Клон клітин, що продукують fsh

Реферат: Винахід належить до молекул нуклеїнових кислот, що містять послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α- і β-ланцюг фолікулостимулюючого гормону людини (FSH), відповідно, які модифіковані відносно використання кодонів в клітинах СНО, рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, що містить такі послідовності нуклеїнових кислот, і клітин-хазяїнів, що містять такі рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, а також їх застосування при одержанні рекомбінантного FSH людини, способу одержання клітин-хазяїнів, що експресують фолікулостимулюючий гормон людини. UA 103598 C2 (12) UA 103598 C2 UA 103598 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується молекул нуклеїнових кислот, що містять послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α- і β-ланцюг фолікулостимулюючого гормону людини (FSH), відповідно, де послідовність нуклеїнової кислоти модифікована відносно використання кодонів в клітинах CHO, в порівнянні з послідовністю нуклеїнової кислоти FSH людини дикого типу. Крім того, даний винахід стосується рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, що містить такі послідовності нуклеїнових кислот, і клітин-хазяїв, що містять такі рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, а також їх застосування при одержанні рекомбінантного FSH людини. На закінчення, даний винахід також стосується способу одержання клітин-хазяїв, що експресують фолікулостимулюючий гормон людини за допомогою трансфікування клітин в суспензійній культурі в умовах відсутності сироватки рекомбінантною молекулою нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом. Фолікулостимулюючий гормон (FSH) продукується гонадотропними клітинами передньої частки гіпофіза і вивільняється в кровоток. FSH діє разом з лютеїнізуючим гормоном (LH) при регуляції дозрівання ооцитів у жінок і сперматогенезу у чоловіків. Як FSH, так і LH належать до сімейства гетеродимерних глікопротеїнів, які складаються з двох нековалентно пов'язаних α- і βланцюгів, які кодуються окремими генами. У той час як послідовності амінокислот α-ланцюга FSH і LH є ідентичними, послідовності амінокислот β-ланцюга у двох білків відрізняються. Як α-, так і β-ланцюги є глікозилованими. α-ланцюг FSH має два потенційних аспарагін-зв'язаних сайта глікозилування в положеннях 52 і 78, в той час як β-ланцюг FSH має два потенційних аспарагінзв'язаних сайта глікозилування в положеннях 7 і 24 (Olijve et al. (1996) Mol. Hum. Reprod. 2(5): 371-382). FSH людини використовують для лікування жінок з відсутністю овуляції, для стимулювання мультифолікулярного розвитку (суперовуляції) і при підготовці до штучного запліднення, такого як IVF (запліднення in vitro), GIFT (перенесення гамети в маточну трубу) або ZIFT (перенесення зіготи в маточну трубу). Крім того, FSH людини використовують для стимулювання дозрівання фолікул у жінок з низьким виробленням FSH або з його відсутністю і для стимулювання сперматогенезу у чоловіків з природженим або набутим гіпогонадотропним гіпогонадизмом. Спочатку, FSH для медичних використань очищали з постменопаузальної сечі людини. Однак цей очищений FSH має той недолік, що він також містить LH і інші забруднюючі білки людського походження. Крім того, використання такого природного джерела накладає обмеження на доступність і однорідність продукту. З розвитком технології рекомбінантних ДНК, стало можливим продукування FSH людини в культурах клітин, трансфікованих послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують α- і βланцюги. Послідовності ДНК, що кодують α- і β-ланцюги, і способи одержання рекомбінантного FSH людини описуються, наприклад, в WO 88/10270, WO 86/04589 і в EP 0 735 139. У цей час, на ринку в Німеччині є два комерційних продукти рекомбінантного FSH людини, а саме GONAL-F® і PUREGON®, обидва з яких одержують за допомогою експресії ДНК дикого типу, що кодують α- і β-ланцюги в клітинах CHO. Однак як і раніше зберігається необхідність в оптимізації експресії ланцюгів FSH для поліпшення виходу і швидкості експресії FSH для даної кількості клітин. Таким чином, в основі даного винаходу лежить проблема створення послідовності нуклеїнової кислоти і рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, за допомогою яких рекомбінантний FSH людини може бути одержаний у великих кількостях в еукаріотичних клітинах. Відповідно до даного винаходу, ця і інші задачі вирішені за допомогою ознак, представлених в незалежному пункті формули винаходу. Переважні варіанти здійснення охарактеризовані в залежних пунктах формули винаходу. Відповідно до даного винаходу, молекули нуклеїнових кислот, що містять модифіковані послідовності нуклеїнових кислот, що кодують α- і β-ланцюги FSH людини, які адаптовані відносно використання кодонів в клітинах яєчників китайських хом'ячків (CHO), використовують для трансфікування клітин CHO і приводять до значного збільшення продукування FSH в трансфікованих клітинах CHO. У контексті даного винаходу, термін "збільшення продукування FSH" стосується ситуації, коли при експресії модифікованої послідовності нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні, в клітиніхазяїні продукується більша кількість FSH в порівнянні з ситуацією, коли немодифікована послідовність нуклеїнової кислоти, кодуюча FSH з такою ж послідовністю амінокислот, експресується в такому ж типі клітин-хазяїв при схожих умовах, таких, наприклад, як порівнянні процедури трансфікування, порівнянні вектори експресії і тому подібне. Генетичний код є надмірним, оскільки 20 амінокислот визначаються за допомогою 61 триплетного кодону. Таким чином, більшість з 20 протеїногенних амінокислот кодуються за 1 UA 103598 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою декількох основних триплетів (кодонів). Однак кодони, які описують конкретну амінокислоту, не використовуються з такою ж частотою в конкретному організмі, але є переважні кодони, які використовуються часто, і рідкі кодони, які використовуються не так часто. Відмінності у використанні кодонів, що згадуються, зв'язуються з пониженням селективного еволюційного тиску, і, зокрема, ефективності трансляції. Одна з причин більш низької ефективності трансляції кодонів, що рідко зустрічаються, могла б полягати в тому, що відповідні пули аміноацил-tРНК збіднені і з цієї причини не є більш доступними для синтезу білка. Крім того, різні організми віддають перевагу різним кодонам. Таким чином, наприклад, експресія рекомбінантних ДНК, що походять з клітин ссавців, в клітинах E.coli часто відбувається тільки субоптимально. З цієї причини, заміна кодонів, що рідко використовуються, на кодони, що часто використовуються, може поліпшити експресію в деяких випадках. Для багатьох організмів, послідовність ДНК великого числа генів є відомою, і є таблиці, з яких може бути одержана частота використання конкретних кодонів у відповідному організмі. За допомогою використання згаданих таблиць послідовності білків можуть бути відносно точно трансльовані зворотно, з утворенням послідовностей ДНК, які містять кодони, переважні у відповідному організмі для різних амінокислот білка. Таблиці для використання кодонів можуть, серед іншого, бути знайдені на наступних інтернеті-адресах: http://www.kazusa.or.jp/кодон/index.html або http://www.entelechon.com/index.php?id=tools/index. Є також програми, доступні для зворотної трансляції послідовності білка, наприклад, послідовності білка α- або β-ланцюга FSH людини, з утворенням виродженої послідовності ДНК, подібні, наприклад, програмам на сайті http://www.entelechon.com/eng/backtranslation.html. Термін "послідовність нуклеїнової кислоти" для цілей даного винаходу стосується будь-якої молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептиди, такі як пептиди, білки, і тому подібне. Ці молекули нуклеїнових кислот можуть бути одержані з ДНК, РНК або їх аналогів. Однак молекули з нуклеїнових кислот, що одержуються з ДНК, є переважними. Фахівець в даній галузі, безсумнівно, знає, що модифікація початкової нуклеотидної послідовності описує процес оптимізації по відношенню до використання кодону. Якщо кодуюча послідовність чужого ферменту дикого типу підбирається, наприклад, для використання кодону клітин CHO, внесені зміни можуть легко ідентифікуватися за допомогою порівняння модифікованої послідовності і початкової послідовності (дивись фігури 1a і 1b). Крім того, обидві послідовності будуть кодувати одну і ту ж послідовність амінокислот. Послідовність амінокислот α-ланцюга FSH людини показана в SEQ ID No. 5 і послідовність амінокислот βланцюга FSH людини показана в SEQ ID No. 6. Ці послідовності амінокислот відповідають послідовності амінокислот α- і β-ланцюгів FSH людини дикого типу, депонованим під номером доступу J 00152 в базі даних EMBL і під номером доступу NM 000510 в базі даних NCBI, відповідно. У випадку α-ланцюга FSH людини початкова послідовність нуклеїнової кислоти показана в SEQ ID No. 3, а у випадку β-ланцюга FSH людини початкова послідовність нуклеїнової кислоти показана в SEQ ID No. 4. Відповідно до даного винаходу, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, модифікується по відношенню до використання кодону в клітинах CHO, щонайменше, в 30 положеннях, переважно, щонайменше, в 40 положеннях, особливо переважно, щонайменше, в 50 положеннях, також особливо переважно, щонайменше, в 60 або 70 положеннях, а найбільш переважно, щонайменше, в 75 положеннях, в порівнянні з початковою послідовністю. Крім того, відповідно до даного винаходу, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує βланцюг FSH людини, модифікують по відношенню до використання кодону в клітинах CHO, щонайменше, в 25 положеннях, переважно, щонайменше, в 30 положеннях, більш переважно, щонайменше, в 40 положеннях, особливо переважно, щонайменше, в 50 положеннях, також особливо переважно, в 60 положеннях, а найбільш переважно, щонайменше, в 65 положеннях, в порівнянні з початковою послідовністю. Найбільш переважно, модифікована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини, являє собою кодуючу область послідовності нуклеїнової кислоти, приведену в SEQ ID No. 1, або послідовність нуклеїнової кислоти, яка ідентична кодуючій області послідовності нуклеїнової кислоти, приведеній в SEQ ID No. 1, щонайменше, на 90 %, переважно, щонайменше, на 92 % або 94 %, особливо переважно, щонайменше, на 96 % або 98 %, а найбільш переважно, щонайменше, на 99 %, по всій кодуючій області. У SEQ ID No. 1, кодуюча область починається з нуклеотиду 56 і тягнеться до нуклеотиду 442. Найбільш переважно, оптимізована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, являє собою кодуючу область послідовності нуклеїнової кислоти, приведену в 2 UA 103598 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID No. 2, або послідовність нуклеїнової кислоти, яка ідентична кодуючій області послідовності нуклеїнової кислоти, приведеній в SEQ ID No. 2, щонайменше, на 85 %, переважно, щонайменше, на 87 % або 90 %, особливо переважно, щонайменше, на 92 % або 94 %, а найбільш переважно, щонайменше, на 96 %, 98 % або 99 %, по всій кодуючій області. У SEQ ID No. 2, кодуюча область починається з нуклеотиду 19 і тягнеться до нуклеотиду 366. Терміни "немодифікована послідовність нуклеїнової кислоти", "послідовність нуклеїнової кислоти дикого типу" або "початкова послідовність нуклеїнової кислоти" для цілей даного винаходу стосуються послідовності нуклеїнової кислоти, яка призначена для використання для (над)експресії в клітині-хазяїні і яка не адаптована відносно використання кодону в клітиніхазяїні, але являє собою дійсну послідовність нуклеїнової кислоти дикого типу, що кодує білок. Терміни "модифікована послідовність нуклеїнової кислоти" або "оптимізована послідовність нуклеїнової кислоти" для цілей даного винаходу стосуються послідовності, яка модифікована для експресії в клітині-хазяїні за допомогою пристосування послідовності немодифікованої/початкової послідовності нуклеїнової кислоти відносно використання кодону клітини-хазяїна. Модифікована або оптимізована послідовність нуклеїнової кислоти кодує білок, що має таку ж послідовність амінокислот, що і білок, що кодується немодифікованою послідовністю. Ідентичність послідовностей визначають за допомогою ряду програм, основаних на різних алгоритмах. У даному винаході, алгоритми Needleman і Wunsch або Smith і Waterman дають особливо надійні результати. Для порівняння послідовностей, використовують програму PileUp (Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evolution 25: 351-360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153), або програми Gap and Best Fit (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453 і Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489), які містяться в пакеті програмного забезпечення GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Значення ідентичності послідовностей, приведені в цьому документі в процентах, визначають з допомогою програми Gap по всій області послідовності з наступними настройками: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10000 і Average Mismatch: 0.000. Якщо не вказано інакше, вказані настройки використовують як стандартні настройки для порівняння послідовностей. Без наміру обмежуватися гіпотезами, передбачається, що кодон-оптимізовані послідовності ДНК дозволяють більш ефективну трансляцію і мРНК, одержані з їх допомогою, можливо, мають більш тривалі періоди напівжиття в клітині і з цієї причини є частіше доступними для трансляції. Фахівці в даній галузі добре знайомі з методиками, які дозволяють перетворювати початкову початкову послідовність нуклеїнової кислоти в модифіковану послідовність нуклеїнової кислоти, кодуючої поліпептиди ідентичних амінокислот, але з різним використанням кодонів. Це може досягатися, наприклад, за допомогою методик мутагенезу на основі ланцюгової полімеразної реакції, за допомогою звичайних відомих процедур клонування, за допомогою хімічного синтезу і тому подібне. Також, метою даного винаходу є рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти, що містить модифіковану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини, де модифіковану послідовність нуклеїнової кислоти вибирають з групи, що складається з кодуючої області нуклеотидної послідовності відповідності до SEQ ID No. 1 і нуклеотидної послідовності, що має ідентичність послідовності, щонайменше, 90 %, з кодуючою областю нуклеотидної послідовності, як показана в SEQ ID No. 1, і де модифікована послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем промотору, який є активним в клітині-хазяїні. Термін "промотор, який є активним в клітині-хазяїні" призначається для позначення того, що промотор в рекомбінантній молекулі нуклеїнової кислоти дозволяє експресувати послідовність нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні, в якій експресія послідовності нуклеїнової кислоти є бажаною. Активність промотору звичайно визначається присутністю факторів транскрипції, які здатні зв'язуватися з промотором і активувати транскрипцію. Промотори, які є придатними для експресії послідовностей нуклеїнових кислот в клітинах ссавців, добре відомі фахівцям в даній галузі і включають вірусні промотори, такі як CMV, SV40, HTLV або головний пізній промотор аденовірусу і інші промотори, такі як промотор EF-1α- або промотор UbC. Термін "клітина-хазяїн" для цілей даного винаходу стосується будь-якої клітини, яка звичайно використовується для експресії, тобто для транскрипції і трансляції послідовностей нуклеїнових кислот для продукування, наприклад, поліпептидів. Зокрема, термін "клітинахазяїн" або "організм" стосується прокаріотів, нижчих еукаріотів, клітин рослин, комах або систем культур клітин ссавців. Переважно, клітина-хазяїн являє собою клітину ссавця, більш 3 UA 103598 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно, клітина-хазяїн являє собою клітину гризуна, ще більш переважно, клітина-хазяїн являє собою клітину гризуна, яка має використання кодону, схоже з клітинами CHO, а найбільш переважно, ця клітина-хазяїн являє собою клітину CHO. Лінія клітин-хазяїв CHO, що використовується для експресії модифікованої послідовності і для продукування рекомбінантного FSH людини, являє собою похідну лінію клітин CHO-K1 і має дефіцит активності дигідрофолатредуктази (dhfr). Лінії клітин одержують з DSMZ (Cat. No. ACC 126) і адаптують для суспензії і умов відсутності сироватки в культурі. Лінія клітин CHO, що містить рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить першу оптимізовану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини, і другу оптимізовану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, була депонована з 28 березня 2007 року в DSMZ, Braunschweig, під номером депозиту DSM ACC2833. Термін "рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти" в значенні, що використовується в даному винаході, призначається для включення в нього всіх видів молекул нуклеїнових кислот, які здатні вводитися в клітину-хазяїна і здійснювати експресію послідовності нуклеїнової кислоти, яка міститься в рекомбінантній молекулі нуклеїнової кислоти. Термін включає, серед іншого, вектори плазмід і вірусні вектори, такі як аденовірусний, лентивірусний і ретровірусний вектор, при цьому, вектори плазмід є переважними. Приклади придатних для використання векторів плазмід, які можуть використовуватися для експресування білків в клітинах ссавців, добре відомі і включають, наприклад, ряд векторів pCI, pSI (Promega), вектори pcDNA®, pCEP4, pREP4, pSHOOTER™, pZeoSV2 (Invitrogen), pBlast, pMono, pSELECT, pVITRO і pVIVO (In Vivogen). Крім промотору і послідовності нуклеїнової кислоти, яка повинна експресуватися, рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти звичайно містить інші функціональні елементи, такі як послідовності поліаденілування, гени прокаріотичної і/або еукаріотичної селекції, які дозволяють ідентифікацію позитивно трансформованих прокаріотичних і/або еукаріотичних клітин, і джерело реплікації. Фахівець в даній галузі знає, які елементи, які він повинен вибирати для конкретної мети, і який вектор плазміди є придатним для експресії конкретної послідовності нуклеїнової кислоти в конкретній клітині-хазяїні. Рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, що містять послідовності нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом, можуть бути одержані за допомогою стандартних способів молекулярної біології, які описані в літературі, наприклад, в Sambrook and Russell (2001) Molecular cloning - а laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, USA. Переважно, рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом містить як модифіковану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини, так і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH. Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, вибирається з оптимізованоїпослідовності нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, який вибирають з групи, що складається з кодуючої області послідовності нуклеїнової кислоти відповідно до SEQ ID No. 2, послідовності нуклеїнової кислоти, що має ідентичність послідовності, щонайменше, 85 %, з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID No. 2, з кодуючою областю немодифікованої послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID No. 3, і з послідовності нуклеїнової кислоти, що має ідентичність послідовності, щонайменше, 70 %, з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID No. 3. Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, може знаходитися під контролем того ж промотору, що і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини, наприклад, за допомогою ділянки внутрішньої посадки рибосоми (IRES), або вона може знаходитися під контролем окремого промотору. Переважно, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, знаходиться під контролем окремого промотору. Більш переважно, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує оптимізований β-ланцюг FSH людини, знаходиться під контролем промотору SV40, а послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує αланцюг FSH людини, знаходиться під контролем промотору CMV. Найбільш переважно, рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом має послідовність нуклеїнової кислоти, показану в SEQ ID No. 7. Крім того, даний винахід стосується клітини-хазяїна, яка містить рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, що містить оптимізовану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує βланцюг FSH людини, і яка додатково містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує αланцюг FSH людини, який вибирають з модифікованої послідовності нуклеїнової кислоти, 4 UA 103598 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вибраної з групи, що складається з кодуючої області нуклеотидної послідовності відповідно до SEQ ID No. 2 і нуклеотидних послідовностей, що мають ідентичність послідовності, щонайменше, 85 %, з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NO. 2, і кодуючою областю немодифікованої послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID No. 3, і послідовностей нуклеїнових кислот, що мають ідентичність послідовності, щонайменше, 70 %, з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID No. 3. Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, може бути присутньою в тій же рекомбінантній молекулі нуклеїнової кислоти, що і оптимізована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини, або вона може вводитися в клітинухазяїна на окремій рекомбінантній молекулі нуклеїнової кислоти. Переважно, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, присутня в тій же рекомбінантній молекулі нуклеїнової кислоти, що і оптимізована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини. Клітина-хазяїн може вибиратися з системи культур клітин ссавців, таких як клітини NIH3T3, клітини CHO, клітини COS, клітини 293, клітини Jurkat, клітини BHK і клітини HeLa. Переважно, клітина-хазяїн являє собою клітину гризуна, більш переважно, клітина-хазяїн являє собою клітину гризуна, яка має використання кодону, схоже з клітиною CHO, а найбільш переважно, ця клітина-хазяїн являє собою клітину CHO. Також, об'єктом даного винаходу є культура клітин, що містить клітини-хазяї, що містять рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить модифіковану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини, і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, де послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг, може вибиратися з групи, що складається з немодифікованої послідовності нуклеїнової кислоти і модифікованої послідовності нуклеїнової кислоти, як визначено вище, у відповідному культурному середовищі. Культуру клітин одержують за допомогою культивування клітин-хазяїв у відповідному культурному середовищі в умовах, які підтримують ріст клітин-хазяїв. Термін "культивування клітин" повинен розумітися як такий, що означає, що клітини підтримуються in vivo при умовах, які роблять можливими проліферацію, нормальний метаболізм клітин і утворення рекомбінантного білка. Це означає, що клітини забезпечуються всіма необхідними поживними речовинами, а також киснем, і підтримуються при відповідному pH і при відповідній осмолярності. Клітини можуть культивуватися будь-яким придатним для цього чином. Переважно, клітини культивують як суспензійні культури, наприклад, в колбах або в колбах, що обертаються. Термін "культивування" включає періодичне культивування, культивування з підпиткою, а також перфузійні культури і інші відповідні способи культивування. "Культивування в суспензії" означає, що клітини не прилипають до поверхні, а розподіляються в культурному середовищі. "Періодичне культивування", як використовується в даному винаході, являє собою спосіб культивування, при якому культурне середовище не додається і не видаляється під час культивування. "Спосіб з підпиткою", як використовується в даному винаході, являє собою спосіб культивування, при якому культурне середовище додають під час культивування, але культурне середовище не видаляється. "Перфузійне культивування" в рамках даного винаходу являє собою спосіб культивування, при якому середовище культивування видаляється і нове культурне середовище додають під час культивування. Культурне середовище переважно має тільки низький вміст сироватки, наприклад, максимальний вміст (об'єм/об'єм) сироватки 1 %; найбільш переважно, середовище не містить сироватки. Приклади відповідних культурних середовищ являють собою мінімальні середовища, такі як RPMI 1640, DMEM, F12, ProCHO5 або eRDF, які можуть змішуватися одне з одним і з добавками, відповідно до потреб клітин. У доповнення до глюкози і амінокислот, середовище може містити хелатори, такі як ауринтрикарбонова кислота (ATA), неорганічні солі, такі як фосфатні солі, поліаміни і їх попередники, такі як путресцин, гормони, такі як інсулін, антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, і суміші вітамінів, попередники ліпідів, такі як етаноламін, і захищаючі клітини речовини, такі як Pluronic F68. Фахівці в даній галузі знають, яке культурне середовище використовують для культивування конкретного типу клітин. Переважно, культурне середовище являє собою ProCHO5. 5 UA 103598 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також, об'єктом даного винаходу є спосіб, в якому клітини-хазяї відповідно до даного винаходу спочатку культивують у відповідному культурному середовищі протягом певного періоду часу, а потім супернатант культури клітин збирають. "Супернатант культури клітин" являє собою культуральне середовище для клітин, яка знаходиться в контакті з клітинами протягом певного періоду часу і яке потім відділяють від клітин. Супернатант культури клітин містить рекомбінантний білок, що продукується клітинами. Клітини можуть відділятися від супернатанта за допомогою звичайних методик розділення, таких як фільтрування і центрифугування. У довготривалих культурах, супернатант клітинхазяїв відповідно до даного винаходу містить концентрації FSH, щонайменше, 500 нг/мл, переважно, щонайменше, 1000 нг/мл, більш переважно, щонайменше, 1500 нг/мл, і найбільш переважно, щонайменше, 2000 нг/мл. Рекомбінантний FSH людини може бути очищений від супернатанта культур клітин за допомогою однією або декількох стадій очищення. Відповідні способи очищення відомі фахівцям в даній галузі і включають іонообмінну хроматографію, хроматографію гідрофобних взаємодій, хроматографію на гідроксіапатиті, афінну хроматографію і гельпроникну хроматографію. Способи очищення рекомбінантного FSH людини описані, наприклад, в WO 00/63248, WO 2006/051070 і WO 2005/063811. Для введення як лікарський засіб, очищений рекомбінантний FSH людини змішують з одним або декількома наповнювачами, з одержанням композиції, яку можна вводити пацієнтам. Відповідні композиції для рекомбінантного FSH людини описуються, серед іншого, в EP 0 853 945, EP 1 285 665, EP 0 974 359, EP 1 188 444 і EP 1 169 349. Клітину-хазяїна згідно з даним винаходом одержують за допомогою трансфікування клітини рекомбінантною молекулою нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом, яка містить або тільки модифіковану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини, або також послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини. Альтернативно, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг, і нуклеотидна послідовність, що кодує αланцюг, можуть бути присутніми на окремих рекомбінантних молекулах нуклеїнових кислот, які вводять в клітину-хазяїна або одночасно, або послідовно. Відповідні способи трансфікування відомі фахівцям в даній галузі і включають в себе, наприклад, осадження з фосфатом кальцію, трансфікування, що опосередковується DEAEдекстраном, електропорацію і ліпофекцію. Можуть також використовуватися комерційно доступні набори для трансфікування, такі як SuperFect, PolyFect, Effectene (Qiagen), TransFast™, ProFection®, Transfectam® (Promega) і TransPass™ (NEB). Переважно, клітини трансфікують в той час, коли вони знаходяться в суспензії, і вони трансфікуються в умовах відсутності сироватки. Для одержання рекомбінантного FSH людини в промисловому масштабі, клітини звичайно стабільно трансфікують, що означає, що успішно трансформовані клітини відбирають після трансфікування за допомогою агента селекції, який знищує нетрансфіковані клітини, в той час як трансфіковані клітини, що містять ген стійкості, продовжують рости. Відповідні реагенти включають антибіотики, такі як зеоцин, неоміцин і пуроміцин, і інші лікарські засоби, такі як метотрексат. Даний винахід ілюструється за допомогою наведених далі прикладів, які не повинні розумітися як такі, що обмежують. Приклади 1. Клонування рекомбінантної молекули з нуклеїнової кислоти, що містить оптимізовані послідовності нуклеїнових кислот, що кодують α- і β-ланцюг FSH людини Використовують основний ланцюг вектора pUC18, який вже містить сайт поліаденілування SV40 і сайт сплайсування, і касету гена dhfr, що складається з промотору RSV, гена дигідрофоліатредуктази миші і сайта поліаденілування і сплайсування SV40. Ген дигідрофоліатредуктази робить можливим селекцію трансфікованих клітин і ампліфікацію трансфікованого гена за допомогою лікарського засобу метотрексата. Немодифіковані послідовності α- і β-ланцюгів FSH людини одержують з Fiddes and Goodman (1979) Nature 281: 351-356, і Jameson et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2(9): 806-815, відповідно. Ці послідовності оптимізують, при цьому кодуючі області адаптують для використання кодону в генах CHO, що часто використовуються. Крім того, вводять додатковий стоп-кодон для забезпечення ефективного завершення трансляції. Оптимізовані нуклеотидні послідовності для α- і β-ланцюги показані в SEQ ID No. 1 і 2, відповідно, і порівняння послідовності дикого типу і модифікованої послідовності нуклеїнової кислоти показане на фіг. 1a і 1b. Порівняння послідовностей показує, що модифікована і немодифікована послідовності нуклеїнових кислот, що кодують α-ланцюг FSH людини, ідентичні 6 UA 103598 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на 80 %, в той час як модифікована і немодифікована послідовності нуклеїнових кислот, що кодує β-ланцюг FSH людини, ідентичні на 85 %. Модифіковані послідовності інсертують окремо в дві копії основного ланцюга pUC18 за допомогою розрізання їх за допомогою ферментів рестрикції SacII і NcoI і подальшого лігування. Промотор CMV і промотор SV40 ампліфікують з відповідного шаблона ДНК за допомогою наступних праймерів, одночасно вводячи сайт рестрикції AscI і PacI (підкреслений в наступних праймерах): Праймер Asc-CMV-F 5' - GGC GCG CCT TTT GCT CAC ATG GCT CG-3' (SEQ ID No. 8) Праймер Pac-CMV-R 5' - CCT TAA TTA AGA GCT GTA ATT GAA CTG GGA GTG-3' (SEQ ID No. 9) Праймер Asc-SV40-F 5' - GGC GCG CCG CAT ACG CGG ATC TG-3' (SEQ ID No. 10) Праймер Pac-SV40-R 5' - CCT TAA TTA AGT TCG AGA CTG TTG TGT CAG AAG A-3' (SEQ ID No. 11) Промотор CMV вводять в плазміду, що містить α-ланцюг FSH людини, за допомогою розрізання плазміди за допомогою ферментів рестрикції AscI і PacI і лігування, і промотор SV40 вводять в плазміду, що містить β-ланцюг FSH людини, за допомогою розрізання плазміди за допомогою ферментів рестрикції AscI і PacI і лігування. Нарешті, касету експресії для β-ланцюга FSH людини, що містить промотор SV40, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг, і сигнал поліаденілування SV40, ампліфікують за допомогою наступних праймерів, одночасно вводячи сайт рестрикції Notl, як на 5', так і на 3' кінці ампліфіката (підкреслено в наступних праймерах): Праймер beta-NotI-F 5' - GCG GCC GCA TAC GCG GAT CTG C-3' (SEQ ID No. 12) Праймер beta-NotI-R 5' - GCG GCC GCT CAC TCA TTA GGC ACC CCA GG-3' (SEQ ID No. 13) Потім ампліфікат вставляють в розрізану з допомогою NotI плазміду, що містить α-ланцюг FSH людини. Одержана плазміда, що містить як оптимізовану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг, так і оптимізовану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує βланцюг, показана на фіг. 2. Послідовність плазміди з обома оптимізованими послідовностями нуклеїнових кислот показана в SEQ ID No. 7. 2. Транзієнтна трансфекція клітин CHO рекомбінантними молекулами нуклеїнових кислот, що містять різні поєднання α- і β-ланцюгів FSH людини Плазміди, що містять або оптимізовану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує αланцюг, або оптимізовану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг, в поєднанні з відповідним β-ланцюгом або α-ланцюгом дикого типу, або містять обидві оптимізовані послідовності, одержують, як описано в 1), вище. ДНК змішують із середовищем ProCHO5 (Lonza), що містить 8 мМ глютаміну без HT (5-гідрокситритаміну), до одержання загального об'єму 200 мкл. Потім 20 мкл реагенту SuperFect (Qiagen) додають до розчину ДНК і перемішують. Потім цю суміш інкубують протягом 5-10 хвилин при кімнатній температурі. Аліквоти, що містять 1,68106 клітин CHO, центрифугують (5 хв., 800 об./хв., 18-25 °C), супернатант видаляють і клітини повторно суспендують в 1,1 мл культурного середовища ProCHO5, що містить 8 мМ глютаміну без HT. Потім суспензію переносять в суміш ДНК, потім суміш ДНК інкубують протягом 5-10 хвилин, перемішують і переносять в ямки 6-ямкового планшета. Клітини інкубують протягом 3 годин при 37 °C, це інкубування приводить до прилипання клітин. Супернатант видаляють, клітини промивають три рази 1 мл PBS, а потім додають свіже культурне середовище (2 мл ProCHO5, що містить 8 мМ глютаміну без HT). Після 2 днів інкубування при 37 °C, супернатант видаляють і центрифугують. Супернатант концентрують (коефіцієнт концентрування 16,67) і концентрацію FSH визначають за допомогою пристрою для прочитання ELISA (Anogcn). Результати цього вимірювання показані на фіг. 3. Результати показують, що введення модифікованого α-ланцюга в поєднанні з β-ланцюгом дикого типу приводить до зменшення експресії майже на 50 % в порівнянні з поєднанням двох ланцюгів дикого типу. У протилежність цьому, введення модифікованого β-ланцюга, в поєднанні з α-ланцюгом, як дикого типу, так і модифікованого, приводить до транзієнтної експресії FSH, яка посилюється з коефіцієнтом 1,5-3 в порівнянні з поєднанням α-ланцюга дикого типу і βланцюга дикого типу. З цієї причини, зокрема, використання модифікованого β-ланцюга приводить до значного посилення експресії FSH після транзієнтного трансфікування, в той час як модифікований α-ланцюг не впливає позитивно на продукування FSH. Короткий опис креслень 7 UA 103598 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг.1: Порівняння немодифікованих і модифікованих послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують α-ланцюг і β-ланцюг FSH людини a) Порівняння послідовностей модифікованої і немодифікованої послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини pXM17ss#6: частина плазміди, що містить модифіковану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини (SEQ ID No. 2) wt α FSH: немодифікована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини (SEQ ID No. 3) Ініціюючий кодон і стоп-кодони показані виділеними буквами. b) Порівняння послідовностей для модифікованої і немодифікованої послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини Query: немодифікована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини (SEQ ID No. 4) Subject: модифікована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини (SEQ ID No. 1) Ініціюючі кодони і стоп-кодони показані виділеними буквами. Фіг. 2: Карта рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, що містить як модифіковану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг FSH людини, так і модифіковану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг FSH людини. Фіг. 3: Аналіз експресії різних поєднань α- і β-ланцюгів після транзієнтної експресії в клітинах CHO. Показана відносна експресія FSH по відношенню до клітин, що експресують поєднання α- і β-ланцюгів дикого типу. w/w: немодифікований α- і β-ланцюг, s/w: модифікована α-ланцюг і немодифікований β-ланцюг, w/s: модифікована β-ланцюг і немодифікований α-ланцюг, s/s: модифікований α- і β-ланцюг. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Молекула нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує βланцюг фолікулостимулюючого гормону людини (FSH), яка вибрана з групи, що складається з кодуючої області послідовності нуклеїнової кислоти відповідно до SEQ ID NO:1 і послідовностей нуклеїнових кислот, що мають ідентичність послідовності, щонайменше 98 %, з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NO:1. 2. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти, що містить першу послідовність нуклеїнової кислоти за п. 1 під контролем промотору, який є активним в клітині-хазяїні. 3. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 2, що додатково містить другу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг фолікулостимулюючого гормону людини (FSH), яка вибрана з групи, що складається з кодуючої області послідовності нуклеїнової кислоти відповідно до SEQ ID NO:2 і послідовностей нуклеїнових кислот, що мають ідентичність послідовності, щонайменше 85 %, з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NO:2. 4. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 2, що додатково містить другу послідовність нуклеїнової кислоти, яка вибрана з групи, що складається з кодуючої області послідовності нуклеїнової кислоти відповідно до SEQ ID NО:3 і послідовностей нуклеїнових кислот, що мають ідентичність послідовності, щонайменше 70 %, з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NО:3. 5. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 3 або 4, в якій друга послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем окремого промотору. 6. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 2-5, в якій перша послідовність нуклеїнової кислоти і/або друга послідовність нуклеїнової кислоти знаходяться під контролем вірусного промотору. 7. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 6, в якій перша послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем промотору SV40. 8. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 7, в якій друга послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем промотору CMV. 9. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 2-8, що має послідовність нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NО:7. 10. Клітина-хазяїн, яка містить рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 3-9. 8 UA 103598 C2 5 10 15 20 25 30 35 11. Клітина-хазяїн за п. 10, що являє собою клітину ссавця. 12. Клітина-хазяїн за п. 10 або 11, що являє собою клітину яєчника китайського хом'ячка (СНО). 13. Клітина-хазяїн за будь-яким з пп. 10-12, що має номер депозиту DSM АСС2833. 14. Клітина-хазяїн, що містить першу рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти за п. 2 і другу рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг фолікулостимулюючого гормону людини (FSH), яка вибрана з групи, що складається з (а) кодуючої області послідовності нуклеїнової кислоти відповідно до SEQ ID NO:2, (b) послідовностей нуклеїнових кислот, що мають ідентичність послідовності, щонайменше 85 %, з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NO:2, (с) кодуючої області послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NO:3; і (d) послідовностей нуклеїнових кислот, що мають ідентичність послідовності, щонайменше 70 %, з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NO:3. 15. Культура клітин, що містить клітину-хазяїна за будь-яким з пп. 10-14 у прийнятному культурному середовищі. 16. Спосіб одержання клітини-хазяїна за будь-яким з пп. 10-13, що включає трансфікування клітин в суспензійній культурі в умовах відсутності сироватки рекомбінантною молекулою нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 3-9. 17. Спосіб за п. 16, що додатково включає стадію очищення рекомбінантного FSH людини від супернатанта культури клітин. 18. Спосіб одержання клітини-хазяїна за будь-яким з пп. 10-13, що включає трансфікування клітин в суспензійній культурі в умовах відсутності сироватки рекомбінантною молекулою нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 3-9. 19. Спосіб одержання клітини-хазяїна за п. 14, що включає трансфікування клітин в суспензійній культурі в умовах відсутності сироватки першою рекомбінантною молекулою нуклеїнової кислоти за п. 2 і другою рекомбінантною молекулою нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг фолікулостимулюючого гормону людини (FSH), яка вибрана з групи, що складається з (a) кодуючої області послідовності нуклеїнової кислоти відповідно до SEQ ID NO:2; (b) послідовностей нуклеїнових кислот, що мають ідентичність послідовності, щонайменше 85 %, з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NO:2; (c) послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NO:3; і (d) послідовностей нуклеїнових кислот, що мають ідентичність послідовності, щонайменше 70 % з кодуючою областю послідовності нуклеїнової кислоти, як показано в SEQ ID NO:3. 20. Застосування послідовності нуклеїнової кислоти відповідно до SEQ ID NO:1 або послідовності нуклеїнової кислоти відповідно до SEQ ID NO:1 і 2 для одержання рекомбінантного FSH людини. 9 UA 103598 C2 10 UA 103598 C2 11 UA 103598 C2 12 UA 103598 C2 13 UA 103598 C2 14 UA 103598 C2 15 UA 103598 C2 16 UA 103598 C2 17 UA 103598 C2 18 UA 103598 C2 19 UA 103598 C2 20 UA 103598 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 21