Пептидна фармацевтична композиція, засіб на її основі для лікування гастродуоденальних захворювань, які викликаються helicobacter pylori, і спосіб його використання

Реферат: Винахід належить до фармацевтичної композиції, яка має специфічну активність, що виражається в інгібуючій дії на мітохондріальні механізми апоптозу в епітеліоцитах шлунка, що індукується Helicobacter pylori, де фармацевтична композиція як діючу речовину містить ефективну відносно Helicobacter pylori кількість пептиду формули H-Glu-Asp-Gly-OH і фармацевтично прийнятний носій, та застосування зазначеної композиції для лікування гастродуоденальних захворювань, що викликаються Helicobacter pylori. UA 104981 C2 (12) UA 104981 C2 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід стосується лікарських засобів для лікування гастродуоденальних захворювань, які викликаються Helicobacter pylori, зокрема, сполук, призначених для застосування в фармацевтичній промисловості, і стосується засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить як діючу речовину пептид, який має специфічну активність, яка може бути використана в медицині для лікування гастродуоденальних захворювань, що викликаються Helicobacter pylori. У винаході використовується наступна, прийнята в цій галузі термінологія, а також скорочення. Helicobacter pylori - коротка (2,5-0,4×0,5 мкм) грамнегативна бактерія, яка є важливим патогенним мікроорганізмом, що викликає у людини, гастродуоденальні захворювання. Колонізація цією бактерією епітеліальної тканини шлунка веде до розвитку запалення і до прогресуючого хронічного гастриту зі значно збільшеним ризиком формування пептичної виразки шлунка. На основі проведеного епідеміологічного дослідження Helicobacter pylori була віднесена Всесвітньою організацією охорони здоров'я (ВОЗ) до категорії 1 (явної) людських канцерогенів. Пов'язаними з інфекцією Helicobacter pylori гастродуоденальними захворюваннями є: гастрит, пептична виразка, виразкова хвороба шлунка і дванадцятипалої кишки, атрофія шлунка, кишкова метаплазія, невиразкова диспепсія, MALT лімфома. Мітохондріальний механізм апоптозу ініціюється, головним чином, різними ушкоджуючими впливами, які спричиняють збільшення проникності мітохондріальної мембрани і вихід в цитоплазму ряду мітохондріальних білків, зокрема цитохрому С, який зв'язується з білком APAF-1 і стимулює утворення його олігомерів. Це, в свою чергу, спричиняє рекрутування на комплекс молекул прокаспази-9, який утворився, їх агрегацію, аутопроцесування і формування активного комплексу каспази-9. На наступному етапі відбувається рекрутування на цей комплекс молекул прокаспази-3 і їх процесування до активних форм, які розщеплюють ключові мішені, і викликають апоптоз. Апоптоз-запрограмована або індукована форма загибелі клітини, що виявляється в зменшенні її розміру, конденсації і фрагментації хроматину, ущільнення зовнішньої і цитоплазматичної мембран без виходу вмісту клітини в навколишнє середовище. Апоптоз є загальнобіологічним механізмом, відповідальним за підтримку постійності чисельності клітинних популяцій, а також формоутворення і вибраковування дефектних клітин. Порушення регуляції апоптозу приводить до виникнення різних захворювань, пов'язаних з посиленням або, навпаки, інгібуванням апоптозу. Під антиапоптотичним ефектом мається на увазі ефект, що запобігає індукованій загибелі клітин, що приводить до нормалізації регуляції апоптозу. Необхідно зазначити, що інфікованість населення Helicobacter pylori в різних країнах варіюється від 50 до 90 %. Причому у більшості людей відмічається безсимптомне носійство, тоді як у 10 % випадків хелікобактерна інфекція приводить до розвитку виразкового ефекту. Експериментально доведено, що Helicobacter pylori здатний посилювати апоптоз не тільки клітин ендотелію, але також макрофагів і Т-лімфоцитів, що приводить до елімінації антигенспецифічних клітин, знижує ефективність механізмів імунного захисту і сприяє персистенції інфекції [А.А. Останін і співавт., Характеристика апоптозу і функціональної активності лімфоцитів у хворих виразковою хворобою. Бюлетень СВ РАМН, №1 (111), 2004]. У лікуванні мікробактеріальних інфекцій для ерадикації бактерій роду Н. pylori широко застосовують антибіотик кларитроміцин [Cellini L., Marzio L. Rifabutin based triple therapy for eradication of Н. pylori primary and secondary resistant to tinidazole and clarithromycin. - Dig Liver Dis. 2005 Jan; 37(1):33-8]. Препарат Клацид (кларитроміцин, кларитросин) є синтетичним антибіотиком, що застосовується для ерадикації хелікобактерної інфекції [Довідник Відаль. Лікарські препарати в Росії. Довідник. - М.: АстраФармСервич, 2010 р. - С. 657-660]. Однак потрібно відмітити, що застосування препарату Клацид має і негативні властивості: з боку травної системи: блювання, стоматит, біль в епігастрії, глосит, нудота, зміна смаку, знебарвлення язика, грибкове ураження слизової порожнини рота, псевдомембранозний коліт, діарея; з боку нервової системи: запаморочення, сплутаність свідомості, головний біль, відчуття тривоги, тривожні сновидіння, безсоння, шум у вухах, галюцинації, дезорієнтація, деперсоналізація і психози, втрата слуху; з боку серцево-судинної системи: подовження інтервалу QT, мерехтіння або тріпотіння шлуночків, тахікардія. Лабораторні показники: гіпоглікемія, скороминуще підвищення активності печінкових трансаміназ, тромбоцитопенія і лейкопенія. Алергійні реакції: висип на шкірі, кропивниця, в одиничних випадках - синдром Стівенса-Джонсона і анафілактичний шок. При цьому крім традиційно застосовуваних лікарських засобів відомі також сполуки, в тому числі пептидні сполуки, придатні для боротьби з бактеріями Helicobacter pylori. 1 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відомі сполуки (бензімідазольні і імід-зопіридинові похідні), придатні для боротьби з бактеріями Helicobacter pylori, описані в міжнародних заявках WO 94/13290, WO 94/19346, WO 95/01351, WO 95/15324, WO 96/00224, WO 95/34554, WO 95/34553, WO 96/02534. Відомий рекомбінантний поліпептид, який являє собою поверхнево-проявлюваний антиген Helicobacter pylori з приблизною молекулярною масою 29 кДа, і фрагменти нуклеїнових кислот, що кодують вказаний антиген [патент РФ № 2195463]. Рекомбінантний поліпептид, описаний в патенті РФ № 2195463, може бути використаний для діагностики інфекцій Helicobacter pylori, а також для виготовлення вакцинних композицій, які здатні елісувати захисну імунну відповідь проти вказаної інфекції. Рекомбінантні поліпептиди корисні не тільки для діагностики інфекцій, що викликаються Helicobacter pylori, але і для профілактичного застосування, які будуть викликати (елісувати) захисну імунну відповідь проти таких інфекцій. Відоме застосування пептиду формули (I): ((X)l(Y)m)n, де пептид містить від 3 до 200 амінокислот і де 1, m і n являють собою цілі числа від 0 до 10; Х і Y, які можуть бути однаковими або різними, являють собою катіонні амінокислоти, вибрані з аргініну і лізину, у виготовленні лікарських засобів для лікування мікробної інфекції [патент РФ № 2396273]. У переважному аспекті у винаході, описаному в патенті РФ № 2396273, запропоноване застосування пептиду у виготовленні лікарського засобу для лікування мікробної інфекції. При цьому під "мікробною інфекцією" мають на увазі інфекцію, викликану бактерійним патогеном, який може відбуватися від видів бактерій, включаючи Helicobacter spp., наприклад Helicobacter pylori. Відоме застосування (S)-(+)-2-[4-(2-фторбензилокси)-бензиламіно]пропанаміду як протизапального агенту, а також фармацевтична композиція, яка має протизапальну активність, що включає фармацевтично прийнятну допоміжну речовину і як активний агент (S)-(+)-2-[4-(2фторбензилокси)бензиламіно]пропанамід в кількості, ефективній для зменшення або запобігання запаленню [патент РФ № 2396251]. Запальні стани у ссавців, включаючи людей, які можуть бути вилікувані введенням однієї або більше α-аміноамідних сполук формули, включають захворювання шлунково-кишкового тракту, в тому числі виразки, гінгівіті, хворобу Крони, атрофічний гастрит, gastritis varialoforme, виразковий коліт, глютенову хворобу, місцевий ілеїт, пептичні виразки, печію і інші пошкодження ШК тракту, наприклад, Helicobacter pylori. Відомий поліпептид, гомологічний поліпептиду, який експресується Eurotinium amstelodami, що має протимікробну активність, і може бути використаний для застосування як лікувальний або профілактичний засіб людині [патент РФ №2393224]. Протимікробні поліпептиди, описані в патенті РФ №2393224, придатні також для складів для знищення мікробів in vitro, зокрема, коли небажано застосовувати множину загальноприйнятих антибіотиків. Наприклад, протимікробні поліпептиди згідно з винаходом можна додавати в харчові препарати для тварин і/або людини; або їх можна включати як добавки в культури клітин in vitro для запобігання надмірному зростанню мікробів в культурі тканини. При цьому чутливість конкретного мікроба до знищення за допомогою протимікробних поліпептидів згідно з винаходом можна визначати за допомогою аналізу in vitro. Мікроби, які представляють інтерес, включають в тому числі Helicobacter sp., наприклад, Helicobacter pylori. Відоме застосування аліламінових похідних, таких як тербінафін, у виготовленні лікарського засобу інфекції Helicobacter pylori або асоційованих захворювань [патент РФ №2193402]. Відоме застосування похідних хінолон- і нафтиридонкарбонової кислот, які заміщені в 7положенні радикалом 2-окса-5,8-діазабіцикло-[4,3,0]-нон-8-іл, а також їх солей для лікування Helicobacter pylori-інфекцій і пов'язаних з ними гастродуоденальних захворювань [патент ЕА №2477]. До недоліків відомих засобів і композицій можна віднести їх неспецифічну дію. З рівня техніки відомий пептид глутаміл-аспартил-гліцин загальної формули: Н-Glu-Asp-GlyOH [Реєстраційний номер RN-75007-24-8 згідно STN int. BD Registry Chemical abstract]. Відомо також, що пептид H-Glu-Asp-Gly-OH має стресопротекторну дію [патент RU № 2304444, 2006]. Крім того, відомо, що пептид H-Glu-Asp-Gly-OH має протипухлинну дію [патент RU № 2362579, 2009]. У процесі подальшого експериментального вивчення пептиду глутаміл-аспартил-гліцин загальної формули: H-Glu-Asp-Gly-OH була виявлена його раніше невідома властивість, яка виявляється в наданні специфічної активності, що виражається в інгібуючій дії на мітохондріальні механізми апоптозу в епітеліоцитах шлунка, що індукується Helicobacter pylori. Враховуючи поширеність (за оцінками ВОЗ, носіями Helicobacter pylori є приблизно 50 % населення Землі) пов'язаних з інфекцією Helicobacter pylori гастродуоденальних захворювань, розробка нових груп препаратів, в тому числі біологічно активних сполук, які мають при цьому специфічну активність, є актуальною. 2 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даним винаходом поставлена, і вирішена задача отримання фармацевтичної композиції, яка має специфічну активність, засобу на її основі і способу його використання шляхом інгібування мітохондріальних механізмів апоптозу, що індукується Helicobacter pylori. Технічний результат винаходу полягає у вияві пептидом глутаміл-аспартил-гліцин формули: H-Glu-Asp-Gly-OH специфічної активності, що виражається в інгібуючій дії на мітохондріальні механізми апоптозу в епітеліоцитах шлунка, що індукується Helicobacter pylori при застосуванні його як діючої речовини в фармацевтичній композиції для виготовлення засобу для лікування гастродуоденальних захворювань, що викликаються Helicobacter pylori, введення якого суб'єкту, потребуючому цього, надає протекторну дію на мітохондріальні механізми апоптозу, що індукується Helicobacter pylori, перешкоджає дії мікроба на клітини, шляхом інгібування процесу апоптозу, що індукується Helicobacter pylori. Для рішення поставленої задачі і досягнення вказаного технічного результату запропонована група винаходів, об'єднаних загальним винахідницьким задумом. Одним з аспектів винаходу є фармацевтична композиція, що має специфічну активність, яка виражається в інгібуючій дії на мітохондріальні механізми апоптозу в епітеліоцитах шлунка, що індукується Helicobacter pylori, яка характеризується тим, що як діючу речовину містить ефективну відносно Helicobacter pylori кількість пептиду формули H-Glu-Asp-Gly-OH і фармацевтично прийнятний носій. Згідно з винаходом фармацевтична композиція містить діючу речовину в кількості від 1 мкг/кг до 10 мкг/кг. Згідно з винаходом фармацевтична композиція знаходиться в формі, прийнятній для перорального або парентерального введення. Винахід стосується застосування фармацевтичної композиції для виготовлення засобу для лікування гастродуоденальних захворювань, що викликається Helicobacter pylori. Іншим аспектом винаходу є засіб для лікування гастродуоденальних захворювань, що викликаються Helicobacter pylori, який містить як діючу речовину ефективну відносно Helicobacter pylori кількість пептиду формули H-Glu-Asp-Gly-OH і фармацевтично прийнятний носій. Згідно з винаходом засіб містить діючу речовину в кількості від 1 мкг/кг до 10 мкг/кг. Наступним аспектом винаходу є спосіб лікування гастродуоденальних захворювань, що викликаються Helicobacter pylori шляхом інгібування мітохондріальних механізмів апоптозу в епітеліоцитах шлунка, що індукується Helicobacter pylori, що полягає в тому, що суб'єкту, який потребує цього, вводять ефективну відносно Helicobacter pylori кількість пептиду формули HGlu-Asp-Gly-OH в дозі від 1 мкг до 10 мкг на 1 кг масу тіла перорально щодня 3 рази на день протягом 10-20 днів або парентерально однократно щодня протягом 10 днів. Згідно з винаходом введення здійснюють перорально або парентерально. Пептид глутаміл-аспартил-гліцин формули: H-Glu-Asp-Gly-OH отримують класичним методом пептидного синтезу в розчині. Можливість об'єктивного вияву технічного результату при використанні винаходу підтверджена достовірними даними, що містять відомості експериментального характеру, отриманими по методиках, прийнятих в даній галузі. Вивчення біологічної активності проводили на тваринах в експериментальній моделі виразкової хвороби шлунка, асоційованій з Helicobacter pylori. Під поняттям "фармацевтична композиція" мають на увазі різні лікарські форми, що містять пептид, який має специфічну активність, що виражається в дії на мітохондріальні механізми апоптозу, що індукується Helicobacter pylori, які можуть знайти лікувальне застосування як засіб для профілактики і терапії інфекції, що викликається Helicobacter pylori, і пов'язаних з нею гастродуоденальних захворювань. Поняття "ефективна відносно Helicobacter pylori кількість пептиду" має на увазі використання такої кількості діючої речовини, яка визначена в умовах експерименту in vivo і яка відповідно до її кількісних показників активності і токсичності, а також на основі знань фахівця повинна бути ефективною в даній лікарській формі. Фармацевтично прийнятні носії вибирають з групи включених в Державну Фармакопею XII видання допоміжних речовин, що використовуються для створення готової лікарської форми у вигляді таблеток або капсул (для перорального застосування) або 0,9 % розчин натрію хлориду (для парентерального введення). Для отримання фармацевтичних композицій, що відповідають винаходу, ефективну кількість пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH як діючу речовину змішують з фармацевтично прийнятним носієм згідно з прийнятими в фармацевтиці способами компаундування. 3 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Суть винаходу пояснюється фігурами. На Фіг. 1 представлена фотографія, культура фібробластів, де а - 1 доба культивування; б 3 доба культивування; в - 5 доба культивування. х600. На Фіг. 2 представлена експресія мітохондріального GPF в фібробластах, де а - контроль; б - дія Helicobacter pylori; в - дія пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH. х1000. На Фіг. 3 представлена експресія мітохондріального GPF в фібробластах, де а - контроль; б - дія Helicobacter pylori; в - дія пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH. x1000. На Фіг. 4 представлені показники експресії мітохондріального GFP в фібробластах при дії Helicobacter рylori і пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH. На Фіг. 5 представлена експресія мітохондріального GPF в епітеліальних клітинах шлунку. а - контроль, б - дія Helicobacter pylori, в - дія пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH. Збільшення х1000. На Фіг. 6 представлені показники оптичної густини експресії mtxGFP в культурах епітеліоцитів шлунка людини (H.Pyl-). На Фіг. 7 представлені показники площі експресії mtxGFP в культурах епітеліоцитів шлунка людини (H.Pyl+). На Фіг. 8 представлені показники площі експресії mtxGFP в культурах епітеліоцитів шлунка людини (H.Pyl-). На Фіг. 9 представлені показники оптичної густини експресії mtxGFP в культурах епітеліоцитів шлунка людини (H.Pyl+) На Фіг. 10 представлена експресія протеїнів в тканині з краю виразки. Дослідження in vivo. Вестерн-блотинг. Рівень експресії виражений в % по відношенню до контрольних значень, прийнятих за 100 %. На Фіг. 11 представлена експресія мРНК протеїнів в слизовій оболонці з краю виразки шлунка. Дослідження in vivo. ПЛР-РЧ. Значення експресії представлені в у. о., які відображають насиченість забарвлення гелю. На Фіг. 12 представлений патоморфоз індукованої виразки шлунка. А - 7 доба (виразка без введення пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH); Б - 21 доба (виразка без введення пептиду H-Glu-Asp-GlyOH); В- 21 доба (повна епітелізація виразки після введення пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH в дозі 2,5 мкг/кг). На Фіг. 13 представлена експресія мітохондріального GFP в епітелії шлунка на 7-у добу після індукції виразки. На Фіг. 14 представлена експресія мітохондріального GFP в епітеліальних клітинах шлунка на 15 добу після індукції виразки. А - інтактні тварини; Б - індукція виразки; В - дія пептиду HGlu-Asp-Gly-OH. х1000. На Фіг. 15 представлена експресія мітохондріального GFP в ізольованих мітохондріях епітеліальних клітин шлунка на 21 добу після індукції виразки. А - інтактні тварини; Б - індукція виразки; В - дія пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH. х1200. На Фіг. 16 представлена експресія мітохондріального GFP в епітелії шлунка на 15-у добу після індукції виразки. На Фіг. 17 представлена експресія мітохондріального GFP в епітелії шлунка на 21-у добу після індукції виразки. Винахід також ілюструється прикладами: синтезу пептиду глутаміл-аспартил-гліцин загальної формули: H-Glu-Asp-Gly-OH (приклад 1), вивчення дії фармацевтичної композиції, яка містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH на молекулярно-клітинні механізми апоптозу (приклад 2), вивчення біологічної активності і ефектів пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH на мітохондріальні механізми апоптозу в епітеліоцитах шлунка, (приклад 3), вивчення біологічної активності і ефектів пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH на мітохондріальні механізми апоптозу в епітеліоцитах шлунка, що індукуються мікробом Helicobacter pylori, in vivo (приклад 4), вивчення токсичності пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH (приклад 5). Приклад 1. Синтез пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH 1. Назва сполуки: глутаміл-аспартил-гліцин. 2. Структурна формула:H-Glu-Asp-Gly-OH 4 UA 104981 C2 CO OH O HN 2 N H N H CO OH O CO OH 5 3. Брутто-формула без протиіону: C11H17N3O8. 4. Молекулярна вага без протиіону: 319,27. 5. Протиіон: ацетат. 6. Зовнішній вигляд: білий аморфний порошок без запаху. 7. Спосіб синтезу: пептид отриманий класичним методом синтезу в розчині по схемі: BOC-Glu(OBzl)OH HOS u DC C BOC-Glu(OBzl)OSu H-Asp(OBzl)OH BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)OH 1)HOBt,DCC 2)H-Gly-OBzl BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-GlyOBzl 1) H2 /Pt 2) TFA 10 15 20 25 30 H-Glu-Asp-GlyOH ВОС – трет-бутилоксикарбонільна група, OSu-N-оксисукцинімідний ефір, DCC-N, N’-дициклогексилкарбодіімід, OBzl - бензиловий ефір, TFA - трифтороцтова кислота, HOBt-N-оксибензотриазол. Характеристики готового препарату: - Вміст основної речовини: 97,93 % (по ВЕРХ, 220 нм), - ТШХ - індивідуальний, Rf=0,45 (ацетонітрил-вода 1:2), - Вміст вологи: 6 %, - рН 0,01 % розчину: 4,9, - Питоме оптичне обертання: [α]D22: -31° (с=1, H2O), "Polamat А", Carl Zeiss Jena. Приклад синтезу: 1) BOC-Glu(OBzl)-OSu, N-оксисукцинімідний ефір N-трет-бутилоксикарбоніл-(γбензил)глутамінової кислоти (I). N-трет-бутилоксикарбоніл-(γ-бензил)глутамінову кислоту BOC-Glu(OBzl)-OH (33,7 г, 0,1 моль) розчиняли в 50 мл N, N’-диметилформаміду, охолоджували до температури -10 °C, додавали при перемішуванні охолоджені (4-6 °C) розчини N, N’-дициклогексилкарбодііміду (23,0 г, 0,11 моль) в 30 мл N, N’-диметилформаміду і N-гідроксисукциніміду (13,0 г, 0,11 моль) в 20 мл N, N’-диметилформаміду. Реакційну суміш перемішували протягом 12 год. при охолоджуванні 5 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 льодом і далі протягом 1 доби при кімнатній температурі. N, N’-дициклогексилсечовину, що випала, відфільтровували і отриманий розчин активованого ефіру використовували без виділення на наступній стадії. 2) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH, N-трет-бутилоксикарбоніл-(γ-бензил)глутаміл-(βбензил)аспартат (II) (β-Бензил) аспарагінову кислоту H-Asp(OBzl)-OH (28,0 г, 0,12 моль) і 36 мл (0,12 моль) триетиламіну суспендували в 50 мл N, N’-диметилформаміду і перемішували протягом 1 год. Потім додали порціями розчин активованого ефіру BOC-Glu(OBzl)-OSu (I), отриманий на попередній стадії. Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 2 діб. Потім підкислювали 0,5 н сірчаною кислотою до рН 2-3 і екстрагували етилацетатом 4×50 мл. Витяжки об'єднували і послідовно промивали 0,5 н H2SO4 3×50 мл, водою 2×50 мл, 5 % розчином NaHCO3 2×50 мл, водою 2×50 мл, насиченим розчином NaCl 2×50 мл. Органічний шар сушили над Na2SO4, упарювали розчинник у вакуумі, залишок кристалізували під гексаном. Отримано 50 г продукту (92 %). Rf=0,34 (бензол-ацетон 2:1). 3) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl (III), бензиловий ефір N-трет-бутилоксикарбоніл-(γбензил)глутаміл-(β-бензил)аспартил-гліцину (III). 2,7 г (5 ммоль) дипептиду і 0,95 г (7 ммоль) оксибензотриазолу розчиняли в тетрагідрофурані (10мл) і охолоджували до температури -10 °C. 1,44 г (7 ммоль) дициклогексилкарбодііміду розчиняли в 5 мл тетрагідрофурану і охолоджували до тієї ж температури. 3,4 г (10 ммоль) тозилату бензилового ефіру гліцину розчиняли в 10 мл тетрагідрофурану, додавали 1,4 мл (10 ммоль) триетиламіну і охолоджували до тієї ж температури. При охолоджуванні на крижаній бані і інтенсивному перемішуванні об'єднували розчини дипептиду з оксибензотриазолом і карбодііміду, через 10 хв. додавали розчин тозилату бензилового ефіру гліцину. Реакційну суміш перемішували протягом 3 год. при охолоджуванні льодом і протягом 1 діб при кімнатній температурі. Дициклогексилсечовину, що випала, відфільтровували, фільтрат упарювали у вакуумі, залишок розчиняли в етилацетаті (100 мл). Розчин промивали послідовно 0,5 н сірчаною кислотою, водою, 5 % розчином бікарбонату натрію, водою, сушили над безводним сульфатом натрію. Етилацетат упарювали у вакуумі, кристалізація залишку в системі етилацетат/гексан. Перекристалізація з ізопропанолу. Отримано після сушіння у вакуумі 2,74 г продукту (85 %). Rf=0,78 (бензол-ацетон 1:1). 4) H-Glu-Asp-Gly-OH (IV), глутаміл-аспартил-гліцин. Захищений трипептид BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl (III) (2,7 г) розчиняли в суміші метиловий спирт - вода (4:1) (50 мл) і гідрували над каталізатором Pd/С (5 %) протягом 4 год. Каталізатор відфільтровували, розчинник упарювали у вакуумі, залишок сушили у вакуумі над KOH і P2O5. Далі продукт розчиняли в 15 мл суміші хлористий метилен-трифтороцтова кислота (5:1) і витримували при кімнатній температурі протягом 2 год. Повноту проходження реакції деблокування контролювали по ТШХ в системі ацетонітрил-вода (1:3). Розчинник упарювали у вакуумі, залишок сушили у вакуумі над КОН. Для очищення 300 мг препарату розчиняли в 4 мл 0,01 % трифтороцтової кислоти, і піддавали високоефективній рідинній хроматографії на колонці із зворотною фазою 50×250 мм Diasorb-130-C16T, 7 мкМ. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Умови хроматографування А: 0,1 % TFA; В: MeCN/0,1 % TFA, градієнт В 0 → 50 % за 100 хв. Об'єм проби 5 мл, детекція при 215 нм, сканування 190-600 нм, швидкість потоку 10 мл/хв. Відбирали фракцію основного піка. Розчинник упарювали у вакуумі при температурі не вище 40 °C, упарювання багаторазово (5 разів) повторювали з 10 мл 10 % розчину оцтової кислоти. Остаточно залишок розчиняли в 20 мл деіонізованої води і ліофілізували. Отримано 150 мг очищеного препарату у вигляді аморфного білого порошку без запаху. 5) Аналіз готового препарату. - Вміст основної речовини визначали методом ВЕРХ на колонці Phenomenex З 18 LUNA 4,6×150 mm. А: 0,1 % TFA, В: MeCN; В: 0-100 % на 10 хв. Швидкість потоку 1 мл/хв. Детекція при 220 нм, сканування 190-600 нм, проба 20 μl. Вміст основних речовини 97,93 %. - ТШХ: індивідуальний, Rf=0,45 (ацетонітрил-вода 1:2, пластинки ПТШХ-П-В-УФ Sorbfil, силікагель СТХ-1ВЕ 8-12 мкм, проявлення хлор/бензидин). - Вміст вологи: 6 % (гравіметрично по втраті маси при сушінні 20 мг при 100 °C). - рН 0,01 % розчину: 4,9 (потенціометрично). - Питоме оптичне обертання: [α]D22: -31º (с=1, H2O), "Polamat А", Carl Zeiss Jena. - Основна (або діюча) речовина, виготовлена у вигляді сухого препарату, може бути перетворена в фармацевтичну композицію, що відповідає винаходу, шляхом додавання фармацевтично прийнятного носія. 6 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для отримання готової лікарської форми засобу для профілактики або лікування інфекції, що викликається Helicobacter pylori, фармацевтично прийнятні носії вибирають з групи включених в Державну Фармакопею XII видання допоміжних речовин, що використовуються для створення готової лікарської форми у вигляді таблеток або капсул (для перорального застосування) або 0,9 % розчин натрію хлориду (для парентерального введення). Приклад 2. Вивчення дії фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, на молекулярно-клітинні механізми апоптозу Вивчення дії фармацевтичної композиції, що містить як діючу речовину пептид H-Glu-AspGly-OH, на молекулярно-клітинні механізми апоптозу проводили на дикому типі мишачих ембріональних фібробластів (MEF+/+, нокаутна лінія мишей LMNA). Клітини культивували при температурі 37 °C у вологому інкубаційному середовищі, що містить 5 % CO2 в DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, ICN Biomedicals) і 10 % ембріональної телячої сироватки. Попереднє розділення клітин для пасивування в співвідношенні 1:3-1:5 проводили, використовуючи суміш 0,125 % трипсину, 0,02 М EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0,02 % глюкози, розчиненої в фосфатному буфері. Клітини пасивували в культуральному середовищі протягом 5 діб, після чого забирали для дослідження. У культуральне середовище на 5 добу після початку пасивування клітин вводили пептид HGlu-Asp-Gly-OH в дозі 10 µM, і через 30 хв. клітини забирали для дослідження. Helicobacter pylori (Curtin Matheson Scientific Inc, штам Cag J117, 100 мікробних клітин) додавали в культуральне середовище, в якому культивувалися мишачі ембріональні фібробласти, на 5 добу культивування, інкубували протягом 7 годин для деструкції мітохондрій (відомий ефект дії даного мікроба приводить до розриву мембрани мітохондрій з утворенням реактивних форм кисню і вивільненням апоптогенних факторів, що служать сигналом для активації фінальної ефекторної стадії апоптозу), після чого фібробласти забирали для дослідження. На 5 добу культивування мишачих ембріональних фібробластів в культуральне середовище вводили також пептид H-Glu-Asp-Gly-OH в дозі 10 µM за 30 хв. до введення в культуральне середовище Helicobacter рylori, після інкубації протягом 7 годин разом в Helicobacter рylori фібробласти забирали для дослідження. Стан ізольованих мітохондрій оцінювали за допомогою імунофлуоресцентної конфокальної лазерної мікроскопії. Лізис клітин для ізоляції мітохондрій здійснювали в ізотонічному буфері (200 мM манітолу, 70 мМ сахарози, 1 мМ EGTA-ethylene glycol tetraacetic acid, 10 мМ HEPES-4-(2-hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic acid), pH 6,9) протягом 30 хв. Незруйновані клітини, ядра і мембрани відділяли центрифугуванням (1000 g, 5 хв.). Для отримання збагаченої фракції мітохондрій супернатант додатково центрифугували (12000 g, 20 хв.). Фракцію, що містить ізольовані 2 мітохондрії, вміщували в двошарові стекла з камерами 4,3 мм (Nalge Nunc Inc.). У кожну камеру додавали 2,0 мкл моноклональних антитіл до мітохондріального зеленого флуоресцентному протеїну (mito-GFP, Clontech Laboratories, Inc.) і інкубували протягом 1 години. Конфокальну мікроскопію мітохондрій з визначенням оптичної густини проводили в інвертованому конфокальному мікроскопі Olympus Fluoview CM FV300-IX70 з використанням апохроматичного об'єктиву 606 UPlan (Olympus). Для специфікації флуоресценції mito-GFP, що верифікує структуру мітохондрій в кожній камері використовували хвилю збудження аргонового лазера 488 нм. Спостереження за культурою фібробластів в контролі показало, що моношар через 1 добу був цілісним і рівномірним, фібробласти зберігали звичайну форму і розміри. Щільність 2 моношару становила 774 клітини/мм . Час подвоєння культури становив 24 години. Вид моношару і структура клітин не відрізнялися від звичайних протягом всіх 5 діб спостереження. 2 Щільність моношару на 3 добу становила 1519 клітин/мм . На 5 добу експерименту клітини досягали оптимальної для даної культури густини 2 насичення, яка становила 2020 клітин/мм , що забезпечило перехід культури в стаціонарну фазу зростання, в якій фібробласти мали звичайну для цих клітин видовжену форму, 2-4 паростки, клітинна і ядерна оболонки чітко контурувались (Фіг. 1) цитоплазма клітин була гомогенною. Більшість клітин мали 1 центральне розташоване ядро правильної округлої форми з 1 або 2 ядерцями. У цій фазі клітини знаходилися в оптимальному стані для вивчення їх структури і функції. Helicobacter рylori індукував фрагментацію мітохондрій, які розпадалися на фрагменти різної форми і розмірів, відбувалося руйнування мембрани і крист мітохондрій, знижувалася інтенсивність флуоресценції мітохондріального GFP, що відбивалося на показниках оптичної 7 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 густини (Фіг. 2-4). При дії фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, відмічалося збереження контурів і структури мітохондрій, свічення мітохондріального GFP по показниках оптичної густини навіть перевищувало контрольні показники, що свідчить про присутність у досліджуваного пептиду виражених властивостей превенції порушення мітохондріального шляху апоптозу під дією Helicobacter рylori. Таким чином, проведені дослідження дозволили деталізувати механізм біологічної активності фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, і її дії на мітохондріальний шлях ініціації апоптозу. Встановлений в процесі проведення досліджень виражений антиапоптотичний ефект фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, який реалізовується шляхом блокади мітохондріального каскаду вироблення проапоптозних каспаз, є обнадійливим для її прикладного використання в терапії патологічних станів, пов'язаних із загибеллю клітин або перекрученням шляху їх нормального диференціювання, особливо для лікування виразкової хвороби шлунка і дванадцятипалої кишки (а також пов'язаної з цією патологією можливої пухлинної метаплазії), асоційованої з Helicobacter pylori, оскільки пептид перешкоджає дії мікроба на клітини шляхом інгібування мітохондріальних механізмів апоптозу в епітеліоцитах шлунка, що індукується Helicobacter рylori, демонструючи потужний антиапоптотичний ефект по відношенню до клітин. Приклад 3. Вивчення біологічної активності і ефектів пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH на мітохондріальні механізми апоптозу в епітеліоцитах шлунка, які індукуються мікробом Helicobacter pylori Для оцінки біологічної активності і ефектів пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH на мітохондріальні механізми апоптозу в епітеліоцитах шлунка, що індукуються мікробом Helicobacter pylori, вивчали епітеліальні клітини шлунка людини SGC7901. Клітини культивували при температурі 37 °C у вологому інкубаційному середовищі, що містить 50 mL/L CO 2 в DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, ICN Biomedicals) і 10 % ембріональної телячої сироватки. Попереднє розділення клітин для пасивування в співвідношенні 1:3-1:5 проводили, використовуючи суміш 0,125 % трипсину, 0.02 М EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0,02 % глюкози, розчиненої в 6 фосфатному буфері. Клітини розміщували в кількості 10 клітин на ямку в планшеті з 24 ямок. Клітини пасивували в культуральному середовищі протягом 5 діб, після чого забирали для дослідження. У культуральне середовище на 5 добу після початку пасивування клітин вводили пептид HGlu-Asp-Gly-OH в дозі 10 µM, і через 30 хв. інкубації клітини забирали для дослідження. Як позитивний контроль при тих же умовах в культури вводили антибіотик клацид (Clarithromycin, Abbott) в дозі 500 ng/mL. Helicobacter pylori (Curtin Matheson Scientific Inc, штам Cag J117, 100 мікробних клітин) додавали в культуральне середовище, в якому культивувалися епітеліоцити шлунка людини, на 5 добу культивування, інкубували протягом 7 годин для деструкції мітохондрій (відомий ефект дії даного мікроба приводить до розриву мембрани мітохондрій з утворенням реактивних форм кисню і вивільненням апоптогенних факторів, що служать сигналом для активації фінальної ефекторної стадії апоптозу), після чого епітеліоцити забирали для дослідження. На 5 добу культивування епітеліоцитів шлунка людини в культуральне середовище вводили пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, що відповідає дозі 10 µM, за 30 хв. до введення в культуральне середовище Helicobacter рylori, через 7 годин інкубування після додання в середовище Helicobacter рylori (штам Cag J117, 100 мікробних клітин) епітеліоцити забирали для дослідження. Як позитивний контроль при тих же умовах в культури вводили антибіотик клацид (Clarithromycin, Abbott) в дозі 500 ng/mL. Стан ізольованих мітохондрій оцінювався за допомогою імунофлуоресцентної конфокальної лазерної мікроскопії. Лізис клітин для ізоляції мітохондрій здійснювали в ізотонічному буфері (200 мМ манітолу, 70 мМ сахарози, 1 мМ EGTA-ethylene glycol tetraacetic acid, 10 мМ HEPES-4-(2-hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic acid), pH 6,9) протягом 30 хв. Незруйновані клітини, ядра і мембрани відділяли центрифугуванням (1000 g, 5 хв.). Для отримання збагаченої фракції мітохондрій супернатант додатково центрифугували (12000 g, 20 хв.). Фракцію, що містить ізольовані 2 мітохондрії, вміщували в двошарові стекла з камерами 4,3 мм (Nalge Nunc Inc.). У кожну камеру додавали 2,0 мкл моноклональних антитіл до мітохондріального зеленого флуоресцентного протеїну (mito-GFP, Clontech Laboratories, Inc.) і інкубували протягом 1 години. Конфокальну мікроскопію мітохондрій з визначенням оптичної густини проводили в інвертованому конфокальному мікроскопі Olympus Fluoview CM FV300-IX70 з використанням 8 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 апохроматичного об'єктиву 606 UPlan (Olympus). Для специфікації флуоресценції mito-GFP, що верифікує структуру мітохондрій в кожній камері використовували хвилю збудження аргонового лазера 488 нм. У контролі мітохондрії в епітеліальних клітинах шлунка мали нормальну округлу або овальну форму з виразною флуоресценцією крист і матрикса. Експресія мітохондріального GFP була вираженою, і становила 2,57±0,23 у. о. по показнику оптичної густини і 3,42±0,19 % по показнику середньої площі експресії (Фіг. 5-9). Введення в культуральне середовище Helicobacter рylori викликало чітку фрагментацію мітохондрій, яка супроводжувалася руйнуванням мембрани і крист мітохондрій, знижувалася інтенсивність флуоресценції мітохондріального GFP, що приводило до різкого зниження показників експресії маркера (0,35±0,05 у. о. по оптичній густині; 0,63±0,03 % по середній площі експресії) (Фіг. 5-9). При дії фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, відмічалося збереження контурів і структури мітохондрій, експресія мітохондріального GFP практично не відрізняється від контрольних показників (2,48±0,17 у. о. по оптичній густині; 3,84±0,20 % по площі експресії), що свідчить про присутність у фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, виражених властивостей превенції порушення мітохондріального шляху апоптозу, виникаючого під дією Helicobacter рylori. При цьому потрібно відмітити, описана біологічна активність фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, порівнянна по своїй ефективності з активністю відомого антибіотика клациду, що застосовується як антибактерійний препарат при лікуванні патології шлунка, асоційованої з мікробом Helicobacter рylori. Приклад 4. Вивчення біологічної активності і ефектів пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH на мітохондріальні механізми апоптозу в епітеліоцитах шлунка, що індукуються мікробом Helicobacter pylori, in vivo Дослідження проведене на 90 самцях щурів лінії Спрейг-Доулі (180-220 г), які методом рандомізації були розділені на 9 груп (по 10 тварин): - 1 група - інтактні щури (введення фіз. розчину) - 2 група - моделювання виразки + введення фіз. розчину - 3 група (6 підгруп) - моделювання виразки + введення H-Glu-Asp-Gly-OH - 4 група моделювання виразки + введення антибіотика клациду Виразку моделювали шляхом трикратного введення (через 4 години) через зонд в шлунок щура цистаміну-HCl (Aldrich, Milwannee, WI) в дозі 25 мг/100 г маси тіла. При цьому виразка 2 розміром приблизно 28 мм виникала на межі антрального і фундального відділу шлунка через 12 годин після останнього введення. Одночасно з першим введенням цистаміну-HCl в шлунок щура через той же зонд вводили культуру Helicobacter pylori (Curtin Matheson Scientific Inc, штам Cag J117, 100 мікробних клітин). Засіб на основі фармацевтичної композиції, яка містить досліджуваний пептид H-Glu-AspGly-OH, вводили підшкірно в дозі 1 мкг/кг маси тіла тварини (група 3а), 2,5 мкг/кг маси тіла (група 3б) і 10 мкг/кг маси тіла (група 3в) в 0,5 мл фізіологічного розчину щоденно протягом 5 днів з моменту виникнення виразки шлунка. Засіб на основі фармацевтичної композиції, що містить досліджуваний пептид H-Glu-AspGly-OH, вводили внутрішньошлунково (через зонд) в дозі 1 мкг/кг маси тіла тварини (група 3г), 2,5 мкг/кг маси тіла (група 3д) і 10 мкг/кг маси тіла (група 3е) в 0,5 мл фізіологічного розчину щоденно протягом 5 днів з моменту виникнення виразки шлунка. Антибіотик клацид (Clarithromycin, Abbott) вводили внутрішньом'язово в дозі 10 мг в 1 мл фізіологічного розчину щодня протягом 5 днів з моменту виникнення виразки шлунка. Матеріал для дослідження брали з краю виразки на 7 добу (для вестерн-блотингу і полімеразної ланцюгової реакції в реальному режимі часу ПЛР-РЧ), а також на 7, 15 і 21 добу для морфологічного дослідження і конфокальної мікроскопії. При молекулярно-біологічному дослідженні як сигнальні молекули, експресія яких відображає біохімічні порушення в стінці шлунка і репаративні зміни при розвитку виразкової деструкції, були вибрані наступні: конституїнальна і індуцибельна NO-синтази (cNO і iNO, відповідно), основний представник сімейства білків теплового шоку HSP70 і фактор NF-kappa bp65. Експресія цих факторів вивчалася методом вестерн-блотингу по стандартному протоколу з дотриманням наступних основних етапів. Проби піддавали електрофорезу в одновимірних пластинках гелю на листах з нітроцелюлози з діаметром пор 0,45 µм (Millipore) з використанням губок з абразивним покриттям (Scotch-Brite). Пластинки були вставлені в електрофоретичну камеру з листом нітроцелюлози перед катодом. Камера містила 0,7 % оцтової кислоти, градієнт напруги 6 В/см підтримували протягом 1 години. Листи з електрофоретичними плямами обробляли 3 % бичачим сироватковим 9 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 альбуміном в фізіологічному розчині (0,9 % NaCl/10 мМ Тріс-HCl, рН 7,4) протягом 1 години при температурі 400 °C, потім промивали в фізіологічному розчині і інкубували з шуканими антитілами (Biorad). Потім листи промивали в фізіологічному розчині (5 разів протягом 30 хвилин) і інкубували з індикатором (другими антитілами проти імуноглобулінів первинних антитіл). Візуалізацію мічених плям проводили інкубацією з ізотіоціанатом флуоресцеїну або антиIgG кози, зв'язаними з пероксидазою хріну (Fluca, 1:100), протягом 30 хв. при кімнатній температурі. При використанні флуоресцеїну плями фотографували фотоапаратом Polaroid в довгохвильовому УФ-випромінюванні з використанням жовтого фільтра. При використанні пероксидази мокрі плями забарвлювали в розчині 25 % гуадіанізидину (рН 7,4) протягом 20 хв. і потім висушували фільтрувальним папером, і фотографували. Оскільки експресія вказаних сигнальних молекул безпосередньо пов'язана з рівнем синтезу ряду факторів, методом ПЛР-РЧ визначали експресію mРНК наступних речовин: супероксиддисмутази, TNF-альфа і Сох-2. ПЛР-РЧ проводили в 25 мкл реакційній суміші, яка містить буфер (40 мМ Тріс-HCl pH 8,0, 2,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl); 20 пмоль ДНК; 1 од. акт. Taq-ДНК полімерази; по 0,5 пмоль кожного з праймерів, мічених кожний своїм флуорохромом (донором і акцептор), і відповідну кількість дистильованої води. ПЛР-РЧ проводили в ДНК ампліфікаторі iCycler iQ (Bio-Rad) при наступних умовах: денатурація дволанцюжкової ДНК в першому циклі проводилася при температурі 94 °C протягом 30 сек., потім йшов відпал праймерів і їх подовження при температурі 45 °C протягом 10 сек. з реєстрацією флуоресценції в кінці цієї стадії, денатурація цільового продукту при температурі 80 °C протягом 10 сек., Кількість циклів - 25. Температура відпалу праймерів, а також температура плавлення цільових продуктів дещо варіювала в різних експериментах залежно від GC-складу використовуваних олігонуклеотидів. Електрофоретичний контроль продуктів ПЛР-РЧ проводили в 8 %-вому поліакриламідному гелі в тріс-ацетатному буфері рН 7,8 в неденатуруючих умовах при градієнті напруги 4 V на 1 см довжини гелю в приладі вертикального типу протягом 4 годин. Після завершення електрофорезу гель після фарбування бромистим етидієм фотографували в фотодокументаційній системі Gel Camera System (UVP, Inc., США). Для морфологічного дослідження шматочки слизової оболонки шлунка з краю виразки фіксували в 10 % нейтральному формаліні (pH 7,2), потім зневоднювали матеріал в автоматичній станції Leica TP1020 (Leica) і заливали в парафін. Парафінові зрізи товщиною 5 мкм вміщували на предметне скло, покрите плівкою з полі-L-лізину (Sigma). Для оглядового вивчення зрізи забарвлювали гематоксиліном і еозином, а також пікрофуксином по Ван Гізону. Стан ізольованих мітохондрій оцінювали за допомогою імунофлуоресцентної конфокальної лазерної мікроскопії. Лізис клітин для ізоляції мітохондрій здійснювали в ізотонічному буфері (200 мМ манітолу, 70 мМ сахарози, 1 мМ EGTA-ethylene glycol tetraacetic acid, 10 мМ HEPES-4-(2-hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic acid), pH 6,9) протягом 30 хв. Незруйновані клітини, ядра і мембрани відділяли центрифугуванням (1000 g, 5 хв.). Для отримання збагаченої фракції мітохондрій супернатант додатково центрифугували (12000 g, 20 хв.). Фракцію, яка містить ізольовані 2 мітохондрії вміщували в двошарові стекла з камерами 4,3 мм (Nalge Nunc Inc.). У кожну камеру додавали 2,0 мкл моноклональних антитіл до мітохондріального зеленого флуоресцентного протеїну (mito-GFP, Clontech Laboratories, Inc.) і інкубували протягом 1 години. Конфокальну мікроскопію мітохондрій з визначенням оптичної густини проводили в інвертованому конфокальному мікроскопі Olympus Fluoview CM FV300-IX70 з використанням апохроматичного об'єктиву 606 UPlan (Olympus). Для специфікації флуоресценції mito-GFP, що верифікує структуру мітохондрій в кожній камері використовували хвилю збудження аргонового лазера 488 нм. Використання методу вестерн-блотингу показало, що експресія всіх вивчених сигнальних молекул в зразках слизової оболонки з краю виразки шлунка на 7 день після її індукції достовірно зростає (в 3-5 разів) в порівнянні з нормальною слизовою оболонкою, взятою у інтактних тварин (Фіг. 10). При цьому особливо різко зростає експресія iNOS і фактора NF kappa b-p65. Проведення ПЛР-РЧ дозволило встановити, що при індукції виразки на 7 добу в зразках слизової оболонки з її краю зростає експресія мРНК, що кодує синтез супероксиддисмутази (SOD), TNF-альфа і фактора Cox-2 (Фіг. 11). При вивченні біологічної активності засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH в дозуванні від 1 мкг до 10 мкг на кг масу тіла, встановлено, що він має протективний вплив на слизову оболонку шлунка, знижуючи підвищену експресію обох 10 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 форм NO-синтази і факторів HSP70 і NF kappa b-p65. Рівень продукції вказаних сигнальних молекул в слизовій оболонці краю виразки на 7 добу її індукції порівнянний з практично нормальними показниками. Дослідження макроскопічних і гістологічних препаратів показало наступну картину патоморфозу індукованої виразки (Фіг. 12). У 2-ій групі (моделювання виразки + введення фізіологічного розчину) на 7 добу від початку спостереження виразки залишалися таких же розмірів, як і на 1 добу з моменту індукції. Перифокальний набряк був сильно розвинений, і стінки виразки були покриті фібринознонекротичним нальотом з ознаками хронічного запалення і дрібними ерозіями. У дні виразки виявлявся широкий лейкоцитарно-некротичний шар, під яким розташовувалася грануляційна тканина з підвищеною кількістю тонкостінних кровоносних судин і переважанням фібробластів. У більш глибоких відділах грануляційної тканини виявлялися колагенові волокна з їх частково впорядкованим ходом і невеликою кількістю судин. У підлягаючому до зони некрозу і більш глибоких шарах грануляційної тканини відмічалася виражена дифузна запальна інфільтрація з переважанням нейтрофілів. У 3-ій групі (введення засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить пептид HGlu-Asp-Gly-OH) на 7 добу після індукції виразки відмічалося зменшення не тільки площі виразкового дефекту, але і його глибини, а також очищення дна виразки від некротичних мас і зменшення запалення навколо виразки. При гістологічному дослідженні виразки шлунка зазначалося, що лейкоцитарно-некротичний шар був більш тонким. Підлягаючий шар був представлений дозріваючою грануляційною тканиною з великою кількістю судин і помірно вираженою дифузною лейкоцитарною інфільтрацією переважно з гістиоцитів, лімфоцитів і нейтрофілів. У зоні країв виразкового дефекту визначалися кістозно-розширені залози з проліферацією епітеліоцитів. Подібна дія засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-GlyOH, спостерігалася у всіх 6 підгрупах 3 групи тварин - як при підшкірному, так і при внутрішньошлунковому введенні в 3 концентраціях. Морфологічні зміни в 4-ій групі (введення клациду) фактично були подібними до змін в групі 3. На 15-у доби у тварин 2-ої групи (виразка + фізіологічний розчин) розміри виразкового дефекту дещо зменшувалися, але дно виразок залишалося частково покритим некротичним нальотом, хоча ознаки хронічного запалення ставали менш вираженими. Після застосування засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить пептид H-GluAsp-Gly-OH (3-я група), підшкірно (групи 3а, 3б, 3в) або внутрішньошлунково (групи 3г, 3д, 3е) в трьох дозуванні виявлялося значне зменшення розмірів виразкового дефекту і його глибини. При дії засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, вже на 15-у добу верифікувалась часткова епітелізація країв виразкового дефекту. У дні виразки виявлявся тонкий лейкоцитарно-некротичний шар. У порівнянні з попереднім терміном спостереження відмічалося розростання грануляційної тканини і збільшення кількості кровоносних судин; хід колагенових волокон в грануляційній тканині був більш впорядкованим, запальна інфільтрація була слабко вираженою за рахунок клітин переважно лімфоїдно-гістіоцитарного ряду. Лейкоцитарна інфільтрація ставала дрібновогнищевою, стаз крові скорочувався, а кількість знову утворених мікросудин збільшувалася. Популяція тучних клітин і макрофагів зростала. Слизова оболонка набула рівномірно рожевого забарвлення. Такі ж зміни спостерігалися в 4-ій групі (введення клациду). На 21-у добу у тварин 2-ої групи виразкові дефекти ще зберігалися. Дно виразки було покрите тонким некротичним шаром, і дифузно інфільтроване лейкоцитами. У підлягаючому шарі дозріваюча грануляційна тканина мала частково впорядкований хід колагенових волокон і помірно виражену запальну інфільтрацію гістіоцитами, лімфоцитами і нейтрофілами. У краях виразки виявлялися кістозно-розширені залози, вислані проліферуючим епітелієм. У 3-ій групі (при застосуванні засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, при обох шляхах введення і трьох дозуваннях) макроскопічно виразкові дефекти не виявлялися. Слизова оболонка шлунка була рівномірно епітелізована і мала рожеве забарвлення. Відмічалася епітелізація виразкового дефекту. У слизовій оболонці виразкових дефектів не виявлялося, виявлялися лише зони, в яких визначалися залозисті порожнини, вислані проліферуючим епітелієм. У підлягаючій стромі слизової виявлялася фіброзна тканина з впорядкованим ходом колагенових волокон і слабко вираженою запальною лімфоїдно-гістиоцитарною інфільтрацією. 11 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Потрібно відмітити, що найбільш виражений ефект відмічався в групах 3б, 3в, 3д і 3е при введенні тваринам засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-AspGly-OH, при підшкірному і внутрішньошлунковому шляхах введення, відповідно, в дозах 2,5 мкг/кг і 10 мкг/кг. Однак підшкірне або внутрішньошлункове введення тваринам засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH в дозі 1,0 мкг/кг (групи 3а і 3г), також сприяло прискоренню епітелізації виразкового дефекту, але із затримкою по термінах на 2-3 дні в порівнянні з тваринами, що отримували фармацевтичну композицію, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH в більш високих дозах. Це дозволяє зробити висновок про ефективність застосування засобу на основі фармацевтичної композиції, яка містить пептид HGlu-Asp-Gly-OH в дозі 1,0 мкг/кг, для профілактики розвитку виразкової хвороби шлунка, асоційованої з Helicobacter pylori. Введення клациду (4 група) приводило до таких же змін. Конфокальна мікроскопія і комп'ютерний аналіз мікроскопічних зображень дали наступні результати. У 1 групі (інтактні тварини) мітохондрії в епітеліальних клітинах шлунка мали нормальну округлу або овальну форму з виразною флуоресценцією крист і матрикса. Експресія мітохондріального GFP була вираженою, і складала в середньому по показнику оптичної густини 3,12±0,22 у. о. - на 7 добу, 3,17±0,18 у. о. – на 15 добу і 3,19±0,18 у. о. – на 21 добу (Фіг. 13-16). Індукція виразки (2-а група) приводила на 7 добу до вираженої фрагментації мітохондрій, яка супроводжувася руйнуванням мембрани і крист мітохондрій, при цьому різко падала інтенсивність флуоресценції мітохондріального GFP (фіг. 13), що приводило до різкого зниження показників експресії маркера (0.54±0.02 у.е). На 15 добу в зразках тканин при виділенні мітохондрій відмічалася їх часткова реструкція по показнику оптичної густини експресії мітохондріального GFP (0,87±0,04 у. о., Фіг. 14, 16). На 21 добу відновлення показників експресії мітохондріального GFP реєструвалося ще більш виразно (оптична густина = 1,67±0,09 у. о., Фіг. 15, 17). При дії засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, при обох шляхах введення в трьох дозуваннях, які вивчаються, на всіх термінах, які вивчаються, відмічалися ознаки збереження контурів і структури мітохондрій. Динаміка експресії мітохондріального GFP була наступною: 2.86±0.21 у. о. - на 7 добу, 3,03±0,16 у. о. - на 15 добу, 3,16±0,18 у. о. - на 21 добу (Фіг. 13-17). Подібні ефекти надавав і антибіотик клацид (Фіг. 13-17). Приклад 5. Вивчення токсичності пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH Загальнотоксичну дію пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH досліджували відповідно до вимог "Посібника по експериментальному (доклінічному) вивченню нових фармакологічних речовин" (2000): гострої токсичності при однократному введенні препарату, а також підгострої і хронічної токсичності при тривалому введенні пептиду. Дослідження по вивченню гострої токсичності проведене на 66 білих безпородних мишахсамцях масою 20-22 г. Тварини були рандомізовано розділені на 6 однакових груп. Препарат вводили тваринам однократно внутрішньом'язово в дозах 1, 2, 3, 4, 5 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9 % розчину NaCl. Тваринам контрольної групи в тому ж об'ємі вводили 0,9 % розчин NaCl. Дослідження по вивченню підгострої токсичності проведене на 64 білих безпородних щурахсамцях масою 180-220 г. Щодня однократно тваринам піддослідних груп вводили препарат внутрішньом'язово протягом 90 днів в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9 % розчину NaCl. Тваринам контрольної групи вводили в тому ж об'ємі стерильний 0,9 % розчин NaCl. До введення препарату, на 30, 60 і 90 добу після початку введення препарату у тварин досліджували морфологічний склад і властивості периферичної крові. При завершенні експерименту досліджували біохімічні і коагулологічні показники крові. Дослідження по вивченню хронічної токсичності проводили протягом 6 місяців виходячи з тривалості рекомендованого клінічного призначення препарату на 92 морських свинках-самцях масою 310-350 г. Тварини піддослідних груп отримували щодня однократно внутрішньом'язово пептид протягом 6 місяців в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9 % розчину NaCl. У контрольній групі тваринам вводили по аналогічній схемі стерильний 0,9 % розчин NaCl в тому ж об'ємі. У тварин в периферичній крові загальноприйнятими методами визначали: кількість еритроцитів, гемоглобіну, ретикулоцитів, тромбоцитів, лейкоцитів, лейкоцитарну формулу, швидкість осідання еритроцитів (СОЕ), резистентність еритроцитів. Нарівні з цим визначали вміст в сироватці крові загального білка по методу Лоурі, калію і натрію методом плазмової спектрофотометрії. Після завершення експерименту проводили патоморфологічне 12 UA 104981 C2 5 10 15 20 25 дослідження головного і спинного мозку, спинномозкових гангліїв, щитовидної залози, паращитовидних залоз, надниркових залоз, сім'яників, гіпофіза, серця, легені, аорти, печінки, нирки, сечового міхура, підшлункової залози, шлунка, тонкої кишки, товстої кишки, тимусу, селезінки, лімфатичних вузлів, кісткового мозку. При вивченні гострої токсичності встановлено, що однократне введення досліджуваного пептиду тваринам в дозі, що перевищує терапевтичну, рекомендовану для клінічного застосування, більше ніж в 5000 раз, не викликає токсичних реакцій, що свідчить про велику терапевтичну широту препарату. Вивчення підгострої і хронічної токсичності пептиду свідчить про відсутність побічних ефектів при тривалому застосуванні препарату в дозах, що перевищують терапевтичну в 100-1000 разів. При дослідженні впливу пептиду на морфологічний склад крові морських свинок встановлене збільшення кількості лейкоцитів через 3 місяці після початку введення препарату, який нормалізувався до 6-го місяця спостереження (Таблиця). Інші показники морфологічного складу крові тварин практично не змінювалися. Не відмічено достовірного впливу препарату на СОЕ, резистентність еритроцитів і біохімічні показники сироватки крові. При оцінці загального стану тварин, морфологічних і біохімічних показників периферичної крові, морфологічного стану внутрішніх органів, стану серцевосудинної і дихальної систем, функції печінки і нирок патологічні зміни в організмі не виявлені. Відсутність загальнотоксичної дії дозволяє рекомендувати фармацевтичну композицію, що містить як активний початок пептид Н-Glu-Asp-Gly-OH, для проведення клінічних випробувань. Таким чином, як видно з матеріалів, що ілюструють винахід, перевагою засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, є те, що на противагу відомим і класичним лікарським засобам, зокрема, препарату Клацид (кларитроміцин), він має специфічну активність. Крім того, введення засобу на основі фармацевтичної композиції, що містить як діючу речовину ефективну відносно Helicobacter pylori кількість пептиду формули HGlu-Asp-Gly-OH в дозі від 1 мкг до 10 мкг на 1 кг масу тіла перорально щодня 3 рази на день протягом 10-20 днів або парентерально однократно щодня протягом 10 днів надає протекторну дію на мітохондріальні механізми апоптозу, що індукується Helicobacter pylori, дає підставу передбачати використання цього засобу для лікування гастродуоденальних захворювань, що викликаються Helicobacter pylori. 30 Таблиця Показник 12 Еритроцити, ×10 /л Гемоглобін, г/л Ретикулоцити, % 9 Тромбоцити, ×10 /л 9 Лейкоцити, ×10 /л Нейтрофіли палочкоядерні, % Нейтрофіли сегментоядерні, % Еозинофіли, % Базофіли, % Моноцити, % Лімфоцити, % ШОЕ, мм/год Резистентність еритроцитів, % NaCl - максимальна - мінімальна Загальний білок в сироватці крові, г/л Натрій в сироватці крові, ммоль/л Калій в сироватці крові, ммоль/л Введення пептиду H-Glu-Asp-Gly-OH (1 мкг/кг) 3 місяці 6 місяців Контроль Пептид Контроль Пептид (n=24) (n=24) (n=24) (n=24) 5,3±0,6 5,2±0,1 5,4±0,3 5,2±0,7 14,2±1,4 14,4±0,9 14,5±1,3 14,8±1,1 1,3±0,07 1,1±0,08 1,1±0,05 1,2±0,04 143,7±7,9 143,1±4,5 144,5±8,6 142,8±6,2 9,4±0,5 11,8±0,2* 9,6±0,5 10,3±0,6 0,31±0,04 0,30±0,02 0,33±0,04 0,35±0,001 45,8±2,1 43,9±1,8 46,2±3,5 45,4±3,0 0,69±0,05 0,67±0,06 0,72±0,04 0,73±0,04 0,61±0,04 0,63±0,03 0,72±0,03 0,65±0,08 2,5±0,02 2,6±0,01 2,6±0,06 2,4±0,04 48,9±2,5 51,3±2,2 51,3±2,7 49,7±1,9 1,69±0,05 1,98±0,09 2,01±0,05 1,85±0,06 0,41±0,02 0,32±0,05 0,42±0,02 0,31±0,01 0,42±0,04 0,34±0,04 0,43±0,02 0,33±0,06 72,9±3,1 73,6±2,8 73,1±3,4 72,3±2,9 153,9±5,7 155,6±4,7155,5±6,2 155,2±4,9 5,1±2,3 5,3±2,0 5,2±2,1 5,1±2,5 * - Р