Спосіб очищення рекомбінантного hcg та фармацевтична композиція

Номер патенту: 78488

Опубліковано: 10.04.2007

Автори: ПАРАДІЗІ Джанфранко, СКАГЛІЯ Лаура, РОССІ Мара

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб одержання рекомбінантного hCG, що характеризується питомою біоактивністю в діапазоні від 23000 до 28000 МО/мг, із вихідного матеріалу, який включає наступні стадії:

(a) елюювання вихідного матеріалу через хроматографічну колонку з силікагелем;

(b) елюювання вихідного матеріалу через колонку для іонообмінної хроматографії;

(c) елюювання через другу колонку для іонообмінної хроматографії;

(d) елюювання через колонку для РХВЕ з оберненою фазою;

(e) елюювання через колонку для ексклюзійної хроматографії.

2. Спосіб за п. 1, який включає такі стадії:

(a) елюювання вихідного матеріалу через хроматографічну колонку з силікагелем;

(b) елюювання вихідного матеріалу через колонку для іонообмінної хроматографії з ДЕАЕ-Сефарозою;

(c) елюювання через колонку для іонообмінної хроматографії з СМ-Сефарозою;

(d) елюювання через колонку для РХВЕ з оберненою фазою із силікагелем С18; і

(e) піддавання елюату ексклюзійному хроматографуванню на Сефакрилі.

3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що елюювання через колонку для іонообмінної хроматографії з ДЕАЕ-Сефарозою виконують у натрій-фосфатному буферному розчині при рН 7,5.

4. Спосіб за п. 2 або 3, який відрізняється тим, що елюювання через колонку для іонообмінної хроматографії з СМ-Сефарозою виконують у натрій-фосфатному буферному розчині при рН 6.

5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що стадію (d) елюювання через колонку для РХВЕ з оберненою фазою виконують із використанням як рухомої фази суміші 2-пропанол/буферний розчин Трис-фосфату.

6. Спосіб за будь-яким із пп. 1-5, який відрізняється тим, що стадію (е) елюювання через колонку для ексклюзійної хроматографії виконують із використанням як рухомої фази буферного розчину бікарбонату амонію.

7. Спосіб за будь-яким із пп. 1-6, який відрізняється тим, що вихідним матеріалом є культуральне середовище клітин СНО.

8. Фармацевтична композиція, яка містить рекомбінантний hCG, одержаний способом за будь-яким з пп. 1-7 формули винаходу, та придатні наповнювачі.

9. Фармацевтична композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що наповнювачем є сахароза.

10. Фармацевтична композиція за п. 9, яка відрізняється тим, що є ліофілізованою.

11. Фармацевтична композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що наповнювачем є маніт.

12. Фармацевтична композиція за п. 9, яка відрізняється тим, що вона є рідкою.

13. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 8-12 для підшкірного введення.

Текст

Цей винахід стосується способу очищення хоріонічного гонадотропіну, зокрема, очищення рекомбінантного хоріонічного гонадотропіну людини (hCG) із препарату неочищеного рекомбінантного hCG. Спосіб включає використання іонообмінної хроматографії та рідинної хроматографії високої ефективності (РХВЕ) з оберненою фазою. Хоріонічний гонадотропін є гормон, який продукується плацентою, і його традиційно одержують із сечі вагітних жінок. Цей гормон являє собою гетеродимер, що складається з а- і β-субодиниць, зв'язаних нековалентно. Його ефекти є переважно ефектами гонадотропіну лютеїнізуючого гормону. Хоріонічний гонадотропін призначають жінкам із метою індукування овуляції після стимулювання розвитку фолікулів гормоном стимуляції яєчників або менопаузними гонадотропінами людини при лікування ановуляторної безплідності, спричиненої відсутністю гонадотропінів або їх низькими концентраціями. При цьому вводять внутрішньом'язово одиничну дозу від 5000 одиниць до 10000 одиниць для імітації піка лютеїнізуючого гормону в середині циклу, який за нормальних умов стимулює овуляцію. Хоріонічний гонадотропін вживають також у комбінації з менотрофіном та іноді також із кломіфен-цитратом як допоміжний засіб при процедурах запліднення in vitro та інших способах штучного запліднення, які включають суперовуляцію та відбирання яйцеклітин. Його використовують також для лікування препубертатного крипторхізму у чоловіків. Режими вживання можуть варіювати в широких межах, але звичайно дози становлять від 500 одиниць до 4000 одиниць, які вводять шляхом внутрішньом'язової ін'єкції тричі на тиждень. Хоріонічний гонадотропін вживають також при чоловічій безплідності, пов'язаній з гіпогонадотропним гіпогеніталізмом. В цьому разі режими дозування також варіюють в широких межах, і дози можуть становити від 500 одиниць до 4000 одиниць два або три рази на тиждень. Для сприяння нормальному сперматогенезу часто додатково вживають також агент, що має здатність стимулювати розвиток фолікулів, такий як менотрофін. У випадках олігоспермії можна застосовувати хоріонічний гонадотропін в дозах до 3000 одиниць на тиждень в комбінації з менотрофіном або іншим препаратом для стимуляції фолікулів. Для лікування затримання статевого дозрівання у чоловіків, пов'язаного з гіпогеніталізмом, застосовують дози від 500 одиниць до 1500 одиниць двічі на тиждень; дозу слід коригувати з урахуванням рівня тестостерону в плазмі. Для виділення та очищення hCG із препаратів сечі використовують різні способи [Біркен та інші — Birken et al., Endocrinology, 133(3): 1390-7, 1993; Сакакібара та інші - Sakakibara et al., Chem. Pharm. Bull., 35(5): 14146, 1990; Доніні та інші - Donini et al., Acta Endocrinol., 73(1): 133-45, 1973]. Останнім часом був розроблений та застосований для очищення hCG зі сечі варіант методу афінної хроматографії, названий мембраннофільтраційною афінною хроматографією [Цзю та інші - Xu et al., Protein e xpression and purification, 16: 221-3, 1999]. Цей спосіб виключає використання активованої бромціаном Сефарози як нерухомої фази в колонці для афінної хроматографії та являє собою різновид звичайного способу очищення hCG методом афінної хроматографії із препаратів сечі. Імуноактивність hCG, очищеного цим способом, становить 8554 МО/мг. Перевага рекомбінантного hCG полягає у відсутності інших гормонів групи гонадотропінів та домішок, що походять із людського організму, більш конкретно, від забруднювачів, присутніх у людській сечі. Неочищений препарат рекомбінантного hCG містить, однак, усі інші протеїни та домішки, що походять із клітин, використаних при одержанні рекомбінантного матеріалу, і, отже, дуже бажаним є створення способу досягнення абсолютної чистоти рекомбінантного хоріонічного гонадотропіну. Автори цього винаходу з'ясували, що неочищений препарат hCG, одержаний з концентрованого препарату культурального середовища після рекомбінаційного процесу або з неочищеного концентрату сечі вагітних жінок, можна очистити так, що одержаний hCG буде практично вільний від протеїнів або інших домішок, які містилися в неочищеному препараті hCG. Спосіб очищення базується на використанні іонообмінної хроматографії та рідинної хроматографії високої ефективності з оберненою фазою. Можливе подальше використання ексклюзійної колонки дозволяє видалити з чистого препарату hCG будь-які залишкові кількості домішок. Оптимальні результати досягаються при використанні щонайменше двох стадій іонообмінного хроматографування. Спосіб за цим винаходом можна використати для очищення рекомбінантного hCG із неочищеного препарату культурального середовища, одержаного після рекомбінаційного процесу. Одержаний hCG має високий ступінь чистоти та високу питому біоактивність (в діапазоні 23000-28000 МО/мг) і практично вільний від протеїнів сироватки зародка великої рогатої худоби (FBS), в разі їх присутності в культуральному середовищі, нуклеїнових кислот або інших домішок, присутніх у клітинах носія, які використовуються в рекомбінаційному процесі. Спосіб за цим винаходом можна використати також для очищення сечового hCG, при цьому вихідним матеріалом є неочищений концентрат сечі вагітних жінок, та для очищення CG, одержаного з організмів інших ссавців, в тому числі, наприклад, великої рогатої худоби, коней, свиней, овець та мавп. Метою цього винаходу є запропонувати спосіб очищення hCG із вихідного матеріалу з використанням іонообмінної хроматографії в комбінації з рідинною хроматографією високої ефективності (РХВЕ) з оберненою фазою. Спосіб включає стадії піддавання вихідного матеріалу іонообмінному хроматографуванню та піддавання елюату рідинному хроматографуванню високої ефективності з оберненою фазою. Може бути використана додаткова подальша стадія пропускання елюату через ексклюзійну колонку. Перевага віддається двократному використанню іонообміної хроматографії в різних умовах із метою досягнення оптимальних результатів процесу очищення. Варіант способу згідно з винаходом, якому віддається перевага, включає стадії: (a) елюювання вихідного- матеріалу через хроматографічну колонку з силікагелем; (b) елюювання через колонку для іонообмінної хроматографії зі стаціонарною фазою ДЕАЕ-Сефароза (DEAE-Sepharose); (c) елюювання через колонку для іонообмінної хроматографії зі стаціонарною фазою СМ-Сефароза (CMSepharose); (d) елюювання через колонку для РХВЕ з оберненою фазою на силікагелі С18 (Silica C18); і (e) елюювання через колонку для ексклюзійної хроматографії зі стаціонарною фазою "Сефакрил" (Sephacryl). У варіанті здійснення винаходу, якому віддається перевага, елюювання через колонку для іонообмінної хроматографії з ДЕАЕ-Сефарозою здійснюють у натрій-фосфатному буферному розчині при рН приблизно 7,5. При елююванні через колонку для іонообмінної хроматографії з СМ-Сефарозою перевага віддається використанню натрій-фосфатного буферного розчину при рН приблизно 6. При виконанні елюювання через колонку для РХВЕ з оберненою фазою на стадії (d) перевага віддається використанню 2-пропанолу з буферним розчином Трис-фосфату як рухомої фази. CG за цим винаходом у варіанті, якому віддається перевага, є CG людини, а найбільша перевага віддається рекомбінантному hCG, одержаному з культурального середовища клітин СНО, які використовуються в рекомбінаційному процесі. Іншою метою цього винаходу є запропонувати фармацевтичну композицію, яка містить терапевтично ефективну кількість очищеного рекомбінантного hCG, одержаного з рекомбінаційного процесу, як описано вище, разом із придатними для цього наповнювачами. Прикладом придатного наповнювача є сахароза, яка сприяє стабілізації ліофілізованого продукту. Фармацевтична композиція рекомбінантного hCG особливо придатна для підшкірного введення. Цей винахід пропонує спосіб очищення hCG, зокрема, спосіб очищення рекомбінантного hCG із неочищеного препарату культурального середовища рекомбінаційного процесу. Одержаний hCG має високий ступінь чистоти та високу питому біоактивність (в діапазоні 23000-28000 МО/мг) і практично вільний від протеїнів сироватки зародка великої рогатої худоби (FBS), які присутні в культуральному середовищі, нуклеїнових кислот або інших домішок, присутніх у клітинах носія, які використовуються в рекомбінаційному процесі. Винахід призначений для застосування до біологічних матеріалів, зокрема, до неочищених сумішей, які містять hCG та інші протеїнові забруднювачі. Такі суміші в цьому описі позначено терміном "вихідні матеріали". У прикладах, детально описаних нижче, використовуються вихідні матеріали, що містять r-hCG, одержані з супернатантного середовища культури клітин в біореакторі. Альтернативним різновидом вихідного матеріалу є неочищений концентрат сечі вагітних жінок. Як вихідний матеріал використовують свіжозібране супернатантне середовище культури клітин, що проходило через біореактор протягом двох діб. Перевага віддається просвітленню супернатанта фільтруванням. Потім неочищений розчин можна в разі необхідності концентрувати та піддати хроматографуванню на силікагелі С4 для видалення домішок, що походять із культури клітин. Напівочищений вихідний матеріал після ультрафільтрування піддають іонообмінному хроматографуванню, причому перевага віддається двократному виконанню іонообмінного хроматографування, у варіанті, якому віддається перевага, в різних умовах, та РХВЕ з оберненою фазою. На першій стадії іонообмінного хроматографування можна застосувати як сорбент ДЕАЕ-Сефарозу, при цьому hCG практично повністю проходить через колонку, і досягається видалення значної частки протеїнів, інших ніж hCG, та ДНК. Друга стадія, при якій перевага віддається застосуванню СМ-Сефарози, діє як стадія зв'язування hCG і забезпечує видалення залишкових кількостей ДНК та клітин носія або протеїнів із середовища. У варіанті, якому віддається перевага, цю стадію виконують при температурі приблизно 5°С з елююванням натрій-фосфатним буферним розчином при рН приблизно 6. Хроматографування з оберненою фазою на силікагелі С18 забезпечує ефективне видалення залишкових кількостей нуклеїнових кислот та домішок, що походять із культури клітин. Перевага віддається елююванню колонки сумішшю 2-пропанолу з буферним розчином Трис-фосфату як рухомою фазою. Розчин затриманої фракції потім у варіанті, якому віддається перевага, піддають ультрафільтруванню при верхній межі пропускання молекулярної маси 10 кДа, концентрують, і продукт можна виділити з нього бікарбонатом амонію, рН 8. Концентрований продукт можна потім піддати ексклюзійній хроматографії на сорбенті "Сефакрил" (Sephacryl S-200 HR). На цій стадії досягається розділення за розміром молекул з елююванням бікарбонатом амонію (рН 8) для видалення залишків домішок, що походять із культури клітин, присутність яких ще можлива, потенціальних агрегатів та вільних субодиниць hCG. Потім елюат можна піддати діалізу шляхом ультрафільтрування через мембрани з верхньою межею пропускання 10 кДа, переважно в натрій-фосфатному буферному розчині, рН 7. Після фільтрування очищений нерозфасований розчин hCG доцільно зберігати в стерильних пляшках при низькій температурі. Приклад 1 Реагенти Аміак для аналізу Бікарбонат амонію для аналізу (за Британською Фармакопеєю) (далі БФ) Вторинний кислий фосфат натрію для аналізу Етанол абсолютний денатурований Фосфорна кислота для аналізу (за Європейською Фармакопеєю) (далі ЄФ) 2-Пропанол для аналізу (за Швейцарською фармакопеєю) Хлорид натрію для аналізу (ЄФ) Первинний кислий фосфат натрію для аналізу Гідроксид натрію гранульований для аналізу (ЄФ) Трифтороцтова кислота (ТФК) для РХВЕ Трис-(гідроксиметил)амінометан для аналізу Схема послідовності технологічних операцій процесу очищення у короткому викладі Первинний матеріал із процесу культивування клітин очищають та концентрують шляхом послідовного виконання п'яти стадій хроматографування. Таблиця 1 являє собою схему послідовності технологічних операцій, що коротко представляє варіант здійснення процесу очищення r-hCG, якому віддається перевага, і характеризує сорбенти в хроматографічних колонках та принципи виконання кожної із проміжних стадій. Нижче подано детальну схему послідовності технологічних операцій процесу та його опис. Для попереднього виділення (стадії І) вказані умови, які звичайно використовуються, якщо неочищений матеріал походить із рекомбінаційного процесу. Стадія І (попереднє виділення) На цій стадії (Стадії І) досягається попереднє концентрування та виконується заміна буферного розчину з метою регулювання його складу. Цю стадію починають при кімнатній температурі (хроматографування на силікагелі С4), а потім продовжують при приблизно +5°С. Перевага віддається робочій температурі в діапазоні 5±3°С. Цю стадію повторюють окремо для кожної партії первинного матеріалу, зібраної на протязі виробничого циклу біореактора. (і) Просвітлення первинного матеріалу Свіжовідібране культуральне середовище з біореактора спочатку звичайно просвітлюють шляхом фільтрування. (іі) Хроматографування на силікагелі С4 Після просвітлення первинний матеріал завантажують у хроматографічну колонку з силікагелем С4, попередньо зрівноважену в 25 мМ розчині фосфату натрію, рН 7. Перевага віддається діапазону рН від 6,6 до 7,7. Колонку промивають 25 мМ розчином фосфату натрію до повернення сигналу УФ-детектора на рівень базової лінії. Потім виконують елюювання продукту сумішшю 25 мМ розчину фосфату натрію з 2-пропанолом (34,2% (мас.)), (ііі) Оброблення аміаком Потім до розчину додають розчин аміаку до досягнення кінцевої концентрації 1 М. Цю суміш інкубують протягом 6 год. Після цього розбавляють розчин вдвічі водою і встановлюють рН 7,5, використовуючи 85%-ну фосфорну кислоту. Діапазон рН, якому віддається перевага, становить 7,5±0,2. (iv) Концентрування та діаліз Мембрани з верхньою межею пропускання молекулярної маси 10 кДа, які в проміжках між операціями зберігають в 0,05 Μ розчині гідроксиду натрію, промивають очищеною водою до зниження рН приблизно до 8. Продукт концентрують і діалізують (шляхом ультрафільтрування через мембрани з верхньою межею пропускання 10 кДа) для видалення речовин із молекулярними масами менше ніж 10 кДа та залишків 2пропанолу та для заміни розчину аміаку 40 мМ розчином фосфату натрію, рН 7,5. Діапазон рН, якому віддається перевага, становить 7,5+0,2. Кінцеву затриману фракцію виділяють із мембран 40 мМ розчином фосфату натрію з розрахунком на досягнення концентрації цільового протеїну 3-15 мг/мл. Потім розчин фільтрують, і одержаний концентрат зберігають в замороженому стані при температурі приблизно -15°С. Стадія II (фільтрування та іонообмінне хроматографування на ДЕАЕ-Сефарозі FF) На цій стадії хроматографування r-hCG проходить через колонку, де з розчину видаляється значна частка протеїнів, інших ніж r-hCG, та нуклеїнових кислот. Якщо фільтрування виконують' при кімнатній температурі, то хроматографічні стадії, де продукт проходить через колонку, виконують в холодному приміщенні. (і) Розтоплення та нагромадження неочишених концентратів r-hCG Заморожені концентрати розтоплюють і об'єднують у загальному збірнику. Партію очищеного нефасованого r-hCG одержують з об'єднаних партій неочищеного концентрату r-hCG, одержаних із використанням культури однієї й тієї ж лінії клітин, при цьому кількість об'єднуваних партій концентрату може змінюватися. Критерієм кількості об'єднуваних партій концентрату є показник максимальної здатності зв'язування протеїну на наступній хроматографічній стадії процесу очищення (4 мг суми протеїнів на 1 мг смоли). (ії) Просвітлення фільтруванням Розчин r-hCG у варіанті, якому віддається перевага, пропускають через фільтрувальний пристрій і промивають фільтри 40 мМ розчином фосфату натрію, рН 7,5. (іії) Іонообмінне хроматографування на ДЕАЕ-Сефарозі FF Колонку, заповнену слабко зарядженою аніонообмінною смолою -діетиламіноетан-(ДЕАЕ)-Сефарозою для високої швидкості потоку (DEAE-Sepharose FF), зрівноважують 40 мМ розчином фосфату натрію, рН 7,5. Розчин r-hCG завантажують у верхню частину колонки. В колонку подають 40 мМ розчин фосфату натрію, рН 7,5. Хроматографічний процес контролюють способом УФ спектрофотометрії на довжині хвилі 280 нм. Головну фракцію елюату до початку елюювання піка відкидають. Після цього збирають незв'язану фракцію, яка містить r-hCG. Стадія III (іонообмінне хроматографування на СМ-Сефарозі FF) На цій хроматографічній стадії видаляється значна частка домішок, що походять із клітин носія. Стадію виконують при температурі приблизно 5°С. Перевага віддається температурі в діапазоні 5±3°С. (і) Розбавлення елюату з колонки з ДЕАЕ-Сефарозою FF До елюату з колонки з ДЕАЕ-Сефарозою FF додають воду для ін'єкцій і встановлюють рН 6, використовуючи 85%-ну фосфорну кислоту. Діапазон рН, якому віддається перевага, становить 6±0,1. (іі) Іонообмінне хроматографування на СМ-Сефарозі FF Колонку, заповнену слабко зарядженою аніонообмінною смолою - карбоксиметил-(СМ)-Сефарозою для високої швидкості потоку (CM-Sepharose Fast Flow), зрівноважують 20 мМ натрій-фосфатним буферним розчином, рН 6. Діапазон рН, якому віддається перевага, становить 6±0,1. Розчин r-hCG завантажують у верхню частину колонки. Колонку промивають 20 мМ натрій-фосфатним буферним розчином, рН 6. Хроматографічний процес контролюють способом УФ спектрофотометрії на довжині хвилі 280 нм. Для елюювання продукту використовують 130 мМ натрій-фосфатний буферний розчин, рН 6. Головну фракцію елюату до початку елюювання піка відкидають. Збирають весь пік, який містить r-hCG. Продукт на цій стадії можна факультативно профільтрувати для видалення вірусних забруднювачів. Стадія IV (РХВЕ з оберненою фазою на силікагелі С18) На цій стадії рідинної хроматографії високої ефективності з оберненою фазою забезпечується ефективне видалення залишкових кількостей домішок, що походять із культури клітин, залишків нуклеїнових кислот та ендотоксинів. Після неї виконують ультрафільтрування з верхньою межею пропускання молекулярної маси 10 кДА та факультативне фільтрування. (і) Підготовка аліквотних кількостей Аліквотні кількості доводять до рН 5 і додають 2-пропанол до кінцевої концентрації 15% (об'єми.) (іі) РХВЕ з оберненою фазою на силікагелі С18 Колонку, заповнену сорбентом силікагелем С18, спочатку зрівноважують в суміші 15% (об'єми.) 2пропанолу з 0,5 Μ буферним розчином Трис-фосфату. Завантажують у верхню частину колонки першу аліквотну кількість розчину r-hCG і контролюють хроматографічний процес методом УФ спектрофотометрії. Промивають колонку тим же самим зрівноважувальним буферним розчином. Потім виконують елюювання г-пССіз лінійним градієнтом концентрації 2-пропанолу в рухомій фазі (суміші 2-пропанолу з 0,5 Μ буферним розчином Трис-фосфату) від 15% (об'ємн.) до 25% (об'ємн.). Фракції r-hCG починають відбирати, коли спектрофотометричний пристрій починає детектувати відповідний пік (А280)·Фракції, поглинання яких перевищує 65% максимальної висоти піка у висхідній його частині і 20% максимальної висоти піка у низхідній частині, збирають в один збірник. Потім чотири збірних партії елюату, які містять r-hCG, об'єднують і розбавляють еквівалентним об'ємом води для ін'єкцій (ВДІ). Продукт концентрують та діалізують (шляхом ультрафільтрування через мембрану з верхньою межею пропускання 10 кДа) проти ВДІ для видалення речовин із молекулярною масою менше 10 кДа та 2-пропанолу. Після цього продукт діалізують проти ОД Μ буферного розчину бікарбонату амонію, рН 8. Одержаний проміжний продукт зберігають приблизно при +5°С або в разі необхідності заморожують. Перевага віддається температурі зберігання відповідно 5±3°С або -15°С чи нижче. Стадія V (ексклюзійне хроматографування на сорбенті Сефакрил S-200 HR) На цій хроматографічній стадії з розділенням за розміром молекул забезпечується видалення залишкових кількостей домішок, що походять із культури клітин, потенціальних агрегатів та/або вільних суббдиниць. Після неї виконують ультрафільтрування з верхньою межею пропускання молекулярної маси 10 кДа. Операції хроматографування на сорбенті Сефакрил S-200 HR та ультрафільтрування з верхньою межею пропускання молекулярної маси 10 кДа виконують при температурі приблизно +5°С. Температурний діапазон, якому віддається перевага, становить +5±3°С. (і) ХроматограсЬування на сорбенті Сефакрил S-200 HR Колонку, заповнену сорбентом Сефакрил S-200 HR, зрівноважують 0,5 Μ розчином бікарбонату амонію, рН 8. Перевага віддається діапазону рН 8±0,2. У верхню частину колонки завантажують розчин r-hCG і починають елюювання 0,5 Μ розчином бікарбонату амонію, рН 8. Перевага віддається діапазону рН 8±0,2. Збирання фракції r-hCG починають із початку піка і продовжують до досягнення 50% максимальної висоти піка на низхідній його частині. (іі) Ультрафільтрування з межею пропускання 10 кДа Ультрафільтрувальні мембрани з верхньою межею пропускання молекулярної маси 10 кДа, які у проміжках між операціями очищення зберігають в 0,05 Μ розчині гідроксиду натрію, промивають водою для ін'єкцій, доки рН не досягне приблизно 8. Продукт концентрують і діалізують (шляхом ультрафільтрування) проти ВДІ. Потім продукт діалізують (шляхом ультрафільтрування) проти 0,01 Μ натрій-фосфатного буферного розчину, рН 7, і регулюють кінцеву концентрацію протеїнів для досягнення кінцевої концентрації цільового протеїну 3,5 мг/мл. Очищений нефасований розчин r-hCG доцільно зберігати замороженим при температурі приблизно -15°С. Хроматографічні сорбенти В процесі очищення можна використовувати хроматографічні сорбенти, перелічені нижче. Можна використовува ти також їх еквіваленти. Стадія І: Силікагель С4 (Silica C4), розмір пор 250 А, розмір частинок 50 мкм (продукт Matre x®, фірма МШіроге) Стадія II: ДЕАЕ-Сефароза для великої швидкості потоку (DEAE-Sepharose FF) (фірма Pharmacia) Стадія III: С М-Сефароза для великої швидкості потоку (CM-Sepharose FF) (фірма Pharmacia) Стадія IV: Силікагель С18 (Silica C18), розмір пор 300 А, розмір частинок 15-20 мкм (фірма Vydac) Стадія V: Сефакрил S-200 HR (Sephacryl S-200 HR) (фірма Pharmacia) Нинішні постачальники: Amersham Pharmacia Biotech, Bjorkgatan 30, S-751 84, Uppsala, Sweden; Millipore Corporation, 17 Cherry Hill Drive, Danvers, MA 01923, USA; Vydac, The Separation Group, 17434 Mojave St., Hesperia, CA 92345, USA. Результати Молекулярна маса та розміри молекул SDS-PAGE Відносну молекулярну масу r-hCG, одержаного за способом очищення згідно з цим винаходом, визначали методом електрофорезу в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) в порівнянні зі стандартними протеїнами з відомими молекулярними масами. Забарвлення індикатором брильянтовим зеленим (продукт фірми Coomassie) після невідновлювального SDS-PAGE виявило одну широку смугу гетеродимеру r-hCG із молекулярною масою приблизно 70 кДа (діапазон 65-75 кДа). Ідентичність смуги підтверджено вестерн-блотингом. Біологічна активність Біологічна активність різних партій r-hCG після очищення за способом цього винаходу відображена в Таблиці 2. Концентрацію протеїну визначали спектрофотометричним методом на довжині хвилі 276,5 нм, а=0,616. Середня питома активність препаратів r-hCG має особливо високе значення і досягає приблизно 25000 МО/мг. Таблиця 2 Номер партії r-hCG ВСЕА 9901 ВСЕА 9902 ВСЕА 9903 ВСЕА 9904 ВСЕА 9905 Композиції Питома активність (МО/мг) 24427 26868 25636 27152 23729 Розроблено як рідкі, так і ліофілізовані композиції на основі рекомбінантного hCG високої чистоти, очищеного способом за цим винаходом. Рідкі композиції Дві рідкі композиції з активністю 10000 МО/мл, приготовані у флаконах за стандартом DIN 2R із використанням маніту або сахарози як наповнювачів, випробовували на стабільність при температурах 50°С, 40°С, 25°С і 4°С. Характеристики композицій наведено в Таблицях 3 і 4. Таблиця З Інгредієнти r-hCG Сахароза орто-Фосфорна кислота Гідроксид натрію Одиниці виміру МО/мл мг/мл мг/мл Кількість 10000 102,6 0,98 за потребою до рН 7 Розфасовка: 0,5 мл Таблиця 4 Інгредієнти r-hCG Маніт орто-Фосфорна кислота Гідроксид натрію Одиниці виміру МО/мл мг/мл Кількість мг/мл 0,98 за потребою до рН 7 10000 54,6 Розфасовка: 0,5 мл Результати випробувань стабільності, одержані методами біопроб, ексклюзійної хроматографії в комбінації з рідинною хроматографією високої ефективності та рідинною хроматографією високої ефективності з оберненою фазою, показали, що композиція з манітом більш стабільна в порівнянні з композицією, що містить сахарозу. з точки зору мінімізації окиснення протеїну та утворення вільних субодиниць перевага віддається зберіганню в охолодженому стані. Ліофілізована композиція Ліофілізовану композицію з ефективністю 5000 МО, приготовану у флаконах за стандартом DIN 2R із використанням сахарози як наповнювача, випробовували на стабільність при температурах 50°С, 40°С, 25°С і 4°С. Характеристики композиції подано в Таблиці 5. Таблиця 5 Інгредієнти r-hCG Сахароза орто-Фосфорна кислота Гідроксид натрію Одиниці виміру МО мг мг Кількість 5000 30 0,98 за потребою до рН 7 Результати випробувань стабільності, одержані методами біопроб, ексклюзійної хроматографії в комбінації з рідинною хроматографією високої ефективності та рідинною хроматографією високої ефективності з оберненою фазою, показали, що ця ліофілізована композиція зберігала стабільність при 40°С і 50°С протягом щонайменше 19 тижнів. Випробування стабільності при 25°С і 4°С на протязі 6 місяців не виявили ознак розкладу активної речовини.

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Process for cleaning recombinant hcg and pharmaceutical composition

Автори англійською

Paradisi Gianfranco, Rossi Mara, Scaglia Laura

Назва патенту російською

Способ очистки рекомбинантного hcg и фармацевтическая композиция

Автори російською

Парадизи Джанфранко, Росси Мара, Скаглия Лаура

МПК / Мітки

МПК: C07K 14/59, C07K 1/36

Мітки: фармацевтична, спосіб, композиція, очищення, рекомбінантного

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/6-78488-sposib-ochishhennya-rekombinantnogo-hcg-ta-farmacevtichna-kompoziciya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб очищення рекомбінантного hcg та фармацевтична композиція</a>

Подібні патенти