Вектор експресії

Реферат: Винахід перенесення для вбудовування гена в генетичний локус послідовності бакуловірусу, який містить: касету експресії, яка містить еукаріотичний промотор, функціонально пов'язаний із зазначеним геном; касету подвійної селекції, що видаляється, яка фланкована послідовностями рекомбінації LoxP, причому вказані послідовності LoxP модифіковані, щоб забезпечити проходження тільки одного циклу рекомбінації, яка містить: (і) експресовану послідовність, яка кодує перший селектований маркер; і (іі) експресовану послідовність, яка кодує другий селектований маркер; і послідовності, які фланкують зазначені касету експресії та касету подвійної селекції, причому зазначені послідовності в суттєвому ступені відповідають послідовностям зазначеного генетичного локусу в послідовності бакуловірусу. Також даний винахід належить до способів одержання рекомбінантної бакміди. UA 106733 C2 (12) UA 106733 C2 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відноситься до вектора перенесення, який застосовувується для вбудовування гена в генетичний локус послідовності бакуловірусу. Також даний винахід відноситься до способів застосування вектора перенесення та одержуваних бакмідів і бакуловірусів. Систему експресії на основі бакуловірусу застосовували для експресії тисяч білків у клітинах еукаріот з метою структурних і біохімічних досліджень (14). Крім того, що система на основі бакуловірусу дозволяє здійснювати експресію окремих рекомбінантних білків, її також застосовували для спільної експресії декількох білків, які утворюють комплекси (15-22). Це важливо, оскільки скринінг всього генома для пошуку взаємодіючих молекул показує, що багато життєво-важливих функцій живих клітин обумовлені комплексами білків з декількох субодиниць (23). Для досягнення спільної експресії білків за допомогою системи на основі бакуловірусу застосовували дві основні стратегії. Найпоширеніший підхід – це спільне інфікування клітини двома або більше вірусами, кожен з яких експресує один рекомбінантний білок (19, 24, 25). Однак, часто вихід комплексів білків при такому підході варіює в значній мірі, а спільне інфікування тих самих клітин двома різними бакуловірусами не підкорюється закону розподілу Пуассона (26). Таким чином, хоча спосіб спільного інфікування технічно простий, практично він обмежений одержанням тільки відносно простих комплексів для додатків, яким не потрібна велика кількість очищеного білка. Для додатків, таких як структурні дослідження й великі випробування вакцин, для яких потрібні великі кількості білків, і для більш складних комплексів, утворених великою кількістю субодиниць, застосовували альтернативний підхід спільної експресії білків з декількох однакових касет експресії, які вбудовують у локус поліедрину або Р10 (15-18,22,27). Цей підхід має ту перевагу, що кожна клітина в культурі, яка інфікована рекомбінантним вірусом, відтворювано експресує всі білки, необхідні для утворення білкового комплексу. При порівнянні підходів спільного інфікування й застосування тільки одного бакуловірусу, другий підхід продемонстрував значно більший вихід рекомбінантного комплексу (28). Однак експресія декількох білків із застосуванням одного рекомбінантного вірусу не позбавлена недоліків. Хоча палочковидний бакуловірус є досить стійкий до вставок у його геном, гени трансфікують у вірус за допомогою гомологічної рекомбінації, і вектор перенесення повинен мати такий розмір, щоб з ним було легко працювати в клітинах E. coli. Відповідно, існує обмеження по числу генів, які можна вбудовувати у вектор перенесення. На практиці це означає, що рідко можна експресувати більше чотирьох білків з одного локусу. Крім того, бакуловірус містить послідовності й експресує білки, які запускають гомологічну рекомбінацію (29-32). Відповідно, віруси, які містять велику кількість повторів, схильні до перебудови й рекомбінації (21, 33, 34). Підхід спільної експресії із застосуванням одного бакуловірусу модифікували за допомогою вбудовування сайту LoxР у локус chi/cathepsin бакміди, який вже містить мішень Tn7 у локусі поліедрину (20). Це дозволяє здійснити вбудовування великої кількості експресійних касет у кожен із цих локусів за допомогою рекомбінації в E. coli. Як можна було очікувати виходячи з того, що зазначена система основана на повторюваній дуплікації касети експресії, яку модифікували з метою експресії різних генів, існують дані, що вставки в цій системі деякою мірою генетично нестабільні (21). Недавно, для вивчення бакуловірусу з'явилися нові можливості завдяки застосуванню системи рекомбінації ET, яка дозволила здійснювати селективне вимикання вірусних генів (3549). Однак потенціал даного методу для конструювання й полегшення експресії білків у генетичних локусах крім локусу р10 і поліедрину не вивчали. Даний винахід відноситься до способу ефективної експресії великої кількості рекомбінантних білків (тобто, білків, що не походять від бакуловірусу) з генома одного бакуловірусу. Даний спосіб дозволяє ефективно вводити касети експресії окремих білків у різні локуси в геномі вірусу за допомогою системи рекомбінації ET. Крім того, даний спосіб дає можливість експресії комплексів з великою кількістю субодиниць. Експресія окремих білків із застосуванням бакуловірусу як системи експресії зараз загальноприйнята. Основна методологія даної системи експресії дуже мало змінилася з тих часів, як вона була одержана вперше. Оскільки геном бакуловірусу складається з 133кб дволанцюгової ДНК, він занадто великий для того, щоб працювати з ним напряму. Відповідно, гени, що кодують чужорідні білки, з використанням клітин E. coli клонують у вектори, що містять касету експресії з вірусу комах AcMNPV, які потім вводять з вірусної ДНК у клітини комах, де білки вірусу й клітини опосередковують гомологічну рекомбінацію, яка призводить до продукції інфекційного (стосовно клітин комах) вірусу, який експресує чужорідний білок. Були одержані різні варіанти зазначеної системи, включаючи геноми вірусів, які здатні реплікуватися тільки у випадку походження рекомбінації (1, 2), і проведення рекомбінації в E. coli за допомогою 1 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бакміди, основаної на застосуванні транспозону Tn7 (3) для прискорення відбору рекомбінантного вірусу. Експресію комплексу з декількох білків у клітинах комах також здійснювали за допомогою експресуючої системи бакуловірусу, яка коротко описана вище. Спочатку для спільного інфікування сприйнятливих клітин застосовували декілька вірусів, кожен з яких експресував окремий білок, і комплекс білків очищали після експресії. Однак цей спосіб у найкращому разі неефективний і не достатньо відтворюваний для промислового масштабу. Як альтернативу створили вектори, які включають декілька одиниць експресії, але здатні до рекомбінації з єдиним генетичним локусом вірусу (4-6). Ці вектори мали ту перевагу, що вони давали можливість одержання всіх субодиниць рекомбінантних білків у кожній інфікованій клітині й давали значно більш високий вихід комплексу рекомбінантних білків. Крім того, оскільки всі білки експресує тільки один вірус, відтворюваність результату інфекцій була набагато вище. Такі вектори мають два недоліки. По-перше, оскільки вектори містять повтори, і бакуловірус експресує білки, які запускають гомологічну рекомбінацію, експресія, особливо з конструкцій, що містять три або чотири одиниці експресії, не завжди досить генетично стабільна при великій кількості пересівань вірусів (які необхідні при збільшенні об'єму для промислової експресії білків із застосуванням бакуловірусів). По-друге, є практичне обмеження за розміром вставки, яку легко можна зберігати і з якої можна працювати в E. coli, що обмежує кількість білків, які можна експресувати з таких векторів. Інший підхід, який був запропонований для виробництва декількох білків, складається у вбудовуванні чужорідного білка (білків) в один генетичний локус у бакуловірусі, наступній селекції вірусу, який експресує цей білок, і застосуванні генома цього вірусу для рекомбінації в другому генетичному локусі для експресії інших білків (7). Однак через необхідність високого ступеня технічної підготовки й великої кількості часу, яких вимагає цей підхід (16 днів для першого локусу й 25 днів для кожного наступного локусу), цей підхід застосовували дуже рідко. Останні розробки включали модифікацію ВАС на основі системи транспозону Tn7 за допомогою вбудовування сайту LoxР у другий генетичний локус у бакуловірусі, щоб також уможливити вбудовування додаткових генів у цей локус в E. coli (8). Однак цей спосіб все ще не позбавлений проблем, пов'язаних з тим, що наявність повторів внаслідок дуплікації промоторів у бактеріальних векторах означає, що конструкція буде генетично нестабільна при множинних пересіваннях вірусу, і вектори перенесення будуть швидко досягати розміру, максимально припустимого для маніпуляції в E. coli. Спосіб, запропонований у даному винаході, дозволяє перебороти щонайменше деякі з проблем, властивих раніше існуючим способам, такі як генетична нестабільність і потреба в множинних циклах рекомбінації. Відповідно до першого аспекту даного винаходу запропонований вектор перенесення для вбудовування гена в генетичний локус послідовності бакуловірусу, який містить: касету експресії, що містить еукаріотичний промотор, функціонально пов'язаний з геном; касету подвійної селекції, яка містить: (і) експресуєму послідовність, яка кодує перший селектуємий маркер; і (ii) експресуєму послідовність, що кодує другий селектуємий маркер; і послідовності, які фланкують зазначені касету експресії й касету подвійної селекції, причому зазначені послідовності в суттєвому ступені відповідають послідовностям генетичного локусу в послідовності бакуловірусу. Вектор перенесення, запропонований у даному винаході, можна застосовувати для ефективного вбудовування гена в генетичний локус послідовності бакуловірусу і для відбору послідовностей бакуловірусу, які містять зазначений ген. Зокрема, було показано, що застосування касети подвійної селекції значно збільшує число ідентифікованих позитивних клонів (тобто, послідовностей бакуловірусу, які містять вбудований ген) у порівнянні з відбором за допомогою одиночного селектуємого маркера. Це дає значні переваги в порівнянні із застосуванням одиночного селектуємого маркера. Трансформується тільки невелика кількість бакуловірусів, і, отже, маркер експресується тільки на дуже низькому рівні. Наприклад, коли маркером є стійкість до антибіотика, можна застосовувати тільки дуже низьку концентрацію антибіотика. Це призводить до селекції варіантів бактерій, які є стійкими до використовуваного антибіотика. Отже, деякі бактерії, що ростуть на чашках, можуть не містити модифікацію. Застосування двох способів позитивної селекції дозволяє перебороти ймовірність таких помилкових-позитивних результатів відбору. Вектором перенесення, запропонованим відповідно до даного винаходу, може бути будьякий підходящий вектор, за умови, що він здатний до рекомбінації з послідовністю бакуловірусу шляхом гомологічної рекомбінації й забезпечувати вбудовування гена в послідовність 2 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бакуловірусу. Підходящі вектори перенесення добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Основні властивості вектора перенесення обговорюються нижче. Ген, який потрібно вставити в послідовність бакуловірусу, може являти собою будь-який гетерологічний ген (тобто, ген, що не походить від бакуловірусу). Переважно, зазначений гетерологічний ген кодує субодиницю білкового комплексу. Зазначений гетерологічний ген може кодувати білок вірусу, компонент рецептора або комплексу шаперонів. Особливо переважно, щоб гетерологічний ген кодував білок вірусу, який разом з іншими білками вірусу може утворювати вірусоподібну частку (ВПЧ). Генетичним локусом, в який вбудовують ген у послідовності бакуловірусу, може бути будьякий підходящий локус, який дає можливість експресувати такий вбудований ген, а також не порушує здатність послідовності бакуловірусу до реплікації. Також застосовуваний локус не повинен впливати на здатність бакуловірусу до інфікування клітин, тобто, до реплікації або поширення з клітини в клітину. Такі локуси включають локуси поліедрину й р10. Інші додаткові підходящі локуси, виявлені авторами даного винаходу, включають ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 і odv-e56. Послідовністю бакуловірусу може бути будь-яка підходяща послідовність бакуловірусу, що може реплікуватися в клітині комахи і прокаріотичній клітині, такій як E. coli. Зокрема, можна застосовувати будь-який геном бакуловірусу, який містить реплікон BAC. Підходящі послідовності бакуловірусу включають бакміду AcMNPV. Термін "касета експресії" відноситься до комбінації елементів, необхідних для експресії гена. Відповідно, касета експресії включає підходящий промотор, який уможливлює експресію кодуємого гена в клітинах еукаріот (наприклад, клітинах комах), і підходящу послідовність сигналу поліаденілірування, яка фланкує зазначену послідовність гена. Касети експресії для експресії генів у клітинах еукаріот добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Промотори, які особливо переважні, включають вірусні пізні промотори бакуловірусу (наприклад, р35) або вірусні дуже пізні промотори (наприклад, промотори поліедрину й р10). Підходящі послідовності сигналу поліаденілірування включають послідовність поліаденілірування триптофангідроксилази (Тпг) або послідовності поліаденілірування з генів бакуловірусу. Касета експресії згідно із даним винаходом може містити більше одного гена (наприклад, 2, 3 або 4 гени), що призводить до експресії більш ніж одного гена. Однак зазвичай переважно, щоб касета експресії містила єдиний ген. Було показано, що касета подвійної селекції покращує ідентифікацію й виділення клонів, які успішно включили ген. Касета подвійної селекції містить 2 різних селектуємих маркери. Також зазначена касета містить будь-які елементи, необхідні для експресії маркерів у клітині бактерії, такі як один або більше бактеріальних промоторів. Етап відбору послідовностей, які містять ген, включає відбір послідовностей, що містять обидва селектуємих маркери. Даний етап відбору проводять у клітинах бактерій, наприклад, E. coli. Селектуємими маркерами можуть бути будьякі маркери, які дозволяють відбирати клітини, що містять касету. Наприклад, маркери можуть бути візуальними, такі як маркер, що викликає зміну зовнішнього виду або забарвлення колонії клітин. Як альтернатива, маркер може надавати стійкість, наприклад, до антибіотика. Два зазначених селектуємих маркери можуть бути маркерами одного типу, наприклад, являти собою стійкість до двох різних антибіотиків, або маркерами різного типу, наприклад, являти собою стійкість до антибіотика й візуальний маркер. Перший селектуємий маркер переважно являє собою візуальний маркер, такий як фрагмент LacZalpha, що надає синє забарвлення клітинам, які експресують фрагмент LacZalpha, у присутності IPTG (ізопропілтіогалактозиду) і Xgal. Другий селектуємий маркер переважно являє собою будь-який маркер, який надає стійкості до антибіотика, такої як стійкість до хлорамфеніколу, тетрацикліну, пуроміцину, ампіциліну, пеніциліну, апраміцину, канаміцину або флеоміцину. Особливо переважно, щоб другий маркер надавав стійкості до флеоміцину. Відповідно до переважного варіанта реалізації зазначена касета подвійної селекції фланкована послідовностями рекомбінації LoxР. Послідовності рекомбінації LoxР з'єднуються разом у присутності рекомбінази Cre, що призводить до делеції послідовності, яка знаходиться між ними. Відповідно, касету подвійної селекції можна видалити, що дозволяє застосовувати ті самі селектуємі маркери при введенні будь-яких додаткових генів у послідовність бакуловірусу. Переважно модифікувати сайти LoxР так, щоб між сайтами міг відбуватися тільки один цикл рекомбінації. Підходящі модифіковані сайти LoxР добре відомі фахівцям у даній галузі техніки, наприклад, модифіковані сайти Lox66 і Lox71. Послідовності, що фланкують касету експресії й касету подвійної селекції згідно із даним винаходом, в суттєвому ступені відповідають послідовностям зазначеного генетичного локусу, що дає можливість здійснення гомологічної рекомбінації між вектором перенесення й 3 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовністю бакуловірусу. Кожна фланкуюча послідовність переважно повинна мати довжину щонайменше 20 пар основ (по), більш переважно довжину щонайменше 30 по, і ще більш переважно, довжину щонайменше 50 по, і повинна містити послідовність, яка дозволяє здійснювати специфічну рекомбінацію з послідовністю зазначеного генетичного локусу. Відповідно до другого аспекту даного винаходу запропонований спосіб одержання рекомбінантної бакміди, який включає: об'єднання бакміди й вектора перенесення, який відповідає першому аспекту даного винаходу, для забезпечення можливості гомологічної рекомбінації; і селекцію рекомбінантної бакміди, яка містить касету подвійної селекції. Відбір рекомбінантної бакміди можна проводити за допомогою стандартних методик залежно від касети подвійної селекції. Спосіб одержання рекомбінантної бакміди може додатково включати детектування наявності гена в бакміді або продукту його експресії. Можна застосовувати підходящі методики скринінгу залежно від конкретного гена. Крім того, коли касета селекції фланкована послідовностями рекомбінації LoxР, спосіб переважно додатково включає також індукцію рекомбінації між сайтами LoxР, наприклад, за допомогою впливу на бакміду рекомбіназою Cre, для видалення касети подвійної селекції. Переважно, щоб рекомбіназа Cre була під контролем індукуємого промотору, такого як промотор арабінози. Перевага видалення касети подвійної селекції полягає в тому, що з бакмідою можна рекомбінувати додатковий вектор перенесення, причому зазначений додатковий вектор перенесення може містити ту ж касету подвійної селекції. Відбір додатково рекомбінованої бакміди можна проводити за допомогою тих самих методик, які застосовують після першого циклу рекомбінації. Зазвичай спосіб одержання рекомбінантної бакміди реалізують у прокаріотичній клітині, оскільки системою на основі клітини прокаріот можна легше й швидше маніпулювати. Переважно, щоб система на основі клітини прокаріот забезпечувала можливість гомологічної рекомбінації. Такі системи включають систему рекомбінації лямбда ред, яка описана в заявці на Європейський патент EP-A-1291420. Переважно, щоб спосіб одержання рекомбінантної бакміди був реалізований в E.coli. Особливо переважно, щоб спосіб був реалізований із застосуванням клітин E.coli лінії EL350, які містять і інтегрований профаг лямбда, що експресує exo, bet і gam під контролем регульованого температурою промотору lambdaPL, і рекомбіназу Cre під контролем промотору, що індукує арабинози. Спосіб одержання рекомбінантної бакміди можна повторювати декілька раз так, щоб бакміда могла містити декілька гетерологічних генів, тобто, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше гетерологічних генів. При спробах застосування різних промоторів для експресії кожного вбудованого гена, і якщо кожен ген вбудований у відмінний генетичний локус, можна скоротити або уникнути повторів у бакміді й тим самим гарантувати хорошу генетичну стабільність бакміди. Також переважно, щоб між вбудованими гетерологічними генами був розташований щонайменше один незамінний ген. Таке розташування гарантує, що якщо між будь-якими з вбудованих послідовностей відбудеться гомологічна рекомбінація, незамінний ген буде вилучений, і утвориться нежиттєздатна бакміда. Відповідно до третього аспекту даного винаходу запропонована рекомбінантна бакміда, яка одержана за допомогою способу, що відповідає другому аспекту даного винаходу. Зазначена бакміда містить вбудований ген, а також може містити залишки послідовностей LoxР. Ці залишки можна застосовувати як маркери для ідентифікації бакмід. Переважно, щоб бакміда містила щонайменше 5, 6, 7, 8 або 9 гетерологічних генів. Відповідно до четвертого аспекту даного винаходу також запропонований спосіб одержання рекомбінантного бакуловірусу, що включає культивування еукаріотичних клітин, які містять рекомбінантну бакміду, одержану за допомогою способу, що відповідає другому аспекту даного винаходу в умовах, у яких утворюється бакуловірус. Переважно, еукаріотичні клітини являють собою клітини комах, більш переважно, їх одержують з комах Spodoptera frugiperda або Trichoplusia ni, наприклад, клітини комах Sf21, Sf9 або TN 5B-1-4. Бакуловірус можна виділити за допомогою стандартних методик і можна протестувати експресію вбудованих гетерологічних генів. Відповідно до п'ятого аспекту даного винаходу також запропонований рекомбінантний бакуловірус, одержаний за допомогою способу, що відповідає четвертому аспекту даного винаходу. Відповідно до шостого аспекту даного винаходу також запропонована рекомбінантна бакміда або рекомбінантний бакуловірус, які експресують сукупність гетерологічних білків, які відрізняються тим, що кожен білок експресується з окремого генетичного локусу зазначених бакміди або бакуловірусу. Також переважно, щоб між кожним генетичним локусом, який 4 UA 106733 C2 5 10 експресує гетерологічний білок, був розташований щонайменше один незамінний ген. Таке розташування гарантує, що якщо між генетичними локусами, які експресують гетерологічний ген, відбудеться гомологічнаа рекомбінація, зазначений незамінний ген буде вилучений, і утвориться нежиттєздатна бакміда або бакуловірус. Переважно, щоб зазначені бакміда або бакуловірус експресували щонайменше 3, більш переважно щонайменше 5, а найбільш переважно щонайменше 8 білків. Зазначені білки є гетерологічними, тобто, їх не кодують існуючі в природі бакуловіруси. Також переважно, щоб кодовані гетерологічныі білки були субодиницями білкового комплексу, такого як ВПЧ, комплекс рецептора або комплекс шаперонів. Також переважно, щоб окремі генетичні локуси рекомбінантної бакміди або бакуловірусу були обрані з: ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2, odv-e56 і p10. Положення таких локусів спеціально описане стосовно бакуловірусу AcMNPV у Таблиці 1. Фахівці в даній галузі техніки можуть легко визначити положення локусів в інших штамах бакуловірусів і бакмід на основі цієї інформації. Таблиця 1 Генетичні локуси, що зазначені вище, визначені нижче стосовно еталонної послідовності доступу для AcMNPV (номер доступу NC001623). Локус ctx egt 39k orf51 gp37 iap2 p35 pl odv-e56 Граничні точки 2028-2296 11310-13091 29196-30070 43154-44337 52192-52327 60983-61823 116282-117460 118767-119135 128947-130166 15 20 25 30 35 40 Відповідно до сьомого аспекту даного винаходу також запропоновані рекомбінантна бакміда або рекомбінантний бакуловірус, у яких касету експресії, яка кодує гетерологічний білок, вбудовують в один або більше з наступних генетичних локусів: ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 і odv-e56. Було показано, що зазначені генетичні локуси специфічним чином сприяють високому рівню експресії гетерологічного білка, не порушуючи ключових функцій бакміди або бакуловірусу. Переважно, щоб рекомбінантна бакміда або рекомбінантний бакуловірус кодували сукупність білків, і кожна касета експресії була вбудована в окремий генетичний локус. Також переважно, щоб рекомбінантна бакміда або рекомбінантний бакуловірус кодували щонайменше 3, більш переважно щонайменше 5, а найбільш переважно щонайменше 8 білків. Також переважно, щоб кодуємі гетерологічні білки були субодиницями білкового комплексу, такого як ВПЧ, комплекс рецептора або комплекс шаперонів. Відповідно до восьмого аспекту даного винаходу також запропонований вектор перенесення для вбудовування гена в генетичний локус послідовності бакуловірусу, який містить: касету експресії, яка містить еукаріотичний промотор, функціонально пов'язаний з геном; і послідовності, які фланкують касету експресії, причому зазначені послідовності в значній мірі відповідають послідовностям генетичного локусу в послідовності бакуловірусу, при цьому зазначений генетичний локус вибирають із числа: ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 і odv-e56. Як зазначено вище, було показано, що при вставці гена в перераховані генетичні локуси можна одержати високий рівень експресії гена без порушення ключових функцій послідовності бакуловірусу. Відповідно до дев'ятого аспекту даного винаходу також запропонований спосіб одержання рекомбінантної бакміди, який включає: об'єднання бакміди й вектора перенесення, який відповідає восьмому аспекту даного винаходу, для забезпечення проходження гомологічної рекомбінації; і селекцію рекомбінантної бакміди, яка містить касету експресії. 5 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Способи одержання такої рекомбінантної бакміди й відбору такої бакміди добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Згідно із даним винаходом також запропонована рекомбінантна бакміда, що одержана зазначеним способом. Відповідно до десятого аспекту даного винаходу також запропонований спосіб одержання рекомбінантного бакуловірусу, який включає одержання рекомбінантної бакміди за допомогою способу, запропонованого в даному винаході, і культивування еукаріотичної клітини, яка містить зазначену бакміду з одержанням бакуловірусу. Способи одержання такого рекомбінантного бакуловірусу добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Згідно із даним винаходом також запропонований рекомбінантний бакуловірус, що одержаний зазначеним способом. Згідно із даним винаходом також запропонована клітина, яка містить вектор перенесення, бакміду або бакуловірус, які відповідають будь-якому з аспектів даного винаходу. Згідно із даним винаходом також запропонований спосіб одержання одного або більше білків, який включає культивування рекомбінантної бакміди або бакуловірусу, які відповідають будь-якому з аспектів даного винаходу, у підходящих умовах. Зазначені один або більше білків кодуються одним або більше генами і можуть поєднуватися, утворюючи білковий комплекс, такий як ВПЧ, комплекс рецептора або комплекс шаперонів. Один або більше білок можна ізолювати за допомогою стандартних методик, добре відомих фахівцям у даній галузі техніки. Нижче даний винахід як приклад описаний стосовно наступних фігур. На Фігурі 1 показаний покращений відбір рекомбінантів, що одержані клонуванням ET. А) Схема ДНК, що застосовується для рекомбінації гена cat (хлорамфеніколацетилтрансферази) і подвійних рекомбінацій. Обидві конструкції містять однакові фланкуючі послідовності бакуловірусу (AcMNPV), касету експресії люциферази Renilla (Pp35-Rluc-Tph) і сайти LoxР (LoxР). Подвійний селектуємий маркер також містить ген стійкості до зеоцину (ZeoR) і фрагмент LacZa. У стійкої до хлорамфеніколу конструкції його заміняють на ген cat. В) Кількість позитивних колоній бактерій після рекомбінації ET. ДНК, яку застосовують для рекомбінації, одержували або за допомогою ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції), або шляхом розщеплення рестрикційної ендонуклеази, як зазначено. С) Правильність вбудовування касети експресії Rluc підтверджували за допомогою ПЛР із застосуванням одного праймера в Т-ДНК і одного фланкування цільового локусу в ДНК бакуловірусу. Належний продукт ПЛР (показаний стрілкою) можна одержати тільки після належної інтеграції. Показано результати 12 незалежних рекомбінацій (1–12), відсутність зразка контролю ПЛР (13), зразок немодифікованої бакміди (14) і зразок Т-ДНК (15). Доріжка М – це маркер ДНК. D) Активність люциферази Renilla (відносні світлові одиниці) через 48 годин після інфікування в лізаті клітин, інфікованих пересіванням 2 рекомбінантних бакмід 1–12 з панелі С. Фонова активність еквівалентна активності лізатів неінфікованих клітин, і кількість клітин, інфікованих немодифікованою бакмідою (AcMNPV) була більш ніж в 106 раз меншою. На Фігурі 2 показане селективне видалення маркерних генів. А) Схема, що ілюструє стратегію ET рекомбінації касети експресії (експресії) у ДНК бакміди AcMNPV і селективне видалення тільки маркерних генів (відбір) за допомогою опосередковуваної Cre рекомбінації. B) ПЛР із застосуванням праймерів a і b в А, доріжки 1-2: два незалежних рекомбінанти бакміди після ET рекомбінації, доріжки 3-6: чотири незалежних рекомбінанти після опосередковуваної Cre рекомбінації з метою видалення селектованих маркерів бактерій, доріжка 7: немає зразка, доріжка 8: зразок ДНК немодифікованої бакміди, доріжка 9: зразок ДНК плазміди, яка містить касету селектованого маркера, доріжка 10: маркер ДНК. Продукти ПЛР, які відповідають розмірам, прогнозованим для вихідних і рекомбінантних продуктів опосередковуваної Cre рекомбінації, позначені як Р і R, відповідно. С) Файл трасування послідовностей репрезентативного рекомбінанту з аналізу ПЛР на панелі В, що підтверджує наявність дефективного LoxР, який включає плечі Lox71 і Lox66, що відображають рекомбінант, нездатний піддатися подальшій опосередковуваній Cre рекомбінації. D) Активність люциферази Renilla для вихідних і рекомбінантних бакмід, показаних на панелі В, при їхній трансфекції в клітини комах. Активність люциферази Renilla оцінювали через 48 годин після інфікування після пересівання рекомбінантого вірусу. Фонова активність неінфікованих клітин відзначена позначенням "Клітини". На Фігурі 3 показана ідентифікація додаткових сайтів експресії рекомбінантних білків у геномі AcMNPV. А) Схема AcMNPV, яка ілюструє відносні положення локусів, застосовуваних для експресії білків. В) Таблиця, у якій зазначені локуси, застосовувані для вбудовування, і будь-які додаткові зміни, зроблені в локусі. С) Відносна активність люциферази Renilla через 48 годин після інфікування вірусом, який модифікований таким чином, щоб він містив додаткову касету експресії люциферази світлячка в кожному зазначеному локусі. Всі віруси містять 6 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 однакову касету експресії люциферази Renilla у локусі р10 під контролем промотору р35. Планки погрішностей відбивають стандартне відхилення для п'яти повторів кожного локусу. D) Нормована активність люциферази світлячка, яка відбиває відносну експресію касети з промотору поліедрину – термінатора поліедрину люциферази світлячка, що вбудована в кожен локус, як зазначено. Планки погрішностей відбивають стандартне відхилення для 5 повторів для кожного локусу. Активність люциферази світлячка нормували на контроль люциферази Renilla, що експресується з того ж генома. Вставки люциферази світлячка в локуси orf11, v-fgf, pe і orf23 були виключені, оскільки рівень активності люциферази Renilla був більш ніж на 2 логарифмічні одиниці нижчим, ніж у контрольного вірусу. Вірус Ph містить ген люциферази світлячка в локусі поліедрину, а ген люциферази Renilla у локусі р10. Вірус Ph* містить таку ж вставку гена люциферази Renilla у локусі р10, але не містить вставки гена люциферази світлячка. На Фігурі 4 показана експресія білка оболонки вірусу грипу М1 з локусів egt і поліедрину. На лівій панелі показаний забарвлений Кумасі поліакриламідний гель із додецилсульфатом натрію (SDS PAGE) усього білка з клітин, що інфіковані контрольним бакуловірусом (доріжки 1 і 4), egtMl (доріжка 2) і YM1-M1 (доріжка 3). Розміри білків-маркерів (доріжка М) зазначені ліворуч від гелю. На панелі праворуч показаний результат вестерн-блотінгу подвійного гелю, аналізованого за допомогою антисироватки анти-H7N7. На Фігурі 5 показана спільна експресія білків оболонки вірусу грипу М1 і HA, а також утворення ВПЧ. А) На панелі ліворуч показаний забарвлений Кумасі гель всіх білків; на панелі праворуч показаний результат вестерн-блотінгу подвійного гелю, аналізованого за допомогою антисироватки проти вірусу грипу H7N7. Клітини інфікували подвійним бакуловірусом, що експресує і HA, і М1 (доріжка 1), бакуловірусом, що експресує тільки HA (доріжка 2), клітини контролю (доріжка 3), бакуловірусом, що експресує тільки М1 (доріжка 4). В) Електронномікроскопічні знімки ВПЧ вірусу грипу, з негативним забарвленням. С) ВПЧ вірусу грипу після імунного забарвлення золотом (HA); частки золота показані стрілками. На Фігурі 6 показане одержання бакуловірусу, який одночасно експресує 4 білки. А) Лізат клітин, інфікованих бакуловірусом, який експресує VP2 (доріжка 1), VP5 (доріжка 2), VP3 (доріжка 3) і VP7 (доріжка 4), неінфікованих клітин (доріжка 5) або всіх 4 білків (доріжки 6-10), положення білків-маркерів (М) і розмір у кДа, як зазначено. В) Лізат клітин, які експресують VP5, VP2, VP3, VP7 (доріжки 1-4) і частково очищені ВПЧ (доріжка 5). С) У таблиці зазначений локус вбудовування і промотор вірусу, застосовуваний для експресії кожного білка ВПЧ. D) Електронно-мікроскопічні знімки негативного забарвлення при імунному забарвленні золотом (для VP5), якіц показують очищені ВПЧ BTV. На Фігурі 7 показані кристалічні пластинки, утворені при гіперекспресії CCT5. Чотирикутні агрегати білків у живильному середовищі дуже пізнього інфікування бакуловірусом, який експресує CCT5. На Фігурі 8 показана експресія CCT у клітинах комах. А) Забарвлений Кумасі лізат клітин, інфікованих бакуловірусом, який експресує CCT1-CCT8 (доріжки 1-8, відповідно), тільки клітини (доріжка 9) або тільки бакуловірус, який одночасно експресує 7 субодиниць CCT (доріжка 10). В) Результат вестерн-блотінгу подвійного гелю із застосуванням антисироватки з поліклональних анти-CCT антитіл миші. С) У таблицях зазначені різні генетичні локуси та промотори, застосовувані для експресії кожної із субодиниць CCT. ПРИКЛАДИ Система експресії на основі бакуловірусу має твердо встановлений потенціал для одержання великих кількостей правильно скручених білків еукаріот для досліджень ферментів і структурних досліджень. Однак стає все очевидніше, що багато, якщо не більшість, білків є активними в клітинах у складі комплексів, утворених продуктами декількох різних генів. При зростаючому темпі відкриттів в області структури білків існує реальна потреба в системах для швидкого й надійного одержання і очищення комплексів білків. Зокрема, це справедливо для великих комплексів, які потребують одночасної експресії, а також скручування й процесінгу декількох субодиниць білків у клітині еукаріот. Раніше винахідники розробили вектори перенесення на основі бакуловірусу, які здатні до експресії 2, 3, 4 і 5 білків з генома одного бакуловірусу. У попередніх дослідженнях головна мета винахідників була в одержанні системи, що здатна синтезувати великі кількості комплексів білків вірусу, які містять не еквімолярні кількості кодуємих вірусом білків для досліджень ферментів і структурних досліджень. Одне зі спостережень, зроблених при роботі із зазначеними системами, полягає в тому, що окремий бакуловірус, який експресує декілька генів, утворює бажані комплекси білків набагато ефективніше, ніж клітини комах, що інфіковані спільно декількома бакуловірусами, які експресують окремі гени. У даному дослідженні 7 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винахідники застосували нові технології для розробки цього спостереження для одержання рекомбінантних бакуловірусов, які експресують декілька білків для створення біологічно значимих комплексів білків ссавців. Зокрема, винахідники адаптували й удосконалили нові технології конструювання хромосом бактерій для швидкого й ефективного одержання рекомбінантних бакуловірусів, які одночасно експресують декілька білків. Нові розроблені системи є в 30 раз більш ефективними, ніж традиційні процеси, і вони дозволяють виробляти стандартну вставку генів у будь-який локус геному бакуловірусу. Ці дослідження дозволили ідентифікувати 7 нових генетичних локусів у геномі бакуловірусу, які дозволяють проводити експресію рекомбінантних білків на високому рівні. Крім того, винахідники продемонстрували, що можна проводити багаторазово повторювані цикли рекомбінації, що дозволяє генерувати геноми вірусів, які експресують декілька білків у комплексі в результаті вставок окремих генів. Наприклад, винахідники експресували комплекси білків ВПЧ для вірусу грипу А (підтип Н7) і вірусу катаральної лихоманки овець (серотип 1), а також 8 субодиниць комплексу шаперонів ссавців CCT (TCP), який знаходяться у центрі уваги в дослідженнях раку. МАТЕРІАЛИ Й МЕТОДИ Вбудовування окремого гена в декілька локусів у E.coli одержують за допомогою рекомбінації лямбда ред (Lambda red). Винахід включає застосування локусів бакуловірусу, які раніше не застосовували для експресії декількох білків, і включення селектованих маркерів, які можна видаляти з генома бакуловірусу і надалі застосовувати повторно. На відміну від інших систем гени рекомбінантних білків не фланкують повторами, щоб підвищити їхню генетичну стабільність. Вектори перенесення містять область AcMNPV для керування гомологічною рекомбінацією, касету експресії (промотор AcMNPV, полілінкер, сигнал поліаденілірування) і касету селекції бактерій. Застосовуваний промотор AcMNPV одержують із пізнього (наприклад, р35) або дуже пізнього (поліедрин, р10) гена вірусів. Касета селекції бактерій включає мутантний сайт LoxР – селектуємий маркер бактерій – мутантний сайт LoxР. Мутантні сайти LoxР є варіантами Lox66 і Lox71 (9). Сайти LoxР для кожного селектуємого маркера конструюють так, щоб при рекомбінації маркер віддалявся шляхом руйнування сайту LoxР, який залишається. Кожен селектуємий маркер містить різні мутантні плечі LoxР, щоб не відбувалася рекомбінація між генами різних селектуємих маркерів, які введені в той самий бакуловірус. Вибір системи, застосовуваної для експресії рекомбінантних білків з декількох локусів План оригінального дослідження включав застосування гомологічної рекомбінації в клітинах комах або альтернативний спосіб ET рекомбінації в E.coli, що дає можливість ефективного вбудовування касет експресії для рекомбінантних білків у різних локусах в геномі бакуловірусу. Раніше одержані нами дані вказують на те, що лінеаризація вектора перенесення призводить до значного збільшення частоти рекомбінації (до ~30 %) у локусі (р10), який не демонстрував позитивного відбору, крім виробленого рекомбінантного білка. На початку проекту дослідження були розглянуті дві системи (ET рекомбінація та рекомбінація в клітинах комах) у зв'язку з їхньою відтворюваністю й часом, який займає вся вставка рекомбінантного гена в конкретний локус і перевірка експресії одержуваного білка. Що стосується часу, який займає кожен цикл експресії, система ET рекомбінації відбувалася швидше, в основному внаслідок скорочення часу, необхідного для підготовки генома бакуловірусу до вставки генів у другий генетичний локус бакуловірусу. Крім того, було можливо створити підхід, який дозволяє підтверджувати генетичні вставки незалежно від експресії трансгена, і, отже, потреба у вирощуванні вірусу в клітинах комах для перевірки експресії ставала менш критичною, ніж для системи, яка повністю основана на клітинах комах. По-друге, хоча в систему бакуловірусу можна вводити маркер і вставляти гени спільно, число таких маркерів обмежене, і кожен з них можна застосовувати тільки один раз. Оскільки однією із задач проекту була експресія комплексу CCT миші (TCP1) (8 субодиниць), на ранній стадії як пріоритетний напрямок дослідження був обраний підхід ET рекомбінації, оскільки ця система була швидше, і вона більшою мірою здатна пристосуватися до множинних генетичних вставок. ПРИКЛАД 1 Розробка реагентів, які дозволяють проводити ефективний відбір ET рекомбінантів. Перші експерименти із застосуванням підходу ET були невдалими. Були проведені експерименти, в яких ген-репортер (люцифераза) вводили в штучну хромосому бактерії, яка містить повний геном AcMNPV (бакміду) і проводили відбір за геном стійкості до хлорамфеніколу, який був інтегрований з геном-репортером люциферази. Хоча були виявлені стійкі до хлорамфеніколу колонії бактерій, наступний аналіз показав, що вони не містили належним чином модифікованої бакміди з геном-репортером люциферази. Аналогічні 8 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 результати були одержані, коли ген-репортер, що призначений для експресії в клітинах комах тільки в присутності реплікуючого AcMNPV, був замінений на GFP (зелений флюоресцентний білок). Однак коли конструкцію з GFP застосували для рекомбінації популяції E.coli, без відбору із хлорамфеніколом, і приготували ДНК бакміди для всієї трансформованої популяції E.coli, то зазначена ДНК при трансфекції її в клітини комах призвела до утворення декількох вогнищ флюоресценції (Sf21). Ці дані показали, що проблема полягала не в рекомбінації як такій, а в наступному за рекомбінацією відборі бактерій, які містять вставки. Щоб вирішити цю проблему, винахідники розробили нову касету селекції, яку включали в систему подвійних маркерів на основі фрагмента LacZa і гена стійкості до Зеоцину, фланкуємих модифікованими сайтами рекомбінації LoxР (Фігура 1, А). Застосовуючи дану систему, в чашки для відбору додавали достатню кількість Зеоцину, щоб скоротити, але не знищити фоновий ріст колоній, і відбирали рекомбінанти на основі синього фенотипу колоній у присутності IPTG і X-gal. Щоб оцінити відносну ефективність виділення рекомбінантів при застосуванні систем хлорамфеніколу (cat) і подвійної селекції, винахідники провели експеримент, у якому компетентні для рекомбінації E. coli, що містять немодифіковану бакміду, піддавали електропорації із введенням 30 нг (~12,5 фмоль) або касети на основі хлорамфеніколу, або касети подвійної селекції (Фігура 1, В). Оскільки ідеальна система для введення послідовностей, які кодують чужорідні білки, не може включати багаторазову ПЛР вбудованого гена, винахідники також зрівняли ефективність рекомбінації між ДНК, амплвфікованою за допомогою ПЛР, що є стандартом для ET рекомбінації, і ДНК, виділеною за допомогою рестрикційних ендонуклеаз, очищеною в гелі. Для ПЛР розробили такі праймери, щоб кінці продуктів ПЛР відповідали кінцям фрагментів, виділених за допомогою рестрикційних ендонуклеаз. Подвійний відбір призвів до 20-кратного збільшення кількості позитивних колоній у порівнянні з відбором тільки на основі хлорамфеніколу, коли рекомбінуючі фрагменти ДНК генерували за допомогою ПЛР, і до 30-кратного збільшення, коли фрагменти ДНК виділяли шляхом розщеплення ДНК плазміди рестрикційними ендонуклеазами (Фігура 1, В). Ці розходження були значимими (критерій Ст'юдента, p=0,03). Для відбору на основі хлорамфеніколу між кількістю колоній, одержаних з ДНК із ПЛР та з ДНК, згенерованої рестрикційними ендонуклеазами, розходжень не було. Однак для подвійного відбору середня кількість колоній була в чотири рази більшою для ДНК, що одержана за допомогою рестрикційних ендонуклеаз, ніж для ДНК, що ампліфікована шляхом ПЛР (критерій Ст'юдента, p=0,05). Для підтвердження, що рекомбінанти, які одержані за новим подвійним відбором, були правдивими і представляють модифіковану бакміду, яка містить вбудовану конструкцію експресії, проводили ПЛР на ДНК бакміди, виділеної з позитивних колоній. Один праймер розробили для послідовності всередині маркера стійкості до Зеоцину, а інший праймер був спрямований на послідовність, що є присутньою тільки в ДНК бакміді, яка фланкує правильний сайт вбудовування, але не в Т-ДНК. Таким чином, продукт ПЛР можна одержати тільки тоді, коли між лінійною ДНК, застосовуваною для рекомбінації, і бакмідою відбулася рекомбінація. За допомогою даного способу тестували зразки ДНК 12 окремих бакмід (Фігура 1С, доріжки 1-12), всі вони були позитивні стосовно продукту, що вказує на правильно спрямовану рекомбінацію. Навпаки, ні ДНК однієї тільки бакміди, ні ДНК плазміди, що містить фрагмент ДНК, застосовуваний для рекомбінації, не могли служити матрицею для одержання продукту ПЛР (Фігура 1С, доріжки 14 і 15, відповідно). Щоб одержати подальше підтвердження того, що рекомбінація призвела до утворення інфекційного рекомбінантного бакуловірусу, клітини Sf21 трансфікували тими ж 12 клонами ПЛР-позитивних бакмід, і пересіяли двічі, потім через 48 годин після інфікування оцінювали активність люциферази Renilla у клітинах, інфікованих кожним з рекомбінантів. Клітини, інфіковані кожним з 12 рекомбінантних вірусів, мали активність люциферази Renilla, яка в 106 раз перевищувала фонову активність (Фігура 1,D). На основі зазначених даних у подальших дослідженнях винахідники перейшли до застосування подвійного відбору. ПРИКЛАД 2 Опосередковуване Cre видалення селектуємого маркера дозволяє проводити декілька циклів рекомбінації з тим самим подвійним відбором. Для експресії комплексів білків з декількох різних субодиниць із застосуванням вставок в один локус, розробили таку систему подвійного маркера, щоб касета селекції була фланкована модифікованими сайтами LoxР. Зазначені сайти поєднують у собі як мутації Lox66 і Lox71, які обмежують опосередковувану Cre рекомбінацію до одного циклу (1), так і мутацію в спейсері, що знижує гомологію із сайтами LoxР дикого типу. Таким чином, інкубація модифікованої бакміди з рекомбіназою Cre призводить до видалення подвійного селектуємого маркера і до інактивації сайту рекомбінації LoxР, але залишає на місці касету експресії бакуловірусу (Фігура 9 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2А). Щоб підтвердити, що цю стратегію можна успішно застосовувати для конструювання множинних вставок у ДНК бакміди, Cre-рекомбінацію застосовували для видалення подвійного маркера з бакміди, в яку був вбудований ген-репортер люциферази Renilla. Рекомбінацію проводили в E.coli із застосуванням лінії клітин EL350 (2), яка містить і інтегрований профаг лямбда, який експресує exo, be, і gam під контролем регульованого температурою промотору, і рекомбіназу Cre під контролем індукуємого промотора арабінози. Клітини EL350, які містять три бакміди, модифіковані з метою включення вставки люциферази Renilla для подвійної селекції (Фігура 1), індукували арабінозою, потім наносили на чашки, що містять канаміцин для відбору бакмід і X-gal для відбору колоній, які втратили селектуємий маркер у опосередковуваній Cre рекомбінації. ДНК бакміди очищали від чотирьох передбачуваних рекомбінантів, а опосередковану Cre рекомбінацію підтверджували ПЛР із застосуванням праймерів, що фланкують селектуємі маркери (Фігура 2В). Всі чотири рекомбінанти містили продукти ПЛР, що за розміром відповідають продуктам, очікуваним при успішній Cre-рекомбінації. Надалі це підтверджували секвенуванням за модифікованим сайтом LoxР 4 рекомбінантів (Фігура 2С). Рекомбінанти містили ушкоджений сайт LoxР s, що включав мутації й Lox71, і Lox66, і не був компетентний відносно наступних циклів рекомбінації. Щоб одержати подальше підтвердження того, що рекомбінанти бакмід, одержані при опосередковуваній Cre рекомбінації, є життєздатними в клітинах комах, ДНК бакмід трансфікували в клітини комах і, як раніше, оцінювали активність люциферази після двох пересівань. Всі рекомбінанти демонстрували активність люциферази Renilla, яка була еквівалентна активності для вихідних бакмід до Creрекомбінації (Фігура 2D). ПРИКЛАД 3 Ідентифікація генетичного локусу в геномі бакуловірусу, який підходить для інтенсивної експресії гетерологічних білків. Незважаючи на роботу з екстенсивної експресії білків, яку проводили на системі експресії на основі бакуловірусу, в основному експресія була зосереджена на заміщенні генів поліедрину або р10 з метою експресії рекомбінантних білків. У відносно невеликому числі літературних джерел описується застосування альтернативних локусів для експресії рекомбінантних білків. Щоб перевірити, чи можна ефективно застосовувати відбір у різних генетичних локусах бакуловірусу, на одній з бакмід, що вже містить ген люциферази Renilla, проводили другий цикл рекомбінації. У цих експериментах той же промотор поліедрину – люцифераза світлячка – термінатор поліедрину вставляли незалежно всього у 13 різних генетичних локусів (ctx, 25 orf11, egt, orf23, v-fgf, 39k, orf51, gp37, iap2, chi, pe, odv-el8 і odv-e56), генеруючи бакуловірус із подвійною експресією для білків люциферази Renilla і люциферази світлячка (Фігура 3А). Локуси вибирали як сайти вбудовування в цих експериментах шляхом визначення, які гени бакуловірусу не є ключовими для росту вірусу в культурі тканини, і яке розташування генів бакуловірусу в конкретних локусах сприяє вставці додаткової касети експресії. Проте, у деякі локуси вносили деякі додаткові зміни, зокрема зміни, які призвели до виключення конкретних генів бакуловірусу (Фігура 3В). Рекомбінантні віруси пересівали двічі в клітини комах Sf21, і на третьому пересіванні клітини збирали через 48 годин після інфікування, лізували й оцінювали в них активність люциферази світлячка й Renilla. Активність люциферази Renilla застосовували як маркер реплікації вірусів і експресії білка, оскільки всі рекомбінанти містили однакову касету люциферази Renilla, яка запускається промотором р35, у локусі р10. Експресію люциферази світлячка в кожному новому локусі порівнювали з експресією у віруса, який містить ген люциферази світлячка в локусі поліедрину й такого ж еталонного гена люциферази Renilla. З 13 досліджуваних локусів, 9 демонстрували активність люциферази Renilla, яка перевищує фонову 5 активність щонайменше в 10 раз, і з них 8 (ctx, egt, orf51, gp37, iap2, chi, odv-el8 і odv-e56) демонстрували активність люциферази Renilla, яка дорівнювала або перевищувала активність, вимірювану тільки для вихідної люциферази Renilla, і для контролів люциферази світлячка в локусі поліедрину (Фігура 3С). Чотири локуси (prf11, v-fgf, pe і orf23), які призвели до утворення вірусу, який демонструє активність люциферази Renilla, що перевищувала фонову активність не більше 10 раз, виключили з подальшого аналізу. Для інших вірусів активність люциферази Renilla застосовували як еталонне значення для нормування активності люциферази світлячка й обчислення міри відносної експресії люциферази світлячка з кожного локусу (Фігура 3D). 7 локусів (ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 і odv-e56) демонстрували активність люциферази світлячка, яка перевищувала щонайменше в 10 раз фонову активність, і активність, аналогічну фоновій, коли той же ген експресувався з локусу поліедрину (Фігура 3D). Два віруси (chi і odv-el) демонстрували високий рівень активності люциферази Renilla, але відносно низьку експресію люциферази світлячка. 10 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дане дослідження показало, що можлива інтенсивна експресія чужорідних білків з декількох генетичних локусів у геномі бакуловірусу, і дозволило ідентифікувати сім локусів (ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 і odv-e56) крім поліедрину й р10, які забезпечують хорошу експресію. Із цих сайтів 39k, orf51 і gp37 забезпечують вбудовування в ДНК, фланкуючу кодуючу область гена, що безпосередньо не порушує експресію білків. Навпаки, можна очікувати, що вбудовування в ctx, egt, iap2 і odv-e56 буде перешкоджати експресії відповідних білків з даних генів. Перші три із зазначених генів раніше описували як не ключові гени для росту вірусу в культурі клітин (3-6). Також повідомляли про вкорочення білка ODV-E56 (7). Серед локусів, які не давали хорошої експресії гена-репортера люциферази світлячка, чотири (orf11, v-fgf, pe і orf23) також призводили до зниженої експресії білка-маркера люциферази Renilla, який був присутній у всіх рекомбінантах. Оскільки дослідження було зосереджено на ідентифікації сайтів, які підходять для вбудовування експресуючих конструкцій з дуже пізнім промотором, точну причину такої зниженої експресії не з'ясовували. Можливі пояснення включають локус-специфічні ефекти на реплікацію або транскрипцію вірусу і порушення цілісності елементів ключових промоторів або енхансерів для фланкуючих генів. Низький рівень експресії люциферази світлячка у вірусах із вставками в локуси chi і odv-e18 був непередбаченим за різними причинами. В інших публікаціях є відомості про те, що реєстрували вставку касет експресії рекомбінантних білків у локус chi (8, 9). Можливо, що знижений рівень експресії, спостережуваний відносно гена люциферази світлячка в цьому локусі в наших експериментах, пов'язаний з ефектами на гени, які фланкують вставку. Для odv-e18 в останніх публікаціях, де застосовували той самий мутантний вірус, висувають припущення, що даний білок є ключовим для наробітку отпочкованих вірусів і переміщення від клітини до клітини (10, 11). Зазначені дослідження були основані на мутантах, у яких мала місце делеція в кодуючій послідовності локусу odv-el8 і у фланкуючому гені, що лежить вище. В експериментах, де локус odv-el8 інактивували за допомогою мутації ATG кодуючої послідовності на GAT і згодом вставляли касету люциферази світлячка в цій точці в гені, вдавалося виділити інфекційний вірус. Експресія люциферази Renilla при третьому пересіванні еквівалентна експресії у вихідному вірусі вказує на те, що порушення здатності цього мутантного вірусу до реплікації не відбувалося. Однак, якщо взяти до уваги зниження рівня люциферази світлячка ~ на 2 лог. одиниці в порівнянні з рівнем у віруса без зазначеної мутації, не можна виключати можливість того, що маленька популяція вірусів, у якій мутація піддалася репарації, доповнювала другу популяцію, яка експресує ген-репортер. ПРИКЛАД 4 Експресія комплексів білків із застосуванням мультилокусної експресії в бакуловірусу Приклад 3 присвячений застосуванню генів-репортерів для кількісної оцінки потенціалу різних локусів бакуловірусу до експресії рекомбінантного білка. Щоб з'ясувати, чи можна експресувати і виділити комплекси рекомбінантних білків, були, як об'єкт, обрані три специфічних комплекси з різним числом субодиниць білків. Вірусоподібні частки для вірусу грипу (А/ізоляція/маса/1/80) підтипу Н7 одержували шляхом спільної експресії білків вірусу М1 і НА (комплекс із 2 білків), а для вірусу катаральної лихоманки овець (BTV) серотипу 1 – шляхом спільної експресії VP2, VP3, VP5 і VP7 (комплекс із 4 білків). Крім того, як об'єкт вивчення, винахідники вибрали експресію всіх 8 субодиниць комплексу шаперонів миші CCT, щоб застосовувати його для подальших функціональних і структурних досліджень. ВПЧ вірусу грипу А Для цих експериментів всі гени вірусу грипу брали в адаптованого для лінії мишей штаму H7N7 (А/ізоляція/маса/1/80), одержаного від дослідників у Марбургському університеті імені Філіпа, Німеччина. Щоб перевірити, чи здатна мультилокусна система експресії виробляти комплекси з двох білків, спочатку кодуючу послідовність білка М1 вірусу грипу А вставляли в локус egt під контролем промотора поліедрину. Для порівняння той же ген вставляли в традиційний вектор експресії бакуловірусу (pAc-YMl), який направляє локус поліедрину. Після рекомбінації обидва одержуваних бакуловіруси експресували білок М1. Рівень експресії білка з локусів egt і поліедрину був значно вищим, ніж рівень експресії будь-якого іншого білка вірусу або клітини в клітинах, інфікованих бакуловірусом, при оцінці методом SDS-PAGE з забарвленням Кумасі (Фігура 4). Щоб згенерувати подвійний вірус, який експресує і М1, і HA, касету селекції бактерій видаляли з експресуючої М1 бакміди за допомогою Cre-рекомбінації, а ген HA з того ж штаму вірусу грипу (А/ізоляція/маса/1/80) вставляли в локус p10 за допомогою другого циклу рекомбінації ET. Спільну експресію М1 і НА з одержаного вірусу підтверджували за допомогою SDS-PAGE і вестерн-блотінгу, як зазначено вище (Фігура 5А). Крім того, ВПЧ вірусу грипу 11 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ізолювали із середовища культивування інфікованих клітин, очищали за допомогою ультрацентрифугування в градієнті щільності й візуалізували за допомогою ЕМ аналізу з негативним забарвленням (Фігура 5В). Щоб гарантувати, що візуалізовані ВПЧ дійсно були вірусами грипу, частки імунологічно мітили золотом із застосуванням антитіл, специфічних для HA вірусу грипу (Фігура 5С). У сукупності зазначені дані були надійним доказом того, що мультилокусний підхід можна з успіхом застосовувати для експресії рекомбінантних білків, і що на практиці він може служити для одержання такого рекомбінантного вірусу за допомогою двох циклів вбудовування системи подвійного селектуємого маркера. Інші досліджувачі активно вивчали ВПЧ вірусу грипу і показали, що він має імуногенність у мишей і тхорів. Цей спосіб конструювання ВПЧ має ту перевагу, що він дозволяє одержати геном бакуловірусу з М1, уже заздалегідь інтегрованим і готовим до експресії. Таким чином, для одержання ВПЧ необхідно провести тільки один цикл рекомбінації для додавання гена НА з будь-якого підтипу вірусу грипу, що активно формується, який потрібен для виробництва вакцини. Для вакцин проти грипу, основаних на ВПЧ вірусу грипу, спосіб може спростити необхідне клонування і потенційно збільшити швидкість, з якою можна одержати нові типи ВПЧ. ВПЛ BTV1 На відміну від вірусу грипу, в якого ВПЧ можна сформувати шляхом експресії всього двох білків, ВПЧ BTV вимагає координованої експресії чотирьох структурних білків (VP2, VP3, VP5 і VP7). Щоб краще продемонструвати застосованість нової системи для рекомбінації, одержували віруси, які експресували кожен білок окремо і комбінацію всіх чотирьох структурних білків BTV (Фігура 6). Одна з переваг нової системи полягає в тому, що віруси, що експресують окремі білки й декілька білків, можна одержати з того самого набору векторів перенесення. Це полегшує одержання контрольних вірусів, що експресують окремі білки, які служать маркерами положення білків, що експресуються одночасно в повному комплексі. Для ВПЧ BTV застосовували набір локусів, відмінний від набору локусів, застосовуваних у прикладі з вірусом грипу (Фігура 6С). Крім того, нову систему сполучали з бакмідою з виключеним orfl629, як описано в Zhao et al., (12), щоб можна було застосовувати традиційний вектор перенесення в локусі поліедрину для експресії однієї із субодиниць комплексу. Утворення ВПЧ підтверджували за морфологією часток при ЕМ з негативним забарвленням у сполученні з імунним забарвленням золотом одного з білків зовнішнього капсиду (VP5) (Фігура 6D). CCT миші Застосування даного винаходу не обмежується утворенням вірусоподібних часток. Насправді, оскільки багато білків присутні в клітинах у формі комплексів з більше ніж однієї субодиниці, ефективне формування зазначених комплексів може знайти застосування в цілому ряді областей. Щоб продемонструвати застосованість зазначеної системи в інших дослідженнях, вибрали комплекс шаперонів CCT. Даний комплекс залучений у дослідження раку й внаслідок того, що він складається з 8 субодиниць, являє собою значну проблему в плані експресії білків. Дійсно, не було можливості експресувати даний комплекс у системі на основі бакуловірусу у відсутності векторів і способів, запропонованих у даному винаході. Були сконструйовані вісім векторів перенесення, кожен з яких експресує одну із субодиниць CCT миші і націлений на відмінний локус, ідентифікований у Прикладі 3 вище. Їх застосовували для генерування рекомбінантного вірусу, який експресує кожну субодиницю окремо і сполучення субодиниць. Для однієї із субодиниць (ССТ5) відзначили нетиповий фенотип, коли в клітині була гіперекспресія зазначеного білка. У клітині відзначали кристалічні голки і, наприкінці інфікування, коли клітини розривалися, у середовищі культивування відзначали чотирикутні пластинки кристалічної речовини (Фігура 7). Для даного білка створили схему очищення, і її супроводжували умовами для попередньої кристалізації й речовиною інфікованих клітин для співробітника, який реалізує частину проекту, пов'язаного з CCT. Хоча експресія деяких інших субодиниць CCT призводить до утворення видимих агрегатів у клітинах наприкінці інфікування, експресія жодного з білків не призводила до утворення агрегатів з таким регулярним видом. Всі 8 субодиниць CCT проявляли високий рівень експресії (Фігура 8А) і давали перехресну реакцію з поліклональною антисироваткою, одержаною на CCT мишей. Мала місце деяка перехресна реакція між однією з ендогенних для клітини комах субодиниць CCT і поліклональним антитілом (Фігура 8В, доріжка 9). Однак даний ендогенний сигнал був зв'язаний тільки з 3 субодиницями (CCT1, CCT5 і CCT6), які накопичувалися в інфікованих клітинах у великій кількості і, отже, його було можна чітко визначити. Всі інші субодиниці мігрували як білки з молекулярною масою, яка дещо відрізняється, і, таким чином, могли бути відокремленими від білків клітин комах на основі міграції. ВИСНОВКИ 12 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для всіх трьох комплексів білків мали місце явні розходження в акумуляції того самого рекомбінантного білка при експресії його одного або в присутності інших білків. Майже у всіх випадках мало місце зниження рівня експресії білка, коли з того ж вірусу експресували кілька білків. У якімсь ступені цього можна було очікувати. Беручи до уваги конкуренцію за білки, необхідні для транскрипції, процесінгу РНК, трансляції й скручування білка, можна передбачити, що два гени бакуловірусу з високим рівнем експресії можуть демонструвати більш низьку експресію при роботі разом, ніж при роботі окремо. Однак, що було неочікуваним як для приклада із ВПЧ BTV, так і для приклада з CCT, так це те, що зниження експресії білка варіювало для різних генетичних локусів. Наприклад, у випадку BTV, VP2, VP5, VP3 і VP7 всі приводили до значної й подібної акумуляції білка, коли вони експресувалися зі свого власного локусу. Однак при їх сполученні в одному бакуловірусі, що експресує всі чотири білки, VP2 і VP3 накопичувалися в меншому ступені, ніж VP5 і VP7 (Фігура 6А). Даний ефект не можна пояснити ефектом положення при геномній інтеграції, оскільки і в одиночних, і в "учетверенних" вірусах гени експресувалися з однакових генетичних локусів. Одним із можливих пояснень може бути те, що даний ефект був пов'язаний з різними промоторами, які застосовували для різних генів. І VP5, і VP7 експресувалися під контролем промотору р10, а VP2 і VP3 – під контролем промотору поліедрину. Це може узгоджуватися з одним повідомленням у літературі, відповідно до якого делеція гена р10 призводила до підвищення експресії з локусу поліедрину 13. Таким чином, можна було б передбачити, що дуплікація промотора полдіедрину в присутності двох промоторів р10 буде знижувати експресію з промотора поліедрину генів, які запускають. Однак це не може повною мірою пояснювати ефект, що спостережується у випадку комплексу CCT. І CCT5, і CCT2 експресувалися з промотору р10 і давали високий стаціонарний рівень рекомбінантного білка, коли експресувалися по одному (Фігура 8А і В, доріжки 2 і 5). Однак при сполученні їх в одному вірусі експресія CCT5 значно знижувалася в порівнянні з CCT2 (Фігура 8А і В, доріжка 10). На основі цих даних можна припустити, що інша цис-діюча послідовність, що присутня в локусі р10, може вносити вклад у підвищення відносної експресії CCT2 і BTV VP5, які обидва були вбудовані в даний локус. Відносно низька гадана експресія НА вірусу грипу при вбудовуванні його гена в той же сайт може бути більшою мірою пов'язана із круговоротом даного білка в ЕПР, ніж із транскрипційними ефектами. І CCT2, і VP5 накопичуються в цитоплазмі. Винахідники підвищили ефективність системи ET рекомбінації стосовно бакуловірусу настільки, що її можна застосовувати для стандартного вбудовування касет експресії для рекомбінантних білків. Крім того, вони ідентифікували сім генетичних локусів (ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 і odv-e56), які можна застосовувати для інтенсивної експресії білків і продемонстрували, що комплекси з декількох білків можна збирати за допомогою даної системи, привівши три приклади (ВПЧ вірусу грипу А і BTV, і комплекс CCT). Всі цитовані вище документи включені в дану заявку за допомогою посилань. Цитована література 1. Albert, H., Dale, E. C, Lee, E. & Ow, D. W. Plant J 7, 649-59. (1995). 2. Lee, E. С et al. Genomics 73, 56-65 (2001). 3. Eldridge, R., Li, Y. & Miller, L. K. J Virol 66, 6563-71 (1992). 4. Flipsen, J. Т., Mans, R. M., Kleefsman, A. W., Knebel-Morsdorf, D. & Vlak, J. M. J Virol 69,4529-32 (1995). 5. O'Reilly, D. R. & Miller, L. K. Science 245, 1110-2 (1989). 6. Griffiths, С. М. et al. J Gen Virol 80 (Pt 4), 1055-66 (1999). 7. Braunagel, S. C, Elton, D. M., Ma, H. & Summers, M. D. Virology 217, 97-110 (1996). 8. Berger, I., Fitzgerald, D. J. & Richmond, T. J. Nat Biotechnol 22, 1583-7 (2004). 9. Fitzgerald, D. J. et al. Nat Methods 3, 1021-32 (2006). 10. McCarthy, С. В., Dai, X., Donly, С & Theilmann, D. A. Virology 372, 325-39 (2008). 11. McCarthy, С. В. & Theilmann, D. A. Virology 375, 277-91 (2008). 12. Zhao, Y., Chapman, D. A. & Jones, I. M. Nucleic Acids Res 31, E6-6. (2003). 13. Chaabihi, H. et al. J Virol 67, 2664-71 (1993). 14. Summers, M. D. Adv Virus Res 68, 3-73 (2006). 15. Emery, V. С & Bishop, D. H. Protein Eng 1, 359-66 (1987). 16. French, T. J., Marshall, J. J. & Roy, P. J Virol 64, 5695-700 (1990). 17. Latham, T. & Galarza, J. M. J Virol 75, 6154-65. (2001). 18. Pushko, P. et al. Vaccine 19, 142-53. (2000). 19. Ye, L. et al. Virology 351, 260-70 (2006). 20. Berger, I., Fitzgerald, D. J. & Richmond, T. J. Nat Biotechnol 22, 1583-7 (2004). 13 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 30 21. Fitzgerald, D. J. et al. Nat Methods 3, 1021-32 (2006). 22. French, T. J. & Roy, P. J Virol 64, 1530-6 (1990). 23. Devos, D. & Russell, R. B. Curr Opin Struct Biol 17, 370-7 (2007). 24. O'Neal, С M., Clements, J. D., Estes, M. K. & Conner, M. E. J Virol 72, 3390-3 (1998). 25. Palomares, L. A., Lopez, S. & Ramirez, О. Т. Biotechnol Bioeng 78, 635-44. (2002). 26. Mena, J. A., Ramirez, О. Т. & Palomares, L. A. BMC Biotechnol 7, 39 (2007). 27. Weyer, U. & Possee, R. D. J Gen Virol 72 (Pt 12), 2967-74 (1991). 28. Bertolotti-Ciarlet, A., Ciarlet, M., Crawford, S. E., Conner, M. E. & Estes, M. K.Vaccine 21, 3885-900 (2003). 29. Kamita, S. G., Maeda, S. & Hammock, B. D. J Virol 77, 13053-61 (2003). 30. Crouch, E. A. & Passarelli, A. L. J Virol 76, 9323-34 (2002). 31. Mikhailov, V. S., Okano, K. & Rohrmarm, G. F. J Virol 77, 2436-44 (2003). 32. Pijlman, G. P. et al. J Virol 76, 5605-11 (2002). 33. Pijlman, G. P., van den Born, E., Martens, D. E. & Vlak, J. M. Virology 283, 132-8 (2001). 34. Pijlman, G. P., van Schijndel, J. E. & Vlak, J. M. J Gen Virol 84, 2669-78 (2003). 35. Vanarsdall, A. L., Pearson, M. N. & Rohrmarm, G. F. Virology 367,187-95 (2007). 36. Vanarsdall, A. L., Mikhailov, V. S. & Rohrmann, G. F. Virology 364, 475-85 (2007). 37. Okano, K., Vanarsdall, A. L. & Rohrmann, G. F. Virology 359, 46-54 (2007). 38. Vanarsdall, A. L., Okano, K. & Rohrmann, G. F. J Virol 80, 1724-33 (2006). 39. Okano, K., Vanarsdall, A. L. & Rohrmann, G. F. J Virol 78,10650-6 (2004). 40. Vanarsdall, A. L., Okano, K. & Rohrmann, G. F. Virology 326, 191-201 (2004). 41. Fang, M., Dai, X. & Theilmann, D. A. J Virol 81, 9859-69 (2007). 42. Wang, Y. et al. Virology 367, 71-81 (2007). 43. Yamagishi, J., Burnett, E. D., Harwood, S. H. & Blissard, G. W. Virology 365, 34-47 (2007). 44. Xi, Q., Wang, J., Deng, R. & Wang, X. Virus Genes 34, 223-32 (2007). 45. Li, Y. et al. Virus Genes 31, 275-84 (2005). 46. Stewart, T. M., Huijskens, I., Willis, L. G. & Theilmann, D. A. J Virol 79, 4619-29 (2005). 47. Kamita, S. G. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 2584-9 (2005). 48. Milks, M. L., Washburn, J. O., Willis, L. G., Volkman, L. E. & Theilmann, D. A. Virology 310, 224-34 (2003). 49. Zhao, Y., Chapman, D. A. & Jones, I. M. Nucleic Acids Res 31, E6-6 (2003). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 40 45 50 55 1. Вектор перенесення для вбудовування гена в генетичний локус послідовності бакуловірусу, який містить: касету експресії, що містить еукаріотичний промотор, функціонально пов'язаний зі зазначеним геном; касету подвійної селекції, що видаляється, яка з кожної зі сторін фланкована послідовностями рекомбінації LoxP, причому вказані послідовності LoxP модифіковані, щоб забезпечити проходження тільки одного циклу рекомбінації, яка містить: (i) експресовану послідовність, що кодує перший селектований маркер; і (ii) експресовану послідовність, що кодує другий селектований маркер; і послідовності, які фланкують зазначені касету експресії та касету подвійної селекції, причому зазначені послідовності в суттєвому ступені відповідають послідовностям зазначеного генетичного локусу в послідовності бакуловірусу. 2. Вектор перенесення за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений перший селектований маркер являє собою візуальний маркер. 3. Вектор перенесення за п. 2, який відрізняється тим, що зазначений перший маркер являє собою фрагмент LacZalpha. 4. Вектор перенесення за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений другий селектований маркер надає стійкості до антибіотика. 5. Вектор перенесення за п. 4, який відрізняється тим, що зазначений ген стійкості до антибіотика надає стійкості до флеоміцину. 6. Вектор перенесення, відповідно до будь-якого з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що вказані послідовності, які фланкують касети експресії та подвійної селекції в суттєвому ступені відповідають одному з наступних генетичних локусів: ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iaр2, odve56 і p10. 7. Спосіб одержання рекомбінантної бакміди, який включає: 14 UA 106733 C2 5 10 15 20 25 об'єднання бакміди і вектора перенесення, що відповідає будь-якому з пп. 1-6, для забезпечення проходження гомологічної рекомбінації; і селекцію рекомбінантної бакміди, яка містить зазначені касету експресії та касету подвійної селекції. 8. Спосіб за п. 7, який додатково містить здійснення рекомбінації між послідовностями LoxP із видаленням касети селекції з бакміди. 9. Спосіб одержання рекомбінантного бакуловірусу, який включає одержання рекомбінантної бакміди способом за п. 7 або за п. 8 і культивування еукаріотичної клітини, яка містить зазначену бакміду з одержанням бакуловірусу. 10. Рекомбінантна бакміда, одержана способом за п. 7. 11. Рекомбінантна бакміда за п. 10, що експресує сукупність білків, яка відрізняється тим, що кожний білок експресується з окремого генетичного локусу зазначеної бакміди. 12. Рекомбінантний бакуловірус, одержаний способом за п. 9, причому рекомбінантну бакміду одержують способом за п. 7. 13. Рекомбінантний бакуловірус за п. 12, що експресує сукупність білків, який відрізняється тим, що кожний білок експресується з окремого генетичного локусу зазначеного бакуловірусу. 14. Рекомбінантна бакміда за п. 11 або рекомбінантний бакуловірус за п. 13, які відрізняються тим, що зазначена сукупність білків взаємодіє з утворенням комплексу білків. 15. Рекомбінантна бакміда або рекомбінантний бакуловірус за п. 14, які відрізняються тим, що зазначений комплекс білків являє собою вірусоподібну частку. 16. Рекомбінантна бакміда за п. 11 або рекомбінантний бакуловірус за п. 13, які відрізняються тим, що окремі генетичні локуси вибрані з наступних: ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iaр2 і odv-e56. 17. Клітина, яка містить вектор перенесення, відповідно до будь-якого з пп. 1-6, бакміду відповідно до будь-якого з пп. 10, 11, 14-16 або бакуловірус відповідно до будь-якого з пп. 12, 13-16. 18. Спосіб одержання одного або більше білків, який включає культивування рекомбінантної бакміди, відповідно до будь-якого з пп. 10, 11, 14-16 або бакуловірусу відповідно до будь-якого з пп. 12, 13-16, у придатних умовах. 30 15 UA 106733 C2 16 UA 106733 C2 17 UA 106733 C2 18 UA 106733 C2 19 UA 106733 C2 20 UA 106733 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 21