Фрагмент геномної днк, що кодує еритропоетин, фрагмент кднк, що кодує еритропоетин, спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти), спосіб одержання фармацевтичної композиції еритропоетину людини (варіанти)

Настоящее изобретение касается клонированных генов для человеческого эритропоэтина, которые обеспечивают необычайно высокие уровни выражения, экспрессии указанных генов получения in vitro активного человеческого эритропоэтина. Эритропоэтин (далее ЕПО) представляет собой циркулирующий гликопротеид, который стимулирует образование эритроцита в высших организмах. См. Саrnot и др., Compt Rend, 143:384 (1906). Как таковой, ЭПО иногда упоминается как фактор, стимулирующий эритропоэз. Продолжительность жизни человеческих эритроцитов составляет около 120 дней. Таким образом, около 1/120 общего числа эритроцитов разрушается ежедневно в ретикуло-эндотелиальной системе. Однако, относительно постоянное число эритроцитов продуцируется ежедневно для поддержания уровня эритроцитов все время (Guyton, Textbook of Medical Physiology стр. 56 - 60, W.B.Saunders Co., Филадельфия (1976). Эритроциты продуцируются путем созревания и дифференцировки эритробластов в костном мозге, и ЭПО является Фактором, который воздействует на менее дифференцированное клетки и индуцирует их дифференцировку к эритроцитам (Guyton, выше). ЭПО представляет собой многообещающее терапевтическое средство для клинического лечения анемии или, в частности, ренальной анемии. К сожалению, использование ЭПО еще не является общепринятым в практической терапии вследствие его малой доступности. Для использования ЭПО в качестве терапевтического средства необходимо тщательно обсудить возможные вопросы антигенности, и поэтому предпочтительно, чтобы ЭПО был получен из сырья человеческого происхождения. Например, можно использовать человеческую кровь или мочу от пациентов, страдающих апластической анемией или подобными болезнями, которые выделяют большие количества ЭПО. Эти исходные материалы, однако, существуют в ограниченном запасе. См., например, Write и др., Rec. Progr. Hоrm. Res., 16 - 219 (1960; Espada и др., Biochem. Мed, 3:475 (1970); Fisher, Рhurm. Rev., 24:459 (1972) и Gordon, Vitam. Horm. (N.Y.), 31:105 (1973). Получение продуктов ЭПО, как правило, осуществляется через концентрацией очистку мочи пациентов, обнаруживающих высокие уровни ЭПО, таких, как больные апластической анемии или подобными заболеваниями. См., например, патенты США №№ 439780, 4303650 и 3865801, раскрытие которых введено сюда в качестве ссылки. Ограниченный запас такой мочи служит препятствием практическому использованию ЭПО и поэтому чрезвычайно желательно получать продукты ЭПО из мочи здоровых людей. Трудность в использовании мочи от здоровых людей заключается в низком содержании в ней ЭПО по сравнению с мочой пациентов, страдающих анемией. Кроме того, моча здоровых людей содержит определенные тормозящие факторы, которые действуют против эритропоэза в достаточно высокой концентрации, так, что удовлетворительный терапевтический эффект может быть получен от ЭПО только с последующей значительной очисткой. ЭПО также может быть выделен из плазми крови овцы, и отделение ЭПО от такой плазун крови обеспечивает создание достаточно сильнодействующих и устойчивых водорастворимых препаратов. См. Goldwasser Control Cellular Vit Develop., Часть А, cтр. 487 - 494, Alan R. Ziss, Inc., Нью-Йорк (1981), которая введена сюда а качестве ссылки. ЭПО овцы, однако, можно было бы рассматривать антигенным в людях. Таким образов, в то время как ЭПО является желательным терапевтическим средством, традиционные методики выделения и очистки, используемые с естественными источниками снабжения, являются недостаточными для массового производства этого соединения. Sugimoto и др в патенте США 4377513 описывают один способ для кассового производства ЭПО, содержащий размножения in vivo лимфобластоидных клеток человека, включающих Nomalva, BAL L – I, NAL L – I, TAL L – I и JBL. В специальной литературе появилось описание получения ЭПО с использованием методов генетической инженерии другими авторами. Однако еще не опубликовано ни пригодного раскрытия, ни химической природы продукта. В противоположности этому, настоящая заявка предоставляет пригодное раскрытие массового производства белков, проявляющих биологические свойства человеческого ЭПО. Также является возможным путем этих методик получить белки, которые могут химически отличаться от аутентичного человеческого ЭПО и все же обнаруживать аналогичные (и в некоторых случаях улучшенные) сродства. Для удобства все такие белки, проявляющие биологические свойства человеческого ЭПО, могут упомянуться далее как ЭПО, являются ли они химически идентичными ему или нет. Настоящее изобретение касается клонирования гена, который выражает необычайно высокие уровни человеческого ЭПО, его экспрессии и массового производства іn vitro активного человеческого эритропоэтина. Также описываются пригодные векторы экспрессии для получения ЭПО, экспрессивные клетки, схемы очистки и связанные с этим процессы. Как описывается более подробно ниже, ЭПО был получен в частично очищенной форме и был подвергнут дальнейшей очистке до гомогенности и превращен трипсином для генерации специфических фрагментов. Эти фрагменты были очищены и подвергнуты определению последовательностей. Олигонуклеотиды ЭПО были затем сконструированы на основе этих последовательностей и синтезированы. Эти олигонуклеотиды были использованы для скрининга человеческой геномной библиотеки, из которой ген ЭПО был выделен. Ген ЭПО был проверен на основе его ДНК-последовательности, которая спарила многие секвенированные фрагменты триптического белка. Отрезок геномного клопа был затем использован для демонстрации путем гибридизации того, что мРНК ЭПО могла бы быть обнаружена в человеческой плодной (в возрасте 20 недель) мРНК была получена и подвергнута скринингу кДНК-библиотека печени плода человека. Были получены три клона кДНК ЭПО (после скрининга > 750000 рекомбинатов). Два из этих трех клонов были определены имеющими полную длину, как оценено по полной кодирующей последовательности и значительной 5'- и 3'- нетранслируемой последовательности. Эти кДНК были экспрессированы как в трансформированных клетках вируса SV-40 обезьяна (клеточная линия СОS-I; Gluzman, CeII 23:175 - 182 (1981), так и в клетку личинка китайского хомячка (клеточная линия СНО; Urlaub. G. и Chasin, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. США 77:4216 - 4280 (1980). ЭПО, полученный из клеток СHО, является биологическими активная ЭПО in vitro и in vivo. ЭПО, полученный из клеток СHО, также биологически активен in vitro и in vivo кДНК-клон ЭПО имеет интересную открытую рамку считывания из 14 - 15 аминокислот /аа/ с инициатором и терминатором из 20 - 30 нуклеотидов /nt/ вверх по направленню кодирующей области. Типичный образец Е.соI, трансформированной клонированным геном ЭПО, был депонирован American Type Culture Collection, Pockville, Maryland, где он имеется в наличии под входящим номером ATСС 40153. Таблица 1 представляет собой последовательность оснований экзона 87 пар оснований гена ЭПО человека; Фиг. 1 иллюстрирует обнаружение мРНК ЭПО и мРНК печени плода человека; Таблица 2 представляет аминокислотную последовательность белка ЭПО, выделенную из нуклеотидной последовательности l-HEPOF L 13; Таблица 3 представляет нуклеотидную последовательность кДНК ЭПО в l-HEPOF L 13 (Показано схематически на Фиг. 2) и аминокислотную последовательность, выделенную из нее; Фиг. 3 иллюстрирует относительно положению вставок ДНК четырех независимых геномных клонов человеческого ЭПО; Фиг. 4 представляет собой карту очевидной интронной и экзонной структури гена ЭПО человека; Таблице 4 иллюстрирует ДНК-последовательность гена ЭПО, показанного на Фиг. 4В; Фиг. 5А, 5В и 5С иллюстрирует коструировоние вектора 91023/В/; Фиг. 6 изображает SDS полиакриламидный гель-анализ ЭПО, полученного в клетках COS-І по сравнению з нативным ЭПО. Таблица 5 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности клона ЭПО, l-HEPOF L 6; Таблица 6 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности клона ЭПО, l-HEРOF L 8; Таблица 7 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательность клона ЭПО, l-HEРOF L 13; Фиг. 8 представляет собой схематическое изображение плазмиды pdBPУ-MMTheo (342 – 12). Настоящее изобретение касается клонирования генов ЭПО и получение ЭПО путем экспрессии in vitro этих генов. Патентная и научная литература изобилует способами, являющимися пригодными для получения рекомбинантных продуктов. В основном эти методики включают выделение или синтез требуемой генной последовательности и экспрессию этой последовательности либо в прокариотных, либо эукариотных клетках используя методики, обычно приемлемые для специалиста. Как только искомый ген изолирован, очищен и вставлен в вектор переноса (т.е. клонирован), его доступность в достаточном количестве обеспечена. Вектор с его клонированным геном переносится к природному микроорганизму или линии клеток, например, бактериям, дрожжам, клетками млекопитающих, таких, как СОS-I (почка обезьяны), СНО (яичник китайского хомячка), линиям клеток насекомых и тому подобному, где вектор реплицируется как микроорганизм или линия клеток пролиферирует, и откуда вектор может быть выделен, при помощи общепринятых средств. Таким образом обеспечивается непрерывно возобновляемый источник гена для дальнейших манипуляций, модификаций и переносов к другим векторам или другим локусам в пределах того же вектора. Экспрессия часто может быть получена путем переноса клонированного гена в должной рамке ориентации и считывания в подходящий сайт в векторе переноса так, что трансляционное считывание с прокариотного или эукариотного гена завершается синтезом белкового исходного вещества, содержащего аминокислотную последовательность, кодируемую клонированнм геном, привязанном к Met или амино-концевой последовательности от прокариотного или эукариотного гена, в других случаях сигналы для транскрипционной и трндиционной инициации могут подаваться пригодным геномным фрагментом клонированного гена. Множество специфических методик белкового расщепления может быть использовано для ращепления белкового походного вещества, если оно пролудировано, в требуемой точке, с тем, чтобы высвободить желательную аминокислотную последовательность, которую затем можно очистить традиционными способами. В некоторых случаях белок, содержащий требуемую аминокислотную последовательность, продуцируется без необходимости применения специфических методик расщепления и может быть также высвобожден из клеток в экстрацеллюлярную питательную среду. Выделение геномного клона человеческого ЭПО Человеческий ЭПО был очищен до гомогенности от мочи пациентов, страдавших апластической анемией, как описано ниже. Полное переваривание этого очищенного ЭПО трипсином протеази дало фрагменты, которые были разделены высокоефективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой, восстановлены из градиентных фракций и подвергнуты микросеквеционному анализу. Последовательности триптических фрагментов подчеркнуты в Таблицах 2 и 3 обсуждены более подробно ниже. Две из аминокислотных последовательностей Val-Asn-Fhe-Tyr-Ala-Trp-Lys и Val-Tyr-SerAsn-Phe-Leu-Аrg, были выбраны для конструирования олигонуклеотидных зондов (заканчивающихся олигонуклеотидным пулом 17пL длины и 32-кратным дегенератом и олигонуклеотидным пулом 18 пt и длины 128-кратным дегенератором - из первого триптического фрагмента, а также двумя пулами 14 пt длины, каждый 43-кратный дегенерат, из второго триптического фрагмента, соответственно. 38-кратный дегенеративный 17-мерный пул был использовав для скрининга человеческой геномной ДНК-библиотеки в векторе Сh4 А /22/ с использованием модификации метода ампликации in situ Woo и O’Malley /47/ для получения фильтров для скрининга. Арабские числа в кргых скобках, /I/ - /GI/, используется в настоящем описании для ссылок на публикации, которые приводятся в числовом порядке в конце описания настоящего изобретения. Фаг, гибридизирующий к 17меr, был образован, распределен на малые группы и спробован 14меr и 18меr пулами. Фаг, гибридизирующий к 17меr, 18меr и 14меr пулам, был счищен от пятен, а фрагменты были субклонированы в векторы МІЗ для секвенирования путем дидезокси-метода обрыва цепи, описанного Sanger и Conlson, /23/ (1977). Таблица 1 Таблица 2 Таблица 3 Последовательность области, гибридизирующая к 32-кратному дегенератному 17меr в одном из клонов, показана в Таблице 1. Эта последовательность ДНК содержит внутри открытой рамки считывания нуклеотиды, которые могут точно кодировать триптический фрагмент, используемый для выведения 17меr пула олигонуклеотидов. Кроме того, анализ последовательности ДНК показывает, что 17меr гибридизирущая область содержалась внутри 87bр экзона, соединенная потенциальным акцептором сращивания и донорным сайтами. Положительное подтверждение того, что эти два клона (обозначены здесь l-НРO1 и l-НЕРO2) являются геномными клонами ЭПО получено путем cеквенирования дополнительных экзонов, содержащих другой триптический фрагмент, кодирующий информацию. Выделение клонов кДНК ЭПО Анализ Northern /56/ в отношении человеческой фетальной (возраст 20 недель) печеночной мРНК осуществляли с использованием 95 пt однонитиевого зонда, полученного из клона М13, содержащего участок 87bр экзона, описанного в Таблице 1. Как показано на фиг. 1, сильный сигнал может быть обнаружен в мРНК детальной печени. Точная идентификация этой полосы как мРНК ЭПО была достигнута о использованием того же зонда для скрининга l-кДНК библиотеки бактериофага мРНК фатальной печени /25/. Несколько гибридизирующих клопов было получено с частотой приблизительно 1 положительный на 250 000 подвергнутых скринингу рекомбинантов. Полная нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности для этих клонов (l-HEPOF L 13 и l-HEPOF L 8) представлены в Таблицах 5 и 6. ЭПО-кодирующая информация содержится внутри 594пt в 5'-половине кДНК, включая очень гидрофобный 27 аминокислотный лидер и 166 аминокислотный созревший белок. Идентификация N-конца созревшего белка была основана на N-концевой последовательности белка, выделяемого в моче людей c апластической анемией, как проиллюстрировано в Таблице 1 и как описано в работах Goldwasser /26/, Sue и Sytkowski /27/ и Yangawa /21/. В настоящее время не известно, представляет ли этот N-конец /АІа-Рrо-Рrо-Аrо-/ фактический N-конец, найденный на ЭПО при кровообращении, или происходит некоторое расщепление в почке или моче. Аминокислотные последовательности, которые подчеркнуты в Таблице 2 и 3, обозначают те триптические фрагменты или участок N-конца, для которых была получена информация белковой последовательности. Выведенная аминокислотная последовательность точно согласовывается с триптическими фрагментами, которые были секвенированы, подтверждая, что выделенный ген кодирует человеческий ЭПО. Структура и последовательность гена ЭПО человека Относительные положения вставок ДНК четырех независимых геномных клонов ЭПО человека показаны на Рис. 3. Гибридизационный анализ этих клонированных ДНК при помощи олигонуклеотидных зондов и различных зондов, полученных от двух классов клонов кДНК ЗПО, определил положение гена ЭПО внутри приблизительно 3,3кб области, показанной затемненной линией на фиг. 3. Полный анализ секвенирования этой области (см. Пример 4) и сравнение с клонами кДНК привели к получению карты интронной и экзонной структуры гена ЭПО, показанной на фиг. 4. Ген ЭПО разделяют на 5 экзонов. Часть экзона I, полные экзоны II, III и IY, а также экзона Y содержат белок-кодирующую информацию. Оставшиеся части экзонов I и Y кодируют 5'- и 3'-нетранолируемне последовательности, соответственно. Неустойчивая эксперссия ЭПО в клетках СOS Для того, чтобы наглядно показать, что биологически активный ЭПО может экспресспроваться в системе культуры клеток in vitro, осуществляли исследования, экспрессии в клетках COS /58/. Вектор, используемый для переходных исследований, а именно, р91023 /B/, описан в Примере 5. Этот вектор содержит основной поздний промотор аденовируса, последовательность полиадениляции SV40, SV40нaчaло репликации, ген-усилитель SV40 и ген VA аденовируса. Вставка кДНК в l-НЕРОF L 13 (см. Таблицу 6) была вставлена в вектор р91023 /В/ ниже основного позднего промотора аденовируса. Этот новый вектор идентифицирован как pPTF – L 13. Через двадцать четыре часа после транфекции этого построения в штамм М6 клеток COS-I (Horowitz и др., Т. Мal Арpl. Genet 2:147 - 149 (1983)) клетки промыли, перевели в свободные от сыворотки среды, после чего клетки собрали через 48 часов. Затем с использованием количественного радиоиммунного анализа для ЭПО /55/ исследовали уровень высвобождения ЭПО в культуральную надооадочную жидкость. В отдельном эксперименте вектор, содержащий кДНК ЭПО, из l-HEPOF L 13 был трансформирован в клетки COS-I, и среды собирали, как описано выше. ЭПО в средах был затем определен количественно любым из двух биологических анализов, проводимых in vitro, а именно, 3Hтримидин и СFU-Е /12, 29/, и любым из двух анализов in vitro, а именно гипоксическая мышь и голодающая крыса /30, 31/ (см. Таблицу 9, Пример 17). Эти результаты доказывают, что биологически активный ЭПО продуцируется в клетках COS-I. Под блоттингом Western, с использованием поликлонального антитела анти-ЭПО, эритропоэтин, продуцируемый клетками COS, имеет подвижность на SDS-полиакриламидных гелях, которая идентична подвижности нативного ЭПО, полученного из человеческой мочи (Пример 8). Таким образом, распространение гликосилирования СОS-I, продуцирующая ЭПО, моет быть аналогичным тому, что происходит в случае нативного ЭПО. Различные векторы, содержащие другие промоторы. также могут быть использованы в клетках COS или в других млекопитающих или эукариотичеоких клетках. Примеры этих иных промоторов, пригодных в практике настоящего изобретения, включают ранние и поздние промоторы SV 40, генный промотор металлотионеина мыши, промотор, обнаруживаемый в длинных концевых повторах ретровирусов птиц или млекопитающих, полиэдральный генный промотор бакуловируса и другие. Примерами других типов клеток, пригодных в практике настоящего изобретения, являются Е.СОli, дрожжи, клетки млекопитающих, такие как CНО (яичник китайского хомячка), С127 (эпителий обезьяны), 3Т3 (мышиный фибробласт), СV-I (почка африканской зеленой мартышки) и клетки наcекомых, такие, как клетки от Spodoptera frugiperda и Drosophila metanogaster. Эти дополнительные промоторы и/или типы клеток могут обеспечить возможность регулирования тайминга или уровня экспрессии ЭПО, продуцирующей специфичный к клеткам тип ЭПО, или роста больших количеств ЭПО-продуцирующих клеток в менее дорогостоящих,более легко контролируемых условиях. Экспрессивная система, которая сохраняет преимущества экспрессии в млекопитающих, однако, требует меньше времени для продуцирования клеточной линии с высоким уровнем экспрессии, образуется линией клеток насекомых и ДНК-вирусом, который репродуцируется в этой клеточной линии. Вирус представляет собой вирус ядерного полиэдроза. Он имеет геном двунитевой кольцевой ДНК в 128кб. Цуклеокапсид имеет палочкавидную форму и находится упакованным в двух формах, а именно, неокклюдированной форме - мембранный почкующийся вирус, и окклюдированной форме - упакован в белковый кристалл в зараженном клеточном ядре. Эти вирусы могут быть обычным путем размножены in vitro в культуре клеток насекомых и откорректированы для всох обычных методов животной вирусологии. Культуральные среды клеток - это обычно питательный солевой раствор и 10%-ная фетальная телячья сыворотка in vitro, вирусный рост инициируется, когда неокклюдированный вирус /НОВ/ входит в клетку и продвигается к ядру, где он реплицируется. Репликация является ядерной. В течение начальной фазы 8 - 18 часов постинфекции вирусной аппликации нуклеокапсиды собираются в ядре и впоследствии проходят через плазменную мембрану как НОВы, распространяя инфекцию по культуре клеток. Кроме того, некоторые нуклеокапсиды впоследствии (еще 18 часов постинфекции) остаются в ядре и закупориваются в белковой матрице, известной как полиэдральное внутриклеточное включение /ПВВ/. Эта форма не является инфекционной в культуре клеток. Матрица состоит из белка, известного как полиэдрин, молекулярный вес 33кд. Каждое ПВВ имеет приблизительно 1мм в диаметре, и в ядре могут быть до 100ПВВ. Ясно, что большое количество полиэдрина продуцируется позже в цикле заражения, и оно составляет до 25% общего количества клеточного белка. Так как ПВВ не играет роли в цикле репликации in vitro полиэдриновый ген может быть убран из вирусной хромосоми без какого бы то ни было влияния на жизнеспособность in vitro. При использовании вируса в качестве вектора экспрессии заявитель заменил область, кодирующую полиэдриновый ген, инородной ДНК, подлежащей экспрессии, поместив ее под контроль полиэдринового промотора. Это привело к вирусному фенотипу, не образующему ПВВ. Эта система использовалась несколькими исследователями, наиболее известными из которых являются Реппоск и др. и Smith и др. (Gregory D, Реnuvek, Сnаrіеs Shoemaker и Lois К.Miller, Molecular and Cell Biology 3:84, стр. 399 – 406) сделали сообщение о высокоэффективной экспрессии бактериального белка, В-галактозидазы, когда тот помещен под контроль полиэдрилового промотора. Другой вектор экспрессии на основе вируса ядерного полиэдроза представлен Smith и др. (Gale E. Smith, Max D. Summers и М.J. Fraser, Мolecular аnd Сell Biology, 16 мая 1983, стр. 2155 - 2165. Авторы продемонстрировали эффективность их вектора посредством экспрессии человеческого В-интерферона. Синтезированный продукт был обнаружен гликосилированным и выделенным из клеток насекомых, как можно было ожидать. В Примере 14 описаны модификации полиэдр-гена вируса ядерного полиэдроза Antographa Califormica /AcNPY/, которые позволяют осуществить легкую вставку гена ЭПО в плазмиду так, что он может находиться под транскрипциональннм контролем полиэдринового промотора. Полученную ДНК контрансфецируют с ДНК интактной хромосомы из AcNPY дикого типа в клетки насекомых. Событие генетической рекомбинации приводит к замещению области полиэдринового гена AcN РYС дезоксирибонуплеиновой кислотой из плазмиды. Полученный рекомбинантный вирус может быть идентифицирован среди вирусного потомства посредством его обладания последовательностями ДНК гена ЭПО. Этот рекомбинантный вирус при реинфекции клеток насекомых, как ожидается, и продуцирует ЭПО. Примеры экспрессии ЭПО в СПО, С127 и 3Т3, а также в клетках насекомых представлены в Примерах 10 и 11 /СНО/ 13 /C127 и 3Т3/ и 14 (клетки насекомых). Рекомбинантный ЭПО, полученный в клетках СНО, как в Примере 11, был очищен традиционными методами колоночной хроматографии. Относительные количества сахаров, присутствующих в гликопротеиде, анализировали двумя самостоятельными методами /1/ Reinhord Methods in Enzymol 50:244 - 249 (Метанолиз) и /11/ Таkеmоtо, Н. и др. Anal Biochem. 145:245 /1985/ (пирил-аминнрование, совместно о самостоятельным определением сиаловой кислотой). Результаты, полученные каждым из этих способов, были в превосходном согласии. Таким образом было проделано несколько определений, что дало средние значения, где N-ацетил-глюкозамин для сравнительных целей дан как значение 1: Сахар Относительный молярный уровень Т-Ацетилглюкозамин 1 Гексозы: 1,4 Галактоза 0,9 Манноза 0,5 N-Ацетилнейраминовая 1 кислота Фукоза 0,2 N-Ацетилгалактозамин 0,1 Примечательно, что значительные уровни содержания фукозы и N-ацетилгалактозамина воспроизводимо наблюдались при использовании обоих самостоятельных методов анализа на сахар. Присутствие N-ацетилгалактозамина указывает на наличие O-оцепленного гликооилирования белка. Наличие O-сцепленного гликосилирования далее отмечалось анализом SDS-РAСЕ гликопротеида различными сочетаниями гликоэндных ферментов. В частности, вслед за ферментативным отщеплениям всего N-сцепленного углевода на гликопротеидах с использованием эндо N-гликозидазы пептидного фермента, молекулярная масса белка еще более снижалась после последовательного переваривания нейраминидазой как определено анализом SDS-PAGE. Биологическая активность in vitro очищенного рекомбинантного ЭПО была опробована методом C.KiystalaI, Exp. Нemаtоl., 11:649 (1983) (биопроба на пролиферацию клеток селезенки) с детеринациями белка, рассчитанными на основе данных по аминокислотному составу. После многократных определений удельная активность in vitro очищенного рекомбинантного ЭПО была найдена составляющей более, чем 200000единиц/мг белка. Среднее значение находилось в интервале 275000 - 300000единиц/мг белка. Кроме того, также наблюдались значения выше, чем 300000. Отношение активности in vivo (анализ полицитемических мышей, Kazal и Ersleu, Аm. Clinical Lab, Sci., Том В, стр. 91 (1975)) к активности in vitro, исследуемые для рекомбинантного материала, находились в интервале 0,7 - 1,3. Интересно сравнять представленную выше характеристику гликопротеида с характеристикой рекомбинантного СНО-продуцируемого ЭПО, ранее изложенной в Международной заявке на патент № WO 85/02810 (опубликована 20 июня 1985 года). Аналогичный сравнительный анализ на сахар, представленный на стр. 65 данной заявки, показывает, что значение для фукозы и N ацетилгалактозамина равны 0, тогда как отношение гексозы: N-ацетилгалактозамин равно 15,09:1. Отсутствие N-ацетилгалактозамина указывает на отсутствие O-сцепленного гликосилирования в ранее приведенном гликопротеиде. В противоположность этому материалу охарактеризованный выше рекомбинантный СНО-продуцируемый ЭПО настоящего изобретения содержит значительные и воспроизводимо обнаруживаемые количества как фукозы, так и N-ацетилгалактозамина, содержит менее 1/10 относительного количества гексоз и отличается наличием O-сцепленного гликосилирования. Кроме того, высокая удельная активность вышеописанного рекомбинантного ЭПО на основе СНО может быть непосредственно связана с его отличительным признаком гликоcилирования. Биологически активный ЭПО, полученный прокариотической или эукариотической экспрессией клонированных генов ЭПО настоящего изобретения, может быть использован для лечения in vivo видов млекопитающих врачами и/или ветеринарами. Количество активного компонента, безусловно, будет зависеть от жесткости режима, выбранного пути введения н удельной активности активного ЭПО, и в конечном счете будет решена лечащим врачом или ветеринаром. Такое количество активного ЭПО, определенное лечащим врачом, упоминается здесь как "эффективное для лечения ЭПО" количество. Например, при лечении индуцированной гипопролиферативной анемии, ассоциированной о хронической почечной недостаточностью в овце, эффективное суточное количество ЭПО найдено равным 10единицам/кг в течение 15 - 40 дней. См. Еschbach и др., J.Clin.Invest., 73:434 (1984). Активный ЭПО может вводиться любым путем, подходящим для используемых условий. Предпочтительна инъекция ЭПО в кровоток млекопитающего. Специалисту станет ясно, что предпочтительный путь введения изменяется с выбранным режимом. В то время как активный ЭПО можно вводить как чистое или в основном чистое соединение, предпочтительно иметь его в виде фармацевтической композиции или препарата. Композиции настоящего изобретения, как для ветеринарного, так и для человеческого применения, содержат белок активного ЭПО, как описано выше, вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями его и, по выбору, другими терапевтическими средствами. Носитель (носители) может быть "приемлемым" в смысле его совместимости с другими компонентами композиции и не вредным для его реципиента. Желательно, чтобы композиция не включала окислитель и другие вещества, с которыми, как известно, несовместимы пестициды. Композиции могут быть представлены в единичной лекарственной форме и могут быть получены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики. Все способы включает стадию связывания активного компонента с носителем, которой составляет один или более вспомогательных компонентов. В основном, рецептуры приготавливают путем однородного и тщательного смешения активного компонента с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердими носителями, или с обоими, после чего, если необходимо, осуществляют формование продукта в желательную композицию. Композиции, пригодные для парентерального введения, включает стерильные водные растворы активного компонента с растворами, предпочтительно изотоническими с кровью реципиента. Такие композиции можно приготавливать путем растворения твердого активного компонента в воде для получения водного раствора, и придание стерильности указанному раствору может достигаться в одноразовых или многодозовых контейнерах, например, запаянных ампулах или пробирках. ЭПО/кДНК, как используется здесь, включает созревший ген ЭПО/кДНК, которому предшествует кодон АТG и ЭПО/кДНК, кодирующая аллельные вариации белка ЭПО. Один аллель проиллюстрирован в Таблицах 2 и 3. Белок ЭПО включает производное 1-метионина белка ЭПО (Met-ЭПО) и аллельные вариации белка ЭПО. Созревший белок ЭПО показан последовательностью в Таблице 2, и начинается с последовательности Ala.Pro. Pro.Arg. начало которой изображено цифрой "1" в Таблице 2. Met-ЭПО должен начинаться с последовательности Me. Ala. Pro. Pro. Arg… Следующие примеры даны для содействия в понимании настоящего изобретения, действительный объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Понятно, что в предлагаемых методах могут быть выполнены модификации в пределах сущности настоящего изобретения. Все температуры выражены в градусах по Цельсию и не откорректированы. Знаком для микрона или микро, например, микролитра, микромоля и т.д., служит "мк", например, мкл, мкм и т.д. Примеры Пример 1: Выделение геномного клона ЭПО ЭПО очищают от мочи пациентов, страдающих апластической анемией, в основном, как описано ранее (Мiуаkе и др., J.Biol Сhеm., 252:5558 (1977)), з исключением того, что опускают фенольную обработку и заменяет термообработкой при температуре 80° в течение 5 минут для инактивации нейраминидазы. Конечной стадией очистки является фракционирование на колонке С-4 Vydac высокоэффективной жидкостной хроматографии (Группа Сепарации) с использованием от 0 до 95% ацетонитрального градиента с 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФК) в течение 100минут. Положение ЗПО в градиенте определяют электрофорезом в геле и анализом N-концевой последовательностью (21, 26, 27) основных пиков. ЭПО элюируют при 53% ацетонитрила и обнаруживает приблизительно 40% белка, подвергаемого высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО, выпаривают до 100мкл, доводят до рН 7,0 бикарбонатом аммония, переваренного до готовности 2%-ным, ТРСК-обработанным трипсином (Worthington) в течение 18 часов при температуре 37°. Триптическое переваривание затем подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано выше. Записывают оптическую плотность при 280 и 214нм. Хорошо отделенные пики выпаривают почти до сухости и подвергает непосредственно анализу N-концевой аминокислотной последовательности /59/, использую газофазннй секвениатор Модели 480А Applied Biosystems. Полученные последовательности приведены в Таблицах 2 и 3. Как описано здесь выше, два из этих триптических фрагментов отбирает для синтеза олигонуклеотидных зондов. Из последовательности, Val-Asn-Phe-Тyr-Аlа-Тrр-LyS (аминокислоты 46 - 52 в Таблицах 2 и 3), получают 17ме 32-кратной дегенерации ААА ТТССАNGСGТАGААGTТ и 18меr 128-кратной дегенерации ААА CCANGCGTAGAAGTTNAC. Из последовательности, Vаl-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (аминокислоты 144 - 150 в Таблицах 2 и 3), получают два пула 14-меров, каждый представляет собой 32-кратныч дегенерат ТТGN Т Т и ТТGN Т Т ТАСАСТААСТТССТ ТАСАСТААСТТСТТ которые отличаются в первом положении лейцинового кодона. Олигонуклеотиды помечают в 5'-конце 32Р, используя полинуклеотидную киназу (New Sugland Biolabs) и гамма 32Р-АТР (New England Nuklear) Удельная активность олигонуклеотидов варьируется между 1000 и 3000дюйм3/ммол олигонукпеотида. Геномную ДНК-библиотеку человека в бактериофаге лямбда (Lawn. и др., 22) подвергают скринингу ч использованием модификации методики амплификации in situ первоначально описанной Woo и др., /47/ (1978). Приблизительно 3,5 х 105 фаза высевают c плотностью 6000 фаза на 150мм чашку Петри (среды NZCYM) и инкубируют при температуре 37° до тех пор, пока пятна не станут видимыми, однако маленькими (приблизительно 0,5мм). После охлаждения при температуре 4° в течение 1 часа дупликатные реплики паттернов пятен переносят к найлоновым мембранам (New England Nuklear) и инкубируют в течение ночи при температуре 37° на чашках со свежими средами NZCYM. Затем фильтры денатурируют и нейтрализуют дотированием в течение 10 минут каждого на тонкой пленке 0,5Н NaОН - IМ NаCl и 0 5М Tris /pH 8/ - IМ NаCl, соответственно. Вслед за вакуумной сушкой при температуре 80° в течение 2 часов фильтры промывают в 5 х SSС, 0,5% SDS в течение 1 часа, и клеточные остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью. Это соскабливание снижает фоновое связывание зонда с фильтрами, фильтры затем промывают водой и предварительно гибридизируют от 4 до 8 часов при температуре 48° в ЗМ растворе тетраметиламмонийхлорида, 10мМ NаРО4 /рН 6,8/, 5 х D-enhard's, 0,5% SDS и 10мМ ЭДТК. 17меr, меченый 32Р, затем прибавляют при концентрации 0,1пмoл/мл и гибридизацию осуществляют при температуре 8° в течение 72 часов. Вслед за гибридизацией фильтры промывают экстенсивно в 2 х SSC (0,3М NaCl – 0.03М щитрат натрия, рН 7) при комнатной температура и затем в течение 1 часа в ЗМ ТМАСl - 10мМ NаРО4 /рН 6,3/ при комнатной температуре и от 5 до 15 минут при температуре гибридизации. Приблизительно 120 сильных дупликатных сигналов обнаруживают вслед за 2-х дневной авторадиографией усиливающим экраном. Положительные сигналы отбирают, группируют в пулы из 8, перевысевают и вновь подвергают окринингу в трипликате с использованием 1/2 14меr пула на каждом из двух фильтров и 127мer на третьем фильтре. Условия и 17меr для высевания и гибридизации такие, как описано выше, за исключением того, что гибридизацию для 14меr осуществляют при температуре 37. Вслед за авторадиографией зонд отводят из 17меr фильтра в 50%-ном формамиде в течение 20 минут при комнатной температуре и фильтр повторно гибридизируют при температуре 52° 18меr зондом. Два независимых фага гибридизируют ко всем трем зондам. ДНК из одного из этих фагов обозначен здесь l-HЕРOF переваривают до готовности с помощью Sau3A и субклонируют в М13 для анализа ДНК-последовательности с использованием дидезокси-метода обрыва цепи, предложенного Sanger и Conlson, /23/ (1977). Нуклеотидная последовательность и выведенная аминокислотная последовательность открытой рамки считывания, кодирующей триптический фрагмент ЭПО (подчеркнутая область), описаны здесь. Интронные последовательности даны в строчных буквах, экзонные последовательности /87nt/ даны в прописных буквах. Последовательности, которая согласуются с сайтами акцептора сращивания /а/ и донора /d/, подчеркнуты. (См. Таблицу 4). Таблица 4 Пример 2: Nоrthern анализ мРНК человеческой плодной печени 5мкг мРНК человеческой фетальной печени (получена из 20-недельной фетальной печени) и мРНК печени взрослого подвергают электрофорезу в 0,8%-ном агарозном формальдегидном геле и переносят к нитроцелллозе, используя метод Derman и др., Cell, 23:731 (1981). Однонитевый зонд затем получают из матрицы М13, содержащей вставку, показанную в Таблице 1. Праймером является 20меr, происходящий из того же триптического фрагмента, что и первоначальный 17меr зонд. Зонд получают, как ранее описано Аnderson и др., РNАS, /50/ (1984), за исключением того, что вслед за отщеплением (который продуцирует желательный зонд длиной 95nt, содержащий 74nt кодирующей последовательности) малый фрагмент очищают от матрицы М13 хроматографией на колонке с Сефарозой С14В и 0,1N NаОН - 0,2М NaCl. Фильтр гибридизируют приблизительно до 5 х 106 отсчетов в минуту этого зонда в течение 12 часов при температуре 68°, промывают в 2 х SSC при температуре 68° и подвергают воздействию в течение 6 дней усиливающего экрана. Однонитевая маркерная мРНК из 1200nt (указана стрелкой) движется в примыкающем проходе. (Фиг. 1). Пример 3: кДНК фетальной печени Зонд, идентичный описанному в Примере 2, получает и используют для скрининга библиотеки кДНК фетальной печени, полученной в векторе l-Ch21A (Тоolе и др., Nature, /25/, (1984), используя стандартные методики скрининга пятом (Berten Davis, Science, /54/ (1978). Три самостоятельных положительных клона (обозначены здесь l-HEPOF L 6 (1350 пар оснований). l-HEPOF L 8 (700 п.о.) и lHEPOF L 13 (1400п.о.) выделяют вслед за скринингом 1 x 106 пятен. Полная вставка l-HЕРОF L 13 и lHEPOF L 6 секвенируетоя вслед за субклонированием в М13. (Таблицы 7 и 5, соответственно). Только части l-НЕРОF L 8 секвенируют, оставшиеся подразумеваются идентичными другим двум клонам. (Таблица 7). 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности представлены строчными буквами. Кодирующая область представлена прописными буквами. Таблица 5 Таблица 6 Таблица 7 В отношении Таблиц 2 и 3 следует упомянуть, что выведенная аминокислотная последовательность, показанная ниже нуклеотидной последовательности, пронумерована, начиная с цифры для первой аминокислоты созревшего белка. Мнимый лидерный пептид указан во всех верхушках для аминокислотных обозначений. Остатки цистерна в созревшем белке дополнительно указаны SH, и потенциальные N-оцепленные сайты гликосилирования обозначены звездочкой. Аминокислоты, которые подчеркнуты, отмечают те остатки, идентифицированные секвенированием N-концевого белка или секвенированием триптических фрагментов ЭПО, которые описаны в Примере 1. Частичное подчеркивание указывает на остатки в аминокислотной последовательности определенных триптических фрагментов, которые не могли быть определены однозначно. кДНК-клоны l-HEPOF L 6, l-HEPOF L 8 и lНЕРОF L 13 депонированы и доступны из Аmеrісаn Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящими номерам АТCС 40156, АТСС 40152 и АТСС 40153, соответственно. Пример 4: Геномная структура гена ЭПО Относительные размеры и положения четырех самостоятельных геномных клонов ( l-НЕРОI, 2, 3 и 6) из библиотеки Haelll/Alui проиллюстрированы перекрывающимися линиями на Фиг. 3. Утолщенная линия указывает положение гена ЭПО. Масштаб (в Кб) и положения известных сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции приводятся. Область, содержащая ген ЭПО, подлостью секвенирована из обоих тяжей с использованием направленных экзонуклеаза III-генерированных рядов делеций через эту область. Схематическое изображение пяти экзонов, кодирующих мРНК ЭПО, показано на фиг. 4. Точная 5'-граница экзона 1 в настоящее время неизвестна. Белок - кодирующее участки экзонов затемнены. Полная нуклеотидная последовательность экзонов показана в Таблице 4. Известные пределы каждого экзона очерчены сплошными вертикальными полосами. Геномные клоны l-НЕРО1, l-НЕРО2, l- НЕРО3 и l-НЕРО6 деполированы и доступны из Аmerican Type Culture Collection, Rоскville, Maryland, под входящими номерами АТСС 40154, АТСС 40155, АТСС 40150 и АТСС 40151 соответственно. Пример 5: Конструирование вектора р91023 /В/ Вектором трансформации является pAdD26sVpA /3/, описанный Каufman и др., Моl. Cell Biol., 2:1304 (1982). Конструкция этого вектора показана на фиг. 5А. Короче говоря, эта плазмида содержит кДНК-ген дигидрофолятредуктазы мыши /DFNF/, который находится под транокрипциональным контролем основного позднего промотора аденовируса 2 /Ad2/. 5'-сайт сращивания указан в аденовирусной ДНК, и 3'-сайт сращивания, происходящий от гена иммуноглобулина, присутствует меду основным поздним промотором аденовируса 2 и DFНР-кодирующей последовательностью. Ранний сайт полиаденилирования sV40 присутствует по направлению ниже от DFHP-кодирующей последовательности. Участок прокариотического происхождения pAdS26SvрА /3/ исходит от psVOd/Меllon и др., Cell, 27:279 (1981) и не содержит последовательности рBR322, нзвестные тем, что они ингибируют репликацию в клетках млекопитающих (Lusky и др., Nature, 293:79 (1981)) pAdD26 pA /3/ превращают в плазмиду pCVSV L 2, как показано на фиг. 5А pAdD26VS pA /3/ превращают в плазмиду рАdD26 SvpA /3/ /d/ деленной одного из двух cайтов Psti в плазмиде pAdD26 SvpA /3/. Это осуществляют путей частичного переваривания Psti, используя недостаточность фермента таким образом, что получают субпопуляцию линеаризованных плазмид, в которой только один сайт Psti расщеплен, о последующей обработкой ферментом Кленова, сшиванием для рециркуляризации и скринингом для делеции сайта Psti, расположенного 3' к полиадениляционной последовательности SV10. Трех раздельный лидер аденовируса и гены, ассоциированные с вирусом (УА гены), вставляют в плазмиду pAdD26SVpA/3/ /d/, как показано на фиг. 5А. Во-вторых pAdD26SVpA/3/ /d/ расщепляют Puull для создания линейной молекулы, открытой внутри 3'-части трех элементов, содержащих трехраздельный лидер. Затем pJAW 43 (Zatn и др., Cell, 16:851 (1979)) переваривают Xhol, обработанным фрагментом Кленова, переваривают pvull, и фрагмент из 140 п.о., содержащий вторую часть третьего лидера, выделяют электрофорезом в акриландо геле /6/ в буфере бората Tris; Maniatis и др., выше. Фрагмент 140п.о. затем сшивают с Pvull-переваренной плазмидой pAdD26SVpA/3/ /d/. Продукт сшивания используют для трансформации Е.cоl в устойчивость к тетрациклину, и колонии подвергают окринингу о использованием методики Gruustein – Hoghess, применяя зонд, меченый 32Р, гибридизирующий к Фрагменту из 140п.о. ДНК получают из положительно гибридизирующих колоний для испытания того, является ли реконструированный сайт Pvull 5'-или 3’ - вставленной ДНК из 140п.о., специфичной ко второму и третьему поздним лидерам аденовируса. Правильная ориентация сайта Pvull - на 5'-стороне вставки 140п.о. Эта плазмида обозначена tтpL на фиг. 5. Фрагмент Ava II D вируса SV40, содержащего последовательность энхансера SV40, получают путем переваривания ДНК SV40 фрагмента Ava II. затупления концов фрагментом Кленова PolI, сшивания Хhо 1-линкеров с Фрагментами, переваривания Хhо 1 для открывания cайта Хhо 1 и выделения четвертого, наибольшего фрагмента /D/ посредством электрофореза в геле. Этот фрагмент затем сшивают с pTPL. разрезом Хhо 1, получая плазмиду pCYSYL 2-TPL. Ориентация фрагмента DSV10 в pCYSYL 2-TPL такова,, что поздний промотор вируса SV40 находится в такой же ориентации, что и основной поздний промотор аденовируса. Для интродуцирования генов, связанных о аденовірусом /генов YА/, в рСYSYL 2-TPL, вначале конструируют плазмиду рВР322, которая содержит фрагмент в Нind III аденовируса типа 2. ДНК аденовируса типа 2 переваривают Нind III и фрагмент В выделяют электрофорезом в геле. Этот Фрагмент вставляют в плазмиду рВР322, которая предварительно была переварена Нind III. После трансформации Е.соli в устойчивость к ампициллину рекомбинанты подвергают скринингу для вставки фрагмента В Нind III, и вставленную ориентировку определяют путем переваривания рестрикционным ферментом. pBP322 – Ad Hind III В содержит фрагмент В Hind III аденовируса типа 2 в ориентация, изображенной на фиг. 5В. Как показано на фиг. 5Б, гены VA удобно получает из плазмиды рВР322 - Ad Hind III В путем переваривания Нра I, добавления линкеров EcоRI и переваривания EcoRI о последующим восстановлением фрагмента 1,4кб. Фрагмент, имеющий липки концы EсoRI, затем вшивают в EcoRI-сайт PTL, ранее переваренной ЕсоRI. После трансформирования НВIOI Е.cоli и отбора для устойчивости к тетрациклину, колонии подвергают скрянингу посредством фильтр-гибридизации в ДНК, специфичную для генов УА. ДНК получают из положительно гибридизирующих клонов и охарактеризовывают перевариванием рестрикционной эндонуклеазой. Полученная плазмида обозначена р91023. Как показано на фиг. 50, два сайта EсoRI в плазмиде р91023 отщепляют путем разрезания р91023 до готовности при помощи EcoRI, восстановления двух ДНК-фрагментов, один около 7кб и другой около 1,3кб. Последний фрагмент содержит гены УА. Концы обоих фрагментов заполняют с использованием фрагмента Кленова Poll и два фрагмента затем сшивают один к другому. Плазмиду р91023/А/. содержащую гены УА и являющуюся аналогичной плазмиде р91023, однако потерявшую интерстициальный фрагмент для двух сайтов EcoRI, идентифицируют посредством скрининга Grunstein Hogness фрагментов гена УА, а также традиционного анализа рестрикционного соайта. Один Pst 1-сайт в плазмиде р91023/А/ отщепляет и заменяют на EcoRI-сайт. р91023/А/ разрезают до готовности при помощи Рsti и обрабатывают фрагментом Кленова Роli для генерации прорастающих концов. EcoRI-линкеры сшивают с тупоконечным cайтом Рsti плазмиды р91023/А/. Линейную плазмиду р91023/А/ о EcoRI-линкерами, присоединенными в тупоконечном сайте Psti, отделяют от несшившихся линкеров и переваривают до готовности EсoRI, после чего повторно сшивают. Плазмиду р91023/В/, как изображено на фиг. 5С, восстанавливают и идентифицируют как имеющую структуру, аналогичную плазмиде р91023%/А/, но вместо прежнего сайта Psti содержится сайт EcoRI. Плазмида р91023/В/ депонирована и доступна из American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящим номером АТСС 39754. Пример 6. кДНК-клоны (l-ЕРОF L 6 и l-EPOF L 13, Пример 3) вставляют в плазмиду р91023/В/, образуя pPTF L 6 и pFT F L 13, соответственно. 8мкг каждой из очищенных ДНК затем используют для трансфекции 5 х 106 клеток COS, используя DЕАЕ-декотран-метод (ниже). Через 12 часов клетки промывают и обрабатывают Хлорохином (0,1мМ) в точение 2 часов, промывают вновь и выдерживают в течение 24 часов в 10мл средах, содержащих 10%-ную фетальную телячью сыворотку. Среды меняют на 4мл среды, свободные от сыворотки, и собирают через 48 часов. Получение иммунологическя активного ЭПО определит количественно радиоиммунннм анализом, как описано Sherwood и Glodwasser /55/. Антитело поставлено Доктором Judith Sherwood. Кодированный изотопный индикатор получают из гомогенного ЭПО, как описано в Примере 1. Чувствительность пробы составляет приблизительно 1нг/мл. Результаты приводили ниже в Таблице 8. Таблица 8 Вектор Уровень ЭПО, высвобожденного в среды /нг/мл/ рРТР L 13 330 pPTF L 6 31 FTT L 13 депонирована и доступна из Аmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland под входящим номером АТСС 39990. Пример 7, кДНК ЭПО (l-HEPОF L 13) вставляют в плазмиду р91023 /В/, трансформируют в клетки COS-1 и собирают, как описано выше (Пример 6), за исключением того, что хлорохинную обработку опускают. Биологически активный in vitro ЭПО измеряют с использованием либо колониеобразующей пробы о клетками фатальной печени мыши в качестве источника CFV-E, либо пробы поглощения 3Н-тимидином, используя клетки селезенки от мышей, инъекцированных фенилгидразином. Чувствительности этих анализов составляют приблизительно 25мЕдиниц/мл. Биологически активный in vitro ЭПО измеряют о использованием либо метода гипоксической мыши, либо метода голодающей крысы. Чувствительность этих анализов составляет приблизительно 100мЕдиниц/мл. Никакой активности не обнаружено ни в одном из этих опытов с имитированной кондиционированной средой. Результаты ЭПО, экопресоированного клоном ЕРОF L 13, показаны ниже в Таблице 9, где приведенные активности выражены в единицах/мл, с использованием торгового, количественно определенного ЭПО (Тоyоbо, I пс.) в качестве стандарта. Таблица 9 ЭПО, выделенный из клеток С05, трансфекцированных кДНК ЭПО, тип 1 Проба Активность RIA 100 н/мл CFV-Е 2 0,5 Ед/мл 3 Н-Тhy 3,1 1,8 Ед/мл гипоксическая мышь 1 Ед/мл голодающая крыса 2 Ед/мл Пример 8: Гель-анализ полиакриламида SDS ЭПО из клеток СОS 180нг ЭПО, высвобожденного в среды клеток COS, транcфекцированных кДНК ЭПО (l-HЕРОF L 13) в векторе 91023 /В/ (выше), подвергают электрофорезу на 10%-ном геле полиакриламида Laemlli SDS и электропередают нитроцеллюлозной бумаге (Towbin и др., Proc. Nati. Acad Sci США, 76:4350 (1979)). Фильтр зондируют антителом анти-ЭПО, как описано в Таблице 8, промывают и повторно зондируют белком А 125I-стаф. Фильтр авторадиографируют в течение двух дней. Нативный гомогенный ЭПО описан в Примере 1, и его подвергают электрофорезу или перед (проход В), или после йодирования (проход С) (см. Фиг. 6). Используемые маркеры включают метионин, меченый 35S, сывороточный альбумин (68000д) и яичный альбумин (45000д). Пример 9: Конструирование RKI-4 Фрагмент Bam HI-Pvull из плазмиды PSV2 НГР (Subramani й др., Моl Сеll.Вiol. 1:854 – 864 (1981)), содержащий ранний промотор sV40, смежный с гном дигидрофолятредуктазы мыши (DHFR), энхансер sV40, малый антигенный интрон t и последовательность полиаденилирования SV40 выделяют (фрагмент А). Оставшиеся Фрагменты получают из вектора р91023/А/ (выше) следующим образом, р91023/А/ переваривают РstI в единственном сайте РstI около промотора аденовируса для линеаризации плазмиды, и либо сшивают с синтетическими конвертерами Рst I - EcoRI и рециркулизуют (создавая сайты Рst I EcoRI – Pst I в первоначальном сайте Рst I; 91023/В'//, либо обрабатывают большим фрагментом ДНК-полимеразы I для разрушения сайтов Pst I и сшивают о синтетическим EcoRI -линкером и рецеркулизуют (создавая EcoRI-сайт в первоначальном сайте Pst I; 91023/В/. Каждую из двух полученных плазмид 91023/B/ и 91023/В'/ переваривают хbа и ЕСORI для получения двух фрагментов (F и G). Путем соединения фрагмента G из плазмиды р91023/В/ и фрагмента F из плазмиды р91023/В'/, а также фрагмента G из плазмиды р91023/В/ и фрагмента F из плазмиды р91023/В'/ создают две новые плазмиды, которые содержат либо сайт EсoRI – Pst I, либо сайт PstI - EcoRI, где Рst I - сaйт, являющийся наиболее близким к основному позднему промоторе аденовируса назван р91025/С/. Вектор р91023/С/ переваривают ХhоІ до готовности, и полученную линеаризованную ДНК с липкими концами затупляют путем реакции наполнения концов большим фрагментом Е.соli ДНК-полимеразы I. К этой ДНК пришивают фрагмент Hind III - EcoRI из 340п.с., содержащий энхансер sV40, полученный следующим образом: Фрагмент Hind III - Pvull из вируса sV40, который содержит основу sV40 или репликации, а также энхансер вставляют в плазмиду в lac/Little и др., Mol.Biol.Med., 1:473 - 488 (1983)). Вектор с lаc получают перевариванием ДHК c lac c ВаmHl, наполнением липкого конца большим фрагментом ДНК-полимеразы I и перевариванием ДНК Нind III. Полученная плазмида (с sVHPlac) регенерирует ВаmНІ-cайт путем сшивания c тупым концом Рvu II. Фрагмент EcoRI-Hind III получают из с sYHPlac и пришивают к фрагменту EcoRI - Hind III P sVod/Меllоn и др., выше), который содержит плазмидную основу репликации, и отбирают полученную плазмиду pVHPOd. Затем получают фрагмент EcoRI – Hind III из 340п.о. плазмиды PSVHPOd, содержащий основу SV40 (энхансер, затупляют с обоих концов при помощи большого фрагмента ДНК-полимеразы I и сшивают с Xhol-переваренным, тупоконечным вектором р91023/C/, описанным выше. Полученную плазмиду /р91023/С/ (Хhо) плюс EcoRI/Hind III/тупая основа SV40 плюс энхансер/, в которой ориентация фрагмента Hind III -EcoRI такова, что ВаmHl-сайт внутри фрагмента является близлежащим к гену VА, называют pES105. Плазмиду PES105 переваривают ВаmНІ и Рvu II, а, также отдельно PvuII, и выделяют Фрагмент ВаmHl – Pvu II, содержащий основной поздний промотор аденовируса (фрагмент В), и фрагмент Pvu II, содержащий плазмиду в течение периода устойчивости гена (устойчивости к тетрациклину), а также другие последовательности (фрагмент C), Фрагменты А, В и С сшивают и полученную плазмиду, показанную на фиг. 7, выделяют и обозначают РКI4. Плазмида РКI-4 депонирована American Culture Collection Rockville, Maryland, где она доступна под входящим номером АТСС 39940. Пример 10: Экспрессия ЭПО в клетках CНО - Метод 1 ДНК (20мкг) из плазмиды pPTF L 13, описанной выше (Пример 5), отщепляют рестрикционной эндонуклеазой Сlа І для линеаризации плазмиды и сшивают c Сlа I-отщепленной ДНК из плазмиды pAdD265sVp/A/ I (2мкг), которая содержит интактный ген дигидрофолятредуктазы (DHFR), приводимый в действие основным поздним промотором аденовируса Kaufman и Sharp, Моl.and Cell Вiоl., 2:1304 - 1319 (1982)). Эту сшитую ДНК используют для трансфекции D HF R-отрицательных клеток CНО (DUKX-BII, Chasin L.A. и Urlab G. (1980) PNAS 77:4216 - 4220/, и после двухдневного выращивания клетки, которые приняли в себя по крайней мере один ген D HF R, отбирают в альфа-средах, не имеющих нуклеотиды, и пополняют 10%-ной диализированной фотальной бычьей сывороткой. Вслед за ростом в течение двух недель в избирательных средах, колонии извлекают из первоначальных чашек, объединяет по группам из 10 - 100 колоний на пул, повторно высевает выращивают до слияния в альфе-средах, не имеющих нуклеотиды. Отстоявшиеся среди из пулов, выращенных до метотрексатной селекции, опробуют на ЭПО посредством радиоиммуноанализа (RIA). Пулы, которые показывают положительное ЭПО-получение, выращивают в присутствии метотрексата (0,02мкМ) и затем субклонированный из пула Сlа 4,4,02 ЭПО, высвобождает 460нг/мл ЭПО в среды, содержащие 0,02мкМ MТX (Таблица 10). cla 4 4,02 - 7 ЭПО представляет собой клеточную линию выбора для получения ЭПО и депонирован Аmerican Type Culture Collection под входящим номером АТСС CRL 8695. Этот клон подвергают поэтапному отбору при возрастающих концентрациях MTX и, по-видимому, он будет продуцировать клетки, которые обнаруживают даже более высокие уровни содержания ЭПО. Для пулов, которые являются отрицательными при RIA, метотрексат-устойчивые колонии, полученные из эквивалентных культур, растущих в присутствии метотрексата (0,02мкМ), вновь подвергают проверке в пулах для ЭПО путем RIA. Те культуры, которые не являются положительными, субклонируют и подвергают культивированию при еще более возросших концентрациях метотрексата. Ступенчатая селекция с метотрексатом (МТХ) достигается повторными циклами культивирования клеток в присутствии возрастающих концентраций метотрексата и селекции для выживших микроорганизмов. При каждом цикле ЭПО измеряют в надосадочном слое культуры посредством RIА и биологической активности in vitro. Уровни используемого метотрексата в каждой ступенчатой амплификации составляют 0,02мкМ, 0,1мкМ и 0,5мкМ. Как показано в Таблице 10, после первого цикла селекции при 0,02мкМ МТХ в культуральные среды высвобождаются значительные уровни ЭПО. Таблица 10 Уровень высвобождаемого в среды ЭПО 0,02мкМ Сбор в метотрексат в Выборка Анализ a-среде a-среде 4 4 Пул RIA 17нг/л 50нг/мл 4 4 Клон единичной колонии (0,02 – 7) RIA 460нг/мл Пример 11: Экспрессия ЭПО в клетках СПО - Метод 11 ДНК из клона l-HEPOF L 13 переваривают EcoRI, и малый Фрагмент RI, содержащий ген ЭПО, субклонируют в ЕсоRI-cайт плазмиды RКI-4 (см. Пример 10). Эту ДНК (RKF L 13) пат используют для трансфекции DHF R-отрицательных клеток СHО прямо (без переваривания), и селекцию и амплификацию осуществляют, как описано в Примере 10 выше. ДНК RKF L 13 также вставляют в клетки СНО путем слияния протопластов и микроинъекции. Плазмлда RKF L 13 депонирована и доступна из American Type Culture Collection Rokville, Maryland, под входящем номером АТСС 33989. Таблица 11 Уровень высвобождаемого в среды ЭПО 0,02мкМ Сбор в a- метотрексат в Выборка Анализ сборке в aсреде среде Колония RIA 3нг/мл 42нг/мл (пул) 150нг/мл Пул А (клон) 3 H-Thy -“1,5Ед/мл клон RIA -“90нг/мл единичной 3 колонии H-Thy -“5,9Ед/мл (0,02С-Z) Микроинъекцнрованный RIA 60нг/мл 160нг/мл пул (DEPO-I) 3 H-Thy 1,8Ед/мл -Предпочтительный клон единичной колонии депонирован и доступен American Type Culture Collection Rokville, Maryland, под входящим номером АТСС CRL 8695. Пример 12: Экспрессия гоночного клона ЭПО в клетках COS-I Лектором, используемым для экспрессии геномного клона ЭПО, является psVOd (Mellon др., выше). ДНК из psVD (переваривают до готовности при помощи Hind III и затупляет большим фрагментом ДНКполимеразы I. Геномный клон ЭПС, l-НЕРСЗ, переваривают до готовности EcoRI и Hind III, и 4,0кб фрагмент, содержащий ген ЭПО, выделяют и затупляет, как описано выше. Нуклеотидная последовательность этого фрагмента из Hind III-сайта до области, находящейся выше сигнала полиадениляции, показана на фиг. 4 и в Таблице 4. Фрагмент гена ЭПО вставляют в плазмидный Фрагмент рsVOd, и правильно построенные рекомбинанты в обеих ориентирах выделяют и проверяют. Плазмида CSS-I имеет ген ЭПО и ориентации "а" (т.е. с 5'-концом ЭПО, самым ближайшим к началу SV40) и плазмида СZI-3 находится в противоположной ориентации (ориентация "b"). Плазмды CZI-3 и CZ2-I трансекцируют в клетки СOS-I как описано в Примере 7, и среды собирают и анализирует на иммунологиески реактивный ЭПО. Приблизительно 31мг/мл ЭПО обнаружено в отстоявшихся культурах от СZ2-I и 12 - 31нг/мл от CZI-3. Геномные клоны НЕРOI, НEPO2 и HEPO6 могут быть вставлены в клетки COS для экспрессии аналогичном образом. Пример 13: Экспрессия в клетках С127 и ЗТЗ Конструирование рВPУЕРО Плазмиду, содержащую кДНК-последовательность ЭПО под транскрипциональным контролем металлотионеинового промотора мыши и привязанную к полной ДНК вируса бычьей папилломы, получают следующим образом: pEF049f Плазмида S P6/5 приобретена у Promeda Biotec. Эту плазмиду переваривает до готовности с ЕсоRІ, и фрамент EcoRI из 1340 п.о. из l-HЕРОF L 13 вставляют при помощи ДНК-лигазы. Полученную плазмиду, в которой 5’-конец гана ЭПО является ближайшим к промотору SP6 (как определено перевариванием ВglІ и Нind III), обозначают рEP049F. В этой ориентации сайт BamHI в полидинкере PSР6/5 непосредственно примыкает к 5'-концу гена ЭПО. рММТnec ВРV Плазмиду рdВРV-ММТnео (342 – 12) (L aw и др., MoI.and Cell Вiоl., 3:2110 - 2115 (1983)), показанную на фиг. 8, переваривают до готовности ВаmНІ для получения двух фрагментов большого фрагмента ~ 8кб в длину, содержащего геном ВРУ, и меньшего фрагмента, ~ 6,5кб в длину, содержащего pМL2 начало репликации и ампициллин-устойчивого гена, металлотионеинового промотора, неомицин-устойчивого гена и сигнала полиаденилирования SV40. Переваренную ДНК рециркулизуют ДНК-лигазой, и плзамиды, которые содержат только 6,8кб фрагмент, идентифицируют перевариваниями рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и ВаmHI. Одна такая плазмида обозначена рММТneo ВPV. рЕР015а рММТnео ВРV переваривают до готовности BglII. PEP049f переваривают до готовности ВamНІ и ВglII, и приблизительно 700п.о. фрагмент, содержащий целую ЭПО-кодирующую область, получают гельизоляцией. RglII-переваренпую рММТnео ВРУ и фрагмент ВаmНІ/ВglІІ ЭПО из 700п.о. сшивают, и полученные плазмиды, содержащие кДНК ЭПО, идентифицируют гибридизацией в колониях при помощи олигонуклеотидного d/GGTCATCTGTCCCCTGTCC/ зонда, являющегося специфичным к гену ЭПО. Из плазмид, которые являются положительными под гибридизационным анализом, одна /рЕР015а/, которая имеет кДНК ЭПО в ориентация, так, что 5'-конец кДНK ЭПО является близлежащим к металлотнонеиновому промотору, идентифицируется путем переваривания EcoRI и KpnI. рВРУ-ЭПО Плазмиду рЕР015А переваривают до готовности BamHI длл линеаризации плазмиды. Плазмаду рdBРУ-ММТnео /342 - 12/ также переваривают до готовности ВаmНІ для получения двух фрагментов длиной 6,5 и 8кб. фрагмент, который содержит целый геном вируса бычьей папилломы, выделяют в геле. РЕР015а/ ВаmHІ. и Фрагмент ВаmНІ длиной 8кб сшивают друг с другом, и плазмиду /рВРУ-ЭПО/, которая содержит Фрагмент ВРУ, идентифицируют гибридизацией в колониях с использованием олигонуклеотидного зонда d/P-CCACACCCGGTACACA-OH/, который является специфичным к геному ВРУ. Переваливание ДНК рВРУ-ЭПО с Нind III указывает на то, что направление транскрипции генома ВРУ является таким же, как и направление транскрипции металлотионеинового промотора (как в рdВРVММТnео /342 – 12/, см. фиг. 9). Плазмида рdВРV-ММТnео /342 – 12/ доступна из America Туре Сulture, Collection, Rockville, Maryland под входящим номером АТСС 37224. Экспрессии Следующие методы используются для экспрессии ЭПО. Метод 1 Получают ДНК рВРУ-ЭПО и приблизительно 25кг используют для трансфекии 1 х 106 клеток С127 /Lowy и др., J.of.Viol., 26:291 - 298 (1978) CНО, используя стандартные методики осаждения фосфата кальция (Grahm и др., Virology 52:456 - 457 (1973)). Через пять часов после трансфекции трпнсфекционные среды удаляют, клетки шокируют глизерином, промывают и прибавляют свежую aсреду, содержащую 10%-ную фетальную бычью сыворотку. Через сорок восемь часов. клетки трипоинизируют и расщепляют в отношении 1:10 в DМЕ среде, содерашей 500мкг/мл G 413 (Southern и др., Mol. Appl. Genet., 1:327 - 341 (1982)), и клетки выращивает в течение двух-трех недель. G418устойчивые колонии затем выделяют индивидуально в микротитровый колодец и выращивают до суболивания в присутствии G418. Клетки затем промывают, прибавляют свежие среды, содержащее 10%-ную фетальную бычью сыворотку, и среды собирают через 24 часа. Кондиционированное среды испытывают, и они являются положительными для ЭПО под радио-имунным анализом и биологической пробой in vitro. Метод II Клетки С127 и ЗТЗ котрансфецируют 25мкг рВРУ-ЭПО и 2мкг рSV2nео (Southern и др., выше), как описано в Методе I. Это составляет приблизительно 10-кратный мольный избыток рВРУ-ЭПО. Вслед за транофекцией применяют методику, анологичную описанной в Методе I. Метод III Клетки С127 трансфецируют 30мкг рBРУ-ЭПО, как описано в Методе I. Вслед за трансфекцией и расщеплением (1:10) свежие среды меняют каждые три дня. Приблизительно через 2 недели появляются очаги ВРУ-трансформироварных клеток. Отдельные очаги собирают в 1см колодцы микротитровой чашки, выращивают до субсливающегося монослоя и анализируют на активность ЭПО или его активность в кондиционированных средах. Пример 14: Экспрессия в клетках насекомых Конструирование рІУЕУ EPOF L 13 Плазмидный вектор рІУЕУ депонирован и доступен из America Туре Сulture, Collection, Rockville, Maryland под входящим номером АТСС 39991. Вектор модифицирует следующим образом: рІУЕУN І рІУЕУ переваривают EcoRI для линеаризации плазмиды, затупляют с использованием большого Фрагмента ДНК-полимеразы 1, и одиночный линкер No I. GGCGGCCGCC CCGCCGGCGG вставляют сщиванием с тупым концом. Полученную плазмиду обозначают рІУЕУ N І. рІYEYSІ рІУЕУ переваривают Smal для линеаризации плазмиды, и одиночный линкер Sfil GGGCCCCAGGGGCCC CCCGGGGTCCCCGGG вставляют сшиванием с тупым, концов. Полученную плазиду обозначают рІУЕУSІ. рІУЕУSl ВgКр Плазмиду рІУЕУSІ переварчгают КрnІ для линеаризации плазмиды, и приблизительно от 0 до 100п.о. отщепляют от каждого конца путем переваривания двунитевой эндонуклезой Ваl 31. Любые полученные концы, которые не совсем тупые, затупляют с использованием большого фрагмента ДНК-полмеразы I, и полилинкер вставляют сшиванием с тупым концом. Полилинкер вставляют в обеих ориентациях. Плазмиду, в которой ориентировал полилинкер таким образом, что сайт ВglІІ внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют рІУЕУSІВgКр. Плазмиду, в которой сайт КрnІ внутри полилинкера является близлежащем к полиэдральному генному промотору, называют рІУЕУSІКрВg. Число пар основании, которые были потеряны между первоначальным КрnІ-cайтом в рІУЕУSІ и полиэдральным промотором, не определено. рІУЕУSIBgKp депонирована и доступна из American Туре Сulture, Collection, Rockville, Maryland, под входящим номером АТСС 39988. рIЕYSIВgКр N l рІYЕУ N I переваривают до готовности КрnІ и РstІ для продуцирования двух фрагментов. Больший фрагмент, который содержит плазмидное начало репликации и 3'-кзнец полиэдрального гена, получают выделением в геле (фрагмент А). рІУЕУSІВgКр переваривают до готовности РstІ и Крn для получения двух фрагментов, и меньший фрагмент, который содержит полиэдральный генный промотор и полиллнкер, получают выделениями в геле (фрагмент В). Фрагменты А и В затем объединяют ДНКлигазой для образования новой плазмиды рIYEYSIBgКр N I, которая содержит частично потерянный полиэдральный ген, в которой вставлен полилинкер, а также содержит NotI-сайт (замещая разрушенный EcoRI-сайт) и SfiI-сайт, который прикрывает фланг полиэдрального генного участка. рІYЕРО рІYЕYSІ BGKpN I переваривают до готовности ЕсоRІ для линеаризации плазмиды, и вставляют фрагмент ЕсoRІ длиной 1340 пар оснований из a-HEPOF L 13. Плазмиды, содержащие ген ЭПО в ориентации так, что 5'-конец гена ЭПО является близлежащим к полиэдральному промотору н 3'- концу полиэдрального гена, идентифицируют путем переваривания BglІІ. Одну из этих плазмид в ориентации, описанной выше, обозначают как рІУЕРО. Экспрессия ЭПО в клетках насекомых Большие количества плазмиды рІУЕРО получают трансформацией штампа JМІОІ-tglЕ.соli. Плазмидную ДНК выделяют посредством методики осветленного лизата (Maniatis и Frietsch, Gold Spring Harbor Manual) й подвергают дальнейшей очистке CsCI-центрифугированием. ДНК птама L – I вируса полиэдроза Аntographa california дикого типа (AсNPY) получает фенольной экстракцией вирусных частиц, и последующей очисткой вирусной ДНК. Эти две ДНК затем контрасфецируют в клетки IРI B-SF-21 Spodoptera frugiperda /Vaughu и др., in vitro, Том В, стр. 213 - 217 (1977), используя методику трансфекции с фосфатом кальция (Potter и Miller, 1977). Для каждой чашки контрансфецируемых клеток используют хомутик ДНК АсNРУ дикого типа и 10мкг рІУЕРО. Чашки инкубируют при температуре 27°С в течение 5 дней. Затем собирают надосадочную жидкость, и экспрессию ЭПО в надосадочном слое подтверждают радиоиммунным анализом и биологической пробой in vitro Пример 15: Счистка ЭПО Кондиционированные среды клеток COS (121) концентрациями ЭПО до 200мкг/литр концентрируют до 600мл с использованием ультрафильтрационных мембран с молекулярным весом 10000, таких как Millipore Реlliсаn, снабженный 5кв, фут (0,465кв.м) мембраной. Опыты осуществляют RIA как описано в Примере 6. Удерживатель из ультрафильтрации диафильтруют против 4мл 10мМ буферного раствора фосфата натрия при рН 7. Концентрированные и диафильтрованные кондиционированные среды содержат 2,5мг ЭПО в 380мг общего белка. Раствор ЭПО дополнительно концентрируют до 186мл, и осажденные белки извлекают центрифугированием при 110000хг в течение 30 минут. Надосадочный слой, который содержат ЭПО (2,0мг) приводят к рН 5,5 50%-ной уксусной кислотой, позволяет перемешаться при температуре 4°С в течение 30минут, осадок извлекают центрифугированием при 13000 х г в течении 30 минут. Хроматография на карбонилметильной сефарозе Отстоявшийся слой от центрифугирования (20мл), содержащий 200мкг ЭПО (24мг общего белка), подводят к колонке, упакованной СМ-Сефарозой (20мл), уравновешенней в 10мМ ацетате натрия, рН 5,5, прорывают 40мл того же буферного раствора. ЭПО, связанный с СМ-Сефарозой, элюируют 100мл градиента NaV (0 – 1) в 10мМ растворе фосфата натрия, рН 5,5. Фракции, содержащие ЭПО (общее количество 50мкг в 2мг общих белков, объединяют по группам и концентрируют до 2мл с использованием ультрафильтрационной мембраны Аmicon УМIO. ВЭЖХ с обращенной фазой Концентрированные Фракции из СМ-Сефарозы, содержащие ЭПО, подвергают дальнейшей очистке ВЭЖХ с обращенной фазой, используя колонку Vydac С - 4. ЭПО подают на колонку, уравновешенную в 10%-гом растворителе В (Растворитель А представляют собой 0,1% CH3CO2H в воде; растворитель В представляет собой 0,1% CH3CO2H в CH3CN), с низкой степенью подачи 1мл/мин. Колонку промывают 10% В в течение 10минут и ЭПО элюируют линейным градиентом В (10 – 70% в течение 60 минут). Фракции, сожержащие ЭПО, объединяют по группам (~40мг ЭПО в 120мкг общих белков) и лиофизируют. Диофилизированный ЭПО повторно структорируют в 0,1М растворе Iris-Hcl при рН 7,5, содержащем 0,15М Nacl, и повторно хроматографируют ВЭЖХ с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО, объединяют по группам и анализируют электрофорезом в SDS-полиакриламидом (10%) геле (Lamelli U K., Nature). Объединенные фракции ЭПО содержат 15,5мкг ЭПО в 25мкг общего протеина. Изобретение описано подробно, включая предпочтительные варианты его существования. Специалист, однако, поймет, сто при рассмотрении описания изобретения и чертежей могут возникнуть варианты и усовершенствования в пределах объема и сущности настоящего изобретения, заключенных в прилагаемой формуле изобретения.