Спосіб очищення тромбіноподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, анкрод природного походження
Формула / Реферат
1. Спосіб очищення тромбіноподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, який полягає в тому, що
а) протеазний сировинний продукт піддають попередньому очищенню за допомогою афінної хроматографії або хроматографії в основному іонообміннику,
б) одержану таким чином фракцію з тромбіноподібними ферментами піддають хроматографії в слабкому катіонному обміннику або відокремлюють шляхом адсорбції на склі в основному діапазоні і
в) основну складову із стадії “б” піддають гельпроникній хроматографії або очищують шляхом хроматографії на склі в кислому діапазоні,
причому щонайменше одна із стадій “б” і “в” включає відокремлення шляхом хроматографії на склі.
2. Спосіб згідно з п. 1, який відрізняється тим, що очищення шляхом адсорбції в стадії “б” здійснюють на склі, а стадію “в” здійснюють шляхом гельпроникної хроматографії.
3. Спосіб згідно з п. 1, який відрізняється тим, що очищення шляхом хроматографії в стадіях “б” і “в” здійснюють на склі.
4. Очищений анкрод природного походження, одержаний способом за п. 1 з чистотою понад 95 %.
Текст
1 Спосіб очищення тромбіноподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, який полягає в тому, що а) протеазний сировинний продукт піддають попередньому очищенню за допомогою афінної хроматографії або хроматографії в основному юнооб міннику, б) одержану таким чином фракцію з тромбіноподібними ферментами піддають хроматографії в слабкому катіонному обміннику або відокремлюють шляхом адсорбції на склі в основному діапазоні і в) основну складову із стадії "б" піддають гельпроникній хроматографії або очищують шляхом хроматографії на склі в кислому діапазоні, причому щонайменше одна із стадій "б" і "в" включає відокремлення шляхом хроматографії на склі 2 Спосіб згідно з п 1, який відрізняється тим, що очищення шляхом адсорбції в стадії "б" здійснюють на склі, а стадію "в" здійснюють шляхом гельпроникної хроматографії 3 Спосіб згідно з п 1, який відрізняється тим, що очищення шляхом хроматографії в стадіях "б" і "в" здійснюють на склі 4 Очищений анкрод природного походження, одержаний способом за п 1 з чистотою понад 95 % Даний винахід стосується способу для очищення тромбінподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут Прикладами таких протеаз є батроксобін, кроталаза і, зокрема, анкрод Останній є антикоагулянтом, що ізолюється із отрути змії Agkistrodon rhodostoma (Merck-Index 1989, № 664) Уже відома велика КІЛЬКІСТЬ способів його одержання із отрути змій (патенти Великобританії 1 094 301, 1 177 506, 1 293 793, патенти США 3 743 722, 3 879 369, описи винаходів до викладених заявок ФРН 2 428 955, 2 734 427) Ці способи базуються, в основному, на хроматографії і дають анкрод з різним виходом і ступенем чистоти Анкрод високої чистоти із зміїної отрути досі одержати не вдавалось Завжди ізолювали суміш ферментів з анкродом в якості основної складової, яка в залежності від способу була в більшій або меншій мірі забруднена сторонніми протеїнами Тому був знайдений шлях одержання тромбінподібних протеаз високої чистоти із зміїних отрут Предметом винаходу є спосіб очищення тромбінподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, який полягає втому, що ^~ СО 00 протеазний сировий продукт піддають попередньому очищенню за допомогою афінної хрома СО ^f тографм або хроматографії в основному юнообміннику, одержану таким чином фракцію з тромбінподібними ферментами піддають хроматографії в слабкому катіонному обміннику або відокремлюють шляхом адсорбції на склі в основному діапазоні, основну складову із стадії 2 піддають гельпроникній хроматографії або очищують шляхом хроматографм на склі в кислому діапазоні, причому щонайменше одна із стадій 2 і З включає відокремлення шляхом адсорбції або хроматографії на склі Крім того, предметом винаходу є одержані із зміїних отрут тромбінподібні протеази, з чистотою від 95 до 100%, Рекомендується на стадії б очищення р — О ^f « і ^ J 5Г — 46831 здійснювати шляхом адсорбції на склі, а на стадії мл/год Промиванням колонки при кімнатній темв за допомогою гельпроникної хроматографії пературі приблизно 300 мілілітрами врівноважувального буфера (1 ОмМ трисВ особливо переважній формі втілення винафосфатний буфер, рН 8,5) до одержання елюату ходу як на стадії б, так і на стадії [3 очищення прозі значенням Агаонм* 0,5 і подальшим промиванводять за допомогою адсорбції або хроматографії ням 400 мілілітрами 35 мМ трис-фосфатного буДля попереднього очищення шляхом афінної фера рН 6,0 до одержання елюату зі значенням хроматографії особливо придатні агматинова, А8 Н 2 О М Z- 0,4 елюювали близько 70 - 80% чуарпнінова або гепаринова сефарози жорідних білків (відносно оптичної густини В якості основного юнообмінника для попевихідного розчину при 280нм) Основну фракцію з реднього очищення придатні DEAE-целюлози і анкродом з виходом 85% елюювали в 150 - 200мл DEAE-сефарози 150мМ трис-фосфатного буфера рН 6,0 Для іонообмінної хроматографії особливо придатні трис-фосфатні та натрій-фосфатні буфеб Основне очищення рні розчини Елюат, що містить анкрод, шляхом ультрафіІонообмінну хроматографію проводять при льтрації на мембрані з номінальною границею значенні рН від 5 до 9, переважно від 6 до 8,5 розділення 10000 Дальтон концентрували до 20мл В ході попереднього очищення із сирового і перебуферували ЮОмМ трис-фосфатним буфеферменту видаляють майже 70 - 80% чужорідних ром рН 8,0 Цей розчин подавали на колонку білків та інших складових діаметром 1,6см, наповнену до висоти 15см склом BIORAN-CPG (фірма Schott, діаметр пор 25 - 35нм, Якщо другу стадію очищення проводять з вирозмір часток ЗО - бОмкм) Промиванням колонки користанням катіонного обмінника, то беруться до при кімнатній температурі 300 мілілітрами ЮОмМ уваги такі слабкі кислі обмінники СМтрис-фосфатного буфера рН 8,0 при швидкості SEPHAROSE, значення рН 5 - 9, та AMBEKLITE потоку 250мл/год з колонки елюювали близько CG50, рН 5 - 9 60% чужорідних білків (відносно оптичної густини Вираз "хроматографія на склі" означає, що анзакладки при 280нм) крод і споріднені тромбінподібні ферменти, а також сильно основні протеази зв'язують на скляній Для елюювання використовували 0,5мМ розматриці при значеннях рН 7,5 - 9, переважно 8,0 чин хлориду натрію, забуферений ЮОмМ трис8,5 Близько 60% передовсім кислих чужорідних фосфатним буфером до значення рН 8,0 Елюат білків не зв'язаними вимиваються із колонки автоматично уловлювали фракціями близько врівноважувальним буферним розчином (переЮмл Тромбінподібні ферменти елюювали в ПІКОВІ важно трис-фосфатним або натрій-фосфатним) ІЗ розмитою (хвостовою) зоною, що прилягає до Анкрод з чистотою понад 90% пофракційно нього Для одержання основної складової елююють зі скла шляхом підвищення іонної сили (відповідає анкроду) у формі, що містить щобуферного розчину до 0,3 - 1,0М додаванням кунайбільше 5% тромбінподібних побічних складохонної солі вих, при переході від основного піка до хвостової зони окремі фракції досліджувались за допомогою На другій стадії очищення фермент збагарідинної хроматографії зі зворотною фазою як чується майже до 90% щодо їх специфічної фібриногеназної активності, Для проведення гельпроникної хроматографії так і щодо складу 3 основним піком поєднували на стадії в очищення беруться до уваги SEPHACлише фракції, що мали специфічну активність, RYL S-100HR, SUPERDEX, SEPHADEX, ULTROбільшу, ніж 1700 U/OD28OHM і вміст побічних склаGELіSUPEROSE дових, менший, ніж 10% (близько 80мл) 3 колонки Якщо для цієї стадії в очищення вибирають BIORAN одержували основну складову чистотою хроматографію на склі, то в кислому рН-діапазоні 96% з виходом 72% 4 - 6 основні чужорідні білки адсорбують із розчину анкроду на скляній поверхні, а сам анкрод чистов Тонке очищення тою 95% може бути елюйований із колонки безпоЕлюат з основною складовою - анкродом середньо у врівноважувальному буфері Бажана шляхом ультрафільтрації на мембрані YM 10 іонна сила буфера може бути встановлена шля(фірма Amicon) концентрували до 2мл і одержаний хом додавання солі, наприклад, кухонної солі концентрат подавали на колонку діаметром 1,6см, до висоти 85см заповнену SEPHARYL S-100 HR Новий спосіб особливо придатний для чистоКолонку попередньо врівноважували буферним вого одержання анкроду, який за цим способом розчином, що складався із ЮОмМ хлориду натрію має чистоту понад 95% та ЮОмМ фосфату натрію і мав рН 6,9 За допоПриклад 1 могою цієї операції гельпроникної хроматографії а Попереднє очищення від анкроду відокремлювали рештки протеаз, а Зг висушеної отрути малайської гримучої змії також трис На цій стадії вихід становив близько розчиняли в 50мл трис-(пдроксиметил)90% амінометан (трис)-фосфатному буферному розчині рН 8,5, нерозчинні КЛІТИННІ залишки отрути відПриклад 2 центрифуговували і прозорий, жовтий розчин поа Попереднє очищення давали на хроматографічну колонку діаметром 2,1 г висушеної отрути малайської гримучої змії 1,6см, до висоти 30см наповнену DEAEрозчиняли в 50мл 35мМ трис-фосфатного буфера SEPHAROSE-FF (фірма Pharmacia) рН 8,5, нерозчинні КЛІТИННІ складові отрути Тромбінподібні ферменти отрути, а також білки з відцентрифуговували і прозорий, жовтий розчин кислим характером зв'язували на матриці Хромаподавали на хроматографічну колонку діаметром тографію здійснювали зі швидкістю потоку 150-200 1,6см, до висоти 30см наповнену DEAE 46831 SEPHAROSE-PF (фірма Pharmacia) і врівноважену білки, а також побічні складові, тоді як основна вказаним буфером Промиванням колонки при складова - анкрод - з чистотою близько 100% і кімнатній температурі 600мл врівноважувального виходом 80 - 90% (відносно внесеної КІЛЬКОСТІ) < буфера до досягнення значення А28о 0,2 вимиваелюювалась із колонки врівноважувальним буфели майже 70% чужорідних білків (відносно оптичром ної густини закладки при 280нм) Основну фракцію Приклад З з виходом 90 - 100% елюювали 200 - 250 а, б Попереднє і основне очищення мілілітрами 150мМ трис-фосфатного буфера рН 2,1 г висушеної отрути малайської гримучої змії 6,0 попередньо фракціонували аналогічно прикладу 2 на DEAE-SEPHAROSE, елюат концентрували анаб Основне очищення логічно прикладу 1 до 20мл і перебуферували Аналогічно прикладу 1, елюат концентрували 40мМ трис-фосфатним буфером рН 6,2 Цей роздо 20мл і забуферювали 50мМ натрій-фосфатним чин подавали на хроматографічну колонку буфером рН 8,5 Цей розчин подавали на колонку діаметром 1,6см, до висоти 20см наповнену СМBIORAN-CPG (діаметр 1,6см, висота 15см, діаметр SEPHAROSE-FF (фірма Pharmacia), і пор 25 - 35см, розмір часток 30-60мкм) Промиврівноважену вказаним вище буфером Шляхом ванням колонки при кімнатній температурі 300 промивання колонки при кімнатній температурі 300 мілілітрами 50мМ натрій-фосфатного буфера рН мілілітрами врівноважувального буфера при 8,5 зі швидкістю 250мл/год з колонки елюювали швидкості потоку 250мл/год з колонки елюювали близько 60% чужорідних білків (відносно оптичної близько 60% чужорідних білків (відносно оптичної густини закладки при 280нм) густини закладки при 280нм) Для елюювання тромбінподібних ферментів використовували 1М розчин хлориду натрію, заДля елюювання тромбінподібних ферментів буферений 50мМ розчином фосфату натрію до аналогічно прикладові 2 використовували 1 М роззначення рН 8,0 150 мілілітрами буфера елюювачин хлориду натрію, забуференого 50мМ розчином ли близько 80% внесених ферментів фосфату натрію до значення рН 8,0 150 мілілітрами буфера елюювали близько 80% в Тонке очищення тромбінподібних ферментів Елюат описаним вище чином концентрували до 20мл і перебуферували 50мМ натрійв Тонке очищення фосфатним буфером, що мав значення рН 5,0 Тонке очищення анкроду здійснювати анаЦей розчин подавали на колонку, що також мала логічно прикладові 2 на склі BIORAN-CPG (діаметр діаметр 1,6см і до висоти 15см була заповнена пор близько ЮОнм, розміри часток 30-60мкм) склом BIORAN-CPG, що мало, одначе, діаметри фосфатним буфером рН 5,0 Анкрод елюювали із пор 90 - 11 Онм І розміри часток ЗО - бОмкм При рН колонки з чистотою понад 95% і виходом близько 5,0 на склі BIORAN були зв'язані лише основні 85% (відносно внесеної КІЛЬКОСТІ) ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71
ДивитисяДодаткова інформація
МПК / Мітки
МПК: A61K 38/46, A61K 35/58, C12N 9/64
Мітки: спосіб, природного, одержаних, отрут, походження, зміїних, тромбіноподібних, протеаз, очищення, анкрод
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/3-46831-sposib-ochishhennya-trombinopodibnikh-proteaz-oderzhanikh-iz-zminikh-otrut-ankrod-prirodnogo-pokhodzhennya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб очищення тромбіноподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, анкрод природного походження</a>
Попередній патент: Спосіб лікування уражень статевих залоз у чоловіків, хворих на епідемічний паротит
Наступний патент: Система маркування, що персоналізується, з захистом
Випадковий патент: Багатопараметровий протиюзний датчик