Спосіб очищення розчину альфа-1-антитрипсину

1. Спосіб очищення альфа-1-антитрипсину від інших білкових компонентів з розчинів, що містять альфа-1-антитрипсин, який включає стадії: (a) проведення іонообмінної хроматографії розчину, що містить альфа-1-антитрипсин; (b) додання детергентів і необов'язково розчинника для інактивації покритих ліпідною оболонкою вірусів; (c) наступного збільшення концентрації солі для висолювання детергентів. 2. Спосіб за п. 1, у якому зазначений розчин, що містить альфа-1-антитрипсин, одержують з плазми крові або її фракцій, переважно з відновленої плазматичної фракції Коена IV1, або одержують з рекомбінантного чи експресованого трансгенним шляхом препарату альфа-1-антитрипсин або надосадової рідини після ферментації. 3. Спосіб за п. 1 і/або 2, у якому іонообмінну хроматографію виконують на аніонообмінному гелі, переважно на DEAE-Sepharose® або DEAESepharose® Fast Flow. C2 2 UA 1 3 ми, такими як гранулоцити, і тому залучена у запальні процеси. Активність еластази обмежена у часі та у просторі і регулюється, головним чином, інгібітором А1AT. Дисрегуляція подібної активності призводить до швидкого руйнування тканини і може мати патофізіологічні наслідки. Крім того, виникають і/або активізуються запальні процеси. Відомим прикладом пониженої регуляції активності еластази або її відсутності є прогресуюче місцеве руйнування тканини легенів з супутніми симптомами запалення, яке поступово призводить до емфіземи, і тому супроводжується, іноді у значній мірі, легеневими функціональними розладами. На кінцевому етапі це може привести до смерті хворого, уникнути якої можна лише трансплантацією легені. Такі хворі страждають від відсутності активності А1AT або пониженої активності А1AT. У нормальному стані інгібітор продукується у печінці і секретується нею у відносно великих кількостях та циркулює у плазмі крові у відносно високих концентраціях (звичайна концентрація складає 1,3мг/мл). Крім того, фізіологічно ефективні і достатні концентрації А1AT спостерігаються в органах здорових людей, конкретно у легеневій рідині (рідині епітеліальної вистілки). Якщо концентрація А1AT значно понижена або функціональна активність наявного А1AT понижена чи він неактивний (інактивований), то відбувається неконтрольоване руйнування легеневої тканини з усіма згаданими вище наслідками. Причинами відсутності А1AT або недостатньої інгібіторної активності А1AT є, головним чином, генетичні дефекти. Так звана Z-мутація, особливо у гомозиготних особин (PiZZ), призводить до полімеризації молекул А1AT прямо у синтезуючих його клітинах. Відповідно, А1AT більш не може потрапляти у кровотік або може потрапляти у кров в дуже малих кількостях. З одного боку, це приводить до втрати інгібуючої активності, що особливо виявляється у легенях через тривалий час, а з іншого боку, - до накопичення полімерів у клітинах печінки і, отже, до відповідних функціональних розладів. Гетерозиготні особини (PiZ) володіють відповідно зниженим інгібіторним потенціалом. Відомі додаткові мутації з схожими дефектами. Відповідно до сучасної оцінки серед населення США частота виникнення PiZZ-мутації складає порядку 1/1600. Відповідно, число носіїв мутації значно вище, причому з них здогадно виявлено тільки 10%. У даний час не всі пацієнти, що страждають на легеневі функціональні розлади (прогресуючу емфізему), причиною яких є недостатність А1AT або понижена функціональна активність А1AT, можуть одержувати лікування, оскільки застосування А1AT у формі затвердженого лікарського засобу для лікування і/або профілактики є недостатньо доступним. Загальновизнане лікування засноване на внутрішньовенному введенні розчинів, що містять А1AT, одержаних з донорських препаратів плазми крові. Загальновизнане і рекомендоване у даний час дозування А1AT складає 60мг/кг маси тіла на тиждень, що відповідає середньому прийому пацієнтом 16-20г А1AT на місяць. Це, у свою 86775 4 чергу, відповідає кількості, яка в середньому міститься у 15л плазми крові. Беручи до уваги, що тільки частину інгібітора, який міститься у вживаній як вихідний матеріал плазмі крові, одержують у формі чистого препарату, то на місяць для одного хворого як вихідний матеріал потрібно у багато разів більше плазми крові, ніж 15л. Загальний обсяг плазми крові, що потрібна як вихідний матеріал для здобування А1AT і, отже, для постійного лікування хворих, відповідно дуже великий. У загальновизнаних способах одержання препаратів А1AT як вихідний матеріал застосовується так звана фракція Коена (Cohn) IV1. Дану фракцію одержують за допомогою відомого фахівцям методу за Cohn-Oncley абовідповідно до його модифікації, яка заснована на фракційному поділі білків плазми крові шляхом варіювання, головним чином, концентрації етанолу, що додається, корегування показника pH та температури розчину. Разом з А1AT так звана фракція IV1 звичайно містить широкий спектр інших білків плазми крові, кількість яких вже частково зменшена за рахунок попередніх стадій осадження. Модифікацією цього способу одержання є метод за Kistler-Nitschmann. Відповідно, як вихідний матеріал може застосовуватися фракція, подібна до фракції Коена IV1, а також інші фракції, що містять А1AT, такі як так званий супернатант І+ІІ+Іll. Раніше були описані різні способи одержання більш або менш чистого препарату А1AT. Неодноразово повідомлялося про застосування іонообмінної хроматографії для збагачення А1AT, особливо за допомогою аніонообмінників (Gray et al., 1960; Crawford et al., 1973; Chan et al., 1973; etc.). Проте одна тільки ця стадія одержання не дозволяла одержувати препарат A1AT з чистотою, яка відповідає існуючому рівню техніки. Тому, у поєднанні із застосуванням іонообмінників частково застосовуються інші стадії одержання. Наприклад, застосовуються методи адсорбції або осадження, такі як інкубація з поліетиленгліколем (патент США № US-A-4379087), інкубація з комплексоном цинку або гепариновими адсорбентами (патент США № US-A-4629567), або інші. Ці методи застосовуються для (додаткового) очищення А1AT, але у випадку використання кожного з них доводиться змиритися з більшим або меншим зниженням виходу продукту. По суті, втрата продукту зростає із збільшенням числа стадій одержання. Крім того, це часто супроводжується збільшенням затрачуваного на одержання часу, що може знижувати цілісність та активність А1AT, а також підвищувати витрати на виробництво. На додаток до стадій одержання білка, важливою частиною способів одержання білкових продуктів з плазми крові є так звані стадії інактивації або стадії елімінації вірусів. На додаток до так званого способу SD (solvent/detergent - обробка розчинником/ детергентом), при якому відповідні віруси інактивуються шляхом руйнування їх захисної ліпідної оболонки, для збільшення вірусної безпеки застосовуються методи термоінактивації, наприклад, пастеризація (обробка нагріванням при 60°С протягом 10 годин). Проведення фільтрації через нанофільтри затримує віруси з ліпідною оболон 5 кою або без неї звичайно залежно від розміру вірусів. Задачею рівня техніки є об'єднання двох заснованих на різних принципах стадій способу, кожна з яких сама по собі є ефективною, разом в один спосіб одержання з максимальною вірусною безпекою. Залежно від виду білка під час вказаних стадій способу для його стабілізації додають стабілізатори, наприклад, амінокислоти або цукру. Відповідно, згодом вони повинні бути видалені з розчину, що містить А1AT. У випадку застосування методу SD-обробки як агентів, що активно інактивують віруси, додають детергенти, які повинні бути видалені придатними способами на наступному етапі способу одержання. З цією метою було введене застосування адсорбції на гідрофобних носіях, такої як хроматографія на носіях з іммобілізованими С18 ланцюгами. Така хроматографія також супроводжується зниженням виходу продукту і включає зазначені вище недоліки кожної (додаткової) хроматографічної стадії способу. Крім того, зазначені носії застосовуються, як правило, неодноразово, тобто потрібні дорогі і тривалі стадії регенерації носія. Відповідно, був описаний альтернативний ефективний та швидкий спосіб якісного видалення детергентів, який обходиться без стадії проведення хроматографії (міжнародна публікація WO 94/26287, патент США № US-A-5817765). Так, для одержання часток, що містять детергент, які можуть бути відокремлені, наприклад, шляхом простої фільтрації, вміст солі, наприклад, цитрату натрію, у розчині білка, що містить детергент, доводили до надфізіологічних концентрацій (³0,5М). Надалі цей метод називається методом «детергент/висолювання». У наведених у міжнародній публікації WO 94/26287 прикладах метод «детергент/висолювання» застосовували до розчину трьох окремих білків, якими були трансферин, антитромбін III і альбумін. У зазначених прикладах застосування способу приводило до відновлення активності білка на 95%, відповідно, і до зменшення концентрації детергента. Якщо спосіб застосовували в умовах, при яких вихід цільового білка змінювався не надто сильно, то концентрація Triton X-100 у продукті часто залишалася високою. У прикладі 4 міжнародної публікації WO 94/26287 автори винаходу змогли відновити активність альбуміну на 95%, але одержаний продукт містив 250м.д. Triton X-100 і 35м.д. ТnВР. Концентрацій Triton X-100 понад 50м.д., переважно понад 10м.д., слід уникати, особливо при виробництві медичних препаратів, і, як правило, бажано знизити вміст детергента наскільки це можливо. Мета даного винаходу стосується максимально ефективного та швидкого способу очищення препарату А1AT, який приводить до одержання продукту з високою чистотою і безпекою. Переважно, у ході способу одержання активність і/або якість А1AT не повинні змінюватися у гіршу сторону, а вміст детергентів повинен бути зменшений до рівня, прийнятного для медичних препаратів. Інша мета даного винаходу стосується способу очищення розчинів, що містять А1AT, у процесі 86775 6 якого видаляються інші білкові компоненти. Переважно, з розчину А1AT також повинні бути видалені інші компоненти, такі як ліпіди або віруси. Мета досягається шляхом здійснення способу очищення А1AT з розчинів, що містять А1AT, який включає стадії: (a) проведення іонообмінної хроматографії розчину, що містить А1AT; (b) додання детергентів і необов'язково розчинника для інактивації покритих ліпідною оболонкою вірусів; (c) наступного збільшення концентрації солі для висолювання детергентів. Крім того, задача даного винаходу вирішується у варіантах здійснення даного винаходу, визначених у пп.1-11 формули винаходу. Спосіб очищення А1AT з розчинів, що містять А1AT від інших білкових компонентів, наприклад, з відновленої плазматичної фракції Коена IV1, у принципі складається тільки з двох стадій, надзвичайно ефективних щодо збагачення А1AT. А саме, з проведення хроматографії за допомогою аніонообмінника та інактивації вірусів шляхом SD-обробки Triton X-100 і ТnВР з наступним висолюванням інактивуючих віруси агентів. Було виявлено, що остання зазначена стадія може також дуже ефективно застосовуватися у розчинах, що містять А1AT. Спосіб за даним винаходом особливо застосовний у тих випадках, коли розчин, що містить А1AT, містить значні кількості відмінних від А1AT білків. Несподівано було виявлено, що в умовах способу за даним винаходом ця стадія може застосовуватися не тільки для видалення інактивуючих віруси детергентів, але й для істотного додаткового очищення від будь-яких присутніх білкових, ліпопротеїдних і ліпідних домішок, не впливаючи негативно при цьому на вихід А1AT. У поєднанні із зазначеною вище аніонообмінною хроматографією, по суті, одержували продукт А1AT, який мав чистоту >90%, переважно >95%, і містив А1AT в його активній формі. Стадія обробки розчинником/детергентом і висолювання приводять до здобування активного А1AT з виходом >80%. Якщо як вихідний матеріал застосовується відновлена фракція IV1, то спосіб заданим винаходом дозволяє проводити очищення А1AT завдяки видаленню з розчинів, що містять А1AT, α-2макроглобуліну, гаптоглобіну, α-1 кислого глікопротеїду, IgG, IgА і IgM. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу порівняно з розчином А1AT до обробки розчинником/детергентом, який являє собою, наприклад, елюат після проведеної раніше аніонообмінної хроматографії, після стадії висолювання у розчині, що містить А1AT, залишається