Фармацевтична композиція

Реферат: Стабільна водна фармацевтична композиція, яка містить антитіло, що має важкий ланцюг з амінокислотною послідовністю SEQ ID NО:3 і легкий ланцюг з амінокислотною послідовністю SEQ ID NО:4, і фармацевтично прийнятний ад'ювант, розчинник, носій або наповнювач, де згадана композиція має рН від 4 до 6. UA 100255 C2 (12) UA 100255 C2 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до фармацевтичних композицій, а конкретно до стабільних, водних фармацевтичних композицій антитіла, яке зв'язує окислений ЛНЩ, які можуть бути корисними при лікуванні атеросклерозу. Рівень техніки Атеросклероз є багатофакторним захворюванням, яке розвивається переважно у осіб з біохімічними чинниками ризику, включаючи куріння, гіпертонію, цукровий діабет, гіперхолестеринемію, підвищені рівні ліпопротеїну низької щільності (ЛНЩ, LDL) і тригліцеридів, гіперфібриногенемію і гіперглікемію. Атеросклероз є хронічним захворюванням, яке викликає потовщення внутрішньої оболонки (інтими) великих і середніх артерій. Це призводить до ослаблення потоку крові і може викликати ішемію і руйнування тканини в тих органах, які живляться ураженою судиною. У людей атеросклеротичні бляшки розвиваються протягом декількох десятиліть, що призводить до ускладнень, таких як коронарна і церебральна ішемічні і тромбоемболічна хвороби, інфаркту міокарду і церебрального інфаркту. Атеросклероз є основною причиною серцево-судинних захворювань, включаючи інфаркт міокарду, інсульт і захворювання периферійних артерій. Серцево-судинні хвороби є головною причиною захворюваності і смертності в індустріальних країнах, і неухильно прогресують в країнах, що розвиваються, а коронарний атеросклероз є їх центральною базовою патологією. Поточна терапія атеросклерозу не є цілком ефективною при запобіганні розвитку захворювання і ускладнень. Захворювання починається з накопичення ліпопротеїнів, головним чином ЛНЩ, в позаклітинному матриксі судини. Ці частинки ЛНЩ агрегують і піддаються окислювальній модифікації. Окислений ЛНЩ є токсичним і викликає пошкодження судин. Атеросклероз представляє, багато в чому, відповідь на це пошкодження, яка включає запалення і фіброз. Високий рівень холестерину в плазмі, і зокрема, високий рівень ЛНЩ, як правило, визнається рушійною силою в розвитку атеросклерозу, тоді як високий рівень ліпопротеїну високої щільності (ЛВЩ) протидіє розвитку атеросклерозу. Внаслідок цього ЛВЩ називають хорошим холестерином, тоді як ЛНЩ називають поганим холестерином. Спрощено, ЛНЩ транспортує холестерин в тканини, тоді як ЛВЩ адсорбує холестерин в тканинах і транспортує його в печінку, де той піддається деградації. Терапевтичні стратегії лікування атеросклерозу, направлені на пониження рівня ЛНЩ і підвищення рівня ЛВЩ, знаходяться у стадії розробки. ApoB-100 - це білковий компонент ЛНЩ, який є основним переносником холестерину в сироватці крові людини. Окислення ЛНЩ є важливим етапом його конверсії в атерогенну частинку, а його окислювальні модифікації викликають початкове формування смуг жиру найбільш ранніх видимих атеросклеротичних лезій. Радіоактівномічені форми антитіл, які зв'язують окислений ЛНЩ, можуть також використовуватися для радіоімунодетекції атеросклеротичних лезій у експериментальних тварин (Tsimikas et al, 2000). Мічене йодом-125 антитіло проти епітопу з модифікованим малоновим діальдегідом лізином, використовувалося для виявлення бляшок у мишей і кроликів, при цьому було виявлено, що ін'єктоване антитіло локалізується в бляшках аорти. ® З бібліотеки фрагментів рекомбінантних антитіл n-CoDeR були створені людські антитіла, націлені на отримані з людського ApoB-100 окислені пептиди (WO 02/080954). Ці рекомбінантні антитіла, а також антитіла проти інших окислених епітопів ЛНЩ, показали значне інгібування утворення бляшок і запобігання розвитку атеросклеротичних лезій на тваринних моделях (Schiopu et al, 2004; WO 2004/030607; US 6,716,410). Далі було показано, що розкриті в WO 2004/030607 антитіла, які зв'язують окислений ApoB100, особливо IEI-E3, LDO-D4, KTT-B8 і 2-D03, після декількох тижнів лікування індукують активну регресію вже існуючих сформованих атеросклеротичних бляшок в аорті (WO 2007/025781). Такі антитіла пропонувалися для терапії запущеного атеросклерозу для згортання прогресії захворювання в результаті зменшення бляшкового навантаження, а також для терапії асоційованих з атеросклерозом серцево-судинних захворювань. Таким чином, націлювання терапії на основі моноклональних антитіл на окислений ЛНЩ є все більш привабливим способом лікування деяких основних причин смертності у Західному світі. У WO 2007/025781 2D03 було найбільш ефективним при індукції регресії вже існуючих бляшок антитілом. VH і VL послідовності антитіла 2D03 представлені на фігурі 3 WO 2004/030607, а CDR-послідовності антитіла 2D03 приведені в таблиці 2 WO 2007/025781. Як добре відомо в даній галузі, стабільність складу композиції спрощує перевезення і зберігання лікарських засобів, таким чином зменшуючи витрати як для фармацевтичної індустрії, так і для пацієнта (Lucas et al (2004) Pharmaceutical Technology, July 2004 Issue, pp: 69-72). У даній галузі існує необхідність розробки стабільної фармацевтичної композиції, яка містить антитіло 2D03, 1 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 придатної для терапевтичного використання. У останні декілька років успіхи в біотехнології зробили можливим отримання за допомогою рекомбінантних технологій великої кількості білків для фармацевтичних застосувань, таких як антитіла. Оскільки білки більші і складніші, ніж традиційні органічні і неорганічні лікарські препарати (тобто мають багато функціональних груп на додачу до складних тривимірних структур), то отримання стабільної композиції з білками є особливо складною проблемою. Для того, щоб білок, такий як антитіло, залишався біологічно активним, необхідно, щоб композиція підтримувала збереженою інтактну конформаційну цілісність, щонайменше, основної амінокислотної послідовності білка, в той же час, захищаючи функціональні групи білка від деградації. Шляхи деградації білків можуть включати хімічну нестабільність (тобто будь-який процес, при якому відбувається модифікація білка шляхом формування нових зв'язків або розриву існуючих, що призводить до утворення нової хімічної сутності) або фізичну нестабільність (тобто зміни в білковій структурі вищого порядку). Хімічна нестабільність може призводити до деамідування, рацемізації, гідролізу, окислення, β-елімініації або до дисульфідного обміну. Фізична нестабільність може призводити, наприклад, до денатурації, агрегації, преципітації або адсорбції. Трьома найбільш поширеними шляхами деградації білка є агрегація білка, деамідування і окислення (Cleland et al (1993) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377). Багато композицій відомі своєю здатністю підвищувати стабільність композицій на основі антитіл. Наприклад, US 6,171,586 описує композицію, яка містить поліол і ПАР (поверхнево активні речовини), які стабілізують антитіло і не містить хлориду натрію. Розкриття винаходу Несподівано автори винаходу виявили, що антитіло 2D03 демонструє характеристики ® розчинності відмінні від раніше створених продуктів з антитілами на основі n-CoDeR . Як правило, 10-20 мМ фосфатний буфер, який містить 150 мМ NaCl, pH 7-7,5, стабілізує ® композицію із створеними на основі n-CoDeR продуктами з антитілами. ® Автори виявили, що на відміну від інших антитіл, які мають каркас n-CoDeR , 2D03 агрегує при pH вище 6,0. Оскільки pH нижче 4 непридатне для композицій для внутрішньовенного або підшкірного введення пацієнтові, автори визначили вузький інтервал pH для композиції, яка містить антитіло 2D03, яка має корисний період стабільності при зберіганні, і яка є придатною для внутрішньовенного або підшкірного введення пацієнтові. Крім того, якщо концентрація 2D03 або заміна його буфера ультрафільтрацією проходять в розчинах з низькою провідністю (менш ніж 100 мМ еквівалента NaCl), то утворюються агрегати. Початкові дослідження показали, що продукт на основі антитіла 2D03 може бути сконцентрований, щонайменше, до концентрації 160 міліграм/мл, якщо pH підтримувався на рівні 5,5, а в композицію був включений 150 мМ NaCl. У первинних випробуваннях, спроби підвищити стабільність 2D03 шляхом додавання стандартних добавок, таких як полісорбат 20, аргінін, гістидин, глутамінова кислота і манітол, не були достатньо ефективні. Відповідно, перший аспект винаходу, таким чином, забезпечує водну фармацевтичну композицію, яка містить антитіло 2D03 і фармацевтично прийнятний ад'ювант, розчинник, носій або наповнювач, де значення pH композиції знаходиться в діапазоні від 4 до 6. 2D03 є повністю людським IgG1-антитілом, мішенню якого є окислений ЛНЩ. Полінуклеотидні послідовності, які кодують важкі і легкі ланцюги антитіла 2D03 представлені на Фігурі 1 і помічені як SEQ ID No: 1 і SEQ ID No: 2, відповідно. Амінокислотні послідовності важкого і легкого ланцюга антитіла 2D03 представлені на Фігурі 2 і помічені як SEQ ID No: 3 і SEQ ID No: 4, відповідно. Отже, даний аспект винаходу пропонує водну фармацевтичну композицію, яка містить антитіло, яке має амінокислотні послідовності важкого ланцюга SEQ ID No: 3 і легкого ланцюга SEQ ID No: 4 і яка містить фармацевтично прийнятний ад'ювант, розчинник, носій або наповнювач, де значення pH композиції знаходиться в діапазоні від 4 до 6. Антитіло у фармацевтичній композиції може бути отримане за допомогою будь-якого, добре відомого в галузі створення антитіл, підходу. Приклади способів отримання рекомбінантних антитіл детально описані нижче. Термін "фармацевтична композиція" добре відомий в даній галузі і відноситься до препарату, який знаходиться в такій формі, яка дозволяє бути ефективною біологічній активності активного інгредієнта (тобто антитіла 2D03); і який не містить додаткових, таких, що токсично діють на пацієнтів, яким буде вводиться дана композиція, компонентів. Фармацевтично прийнятними ад'ювантами, розчинниками, носіями і наповнювачами є такі, введення яких може бути доцільним пацієнтові для забезпечення ефективної дози 2 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовуваного активного інгредієнта, і які добре відомі в даній галузі. Існує безліч шляхів, за допомогою яких може бути оцінена стабільність фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, деякі з яких детально описані в прикладах 2 і 3. Наприклад, стабільність фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, може бути визначена шляхом оцінювання її чистоти, наприклад, за допомогою гель-фільтрації, катіонообмінної хроматографії і/або ДСН-ПААГ. Додатково або альтернативно, стабільність фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, може бути визначена або на око, або за світлорозсіюванням при 410 нм. Далі додатково або альтернативно, стабільність фармацевтичної композиції може бути визначена на основі активності антитіла 2D03, і, як правило, на основі антигензв'язуючої активності антитіла 2D03 (наприклад, здатності зв'язуватися з MDA-ApoB100). Таким чином, під "стабільною" фармацевтичною композицією, ми розуміє таку, в якій антитіло зберігає здатність зв'язувати MDA-ApoB100 після зберігання (за певний період часу і за певних умова), у порівнянні з антитілом, яке не зберігається таким чином. Більш бажано, щоб антитіло зберігало, щонайменше, 60 %, або, щонайменше, 70 %, 80 %, 90 % або 95 % його здатності зв'язуватися з MDA-ApoB100. Ще краще, щоб антитіло зберігало, щонайменше, 99 % або 100 % його здатності зв'язувати MDA-ApoB100 після певного зберігання, за встановлений період часу і за представлених нижче умов. Під виразом "стабільний фармацевтичний препарат з антитілом" ми розуміємо, що чистота препарату антитіла після певного зберігання, протягом вказаного періоду часу і за приведених нижче умов, складає, щонайменше, 90 % від чистоти інтактного мономірного антитіла, краще 95 % або більше від чистоти інтактного мономірного антитіла, зокрема, 96 % або 97 % 98 % або 99 % або більше від чистоти інтактного мономірного антитіла. Бажано, якщо чистота препарату антитіла після зберігання визначається і/або вимірюється за допомогою гель-фільтрації, як описано в приведених прикладах. У цьому документі вказано, що за цим аспектом винаходу дана фармацевтична композиція є стабільною фармацевтичною композицією. Як правило, композиція є стабільною при зберіганні за температури біля 2-8 °C, щонайменше, протягом 4 тижнів. Бажано, щоб фармацевтична композиція була стабільною за температури біля 2-8 °C, щонайменше, протягом 8 тижнів. Ще краще, якщо фармацевтична композиція стабільна за температури біля 2-8 °C, щонайменше, протягом 14 тижнів або довше. Ще краще, якщо фармацевтична композиція стабільна за температури біля 2-8 °C, щонайменше, протягом 1,5 років, а ще краще - протягом 3 років. Найкраще, якщо фармацевтична композиція стабільна протягом, щонайменше, 4 або 5 років. Як правило, фармацевтична композиція стабільна після заморожування і розморожування композиції. Зручно, якщо фармацевтична композиція стабільна за температури біля 24 °C (наприклад, за температури 25 °C) протягом, щонайменше, 4 тижнів, а краще, протягом, щонайменше, 8 тижнів, або довше. Як продемонстровано, в наведених прикладах, фармацевтичні композиції запропоновані винаходом можуть бути стабільні протягом 6 місяців за температури 25 °C. У втіленнях по винаходу, фармацевтична композиція має мінімальне значення pH рівне 4,1, або 4,2, або 4,3, або 4,4, або 4,5, або 4,6, або 4,7, або 4,8, або pH 4,9, і максимальне значення pH рівне 6,0. У інших втіленнях, фармацевтична композиція має максимальне значення pH рівне 5,9, або 5,8, або 5,7, або 5,6, або 5,5, або 5,4, або 5,3, або 5,2, або 5,1, і мінімальне значення pH рівне 4. У деяких інших втіленнях, фармацевтична композиція має максимальне значення pH рівне 5,9, або 5,8, або 5,7, або 5,6, або 5,5, або 5,4, або 5,3, або 5,2, або 5,1, і мінімальне значення pH, рівне 4. У одному втіленні, фармацевтична композиція має значення рН від 4,9 до 5,1, а конкретніше - pH 5,0. У інших втіленнях, фармацевтична композиція має значення pH від 5 до 6, наприклад, pH від 5,0 до 5,9, pH від 5 до 5,8, pH від 5 до 5,7, або pH від 5,0 до 5,6. У конкретнішому втіленні, фармацевтична композиція має рН від 5,4 до 5,6, а конкретніше - pH близько 5,5. Слід розуміти, що в цілях збереження необхідного pH фармацевтична композиція містить буфер. Термін "буфер", який тут використовується, відноситься до буферного розчину, який, дією його кисло-основних зв'язаних компонентів, перешкоджає змінам pH. Буфер за цим винаходом має значення pH в діапазоні від близько 4 до близько 6; бажано, від близько 4,5 до близько 5,8; краще від близько 4,8 до близько 5,6; і найкраще має значення pH між 5,0 і 5,6. Приклади буферів, які контролюють pH в цьому діапазоні, включають ацетат (наприклад, ацетат натрію) сукцинат (такий як сукцинат натрію), глюконат, цитрат та інші органічні буфери. Бажано, якщо буфер не є фосфатним буфером, особливо якщо потрібний стабільна при заморожуваннірозморожуванні композиція. 3 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Концентрація буфера може бути від близько 1 мМ до близько 50 мМ, прийнятно від близько 5 мМ до близько 40 мМ, а бажано від близько 10 мМ до близько 30 мМ, в залежності, наприклад, від буфера, і необхідної ізотонічності композиції. У бажаному втіленні фармацевтична композиція містить ацетатний буфер. Як правило, ацетат присутній в концентрації 5-30 мМ, а краще в концентрації 10-30 мМ. У конкретнішому втіленні, ацетат присутній в концентрації близько 20 мМ. У втіленні, фармацевтична композиція додатково містить хлорид натрію. Хлорид натрію може бути присутнім в концентрації від близько 50 мМ до близько 200 мМ, прийнятно в концентрації від близько 100 мМ до близько 200 мМ, а краще в концентрації 150 мМ. Додатково або замість хлориду натрію, фармацевтична композиція може містити інші солі і/або амінокислоти. Як правило, антитіло присутнє у фармацевтичній композиції в концентрації від 10 до 200 міліграм/мл, наприклад, від 25 до 150 міліграм/мл. У конкретних втіленнях, антитіло присутнє у фармацевтичній композиції в концентраціях 25±10 міліграм/мл, 120±20 міліграм/мл, або близько 150±10 міліграм/мл. Наприклад, антитіло може бути присутнім у фармацевтичній композиції в концентрації 10 міліграм/мл або 20 міліграм/мл або 30 міліграм/мл або 40 міліграм/мл або 50 міліграм/мл або 60 міліграм/мл або 70 міліграм/мл або 80 міліграм/мл або 90 міліграм/мл або 100 міліграм/мл або 110 міліграм/мл або 120 міліграм/мл або 130 міліграм/мл або 140 міліграм/мл або 150 міліграм/мл або 160 міліграм/мл. Бажано, якщо антитіло присутнє у фармацевтичній композиції в концентрації менше ніж 160 міліграм/мл, такій як менше ніж 100 міліграм/мл або менше ніж 50 міліграм/мл або менше ніж 25 міліграм/мл. Краще втілення винаходу пропонує стабільну, водну фармацевтичну композицію, яка містить на мл: від 15 до 160 міліграма визначеного вище антитіла 2D03; 8,77 міліграм хлориду натрію; 2,35 міліграм ацетату натрію 3-гідрату; 0,16 мкл оцтової кислоти; гідроксид натрію в кількості, достатній для отримання pH 5,5; і воду в кількості, достатній для досягнення кінцевого об'єму в 1 мл. Антитіло може бути присутнім в концентраціях 25±10 міліграм/мл, 120±20 міліграм/мл, або близько 150±10 міліграм/мл. У додатковому кращому втіленні, винахід пропонує стабільну, водну фармацевтичну композицію яка містить: 25 міліграм/мл антитіла за п. 1; 20 мМ ацетату натрію; 150 мМ хлориду натрію; гідроксид натрію в кількості, достатній для отримання pH 5,5 95 % чистота. Слід розуміти, що фармацевтична композиція може також містити консервант. "Консервант" - це сполука, яка може бути включеною до композиції для істотного скорочення в ній бактерій, таким чином, наприклад, сприяючи отриманню композиції для універсального використання. Приклади потенційних консервантів включають хлорид октадецилдиметилбензиламонію, хлорид гексаметонію, хлорид бензалконію, (суміш хлоридів алкілбензилдиметиламонію, в яких алкільні групи є сполуками з довгим ланцюгом), і хлорид бензетонію. Інші типи консервантів включають ароматичні спирти, такі як фенол, бутиловий і бензиловий спирти, алкілпарабени, такі як метилпарабен і пропілпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол, і mкрезол. Кращим консервантом є бензиловий спирт. Проте слід розуміти, що консервант може бути і не потрібним, оскільки представлені в прикладі 3 композиції є стерильними і вільними від бактеріальних або грибкових забруднень. Слід розуміти, що фармацевтична композиція може, в деяких втіленнях, також містити поліол. "Поліолом" є субстанція з багатьма гідроксильними групами, до якої відносяться цукри (відновлюючі і невідновлюючі цукри), цукрові спирти і цукрові кислоти. Типові поліоли мають молекулярну масу меншу, ніж близько 600 кДа (наприклад, в діапазоні від близько 120 до близько 400 кДа). "відновлюючий цукор" - це цукор, який містить напівацетальну групу, яка може відновлювати іони металу або реагувати ковалентно з лізином або іншими аміногрупами в білках, а "невідновлюючий цукор" - це той, який не має дані властивості відновлюючого цукру. Прикладами відновлюючих цукрів є фруктоза, маноза, мальтоза, лактоза, арабіноза, ксилоза, рибоза, рамноза, галактоза і глюкоза. Невідновлюючі цукри включають сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелезитозу і рафінозу. Ксилітол, еритритол, треітол, сорбітол та гліцерин є прикладами цукрових спиртів. Невідновлюючі цукри, такі як сахароза і трегалоза, можуть в 4 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 деяких випадках бути кращими поліолами. Далі слід розуміти, що фармацевтична композиція може в деяких втіленнях також містити ПАВ, багато з яких є добре відомими в даній галузі. Приклади ПАВ включають полоксамери (наприклад, полоксамер 188). Може бути додане така кількість ПАР, яка зменшує агрегацію антитіла і/або мінімізує утворення частинок в композиції. Наприклад, ПАВ може бути присутнім в композиції в кількості від близько 0,001 % до близько 0,2 %, бажано, від близько 0,01 % до близько 0,1 %. У одному втіленні композиція не містить поліолу і/або ПАР. У одному втіленні винаходу, фармацевтична композиція не містить добавок, вибраних з поміж полісорбату 20, аргініну, гістидіну, глутамінової кислоти і Манітолу. У втіленні, винахід пропонує фармацевтичну композицію, в якій антитіло пропонується з чистотою 95 % або більше (наприклад, 96 % або 97 % або 98 % або 99 % або більше, аж до 100 %). Фармацевтична композиція, яка використовується для введення пацієнтові in vivo, бажано є стерильною. Це легко досягається, наприклад, фільтрацією крізь 0,22 мкм стерильний фільтр. Фармацевтична композиція може бути складена для підшкірного або внутрішньовенного введення. У деяких втіленнях, особливо коли фармацевтична композиція складена для внутрішньовенного введення, бажано якщо ця композиція є ізотонічною. Під "ізотонічним" розуміється композиція, яка має власне такий же осмотичний тиск, що і людська кров. Ізотонічні композиції будуть, як правило, мати осмотичний тиск близько 250 до 350 мОсм. Наприклад, ізотонічність може бути визначена газопаровим або кріоскопічним осмометром. У втіленні, фармацевтична композиція, яка містить антитіло, не піддається попередній ліофілізації. У даній галузі добре відомі способи створення антитіл, таких як антитіло, які володіють важким ланцюгом з амінокислотною послідовністю SEQ ID No: 3 і легким ланцюгом з амінокислотною послідовністю SEQ ID No: 4. Коротко, для отримання рекомбінантного антитіла 2D03, полінуклеотид (фігура 1), який його кодує, вставляється в репліковані вектори для експресії. Доступними є велика кількість придатних експресуючих векторів. Компоненти вектора, як правило, включають сигнальну послідовність, точку початку реплікації, один або декілька генів-маркерів, енхансерний елемент, промотер, і послідовність термінації транскрипції. Придатні клітини господаря для експресії глікозильованого антитіла отримують з багатоклітинних організмів. Хоча клітини рослин і комах можуть бути придатними клітинами господаря, бажано, якщо ними є клітини хребетних, оскільки культивування клітин хребетних в тканинній культурі стало звичайною процедурою. Прикладами корисних клітинних ліній ссавців є COS-7, CV1, VERO-76, HEK293, BHK, CHO, TM4, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, MMT, TRI, MRC5, NSO і FS4. Для продукування антитіл клітини господаря трансфікуються експресуючими векторами і культивуються в звичайному поживному середовищі, модифікованому, за необхідності, для індукції промоторів, відбору трансфектантів або ампліфікації генів, які кодують послідовності антитіл. Клітини, які використовуються для продукування антитіла, можуть культивуватися в різних добре відомих і комерційно доступних середовищах, які можуть бути доповнені, за необхідності, гормонами і/або іншими факторами зростання, солями, буферами, нуклеотидами, антибіотиками, мікроелементами і джерелами енергії, такими як глюкоза. Також можуть бути включені будь-які інші необхідні добавки у відповідних концентраціях, відомі фахівцям в даній галузі. Культуральні умови, такі як температура, pH і тому подібне, також добре відомі в даній галузі. При використанні рекомбінантних методів, антитіло може продукуватися внутріклітинно, в периплазмичний простір або секретуватися безпосередньо в середовище. Якщо антитіло продукується внутріклітинно, то на першому етапі дисперсний дебрис або клітин господаря, або лізованих клітин, видаляється наприклад, центрифугуванням або ультрафільтрацією. Якщо антитіло секретується в середовище, то супернатант з таких експресуючих систем, як правило, концентрується за допомогою комерційно доступного фільтру для концентрації білка, наприклад, за допомогою блоку ультрафільтрації Amicon або Millipore Pellicon. Інгібітор протеаз, такий як PMSF, може бути включений на будь-якому з вищезгаданих етапів для інгібування протеолізу, а антибіотики можуть бути включені для запобігання зростанню випадкових контамінантів. Приготована з клітин композиція з антитілом може бути очищена за допомогою, наприклад, гідроксиапатитної хроматографії, гель-електрофорезу, діалізу, афінної хроматографії, і афінна хроматографія є кращим методом очищення. Можливість застосування протеїну А як афінного 5 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ліганду залежить від вигляду та ізотипу присутнього в антитілі імуноглобулінового Fc-домену. Протеїн А може бути використаний для очищення антитіл, в основі яких лежать важкі ланцюги 1, 2, або 4 (Lindmark et al, (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13). Матрицею, до якої прикріпляється афінний ліганд, найчастіше є агароза, але також є інші варіанти матриць. Механічно стійкі матриці, такі як скло з контрольованим розміром пор або полі(стирендивініл)бензол дозволяють використовувати швидші швидкості потоку і коротші періоди проведення процесу, в порівнянні з агарозою. Інші корисні методи для очищення білка включають фракціонування на іонообмінній колонці, преципітацію з етанолом, зворотну ВЕРХ, хроматографію на оксиді кремнію, хроматографію на гепарині, хроматографію "Sepharoset™» на аніоно- або катіонообмінній смолі (таку як колонка з поліаспарагіновою кислотою), хроматофокусування, ДСН-ПААГ і преципітацію з сульфатом амонію. Бажано, якщо антитіло 2D03, яке використовується в композиції, є переважно чистим і бажано переважно гомогенним (тобто вільним від домішкових білків). "Переважно чиста" композиція з антитілом - це композиція, яка містить, щонайменше, 90 мас. % антитіла, виходячи із загальної маси білків в композиції, краще 95 мас. %. "Переважно гомогенна" композиція з антитілом - це композиція, яка містить, щонайменше, 99 мас. % антитіла, виходячи із загальної білкової маси в композиції. Другий аспект винаходу забезпечує виріб, який містить стерильний контейнер, який містить стабільну водну фармацевтичну композицію, визначення якої дано в першому аспекті винаходу. Виріб може бути одноразовим шприцом, посудиною або флаконом та ін. Контейнер може бути сформований з різних матеріалів, таких як скло або пластик. Зразком контейнеру є 3-20 мл одноразовий скляний флакон. Альтернативно, контейнер може бути 3-100 мл скляним флаконом. Контейнер містить композицію, і, за необхідності, ярлик як на самому контейнері, так і разом з ним, який може містити інструкцію із застосування. Виріб додатково може включати інші матеріали, які є бажаними з комерційної і призначеної для користувача точки зору, включаючи інші буфери, розчинники, фільтри, голки, шприци і листок-вкладку з інструкцією із застосування. Як вже було описано в WO 2004/030607 і WO 2007/025781, антитіло 2D03 має здатність запобігати та індукувати регресію атеросклеротичних бляшок. Відповідно, третій аспект винаходу пропонує спосіб лікування і/або профілактики і/або редукції і/або боротьби з атеросклерозом, або з асоційованим з атеросклерозом серцево-судинним захворюванням у пацієнтів, спосіб передбачає введення пацієнтові, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, визначеної вище, у зв'язку з першим аспектом винаходу. У контексті даного винаходу, "терапевтично ефективна кількість" антитіла – це кількість, яка є ефективною з погляду профілактики або лікування атеросклерозу, або серцево-судинного захворювання, пов'язаного з атеросклерозом. Винахід передбачає використання 2D03, тобто антитіла, яке має важкий ланцюг з амінокислотною послідовністю SEQ ID No: 3 і легкий ланцюг з амінокислотною послідовністю SEQ ID No: 4, при виготовленні фармацевтичної композиції, визначення якої дано в першому аспекті винаходу для лікування і/або профілактики і/або скорочення і/або боротьби з атеросклерозом, або серцево-судинним захворюванням, пов'язаним з атеросклерозом, у пацієнта. Винахід також включає фармацевтичну композицію, визначення якої дано вище в першому аспекті винаходу, для використання з метою лікування і/або профілактики і/або редукції і/або боротьби з атеросклерозом, або з серцево-судинним захворюванням, пов'язаним з атеросклерозом у пацієнта. У втіленні, антитіло у фармацевтичній композиції редукує утворення атеросклеротичних бляшок у пацієнта, тобто уповільнює розвиток атеросклерозу, і бажано редукує або запобігає утворенню нових атеросклеротичних бляшок. У іншому втіленні, антитіло у фармацевтичній композиції індукує регресію вже існуючих атеросклеротичних бляшок у пацієнта. Під "регресією атеросклеротичних бляшок" ми розуміємо редукцію розміру і/або кількості і/або ступеня атеросклеротичних бляшок. Як правило, регресія атеросклеротичних бляшок призводить до редукції в області внутрішньої, покритої бляшками, артеріальній поверхні. Таким чином, до "регресії атеросклеротичних бляшок" ми відносимо зниження загального бляшкового навантаження у індивідуума, а також редукування розміру деяких, або всіх, атеросклеротичних бляшок індивідуума. Регресія атеросклеротичних бляшок також веде до збільшення просвіту судин (тобто до збільшення ефективного поперечного перерізу артеріальної судини), що посилює кровоток. 6 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Способи вимірювання розміру і/або кількості і/або ступеня атеросклеротичних бляшок у індивідуума добре відомі фахівцеві в даній галузі, і включають ангіографію, ультразвукове дослідження судин, комп'ютерну і магнітно-резонансну томографії. До "редукування розміру і/або числа і/або ступеня" ми включаємо редукцію на близько 125 %, таку як редукція на близько 1 або 2 або 3 або 4 або 5 % або сильнішу редукцію на близько 6 або 7 або 8 або 9 або 10 % або редукцію на 10-25 %. Більш бажаною є сильніша редукція на 25-50 %, або 50-75 % або більше. До зменшення площі покритої атеросклеротичними бляшками внутрішньої артеріальної поверхні ми включаємо зменшення на близько 1-25 %, таку, як зменшення на близько 1 або 2 або 3 або 4 або 5 %, або більш суттєве зменшення на близько 6 або 7 або 8 або 9 або 10 %, або зменшення на 10-25 %. Більш бажаним є більш суттєве зменшення на 25-50 %, або 50-75 % або більше. Під збільшенням ефективного поперечного перерізу артеріальної судини ми розуміємо збільшення на 1-25 %, таке як збільшення на близько 1 або 2 або 3 або 4 або 5 %, або більш суттєве збільшення на близько 6 або 7 або 8 або 9 або 10 % або збільшення на 10-25 %. Більш бажаним є більш суттєве збільшення на 25-50 %, або 50-75 % або 75-100 %. Краще, якщо ефективний поперечний переріз артеріальної судини збільшується в 2 або 3 або 4 або 5 або 10 разів або більше. Очевидно, ступінь збільшення поперечного перетину артеріальної судини залежить від рівня артеріальної блокади, викликаної атеросклеротичними лезіями до початку лікування. Як правило, регресувати будуть атеросклеротичні бляшки, які знаходяться в аорті індивідуума, але також можуть бути знайдені в інших артеріальних ділянках пацієнта, таких як стегнова, сонна або коронарна артерії. Як правило, лікування буде застосовуватися для пацієнтів, які є ссавцями, включаючи людину, домашніх і сільськогосподарських тварин, тварин зоопарку, спортивних тварин, домашніх тварин, таких як собаки, кішки, коні, корови, вівці, свині, верблюди тощо. В кращому випадку пацієнтом є людина. Як правило, пацієнтом є людина з атеросклерозом. Слід розуміти, що оскільки присутні у фармацевтичній композиції антитіла призводять до редукції розміру вже існуючих атеросклеротичних бляшок (WO 2007/025781), фармацевтична композиція є особливо корисною при лікуванні пацієнтів з прогресуючою або важкою формою атеросклерозу, і з прогресуючою або важкою формою асоційованого з атеросклерозом серцево-судинного захворювання. Пацієнтом може бути людина, яка страждає, або має ризик розвитку серцево-судинного захворювання, пов'язаного з атеросклерозом. Термін "пов'язане з атеросклерозом серцевосудинне захворювання" відноситься до захворювань, які за медичними показаннями пов'язані з атеросклерозом, в результаті того, що вони є наслідком атеросклеротичних лезій. Можна згадати наступні асоційовані з атеросклерозом серцево-судинні захворювання: ішемічна хвороба серця, інфаркт міокарду і інсульти. Також слід розуміти, що оскільки антитіло фармацевтичної композиції одночасно редукує утворення атеросклеротичних бляшок та індукує регресію вже існуючих атеросклеротичних бляшок, то фармацевтична композиція є корисною для зменшення ризику виникнення серцевосудинного захворювання пов'язаного з атеросклерозом у пацієнта з ризиком розвитку згаданих серцево-судинних захворювань внаслідок присутності атеросклеротичних бляшок. Пацієнтом з ризиком розвитку асоційованого з атеросклерозом серцево-судинного захворювання, може бути пацієнт з такими рівнями холестерину в крові, які можуть викликати або посилити серцевосудинне захворювання або дисфункцію. Пацієнтом може бути той, хто має ризик розвитку ішемічної хвороби серця, що є наслідком багатьох чинників ризику (включаючи ожиріння, куріння, гіпертонію, цукровий діабет і сімейний анамнез передчасної ішемічної хвороби серця); той, хто спадково схильний до підвищених концентрацій в плазмі холестерину і тригліцеридів; той, хто страждає на гіперліпідемією, не вторинну по відношенню до базових захворювань (таких як гіпотиреоз, нефротичний синдром, хвороба печінки або алкоголізм); той, у кого підвищений рівень ЛНЩ-холестерину; або той, хто знаходиться під дієтичною гіполіпідемічною дією (додаткове лікування). У втіленні цього аспекту винаходу, винахід може включати попередній етап визначення розміру і/або кількості і/або ступеня атеросклеротичних бляшок у індивідуума. Це може бути зроблено для оцінки необхідності лікування індивідуума для зменшення навантаження атеросклеротичними бляшками, або може бути зроблено для забезпечення базового вимірювання для оцінки ефективності такого лікування або для обох цілей. Слід розуміти, що навантаження атеросклеротичними бляшками, яке необхідно редукувати, може бути пов'язаним 7 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з розмірами і/або ступенем загального бляшкового навантаження. Додатково або альтернативно, це може бути пов'язано з природою бляшок, наприклад, з їх нестабільністю. За необхідності, та, як правило, після введення фармацевтичної композиції винахід може також містити послідовний етап визначення розміру і/або кількості і/або ступеня атеросклеротичних бляшок у пацієнта, з тим, щоб оцінити ефективність лікування в порівнянні з контрольними вимірюваннями, проведеними до початку лікування. Чи є конкретний пацієнт таким, що потребує даного лікування, визначається лікарем. Доведено, що статини (інгібітори 3-гідрокси-3-метилглутарил-коензим А (HMG-CoA) редуктази) є ефективними засобами запобігання гострим серцево-судинним станам шляхом редукування вмісту холестерину в плазмі (і шляхом додаткових, ще не з'ясованих, механізмів). Описане вище введення статину разом з імунотерапією може бути корисним засобом лікування, яке доповнює регресію атеросклеротичних бляшок. Відповідно, четвертий аспект винаходу забезпечує набір, який включає компоненти: фармацевтичну композицію або ліофілізовану композицію, визначення якої дано вище у зв'язку з першим аспектом винаходу, і статин. Придатні і кращі статини обираються з аторвастатину, церівастатину, флувастатину, ловастатину, мевастатину, правастатину, розувастатину і симвастатину. Як правило, статини вводяться в композицію для перорального введення. Кожен з компонентів представлений у формі, яка підходить для введення у поєднанні з іншими. Під "поєднанням" ми розуміємо те, що компоненти можуть підходити для одночасного або комбінованого введення пацієнтові. Проте, оскільки компоненти, як правило, вводяться різними шляхами, то під "поєднанням" ми також розуміємо послідовне або окреме введення протягом одного режиму лікування. Набір може додатково включати інші, бажані з комерційної точки зору або призначені для користувача матеріали, включаючи інші буфери, розчинники, фільтри, голки, шприци і листоквкладиш з інструкцією щодо застосування. Краще, якщо два компоненти набору вибираються для отримання синергічного ефекту. П'ятий аспект винаходу включає спосіб лікування і/або профілактики і/або редукції і/або боротьби з атеросклерозом, або з пов'язаним з атеросклерозом серцево-судинним захворюванням, що передбачає введення індивідуумові фармацевтичної композиції, визначення якої дано вище в контексті першого аспекту винаходу, і статину. Винахід пропонує фармацевтичну композицію, визначення якої дано вище в контексті першого аспекту винаходу, і статин для використання в комбінації при лікуванні і/або запобіганні і/або редукції і/або боротьбі з пов'язаним з атеросклерозом серцево-судинним захворюванням. Краще, якщо для отримання синергетичного ефекту вибирається режим з двома дозами. Придатні і бажані статини включають аторвастатин, церівастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, правастатин, розувастатин і симвастатин. Всі згадані тут документи включені шляхом посилання в повному об'ємі.Зокрема, повні розкриття WO 2004/030607 і WO 2007/025781, які відносяться до антитіла 2D03, включені тут шляхом посилання в повному об'ємі. Перерахування або обговорення раніше опублікованого документа в цьому описі не повинне обов'язково розглядатися як підтвердження того, що документ є частиною тверджень поточного рівня або відноситься до галузі загальних знань. Далі винахід буде описаний детальніше з посиланням на наступні приклади і фігури. На Фігурі 1 зображена полінуклеотидна послідовність, яка кодує важкий ланцюг 2D03 (SEQ ID No: 1) і легкий ланцюг (SEQ ID No: 2). На Фігурі 2 зображені амінокислотні послідовності важкого ланцюга 2D03 (SEQ ID No: 3) і легкого ланцюга (SEQ ID No: 4), які кодуються полінуклеотидами, представленими на Фігурі 1. Області CDR підкреслені. Приклад 1: Вплив pH на стабільність В ході розробки способу очищення автори виявили, що антитіло 2D03 демонструє різні характеристики розчинності в порівнянні з продуктами, раніше створеними за допомогою n® CoDeR . Як правило, 10-20 мМ фосфатний буфер, який містить 150 мМ NaCl, pH 7-7,5 ® стабілізує композицію з антитільними продуктами, створеними за допомогою n-CoDeR . Проте антитіло 2D03 не є стабільним в цій композиції. Відповідно, автори оцінювали вплив pH і концентрації солей на стабільність антитіла 2D03. У результаті з'ясувалося, що: • продукт з антитілом 2D03 агрегує при pH вищому від 6,0, але не при нижчих значеннях pH. • якщо концентрація або заміна буфера ультрафільтрацією проводяться в розчинах з низькою провідністю (менше ніж 100 мМ еквівалентів NaCl (у милі Сименсах)), то це призводить до утворення агрегатів, але цього не трапляється при вищих концентраціях. 8 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Початкові дослідження показали, що продукт на основі антитіла 2D03 може бути сконцентрований, щонайменше, до 160 міліграмів/мл, якщо підтримувати pH 5,5, а до композиції включити 150 мМ NaCl. Приклад 2: Тести на стабільність Реферат Мета цього дослідження полягала у виявленні стабільної композиції для антитіла 2D03 з концентрацією вищою від 100 міліграм/мл. Стабільність шести різних композицій з концентраціями антитіл 100-150 міліграм/мл і pH 5,5 досліджували після інкубації при 5 °C і при 24 °C (прискорене дослідження). Передумови У прикладі 1 автори виявили, що антитіла 2D03 демонструють характеристики розчинності, ® які відрізняються від таких у раніше створених за допомогою n-CoDeR антитільних продуктів. У результаті, виявилось, що продукт агрегує при pH вищому від 6,0, а концентрація і заміна буфера ультрафільтрацією призводять до появи агрегатів якщо проводяться в розчинах з малою провідністю. Ґрунтуючись на цих висновках, подальші дослідження стабільності були обмежені композиціями з pH 5,5 і 150 мМ NaCl. Виходячи з досвіду роботи авторів з висококонцентрованими композиціями на основі ® продуктів n-CoDeR , до більшості тестованих композицій був включений полісорбат 20, оскільки було продемонстровано, що його введення підвищує стабільність композицій на основі антитіл ® n-CoDeR ; до однієї композиції як допоміжні речовини були включені аргінін і глутамінова кислота, на основі даних, викладених Golovanov et al (2004) J. Am. Chem. Soc, 126: 8933-8939; до однієї тестової композиції був включений манітол, оскільки було продемонстровано, що він підвищує стабільність композицій на основі антитіл; а гістидин був протестований, оскільки є, як правило, придатним біологічним буфером з відповідним буферним діапазоном. Аналітичні методи Наступні методи були використані для оцінки стабільності антитіла 2D03 в різних композиціях. Кожен аналіз (вимірювання концентрації, зовнішній вигляд, чистота, активність зв'язування з антигеном, осмолярність і якісний аналіз) проводили з кожною з композицій I-VI після 0, 4, 8, 14 і 18 тижнів зберігання за температур 5 °C і 24 °C. Очищення гель-фільтрацією Чистоту антитіла якісно визначали за допомогою ВЕРХ на колонці "TSKgel 3000SWXL" фірми TOSOH Bioscience. Дана колонка для гель-фільтрації відокремлює молекули відповідно до їх молекулярної маси і має найбільш ефективну роздільну здатність в діапазоні 10-500 кДа. Мобільну фазу 5 мМ фосфату калію, що містить 0,4 М хлорид натрію, pH 7,2, використовували при швидкості потоку 1 мл/хв. УФ-детекцію проводили при 280 нм, а площу мономірного піку розраховували, як відсоток від загальної площі піків. Інтеграцію автоматизували після ручного налаштування параметрів. Вимірювання концентрації білка за A280 Визначення вмісту білка засноване на поглинанні ультрафіолету ароматичними залишками білка при 280 нм. Поглинання при 280 нм прямо пропорційне концентрації білка відповідно до закону Lambert-Beers. Поглинання визначали за допомогою спектрофотометра "Ultrospec110 pro". Зразок розводили в 10 мМ натрій-фосфатному буфері, 0,15 М NaCl, pH 7,4 для того, щоб потрапити в діапазон 0,05-1 одиниць оптичної щільності. Концентрацію білка обчислювали за формулою: A=εbс де A - поглинання ε - коефіцієнт поглинання (в даному випадку 1,62), с - концентрація в міліграм/мл і b - довжина променя світла в кюветі в сантиметрах. Катіонообмінна хроматографія Якісний аналіз антитіла проводили за допомогою катіонообмінної хроматографії, яка розділяє молекули на основі їх відмінностей в загальному заряді білка. Використовували ® катіонообмінну колонку "ProPac weak". Ця колонка спеціально розроблена для забезпечення високої роздільної здатності і високої ефективності розділення білків і глікопротеїнів з pI=3-10, і Mw > 10 000. 10 мМ ацетат натрію, pH 5,0 (мобільна фаза А) і 10 мМ ацетат натрію, 1 М NaCl, pH 5,0 (мобільна фаза B) використовували із швидкістю потоку 1 мл/хв. Застосовували лінійний градієнт 0-75 % мобільної фази B. Детекцію проводили за поглинанням при 280 нм. Світлорозсіювання при 410 нм Для оцінки преципітації, за допомогою спектрофотометра "Ultrospec110 pro" вимірювали світлорозсіювання при 410 нм. Для калібрування використовували деіонізовану воду. ДСН-ПААГ Систему "SDS-PAGE Phast system™» використовували згідно рекомендацій виробника. 9 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Білки (Phastgel Gradient 8-25) детектували після фарбування за Кумассі. Концентрація зразка при завантаженні складала близько 0,5 міліграма/мл, в кожну комірку завантажували по 3-4 мкл. Білковий маркер молекулярної маси "Fermentas PageRuler Prestained Protein Ladder" вносили до першої комірки кожного гелю. Зв'язування з антигеном Планшети для мікротитрування покривали MDA-ApoB100 протягом ночі. Після відмивання, планшети блокували 0,45 % риб'ячим желатином протягом однієї години за кімнатної температури. Стандартні титри 2D03 і тестовані зразки додавали до покритих і заблокованих планшетів для мікротитрування і інкубували за кімнатної температури протягом 2 годин. Після відмивання, додавали кон'югат IG-HRP P214 (rabbit-anti-Human) і інкубували планшети ще годину за кімнатної температури. Зв'язування візуалізували за допомогою субстрату, офенілендиамін дигідрохлориду (OPD), і зупиняли 1 М HCl. Поглинання зчитували ридером "Versamax" за двома довжинами хвиль, 490 нм (тест) і 650 нм (еталон). Дані збиралися програмним забезпеченням "SOFTmax Pro 4.0", на якому проводили підрахунок питомої концентрації антитіла. Зв'язування антигену розраховували як питому концентрацію, отриману даним методом ELISA, розділену на отримане значення аналізу загального білка (визначену за А280). Осмолярність Кількісну осмолярність вимірювали за допомогою осмометра "Micro-Osmometer Typ 13/13 DR". Точки калібрування знаходилися в інтервалі від 0 до 300 мОсм/кг Н 2О. За необхідності, зразок розводили у воді MilliQ для потрапляння в калібрувальний інтервал. Чистота Визначена після тесту на стабільність чистота композицій, складала не менше ніж 95 %. Результати Композиція I Антитіло 2D03 136 міліграм/мл Ацетат натрію 20 мМ NaCl 150 мМ pH 5,5 Результати Стабільність при 5 °C: стабільний через 14 тижнів, втрата стабільності через 18 тижнів. Стабільність при 24 °C: стабільний через 8 тижнів, втрата стабільності через 14 тижнів. Композиція II: Антитіло 2D03 136 міліграм/мл Ацетат натрію 20 мМ NaCl 150 мМ Полісорбат 20 0.1 % (1.1 міліграм/мл) pH 5,5 Результати Стабільність при 5 °C: стабільний через 4 тижнів, втрата стабільності через 8 тижнів. Стабільність при 24 °C: стабільний через 0 тижнів, втрата стабільності через 4 тижні. Композиція III: Антитіло 2D03 136 міліграм/мл Ацетат натрію 20 мМ NаCl 150 мМ Полісорбат 20 0,1 % (1,1 міліграм/мл) Манітол 50 мМ pH 5,5 Результати Стабільність при 5 °C: стабільний через 8 тижнів, втрата стабільності через 14 тижнів. Стабільність при 24 °C: стабільний через 8 тижнів, втрата стабільності через 14 тижнів. Композиція IV: Антитіло 2D03 136 міліграм/мл Ацетат натрію 20 мМ NаCl 150 мМ His-HCl 50 мМ Полісорбат 20 0,1 % (1,1 міліграм/мл) pH 5,5 Результати Стабільність при 5 °C: стабільний через 0 тижнів, втрата стабільності через 4 тижні. 10 UA 100255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Стабільність при 24 °C: стабільний через 0 тижнів, втрата стабільності через 4 тижні. Композиція V: Антитіло 2D03 136 міліграм/мл Ацетат натрію 20 мМ NаCl 150 мМ Аргінін 50 мМ Глутамат 50 мМ Полісорбат 20 0,1 % (1,1 міліграм/мл) pH 5,5 Результати Стабільність при 5 °C: стабільний через 0 тижнів, втрата стабільності через 4 тижні. Стабільність при 24 °C: стабільний через 0 тижнів, втрата стабільності через 4 тижні. Композиція VI: Антитіло 2D03 151 міліграма/мл Ацетат натрію 20 мМ NаCl 150 мМ His-HCl 50 мМ Полісорбат 20 0,1 % (1,1 міліграм/мл) pH 5,5 Результати Стабільність при 5 °C: стабільний через 0 тижнів, втрата стабільності через4 тижні. Стабільність при 24 °C: стабільний через 0 тижнів, втрата стабільності через 4 тижні. Висновок Композиція I була стабільною, щонайменше, протягом 14 тижнів при 5 °C і, щонайменше, протягом 8 тижнів в прискореному дослідженні при 24 °C, і була найбільш стабільною виявленою композицією. Ця композиція була визнана нестабільною протягом 18 тижнів при 5 °C і протягом 14 тижнів при 24 °C із-за присутності осаду, наявність якого була оцінена на око і за світлорозсіюванням при 410 нм. Для кожної з композицій з I по VI, будь-яким з вищеописаних способів в будь-якій композиції з часом не було відмічено яких-небудь відмінностей в чистоті, концентрації, характерних властивостях або активності. Нестабільність всіх композицій визначали за преципітацією, помітною на око і за світлорозсіюванням при 410 нм. Приклад 3: Композиція з концентрованим розчином 2D03 Короткий виклад Антитіло 2D03 в основному об'ємі розчину (37,3 г в об'ємі 1534,6 мл, виходячи з концентрації білка 24,3 міліграм/мл, визначеною за A280) концентрували фільтрацією за допомогою фільтру "Pellicon" (тиск на вході: 1.4-2.1 бар; тиск ретентата: 0-0,7 бар) до кінцевої концентрації 120±20 міліграм/мл за кімнатної температури (фактична концентрація 133 міліграми/мл). Після концентрації продукт фільтрували через стерильний 0,22 мкм фільтр і зберігали за температур від +2 °C до + 8 °C в стерильних пляшках з PETG. У концентрованому розчині антитіла за допомогою описаних нижче відомих процедур контролю якості, оцінювали зовнішній вигляд, концентрацію білка, pH, ендотоксини, чистоту, ізоелектричне фокусування, біологічне навантаження, зв'язування з антигеном. Зовнішній вигляд Проводили візуальний огляд розчину зразка для виявлення частинок, визначення чистоти і кольору. Для виявлення частинок, зразок оглядали фронтально навпроти чорного і білого фону. Для визначення чистоти, 1 мл зразка переносили в скляну пробірку і перевіряли на опалесцентність навпроти чорного фону, порівнюючи з еталонними розчинами, відповідно до Європейської фармакопеї 2.2.1. Зразок вважався чистим, якщо був прозорим як вода, або якщо його опалесценція не було більш вираженою, ніж у контрольної суспензії I. Якщо зразок не відповідав цим критеріям, то рівень опалесценції реєструвався як менший, ніж у першої еталонної суспензії, яка є більш опалесцентною, ніж зразок, наприклад,