування, для встановлення того, який фенотип був індукований. Комп’ютерна верстка Мацело В. 8 Для визначення Т-лімфоцитарних популяцій і субпопуляцій застосовували моноклональні антиСD3, анти-СD4, анти-СD8, анти-СD25, анти-HLA, анти-СD16 антитіла, для визначення природних клітин-кілерів застосовували анти-СD56, антиСD20, анти-СD38 антитіла і для визначення Влімфоцитарних популяцій та плазмацитів застосовували анти-СD79 антитіла. Дані одержували за допомогою триколірного способу. Результати Спостерігали значне збільшення природних клітин-кілерів, які, як відомо, забезпечують кращу відповідь на клітини, інфіковані вірусами, і клітини, що зазнали злоякісного переродження. Спостерігалося також збільшення лімфоцитів Т-хелперів і цитотоксичних Т-лімфоцитів з мембраною CD25, що є субпопуляціями, на які безпосередньо найсильніше впливає модуляція імунної відповіді. Приклад 3 За допомогою способу ELISA, розробленого для кожного цитокіну (TNF-альфа, IFN-гамма, IL10, IL-12, IL-4), було встановлено, що в лейкоцитній плівці клітинних культур відбувається утворення деяких цитокінів. Результати Утворення IL-4 в супернатанті у відповідь на активацію лімфоцитів лактобактеріями було нижче рівня, вимірюваного за допомогою тесту ELISA, що свідчить про те, що Т-хелпери 2 (Тh2), відповідальні за індукцію алергенного явища, не були активовані. З іншого боку, були виявлені високі величини TNF-альфа та IFN-гамма, що вказує на активацію Т-хелперів 1 (Th1). Були виявлені також істотні кількості IL-10 та IL-12; перші, як відомо, індукують диференціацію В-лімфоцитів, інгібують активацію макрофагів і захищають від ризику запального захворювання кишечнику (IBD), а другі активують природні клітини-кілери, індукуючи продукцію IFN-гамма, ключового агента на перших фазах інфекції. Приклад 4 Готували пероральну композицію у формі порошку, яка включає такі компоненти для кожної одиничної дози: PS МІХ (заявка на товарний знак) (ліофілізований)1х108 - 1х1010 Сахароза; Солодові декстрини; Ароматизатор; Діоксид кремнію; Вітамін В2; Вітамін В1. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601