Спосіб очищення fsh

1. Спосіб очищення рекомбінантного людського FSH або варіанта FSH, який включає стадії піддання FSH: (1) іонообмінній хроматографії, яку виконують із застосуванням сильної аніонообмінної смоли; (2) хроматографії на іммобілізованих іонах металу; (2а) іонообмінній хроматографії, яку виконують із застосуванням слабкої аніонообмінної смоли; та (3) хроматографії з гідрофобною взаємодією. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згаданою сильною аніонообмінною смолою є Q Sepharose FF або смола, що має подібні властивості. 3. Спосіб за будь-яким із пп. 1, 2, який відрізняється тим, що іоноообмінну хроматографію на стадії (1) виконують із використанням боратного буфера як елюенту. 4. Спосіб за п. З, який відрізняється тим, що згаданий боратний буфер має рН приблизно 8,5. 5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що хроматографію на іммобілізованих іонах металу виконують із застосуванням смоли, яка містить тридентатні хелатуючі групи. 6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що згадані хелатуючі групи є групами імінодіоцтової кислоти. 7. Спосіб за будь-яким із пп. 1-6, який відрізняється тим, що хроматографію на іммобілізованих іонах металу виконують із застосуванням хелату 2 (19) 1 3 90664 4 19. Спосіб очищення людського рекомбінантного FSH, який включає стадії піддання FSH: (0) ультрафільтрації; (1) аніонообмінній хроматографії на Q Sepharose FF із застосуванням як елюенту приблизно 50 мМ борату та приблизно 0,13 М NaCl, рН приблизно 8,5; (2) піддання елюату зі стадії (1) афінній хроматографії на іммобілізованих іонах металу на хелатуючій смолі Sepharose FF, з Cu++ як іоном металу, та із застосуванням як елюенту приблизно 0,75 М ацетату амонію при рН приблизно 9; (2а) піддання елюату зі стадії (2) аніонообмінній хроматографії на DEAE Sepharose FF із застосу ванням як елюенту приблизно 0,11 М ацетату амонію при рН приблизно 8,5; (3) піддання елюату зі стадії (2а) хроматографії з гідрофобною взаємодією на Phenyl Sepharose FF HS із застосуванням як елюенту приблизно 50 мМ ацетату амонію та приблизно 0,25 М сульфату амонію, рН приблизно 8,25; (4) піддання елюату зі стадії (3) хроматографії з оберненою фазою на Source 30 RPC, із застосуванням як елюенту приблизно 50 мМ ацетату амонію, рН приблизно 7,6, із домішкою приблизно 20 % 2-пропанолу (за об'ємом); (5) піддання елюату зі стадії (4) ультрафільтрації; та (6) піддання ретентату зі стадії (5) нанофільтрації. Цей винахід стосується галузі очищення протеїнів і, зокрема, очищення фолікулостимулювального гормону (FSH). Фолікулостимулювальний гормон (FSH) є придатний для ін'єкцій протеїн, що належить до класу гонадотропінів. FSH застосовується для лікування неплідності та розладів репродуктивної системи у пацієнтів як жіночої, так і чоловічої статі. У природі FSH продукується гіпофізом. Для фармацевтичного застосування FSH можна або виробляти рекомбінантним способом (rFSH), або виділяти із сечі жінок, які перебувають у постклімактеричному віці (uFSH). При лікуванні жінок FSH застосовують для індукування овуляції (ОІ) та для контрольованої гіперстимуляції яєчників (СОН) при використанні штучних репродуктивних технологій (ART). У типовому режимі лікування при індукуванні овуляції пацієнтці щоденно вводять ін'єкції FSH або його варіанта (приблизно 75-300 міжнародних одиниць (MO) FSH на добу) протягом періоду від приблизно 6 днів до приблизно 12 днів. У типовому режимі лікування при контрольованій гіперстимуляції яєчників пацієнтці щоденно вводять ін'єкції FSH або його варіанта (приблизно 150-600 MO FSH на добу) протягом періоду від приблизно 6 днів до приблизно 12 днів. FSH застосовують також для індукування сперматогенезу у чоловіків, які страждають на олігоспермію. При застосуванні 150 MO FSH тричі на тиждень у комбінації з 2500МО людського хоріонічного гонадотропіну (hCG) двічі на тиждень досягнуто підвищення кількості сперматозоїдів у чоловіків, які страждають на гіпогонадотропний гіпогонадизм (Бургес та ін., "Самолікування підшкірним введенням фолікулостимулювального гормону високої чистоти та людського хоріонічного гонадотропіну для лікування гіпогонадотропного гіпогонадизму у чоловіків" - Burgues et al., "Subcutaneous self-administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod. 1997, 12, 980-986). У зв'язку з великим значенням FSH у лікуванні розладів фертильності бажаним є виготовлення FSH високої чистоти та високої питомої активності. Лікування FSH вимагає багаторазових ін'єкцій. Препарати FSH високої чистоти можна застосовувати підшкірно, що уможливлює самостійне введення лікарської речовини пацієнтами, тим самим значно підвищується зручність для пацієнтів та надійність додержання режиму лікування. Лінч та ін. ("Екстракція та очищення фолікулостимулювального гормону та лютеїнізуючого гормону з людського гіпофізу"; Lynch et al. The extraction and purification of human pituitary folliclestimulating hormone and luteinising hormone; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19) описують спосіб очищення FSH з людського гіпофізу. Спосіб включає аніонообмінну та катіонообмінну хроматографію та ексклюзивну хроматографію. Сповіщається, що цей спосіб дозволяє одержати гіпофізний FSH, що має питому активність 4990МО/мг (за даними імунохімічного аналізу) при показнику вмісту лютеїнізуючого гормону (LH) 16МО/мг. Вміст протеїну визначали або в сухій масі, або у розчині за поглинанням на довжині хвилі 280нм (за припущення, що А2801см для концентрації 1г/л дорівнює 1). У заявці WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) описано спосіб очищення FSH із людської сечі, де вихідним матеріалом є екстракти сечі, які названо людськими постклімактеричними гонадотропінами (hMG). У способі застосовується іонообмінна хроматографія на слабоосновних іонообмінних смолах типу DEAE з подальшою афінною хроматографією на смолі, що містить як ліганд похідну сполуку антрахінону. Сповіщається, що цим способом можна одержати сечовий FSH, вільний від LH, що має питому активність 6870МО/мг (за даними імунохімічного аналізу). Вміст протешу визначали, виходячи з припущення, що водний розчин 1мг/мл протеїну у кварцових кюветах з оптичною довжиною 1см має оптичну густину 0,62 на довжині хвилі 277нм. У заявці WO 00/63248 (Institute Massone SA) описано спосіб очищення гонадотропінів, в тому числі FSH, із людської сечі. Спосіб включає такі 5 стадії: іонообмінну хроматографію на сильній катіонообмінній смолі сульфопропілового типу, іонообмінну хроматографію на сильній аніонообмінній смолі та хроматографію з гідрофобною взаємодією (НІС). Сповіщається про одержання препарату FSH, що має питому активність 8400МО/мг (за методом Стілмена-Полі: "Випробування фолікулостимулювального гормону на основі підвищення з людським хоріонічним гонадотропіном" - SteelmanPohley: Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin, Endocrinology; 1953, 53, 604-616) та біологічну активність LH менше ніж 1МО (за методом збільшення маси сім'яних пухирців пацюків Van Hell Η, Matthijsen R та G.A Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) на 75MO FSH. Вміст протеїну визначали методом Лаурі (О.Η. Lowry et al, J. ВЫ. Chem., 1951, 193, 265). У патенті США №5,990,288 (Musick et al.) описано спосіб очищення FSH із біологічних середовищ, наприклад, із людського гіпофізу або сечі людей у постклімактеричному віці. У способі застосовується афінна хроматографія з барвниками. Сповіщається, що спосіб дозволяє одержати з людського гіпофізу FSH, що має питому активність 7066МО/мг (за даними імунохімічного аналізу) при показнику вмісту LH менше ніж 1МО/мг (за даними імунохімічного аналізу), а із сечі - FSH, що має питому активність 6,298 МО/мг (за даними імунохімічного аналізу) та менше ніж 3МО/мг LH (за даними імунохімічного аналізу). Вміст протеїну визначали за поглинанням на довжині хвилі 280нм (за припущення, що А2801см для концентрації 1г/л дорівнює 1). Чиба та ін. "Виділення та часткова ідентифікація LH, FSH та TSH із гіпофізу кролів"; Chiba et al. Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland, Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218) описують спосіб очищення гонадотропінів, в тому числі FSH, з гіпофізу кролів, в якому використовується афінна хроматографія з конканаваліном-А (Concanavalin (Соn) А), хроматографія з гідрофобною взаємодією (НІС) та хроматографія на іммобілізованих іонах металу із застосуванням Сu++. Сповіщається, що одержаний FSH має питому активність 2,17МО/г протеїну (за даними проби на FSH із радіоміченими рецепторами для вимірювання біологічної активності та із застосуванням комплекту BioRad для проби на протеїни (BioRad Laboratories CA USA) для визначення вмісту протеїну). У заявці WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) описано спосіб очищення людського FSH із сечі. Спосіб влючає імунохроматографію із застосуванням специфічних до FSH іммобілізованих моноклональних антитіл, прищеплених до сорбенту Sepharose 4B за допомогою дивінілсульфону та подальшу рідинну хроматографію високої ефективності (РХВЕ) з оберненою фазою. Одержаний FSH не містить LH та інших протеїнів сечі та має питому активність 6200МО/мг ліофілізованого порошку (за методом СтілменаПолі). Цей препарат завдяки своїй високій чистоті був першим препаратом FSH, придатним для підшкірного введення. 90664 6 Існує постійна потреба у нових способах очищення FSH. Метою цього винаходу є запропонувати новий спосіб очищення рекомбінантного FSH або варіанта FSH. У першому аспекті цей винахід пропонує спосіб очищення рекомбінантного людського FSH або варіанта FSH, який включає стадії: (1) іонообмінної хроматографії; (2) хроматографії на іммобілізованих іонах металу; (3) хроматографії з гідрофобною взаємодією (НІС), які можуть бути виконані у будь-якій послідовності. На Фіг.1 показана послідовність стадій процесу очищення r-hFSH. На Фіг.2 показано профіль елюювання при хроматографуванні вихідного неочищеного rhFSH на сорбенті Q-Sepharose FF при детектуванні за оптичною густиною (OD) на довжині хвилі 280нм. На Фіг.3 показано профіль елюювання при хроматографуванні частково очищеного rhFSH методом ІМАС-хроматографії при детектуванні за OD на довжині хвилі 280нм. На Фіг.4 показано профіль елюювання при хроматографуванні частково очищеного rhFSH на сорбенті DEAE-Sepharose при детектуванні за OD на довжині хвилі 280нм. На Фіг.5 показано профіль елюювання при хроматографуванні частково очищеного rhFSH на сорбенті Phenyl-Sepharose при детектуванні за OD на довжині хвилі 280нм. На Фіг.6 показано профіль елюювання на стадії хроматографії з оберненою фазою (RPC) із застосуванням колонки для RPC Source 30. Абревіатури В описі цього винаходу застосовуються такі абревіатури: FSH: фолікулостимулювальний гормон; rFSH: рекомбінантний FSH; hFSH: людський FSH; rhFSH: рекомбінантний людський FSH; BV: Об'єм шару сорбенту; DEAE: діетиламіноетил; ІМАС: афінна хроматографія на іммобілізованих іонах металу; OD: оптична густина; НІС: хроматографія з гідрофобною взаємодією; HPLC: рідинна хроматографія високої ефективності; IRMA: імунорадіометричне випробування; кДа: кілодальтон; НСР: протеїни клітини-хазяїна, тобто протеїни, що походять із клітини-хазяїна, яка використовується для експресії FSH; ІРС: поточний контроль процесу; RP-HPLC: рідинна хроматографія високої ефективності з оберненою фазою; Q FF: іонний обмін на Q-Sepharose FF. Цей винахід пропонує спосіб очищення рекомбінантного людського FSH або варіанта FSH, який включає стадії: (1) іонообмінної хроматографії; 7 90664 (2) хроматографії на іммобілізованих іонах металу; (3) хроматографії з гідрофобною взаємодією (НІС), які можуть бути виконані у будь-якій послідовності. Спосіб очищення за цим винаходом дозволяє одержати очищений FSH порівнянним за ступенем чистоти з відомими продуктами FSH, наприклад, із препаратами Gonal-F (фірми Serono) та MetrodinHP (фірми Serono). Вихідним матеріалом для очищення є рекомбінантний FSH. Варіанти здійснення винаходу, яким віддається перевага Спосіб очищення за цим винаходом включає стадію іонообмінної хроматографії. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, стадію іонообмінної хроматографії виконують із застосуванням сильної аніонообмінної смоли, причому особлива перевага віддається четвертинній амонієвій смолі, наприклад, Q Sepharose FF (фірми Amersham Biosciences) або смолі, що має аналогічні характеристики відповідно до поданого нижче переліку: Тип іонообмінника Загальна ємність (ммоль/мл) Межа ексклюзії (глобулярні протеїни) Форма гранул Структура шару Робочий діапазон стабільності рН Діапазон стабільності рН при очищенні Лінійна швидкість потоку при 25°С, 1бар (0,1МПа), при висоті шару 15см, колонка ХK 50/30 На стадії іонообмінної хроматографії перевага віддається виконанню елюювання із застосуванням буфера, що має помірно лужне значення (наприклад, від приблизно 7,2 до приблизно 9,0 або від приблизно 8,0 до приблизно 9,0, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, приблизно 8,5). До придатних буферів належать, наприклад, боратні буфери, триетаноламін з імінодіоцтовою кислотою. Найбільша перевага віддається боратному буферу з рН приблизно 8,5. Концентрація елюювального реагента відповідно до варіанта, якому віддається перевага, лежить у межах від приблизно 10мМ до приблизно 100мМ, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від приблизно 10мМ до приблизно 75мМ, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, становить приблизно 50мМ. Перед стадією іонообмінної хроматографії може бути доцільним виконання стадії ультрафільтрації для концентрування неочищеного FSH. Ультрафільтрацію (або діалізну фільтрацію) відповідно до варіанта, якому віддається перевага, Склад Розмір частинок Ліганд Хімізм приєднання Ємність по іону металу Робочий діапазон стабільності рН Діапазон короткочасної стабільності рН Параметри потоку та тиску за технічними умовами 8 сильний аніонообмінник 0,18-0,25 4 106 сферичні, діаметр 45-165мкм зшита агароза, 6% 2-12 1-14 400-700см/год. виконують із застосуванням мембрани, яка має поріг проникності в межах приблизно 3-10кДа, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, приблизно 5кДа. Спосіб за цим винаходом включає також стадію хроматографії на іммобілізованих іонах металу. Відповідно до варіанта здійснення, якому віддається перевага, стадію хроматографії на іммобілізованих іонах металу виконують із застосуванням смоли, яка містить тридентатні хелатуючі групи, наприклад, імінодіоцтову кислоту (IDA), та іон двовалентного металу М2+, наприклад, Cu2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+, Mg2+ та Со2+, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, Сu++. Група, яка утворює хелатний комплекс з іоном металу, приєднана до відповідної твердої основи, наприклад, до Sepharose. До смол, яким віддається особлива перевага, належить Chelating Sepharose FF (фірми Amersham Biosciences) або інші смоли, що мають аналогічні характеристики відповідно до поданого нижче переліку: 6% агароза високого ступеня зшиття 45-165мкм Групи імінодіоцтової кислоти на проміжних місточках Через епоксигрупи 30-37мкмоль Сu2+/мл 3-13 2-14 Основна матриця 200-400см/год., 1бар (100кПа), колонка ХK 50/60, висота шару 25см Елюювання на стадії хроматографії на іммобілізованих іонах металу слід виконувати із застосуванням імідазольного, фосфатного або ацетатного буфера, при цьому особлива перевага віддається ацетату, наприклад, ацетату амонію. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, значення рН елюенту має бути в межах від приблизно 7,5 до приблизно 10, відповідно до варіанта, якому від дається більша перевага, від приблизно 8,0 до приблизно 9,5, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, становити приблизно 9. Концентрація буферної сполуки в елюенті відповідно до варіанта, якому віддається перевага, має бути в межах від приблизно 0,1Μ до приблизно 2М, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від приблизно 0,5Μ до приблиз 9 90664 но 1М, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, становити приблизно 0,75М. Спосіб за цим винаходом включає також стадію хроматографії з гідрофобною взаємодією. Відповідно до варіанта здійснення, якому віддається перевага, стадію хроматографії з гідрофобною Матриця Середній розмір частинок Гідрофобний ліганд Густина ліганда Діапазон короткочасної стабільності при рН Діапазон тривалої стабільності рН та робочий діапазон рН Елюювання на стадії хроматографії з гідрофобною взаємодією відповідно до варіанта, якому віддається перевага, виконують із застосуванням буфера, що має значення рН слабколужного середовища (наприклад, від приблизно 7,2 до приблизно 9, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від приблизно 7,5 до приблизно 8,5, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, приблизно 8,25). Елюентом, якому віддається особлива перевага, є розчин ацетату амонію (50мМ) та сульфату амонію (0,25М), відповідно до варіанта, якому віддається перевага, зі значенням рН приблизно 8,25. Після стадії хроматографії з гідрофобною взаємодією можна виконувати також стадію хроматографії з оберненою фазою (RPC). Стадію RPC відповідно до варіанта, якому віддається перевага, виконують із застосуванням, наприклад, смоли SOURCE 30 RPC (фірми Amersham Biosciences). Для елюювання перевага віддається застосуванню буфера, наприклад, ацетату амонію, краще при слабколужному значенні рН, наприклад, рН7-8,5, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, приблизно 7,5 або 7,6. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згаданий буфер містить приблизно 5-25% (за об'ємом), відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, приблизно 10-20%, органічного розчинника, що змішується з водою, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, спирту С1-С3, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, 2-пропанолу (ізопропанолу). Стадії іонообмінної хроматографії, хроматографії на іммобілізованих іонах металу та хроматографії з гідрофобною взаємодією (НІС) можуть бути виконані у будь-якій послідовності, проте відповідно до варіанта, якому віддається перевага, першою виконують стадію іонообмінної хроматографії. Решту стадій, а саме стадії хроматографії на іммобілізованих іонах металу та хроматографії з гідрофобною взаємодією (НІС), можна виконувати у будь-якій послідовності, проте перевага віддається послідовності, вказаній нижче: (1) іонообмінна хроматографія, (2) хроматографія на іммобілізованих іонах металу і (3) хроматографія з гідрофобною взаємодією (НІС). Відповідно до подальшого варіанта здійснення винаходу, якому віддається перевага, між стадією (2) та стадією (3) виконують додаткову стадію іонообмінної хроматографії (2а), при цьому особли 10 взаємодією виконують із застосуванням смоли, наприклад, Phenyl Sepharose FF HS (фірми Amersham Biosciences), або іншої смоли, що має аналогічні характеристики відповідно до поданого нижче переліку: 6% сферична агароза з високим ступенем зшиття 90мкм феніл 40 2-14 3-13 ва перевага віддається застосуванню слабкої аніонообмінної смоли, наприклад, обмінної смоли, яка містить діаміноетильні групи, зокрема, смоли DEAE-Sepharose FF. Відповідно до варіанта, якому віддається особлива перевага, стадії процесу виконують у вказаній нижче послідовності: (1) іонообмінна хроматографія, (2) хроматографія на іммобілізованих іонах металу, (2а) друга стадія іонообмінної хроматографії і (3) хроматографія з гідрофобною взаємодією (НІС). Відповідно до варіанта здійснення винаходу, якому віддається особлива перевага, спосіб за цим винаходом включає стадії, охарактеризовані нижче: (1) іонообмінна хроматографія (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням сильної аніонообмінної смоли, наприклад, Q Sepharose FF); (2) хроматографія на іммобілізованих іонах металу (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням смоли Chelating Sepharose FF та Cu++ як іону металу); (2а) іонообмінна хроматографія (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням слабкої аніонообмінної смоли, наприклад, DEAE Sepharose FF); (3) хроматографія з гідрофобною взаємодією (НІС) (краще із застосуванням Phenyl Sepharose FF HS). На другій стадії іонообмінної хроматографії (2а) перевага віддається застосуванню як елюента амонійно-ацетатного буфера, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, при рН приблизно 8,5. Перевага віддається концентрації ацетату амонію у буферному розчині від приблизно 0,05 до приблизно 0,5Μ, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, приблизно 0,11М. Відповідно до подальшого варіанта здійснення винаходу, якому віддається перевага, після будьякої стадії хроматографії (зокрема, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, після стадії хроматографії з оберненою фазою), пробу FSH піддають концентруванню шляхом ультрафільтрації. Ультрафільтрацію (або діалізну фільтрацію) відповідно до варіанта, якому віддається перевага, виконують із застосуванням мембрани, яка має поріг проникності в межах приблизно 3-10кДа, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, приблизно 5кДа. 11 Відповідно до подальшого варіанта здійснення винаходу, якому віддається перевага, у способі за цим винаходом виконують такі стадії у вказаній нижче послідовності: (0) ультрафільтрація (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням мембрани, яка має поріг проникності приблизно 5кДа), (1) іонообмінна хроматографія (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням Q Sepharose FF), (2) хроматографія на іммобілізованих іонах металу (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням Chelating Sepharose FF та Cu++), (2a) друга стадія іонообмінної хроматографії (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням DEAE Sepharose FF), (3) хроматографія з гідрофобною взаємодією (НІС) (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням Phenyl Sepharose FF HS), (4) хроматографія з оберненою фазою (RPC) (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням Source 30 RPC) і (5) ультрафільтрація (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням мембрани, яка має поріг проникності приблизно 5кДа). Може видатися доцільним піддання проби FSH стадії нанофільтрації для забезпечення відсутності вірусів в очищеному препараті FSH. Нанофільтрацію можна виконувати на будь-якому етапі процесу очищення, проте особлива перевага віддається виконанню нанофільтрації після другої стадії іонообмінної хроматографії або після хроматографії з оберненою фазою, або ж після хроматографії з гідрофобною взаємодією. Нанофільтрацію можна виконувати більше одного разу, наприклад, двічі. Відповідно до варіанта здійснення винаходу, якому віддається особлива перевага, спосіб за цим винаходом включає такі стадії: (0) ультрафільтрація (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням мембрани, яка має поріг проникності приблизно 5кДа), (1) іонообмінна хроматографія (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням Q Sepharose FF), (2) хроматографія на іммобілізованих іонах металу (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням Chelating Sepharose FF та Cu++), (2a) друга стадія іонообмінної хроматографії (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням DEAE Sepharose FF), (3) хроматографія з гідрофобною взаємодією (НІС) (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням Phenyl Sepharose FF HS), (4) хроматографія з оберненою фазою (RPC) (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням Source 30 RPC), (5) ультрафільтрація (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, із застосуванням мембрани, яка має поріг проникності приблизно 5кДа) і (6) нанофільтрація. Зберігання та ліофілізація Одержану в результаті описаного вище процесу очищення рідку композицію, яка містить очищений FSH, можна безпосередньо заморожувати для зберігання, або ж елюат після очищення можна піддавати ліофілізації ("сублімаційному висушу 90664 12 ванню") для видалення розчинника. Одержаний таким чином рідкий або ліофілізований продукт має назву "FSH-напівфабрикат" або FSH ангро" ("FSH Bulk"). Лікарські форми FSH FSH або варіант FSH за цим винаходом або очищений за цим винаходом може бути виготовлений у лікарських формах для внутрішньом'язових або підшкірних ін'єкцій, перевага при цьому віддається лікарським формам для підшкірних ін'єкцій. Лікарська форма FSH може бути ліофілізованою, в такому разі її розчиняють у воді для ін'єкцій безпосередньо перед впорскуванням. Лікарська форма FSH може бути також рідкою, в такому разі її можна впорскувати безпосередньо, без попереднього розчинення. Лікарська форма FSH може бути однодозовою або багатодозовою. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, багатодозова лікарська форма має містити бактеріостатичний агент, наприклад, бензиловий спирт, мета-крезол, тимол або фенол; перевага віддається бензиловому спирту та мета-крезолу. Однодозова лікарська форма також може містити бактеріостатичний агент. У складі лікарських форм FSH за цим винаходом може бути поєднаний із відомими наповнювачами та стабілізаторами, наприклад, із сахарозою та манітом. Лікарські форми можуть містити також антиоксидант, наприклад, метіонін. Крім того, лікарські форми можуть містити поверхнево-активну речовину, наприклад, TWEEN (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, TWEEN 20) або Pluronic (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, Pluronic F68). В одній з багатодозових лікарських форм, яким віддається особлива перевага, FSH, одержаний способом за цим винаходом, введений у лікарську форму шляхом розчинення його у воді для ін'єкцій у поєднанні із сахарозою, фосфатним буфером (рН7), Pluronic F68, метіоніном та метакрезолом або бензиловим спиртом. Показання FSH за цим винаходом є придатним для застосування у всіх випадках лікування, коли FSH є показаним. Зокрема, він особливо придатний для підшкірного введення при індукуванні овуляції, контрольованій гіперстимуляції яєчників при використанні штучних репродуктивних технологій та при лікуванні олігоспермії. Він може застосовуватися у комбінації з іншими гонадотропінами, наприклад, LH та hCG. Він може також застосовуватися у комбінації зі сполуками, які посилюють реакцію на FSH, наприклад, із кломіфен-цитратом, інгібіторами ароматази, наприклад, анастрозолом, летрозолом, фадрозолом та YM-511. Послідовності: ПОСЛІДОВНІСТЬ №1: людський глікопротеїн, α-субодиниця; ПОСЛІДОВНІСТЬ №2: hFSH, β-субодиниця; ПОСЛІДОВНІСТЬ №3: hFSH, β-субодиниця, варіант 1; ПОСЛІДОВНІСТЬ №4: hFSH, β-субодиниця, варіант 2; 13 ПОСЛІДОВНІСТЬ №5: hFSH, β-субодиниця, варіант 3. Термін "фолікулостимульвальний гормон", або FSH, у значенні, вживаному в цьому описі, означає людський FSH (hFSH), продукований у формі зрілого протеїну повної довжини. FSH є димер, що складається з α-субодиниці людського глікопротеїну та β-субодиниці людського FSH. Послідовність амінокислот α-субодиниці людського глікопротеїну відповідає ПОСЛІДОВНОСТІ №1, а послідовність β-субодиниці людського FSH відповідає ПОСЛІДОВНОСТІ №2. Термін "рекомбінантний" стосується препаратів FSH, одержаних за технологією із застосуванням рекомбінантної ДНК (дивись, наприклад, WO 85/01958). Одним із прикладів способу експресування FSH за рекомбінантною технологією є застосування трансфекції еукаріотних клітин послідовностями ДНК, які кодують α- та β-субодиниці FSH, при забезпеченні одного або двох векторів для кожної субодиниці, що має окремий промотор, як описано у Європейських патентах №0 211 894 та №0 487 512. ДНК, що кодує FSH, може являти собою кДНК або може містити інтрони. Іншим прикладом одержання FSH за рекомбінантною технологією є застосування гомологічної рекомбінації для включення гетерологічного регуляторного відрізку в оперативному з'єднанні до ендогенних послідовностей, які кодують одну або обидві субодиниці FSH, як описано у Європейському патенті №0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). Маються на увазі також способи, за якими, як, наприклад, у заявці WO 99/57263 (Transkaryotic Therapies), одну зі згаданих субодиниць гетерологічно включають у клітину, а другу субодиницю експресують за рахунок активації геномних послідовностей шляхом включення гетерологічного регуляторного відрізка методом гомологічної рекомбінації. Спосіб за цим винаходом може бути застосований для очищення FSH, експресованого будь-яким із цих методів. Вислів "рекомбінантна клітина" означає клітину, одержану шляхом включення гетерологічної ДНК, в тому числі будь-яким із вищезгаданих способів генетичних маніпуляцій. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, FSH одержують за рекомбінантною технологією у клітинах яєчників китайського хомяка (СНО), трансфікованих вектором або векторами, що включають ДНК для кодування α-субодиниці людського глікопротеїну та β-субодиниці FSH. ДНК, що кодують згадані α- та β-субодиниці, можуть бути присутніми в одному векторі або в різних векторах. Вислів "варіант FSH" охоплює молекули, що відрізняються від людського FSH амінокислотними послідовностями, схемою глікозилювання або місточками між субодиницями, але виявляють активність, характерну для FSH. Прикладом такої молекули є CTP-FSH - модифікований рекомбінантний FSH тривалої дії, що складається з α-субодиниці природного типу та гібридної β-субодиниці, в якій пептид карбоксильного кінця hCG конденсований з С-кінцем β-субодиниці FSH, як описано Ла-Полтом та ін. (LaPolt et al.; Endocrinology; 1992, 131, 2514 90664 14 2520) або Кляйном та ін. ("Розроблення та ідентифікація рекомбінантного агоніста hFSH тривалої дії" - Klein et al.; Development and characterization of a long-action recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56). Вищевказаний термін охоплює також одноланцюговий CTP-FSH - одноланцюгову молекулу, що складається з таких послідовностей (в напрямку від N-кінця до С-кінця): βFSH ΒhCG-CTP(113-145) αFSH де βFSH означає β-субодиницю FSH, phCGCTP (113-145) означає карбоксильно-кінцевий пептид hCG, a αFSH означає α-субодиницю FSH; ця сполука описана Кляйном та ін. ("Фармакокінетика та фармакодинаміка одноланцюгового рекомбінантного людського фолікулостимулювального гормону, що містить карбоксильно-кінцевий пептид людського хоріонічного гонадоропіну, у організмах резус-мавп" - Klein et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey, Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248-1255]. До інших прикладів варіантів FSH належать молекули FSH, що містять додаткові паратопи глікозилювання, включені до α- та/або β-субодиниць, як описано у заявці WO 01/58493 (власник Maxygen), та молекули FSH із S-Sзв'язками між субодиницями, описані у заявці WO 98/58957. До подальших прикладів варіантів FSH належать хімеричні молекули, які включають амінокислотні послідовності з FSH та послідовності з hCG або LH, описані, наприклад, у заявках WO 91/16922 та WO 92/22568. До згаданих у цьому описі варіантів FSH належать також карбоксильно-кінцеві делеції βсубодиниці, коротші за зрілий протеїн повної довжини, що відповідає ПОСЛІДОВНОСТІ №2. Карбоксильно-кінцеві делеції β-субодиниці людського FSH відповідають ПОСЛІДОВНОСТІ №3, ПОСЛІДОВНОСТІ №4 та ПОСЛІДОВНОСТІ №5. Слід розуміти, що карбоксильно-кінцеві варіанти βланцюга утворюють димери з відомою αсубодиницею і таким чином утворюють гетеродимери варіантів FSH. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, FSH рекомбінантно продукується у клітинах СНО. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, очищений FSH, одержаний способом за цим винаходом, є придатним для підшкірного введення та уможливлює самостійне введення лікарської форми пацієнтом. Вислів "неочищений рекомбінантний FSH" означає надосадову рідину культури клітин, які експресують FSH, до піддання її будь-якій стадії хроматографічного очищення. Цей вислів охоплює сирову форму надосадової рідини (після відділення від клітин), а також концентровану та/або відфільтровану та/або піддану ультрафільтрації надосадову рідину. Термін "біологічна активність" стосовно до дії FSH означає здатність лікарської форми FSH викликати реакції, пов'язані з FSH, наприклад, збі 15 льшення маси яєчників у випробуванні за Стілменом-Полі ("Випробування фолікулостимулювального гормону на основі підвищення з людським хоріонічним гонадотропіном" - Steelman-Pohley: Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin, Endocrinology; 1953, 53, 604-616), або ріст фолікулів у пацієнток жіночої статі. Ріст фолікулів у пацієнтки можна за допомогою ультразвуку кількісно охарактеризувати, наприклад, кількістю фолікулів середнього діаметра приблизно 16мм на 8-й день стимуляції. Біологічну активність характеризують відносно прийнятого стандартного FSH. Вміст LH у препараті FSH можна визначити, наприклад, застосовуючи специфічну до LH імунопробу, наприклад, Delfia hLH Spec (фірми Wallac Oy, Turku, Finland). Термін "питома активність" стосовно до FSH означає виражену у міжнародних одиницях (МО) біологічну активність препарату у відомому біологічному випробуванні FSH, наприклад, за Стілменом-Полі, поділену на кількість протеїну, визначену шляхом аналізу загального вмісту протеїну, наприклад, випробуванням за Лаурі (О.Н. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Fair and R.J. Randall (1951), /. ВЫ. Chem. 193: 265; Hartree E.E. (1972). Anal. Biochem. 48: 422; J.R. Dulley and P.A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64: 136), за Бредфордом (Bradford M.M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248) або вимірюванням поглинання на довжині хвилі 280нм. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, FSH за цим винаходом має питому активність вище за приблизно 4000МО/мг, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, вище за приблизно 6000МО/мг, відповідно до варіанта, якому віддається ще більша перевага, вище за приблизно 7000МО/мг, відповідно до варіанта, якому віддається ще більша перевага, вище за приблизно 8000МО/мг, де біологічна активність вимірюється шляхом біовипробування за Стілменом-Полі, а вміст протеїну визначається з оптичної густини на довжині хвилі 280нм. Приклади Очищення У поданому нижче прикладі описано одержання очищеного рекомбінантного людського FSH (далі r-hFSH) з концентрованого неочищеного rhFSH, одержаного у біореакторах місткістю 15л та 75л. Послідовність стадій процесу очищення, описаного детально у наведених нижче розділах, показано на Фіг.1. Одержаний очищений rhFSH позначено як "rhFSH-ангро". Значення рН та електропровідності для всіх буферів вказано для температури +25°С; тобто значення електропровідності вимірювалися із застосуванням приладу, обладнаного датчиком температури, і одержані значення автоматично коригувалися на різницю температур і відносилися до +25°С. Щодо вимірювань електропровідності, температурний коефіцієнт кореляції завжди вибирався рівним 2. Стадія 0: Діалізна фільтрація концентрованого неочищеного rhFSH 90664 16 Устаткування - система для ультрафільтрації типу Pellicon Mini (фірми Міlliроrе або еквівалентна); - мембрана для ультрафільтрації з порогом проникності 5кДа у поліетерсульфоні типу ВІОМАХ (фірми Мillіроrе або еквівалентна), 0,1м2; - перистальтичний насос типу Masterflex або еквівалентний. Матеріали - концентрований неочищений r-hFSH; - вихідна кількість: 200-400мг FSH, визначена імунопробою DELFIA для FSH (з біореактора місткістю 75л); - гідроксид натрію, гранульований (фірми Merck); - очищена вода (фірми Modulab або еквівалентна); - борна кислота; - тетраборат натрію, декагідрат; - боратний буфер (50мМ борат натрію, рН8,5±0,1): 3,06г борної кислоти та 10г дигідрату тетраборату натрію додавали до 900мл очищеної води при перемішуванні і доводили об'єм розчину до 1л. Методика ультрафільтрації Усі операції виконували в умовах охолодження (3-8°С). Концентрований неочищений r-hFSH (11,5л) піддавали ультрафільтрації у таких умовах: - буфер: 50мМ борат натрію, рН8,5±0,1, питома електропровідність 1,9±0,2мСм/см; - об'ємна швидкість потоку пермеату: 1525мл/хв; - тиск на вході: 1,5-2,2бар (150-220кПа); - середній тиск на мембрані: 1,5-1,8бар (150180кПа), де середній тиск на мембрані (ТМР)= (тиск на вході+ тиск на виході)/2. Розчин rhFSH концентрували до об'єму 1л. - Затриману фракцію розводили 1 об'ємом очищеної води і знов концентрували до 1л (промивання). - Операцію промивання повторювали ще двічі. - Перевіряли питому електропровідність пермеату, і, якщо вона була нижчою від 1,5мСм/см, пробу передавали на наступну операцію, в іншому разі повторювали операцію промивання. Питома електропровідність пермеату