Композиція та способи застосування антитіл до склеростину

Реферат: UA 102075 C2 (12) UA 102075 C2 Винахід належить до антитіла до склеростину, а також до фармацевтичної композиції, що містить зазначене антитіло, та до способу застосування зазначеного антитіла для лікування захворювання, пов'язаного з аномаліями в кістковій тканині, такими як остеопороз. UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої відноситься винахід Цей винахід відноситься до антитіл до склеростину і композицій та способів застосування зазначених антитіл для лікування патологічного порушення, опосередковуваного склеростином, або пов'язаного з аномаліями в кістковій тканині захворювання, такого як остеопороз. Передумови створення винаходу Ген SOST кодує білок склеростин, котрий являє собою глікопротеїн, що секретується та складається з 213 амінокислот. Склеростин є представником надсімейства факторів, що включають "цистеїновий вузол". Склеростин споріднений сімейству білків ДАН/Церберус (DAN/Cerberus), які впливають на передачу сигналів BMP шляхом інгібування зв'язування BMP з рецепторами і, як наслідок, інгібування каскаду передачі сигналів (Avsian-Kretchmer, Mol Endocrinol, 18(1), 2004, сс. 1-12). Експресія мРНК склеростину виявлена в дорослих людей головним чином у кістковій тканині та нирці. Білок склеростин виявлений головним чином у кістковій тканині. У кістковій тканині його експресія обмежена зрілими і повністю диференційованими клітинами, що формують кістку, тобто остеоцитами. Склеростин являє собою ефективний негативний регулятор формування кістки в людини та мишей. Відсутність експресії гена SOST приводить до склеростеозу (Balemans та ін., Hum Mol Genet., 10(5), 2001. сс. 537-543; Brunkow та ін., Am J Hum Genet, 68(3), 2001, сс. 577-589). Пацієнти протягом всього життя страждають розростанням кісткової тканини, що приводить до підвищеної мінеральної щільності і міцності кісткової тканини. У них не виявлено ніяких інших ендокринологічних аномалій - всі ускладнення, що мають місце протягом їх життя, пов'язані з аномальним нагромадженням кісткової тканини. В індивідуумів, що є гетерозиготними носіями цього рецесивного порушення, також виявлена підвищена кісткова маса (Gardner та ін., J. Clin Endocrinol Metab, 90(12), 2005, сс. 6392-6395). Цей фенотип можна рекапітулювати у мишей з дефіцитом гена SOST і його понадекспресія приводить до остеопенії. Крім того, відомо, що хвороба ван Бухема [MIM 239100] - фенотипова копія склеростеозу - викликається порушеною регуляцією гена SOST, пов'язаною з геномною делецією кісткового енхансера далекої дії (Balemans та ін., J Med Gene, 39(2), 2002, сс. 91-97; Loots та ін., Genome Res, 15(7), 2005, сс. 928-935). І, нарешті, SOST піддається в процесі формування кістки негативної регуляції гормоном паращитоподібної залози (PTH), фактором формування кістки, роль якого доведена клінічно, що дозволяє припустити, що анаболічна дія PTH частково може бути обумовлена SOST (Keller і Kneissel Bone, 37(2), 2005, сс. 148-158). Склеростин зв'язує BMP (білки, що беруть участь в остеогенезі) і може діяти як антагоніст BMP in vitro (Winkler та ін., EMBO J., 22(23), 2003, сс. 6267-6276). Склеростин діє також як негативний регулятор канонічного шляху передачі сигналів Wnt (Wingless) або безпосередньо шляхом зв'язування з LRP5/LRP6 (Li та ін., J Biol Chem., 20, 2005, с. 280(20); Semenov, J Biol Chem., 19 жовтня 2006 р. van Bezooijen та ін., J Bone Miner Res, 10 жовтня 2006 р.), або побічно (Winkler та ін., J Biol Chem., 28, 2005, 280(4), сс. 2498-2502). Відсутність експресії склеростину приводить до надлишкового утворення кісткової тканини, при цьому резорбція кістки не порушується (склеростеоз, хвороба ван Бухема) (Balemans та ін., 2001; Brunkow та ін., Am J Hum Genet, 68(3), 2001. сс. 577-589, Balemans та ін., 2006; Loots та ін., Genome Res, 15(7), 2005, сс. 928-935). Лише деякі із застосовуваних у цей час шляхів лікування пов'язаних зі скелетом порушень можуть приводити до підвищення щільності кісткової тканини, більшість доступних у цей час шляхів лікування спрямовані насамперед на інгібування додаткової резорбції кістки, а не на стимуляцію формування нової кісткової тканини. Одним із прикладів медикаментозних засобів, що застосовуються для лікування втрати кісткової тканини, є естроген. Однак не ясно, чи володіє естроген якими-небудь тривалими сприятливими діями. Крім того, естроген може приводити до ризику підвищення виникнення різних типів пухлин, таких як рак молочної залози і ендометрія. Інші сучасні терапевтичні підходи до лікування остеопорозу включають застосування бісфосфонатів (наприклад, FosamaxTM, ActonelTM, BonvivaTM, ZometaTM, олпадронат, неридронат, скелід, бонефос), гормон паращитоподібної залози, кальцилітичних засобів, кальциміметиків (наприклад, цинакальцет), статинів, анаболічних стероїдів, солей лантану і стронцію та фториду натрію. Однак із зазначеними терапевтичними засобами часто пов'язані небажані побічні дії. Короткий виклад суті винаходу Одним з варіантів здійснення винаходу є антитіло або функціональний білок, що містить антигензв'язувальну ділянку антитіла, мішенню якого є поліпептид склеростину (SEQ ID NO: 155), яка відрізняється/який відрізняється тим, що антитіло або функціональний білок специфічно зв'язується з поліпептидом склеростину і може підвищувати в ссавця щонайменше 1 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одну з наступних характеристик: утворення кісткової тканини, мінеральну щільність кісткової тканини, вміст мінералу в кістковій тканині, кісткову масу, якість кісткової тканини та міцність кісткової тканини. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, мають здатність анулювати інгібування склеростином мінералізації кісткової тканини in vitro. У спорідненому варіанті здійснення винаходу вони мають здатність анулювати інгібування склеростином опосередковуваного wnt-1 шляху передачі сигналів. В іншому спорідненому варіанті здійснення винаходу вони можуть порушувати здатність склеростину зв'язувати LRP6 і можуть блокувати інгібуючу дію, котру склеростин при його застосуванні у високих дозах чинить на фосфорилювання Smad1, що індуціюється BMP. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, зв'язуються з областю склеростину між амінокислотами 112 і 126 включно SEQ ID NO: 155 (тобто зазначена галузь складається з амінокислот 112-126 SEQ ID NO: 155) і/або областю між амінокислотами 160-174 включно SEQ ID NO: 155 (тобто зазначена галузь складається з амінокислот 160-174 SEQ ID NO: 155) і ще конкретніше зв'язуються з областю, яка містить як ARLLPNAIGRGKWWR (SEQ ID NO: 156), так і RLVASCKCKRLTRFH (SEQ ID NO: 157). Склеростин інгібує опосередковувану wnt1 активацію STF (SuperTopFlash, репортеріндикатор канонічної передачі сигналів wnt) в HEK293-клітинах. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, відновлюють репортер-індикатор передачі сигналу wnt з високим ступенем відтворюваності. Встановлено, що виявлена за допомогою аналізу репортера інгібуюча активність антитіл, запропонованих у винаході, відносно впливу склеростину на передачу сигналів Wnt у неостеобластних клітинах проявляється в індукції відповідей у вигляді формування кістки в результаті інгібування склеростину in vivo. Так, експерименти in vivo, проведені на дорослих гризунах, продемонстрували, що антитіла, запропоновані у винаході, значно підсилюють кістковий анаболізм. Підвищення кісткової маси за ефективністю відповідало рівню, що досягається при лікуванні, що включає введення з інтервалом в один день дуже високих доз гормону паращитоподібної залози (який застосовували як позитивний контроль). Таким чином, наступним кращим варіантом здійснення винаходу є антитіла, запропоновані у винаході, афінність яких до склеростину характеризується значеннями, що перебувають у нижньому пікомолярному діапазоні, і які інгібують вплив склеростину на передачу сигналів wnt, що характеризується значеннями IC50 близько 10нМ. Ще краще наступним кращим варіантом здійснення винаходу є антитіла, запропоновані у винаході, які зв'язуються з областю склеростину між амінокислотами 112 і 126 включно SEQ ID NO: 155 (тобто зазначена галузь складається з амінокислот 112-126 SEQ ID NO: 155) і/або областю між амінокислотами 160-174 включно SEQ ID NO: 155 (тобто зазначена галузь складається з амінокислот 160-174 SEQ ID NO: 155) і ще конкретніше зв'язується з областю, котра перекриває щонайменше наступні поліпептиди: ARLLPNAIGRGKWWR (SEQ ID NO: 156), так і RLVASCKCKRLTRFH (SEQ ID NO: 157) відповідно, і афінність яких до склеростину характеризується значеннями, що перебувають у нижньому пікомолярному діапазоні, і які інгібують вплив склеростину на передачу сигналів wnt, що характеризується значеннями IC50 близько 10нМ. При оцінці на створеній на мишах моделі встановлено, що зазначені антитіла мають здатність підвищувати кісткову масу в осьовому та додатковому скелеті з ефективністю, що відповідає рівню, що досягається при лікуванні, що включає підшкірне введення з інтервалом в один день дуже високої анаболічної дози гормону паращитоподібної залози (позитивний контроль), і тому їх можна застосовувати для лікування захворювань, пов'язаних з аномаліями кісткової тканини, такими як остеопороз. Іншими варіантуми здійснення винаходу є композиції, що містять антитіла, запропоновані у винаході, у сполученні з альтернативними терапевтичними засобами, призначеними для лікування остеопорозу, такими як бісфосфонати, гормон паращитоподібної залози, рилізингфактори гормону паращитоподібної залози (кальцилітики), що нейтралізують LRP4 антитіла і нейтралізують DKK-1 антитіла. Короткий опис креслень На кресленнях показано: на фіг. 1 - вплив MOR05813_Ig2лямбда при аналізі wnt-1; на фіг. 2 - вплив MOR05813_Ig2лямбда на мінералізацію, що індуціюється BMP-2, в MC3T 31b-клітинах; на фіг. 3 - вплив MOR05813_Ig2лямбда при оцінці взаємодії LRP 6-SOST за допомогою ELISA; на фіг. 4 - вплив MOR05813_Ig2лямбда при аналізі фосфорилювання Smad1; 2 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на фіг. 5-A – вплив "вимикання" LRP4 (siРНК) на інгібуючу активність SOST при аналізі wnt-1 з використанням Hek293-клітин (чорними номерами позначені: відносні рівні активності STF у відсутності SOST, жирними чорними номерами позначені: відносні рівні активності STF у присутності/відсутності SOST); Б- специфічність впливу понадекспресії LRP4 на значення IC50 для SOST і значення IC50 для Dkk1 при аналізі wnt-1 з використанням Hek293-клітин; Вспецифічність впливу понадекспресії LRP4 на інгібуючу активність SOST і Dkk1 при аналізі wnt-1 з використанням C28a2-клітин; Г- специфічність впливу "вимикання" LRP4 (siРНК) на інгібуючу активність SOST і Dkk1 при аналізі wnt-1 з використанням Hek293-клітин; Д-модуляція активності MOR05813 за допомогою LRP4; на фіг. 6 – результати дослідів на мишах, in vivo pQCT (периферична кількісна комп'ютерна томографія) – обробка протягом 2,5 тижнів MOR05813 підвищує загальний зміст мінералу в проксимальному метафізі великогомілкової кістки; на фіг. 7 – результати дослідів на мишах, in vivo pQCT – обробка протягом 2,5 тижнів MOR05813 підвищує загальну мінеральну щільність кісткової тканини в проксимальному метафізі великогомілкової кістки; на фіг. 8 – результати дослідів на мишах, in vivo pQCT– обробка протягом 2,5 тижнів MOR05813 підвищує товщину кортикального шару кістки в проксимальному метафізі великогомілкової кістки; на фіг. 9 – результати дослідів на мишах, in vivo pQCT– обробка протягом 2,5 тижнів MOR05813 підвищує об'єм губчатої речовини кістки в проксимальному метафізі великогомілкової кістки; на фіг. 10 – результати дослідів на мишах, in vivo pQCT– обробка протягом 2,5 тижнів MOR05813 підвищує товщину губчатої кістки в проксимальному метафізі великогомілкової кістки; на фіг. 11 – результати дослідів на мишах, in vivo pQCT – обробка протягом 5 тижнів MOR05813 додатково підвищує загальну мінеральну щільність кісткової тканини в проксимальному метафізі великогомілкової кістки; на фіг. 12 - результати дослідів на мишах, in vivo pQCT – обробка протягом 5 тижнів MOR05813 додатково підвищує мінеральну щільність кісткової тканини у великогомілковій кістці; на фіг. 13 - результати дослідів на мишах, ex vivo DEXA (двоенергетична рентгенівська абсорбціометрія) – обробка протягом 5 тижнів MOR05813 додатково підвищує мінеральну щільність кісткової тканини в стегновій кістці; на фіг. 14 - результати дослідів на мишах, ex vivo DEXA – обробка протягом 5 тижнів MOR05813 додатково підвищує мінеральну щільність кісткової тканини в хребті; на фіг. 15 - результати дослідів на мишах, ex vivo гістоморфометрія – обробка протягом 2,5 тижнів MOR05813 підвищує швидкість формування кістки в додатковому скелеті (дистальний метафіз стегнової кістки); на фіг. 16 - результати дослідів на мишах, ex vivo гістоморфометрія – обробка протягом 2,5 тижнів MOR05813 підвищує швидкість аппозиції (приєднання нових шарів) у додатковому скелеті (дистальний метафіз стегнової кістки); на фіг. 17 - результати дослідів на мишах, ex vivo гістоморфометрія – обробка протягом 2,5 тижнів MOR05813 підвищує мінералізацію поверхні в додатковому скелеті (дистальний метафіз стегнової кістки); на фіг. 18 - результати дослідів на мишах, ex vivo гістоморфометрія – обробка протягом 2,5 тижнів MOR05813 підвищує швидкість формування кістки в осьовому скелеті (поперековий хребець); на фіг. 19 - результати дослідів на мишах, ex vivo гістоморфометрія – обробка протягом 2,5 тижнів MOR05813 не впливає на резорцію кістки в додатковому скелеті (дистальний метафіз стегнової кістки) при оцінці на поверхні остеокластів; на фіг. 20 - результати, отримані за допомогою ELISA, що демонструють вплив MOR05813_Ig2лямбда на зв'язування SOST з LRP6. У кожному випадку застосовували 0,9нМ SOST; на фіг. 21 - результати дослідів на мишах, in vivo pQCT, отримані для варіанту, що включає спільну обробку MOR05813 і золедроновою кислотою: (A) загальна мінеральна щільність кісткової тканини, (Б) загальний вміст мінералу в кістковій тканині, (В) товщина кортикального шару кістки і (Г) мінеральна густина губчатої речовини кістки; на фіг. 22 - результати дослідів на мишах, in vivo pQCT, отримані для варіанту, що включає обробку MOR05813 і попередню обробку алендронатом (alen): (A) загальна мінеральна щільність кісткової тканини, (Б) загальний вміст мінералу в кістковій тканині, (В) товщина кортикального шару кістки і (Г) мінеральна густина губчатої речовини кістки; 3 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 на фіг. 23 - результати дослідів на мишах, in vivo pQCT, отримані для варіанту, що включає анаболічну спільну обробку MOR05813 і (I) антитілом до DKK1 або (II) PTH: (A) загальна мінеральна щільність кісткової тканини, (Б) загальний вміст мінералу в кістковій тканині, (В) товщина кортикального шару кістки і (Г) мінеральна густина губчатої речовини кістки; Докладний опис винаходу Даний винахід відноситься до виділених антитіл, насамперед людських антитіл, які специфічно зв'язуються зі склеростином та інгібують функціональні властивості склеростину. У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, виводять із конкретних послідовностей важких і легких ланцюгів, і/або вони несуть конкретні структурні характеристики, такі як CDR-ділянки, які мають конкретні амінокислотні послідовності. Винахід відноситься до виділених антитіл, способів одержання зазначених антитіл, імунокон'югатів і мультивалентних або мультиспецифічних молекул, які містять зазначені антитіла, і до фармацевтичних композицій, що містять антитіла, імунокон'югати або біспецифічні молекули, запропоновані у винаході. Винахід відноситься також до способів застосування антитіл для інгібування порушення або стану, асоційованого з наявністю експресії склеростину, наприклад, для лікування патологічного порушення, що опосередковується склеростином або яке асоційоване з підвищеним рівнем склеростину; наприклад, пов'язаного з кістковою тканиною захворювання, такого як остеопороз. З метою кращого розуміння даного винаходу спочатку наведені визначення деяких понять. Додаткові поняття будуть роз'яснені при докладному описі винаходу. Під поняття "що містить" підпадає поняття "що включає", а також "що складається", наприклад, композиція "що містить" X може складатися тільки з X або може включати щось додаткове, наприклад, включає X+Y. Поняття "приблизно" відносно чисельного значення x означає, наприклад, x+10 %. Слово "практично" не виключає "повністю", наприклад, композиція, що "практично вільна" від Y може бути повністю вільна від Y. За необхідності слово "практично" може бути упущене при визначенні поняття у винаході. Поняття "імунна відповідь" відноситься до дії, наприклад, лімфоцитів, антигенпрезентуючих клітин, фагоцитів, гранулоцитів і розчинних макромолекул, що продукуються зазначеними вище клітинами або печінкою (включаючи антитіла, цитокіни і комплемент), результатом якого є вибірне ушкодження, деструкція або елімінація з організму-хазяїна патогенов, клітин або тканин, що проникають, заражених патогенами, ракових клітин, або, як у випадку аутоімунітету або патологічного запалення, здорових людських клітин або тканин. Поняття склеростин відноситься до людського склеростину, послідовність якого представлена в SEQ ID NO:155. рекомбінантний людський склеростин можна одержувати від фірми R&D Systems (Міннеаполіс, шт. Міннесота, США; 2006 каталожний № 1406-ST-025). Крім того, рекомбінантний мишачий склеростин/SOST доступні на комерційній основі від фірми R&D Systems (Міннеаполіс, шт. Міннесота, США; 2006 каталожний № 1589-ST-025). В US 6395511 і 6803453 і публікаціях патентів США 20040009535 і 20050106683 описані антитіла до склеростину в цілому. Поняття "антитіло" у контексті даного опису включає повні антитіла і будь-який антигензв'язувальний фрагмент (тобто "антигензв'язувальну ділянку") або їх одноланцюгові варіанти. "Антитіло", що зустрічається в природних умовах, являє собою глікопротеїн, який містить щонайменше два важкі (H) ланцюги і два легкі (L) ланцюги, пов'язані між собою дисульфідними містками. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (скорочено позначений у контексті даного опису як VH) і константної області важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається із трьох доменів, тобто CH1, CH2 і CH3. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (скорочено позначений у контексті даного опису як VL) і константної області легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з одного домена, тобто CL. VH- і VL-області можна додатково підрозділяти на області гіперварібельності, які називають гіперваріабельними ділянками (CDR), які перемежовуються з більш консервативними ділянками, які називають каркасними ділянками (FR). Кожна VH і VL складається із трьох CDR і чотирьох FR, які у напрямку від амінокінця до карбоксильного кінця розташовані в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області важких і легких ланцюгів містять єднальний домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, у тому числі з різними клітинами імунної системи (наприклад, ефекторними клітинами) і першим компонентом (Clq) класичної системи комплементу. 4 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Поняття "антигензв'язувальну ділянка" антитіла (або просто "антигенний центр" ("область детермінанти") у контексті даного опису відноситься до одного або декількох фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, склеростином). Було встановлено, що антигензв'язувальну функцію антитіла можна здійснювати за допомогою фрагментів повнорозмірного антитіла. Прикладами фрагментів, що зв'язуються, які підпадають під поняття "антигензв'язувальна ділянка" антитіла, є Fab-фрагмент, одновалентний фрагмент, що складається з VL-, VH-, CL- і CH1-доменів; F(ab)2-фрагмент, двовалентний фрагмент, що складається з двох Fab-фрагментів, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній області; Fd-фрагмент, що складається з VH- і CH1-доменів; Fv-фрагмент, що складається з VL- и VH-доменів одного плеча антитіла; dAb-фрагмент (Ward та ін., Nature 341, 1989, сс. 544-546), що складається з VH-домена; і виділена гіперваріабельна ділянка (CDR). Крім того, незважаючи на те, що два домена Fv-фрагменти, тобто VL і VH, кодуються різними генами, їх можна з'єднувати за допомогою методів рекомбінації синтетичним лінкером, що дозволяє створювати з них один білковий ланцюг, у якому пара VL- и VH-областей формує одновалентні молекули (відомі за назвою одноланцюговий Fv-фрагмент (scFv); див., наприклад, Bird та ін., Science 242, 1988, сс. 423-426; і Huston та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1988, сс. 58795883). Такі одноланцюгові антитіла також підпадають під поняття "антигензв'язувальна ділянка" антитіла. Зазначені фрагменти антитіла одержують за допомогою загальноприйнятих методів, відомих фахівцям у даній галузі, і фрагменти піддають скринінгу відносно можливості їх застосування, аналогічного застосуванню інтактних антитіл. Поняття "виділене антитіло" у контексті даного опису відноситься до антитіла, що практично вільне від інших антитіл з іншою антигенною специфічністю (наприклад, виділене антитіло, що специфічно зв'язується зі склеростином, практично вільне від антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від склеростину). Однак виділене антитіло, що специфічно зв'язується зі склеростином, може давати перехресну реакцію з іншими антигенами, такими як молекули склеростину з інших видів. Крім того, виділене антитіло може бути практично вільне від іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин. Поняття "моноклональне антитіло" або "композиція моноклонального антитіла" у контексті даного опису відноситься до одержання молекул антитіл однакової молекулярної сполуки. Композиція моноклональних антитіл має однакову специфічність зв'язування і афінність у відношенні конкретного епітопу. Мається на увазі, що поняття "людське антитіло" у контексті даного опису відноситься до антитіл, що несуть варіабельні області, у яких як каркасні, так і CDR-ділянки виводять із послідовностей, що мають людське походження. Крім того, якщо антитіло містить константну область, то константну область також виводять із таких людських послідовностей, наприклад, послідовностей людської зародкової лінії або мутантних версій послідовностей людської зародкової лінії, або антитіла, що містить консенсусні каркасні послідовності, виведені на основі аналізу людських каркасних послідовностей, що описаний в Knappik та ін., J Mol Biol 296, 2000, сс. 57-86. Людські антитіла, запропоновані у винаході, можуть включати також амінокислотні залишки, які не кодуються людськими послідовностями (наприклад, у результаті мутацій, інтродуційованих шляхом випадкового або сайтнаправленого мутагенезу in vitro або соматичної мутації in vivo). Однак у контексті даного опису мається на увазі, що поняття "людське антитіло" не відноситься до антитіл, у яких послідовності CDR, виведені із зародкової лінії інших ссавців, таких як миша, трансплантовані в людські послідовності каркасних ділянок. Поняття "людське моноклональне антитіло" відноситься до антитіл, що мають однакову специфічність зв'язування, які мають варіабельні області, у яких як каркасні, так і CDR-ділянки виводять із людських послідовностей. В одному з варіантів здійснення винаходу людські моноклональние антитіла одержують за допомогою гібридоми, що включає B-клітину, отриману із трансгенної тварини крім людини, наприклад, трансгенної миші, у геномі якої міститься трансген людського важкого ланцюга і трансген людського легкого ланцюга, злитий з імморталізованною клітиною. Поняття "рекомбінантне людське антитіло" у контексті даного опису відноситься до всіх людських антитіл, які одержують, експресують, створюють або виділяють за допомогою методів рекомбінації, наприклад, до антитіл, виділених із тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною або трансхромосомною завдяки інтродукції генів людського імуноглобуліну, або які отримані з гібридом, до антитіл, виділених із клітини-хазяїна, трансформованої з метою експресії людського антитіла, наприклад, з використанням трансфектоми, до антитіл, виділених з рекомбінантної комбінатарної бібліотеки людських антитіл, і до антитіл, отриманих, 5 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресованих, створених або виділених будь-якими іншими шляхами, які включають сплайсинг усього гена людського імуноглобуліну або його частини за допомогою лігування з іншими послідовностями ДНК. Зазначені рекомбінантні людські антитіла несуть варіабельні області, у яких каркасні і CDR-ділянки виводять із послідовностей імуноглобуліну людської зародкової лінії. Однак у деяких варіантах здійснення винаходу зазначені рекомбінантні людські антитіла можна піддавати мутагенезу in vitro (або, коли для одержання людських послідовностей Ig використовують трансгенних тварин, соматичному мутагенезу in vivo), і в результаті амінокислотні послідовності VH- і VL-областей рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які хоча і виведені і є спорідненими послідовностям VH і VL людської зародкової лінії, можуть не зустрічатися в природних умовах у популяції антитіл людської зародкової лінії in vivo. У контексті даного опису поняття "ізотип" відноситься до класу антитіл (наприклад, IgM, IgE, IgG, такому як IgG1, IgG2 або IgG4), який кодується генами константної області важкого ланцюга. Фраза "антитіло, що розпізнає антиген" і "антитіло, специфічне відносно антигену" у контексті даного опису застосовують взаємозамінно з поняттям "антитіло, яке зв'язується специфічно з антигеном". У контексті даного опису мається на увазі, що антитіло, яке "специфічно зв'язується з поліпептидом склеростину", являє собою антитіло, зв'язування якого з поліпептидом склеростину характеризується значенням KD, що становить 1×10-8M або менше, 1×10-9M або менше або 1×10-10M або менше. Антитіло, яке "дає перехресну реакцію з антигеном, відмінним від склеростину", означає антитіло, зв'язування якого з антигеном характеризується значенням KD, що становить 0,5×10-8M або менше, 5×10-9M або менше або 2×10-9M або менше. Антитіло, яке "не дає перехресну реакцію з конкретним антигеном", являє собою антитіло, зв'язування якого із зазначеним антигеном характеризується значенням KD, що становить 1,5×10-8M або більше, або значенням KD, що складає від 5×10-8M до 10×10-8M або 1×10-7M або більше. У конкретних варіантах здійснення винаходу ті антитіла, які не дають перехресну реакцію з антигеном, характеризуються зв'язуванням із цими білками, що практично не виявляється, при оцінці за допомогою стандартних аналізів зв'язування. У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "антитіло, що блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу передачі сигналу wnt" відноситься до антитіла, яке відновлює передачу сигналів, що індуціюється wnt, у присутності склеростину при оцінці за допомогою клітинного (репортерного) аналізу SuperTopFlash (STF), що характеризується значеннями IC50 менше приблизно 1мМ, 100нМ, 20нМ, 10нМ або менше. Зазначений STF-аналіз описаний більш докладно нижче в прикладах. У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "антитіло, що блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу мінералізації" відноситься до антитіла, яке відновлює мінералізацію, що індуціюється BMP2, в присутності склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу, що характеризується значеннями IC50 менш приблизно 1мМ, 500нМ, 100нМ, 10нМ, 1нМ або менше. Зазначений аналіз описаний більш докладно нижче в прикладах. У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "антитіло, що блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою аналізу фосфорилювання Smad1" відноситься до антитіла, яке відновлює фосфорилювання Smad1, що індуціюється BMP6, у присутності склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу, що характеризується значеннями IC50 менше приблизно 1мМ, 500нМ, 100нМ, 10нМ, 1нМ або менше. Зазначений аналіз описаний більш докладно нижче в прикладах. У контексті даного опису мається наувазі, що поняття "антитіло, що інгібує зв'язування склеростину з LRP-6" відноситься до антитіла, яке інгібує зв'язування склеростину з LRP-6, що характеризується значеннями IC50 менше приблизно 1мМ, 500нМ, 100нМ, 10нМ, 5нМ, 3нМ, 1нМ або менше. Зазначений аналіз описаний більш докладно нижче в прикладах. У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "антитіло, яке підсилює формування кістки, підвищує її масу та щільність" відноситься до антитіла, яке має здатність підсилювати формування кістки, підвищувати її масу і щільність на рівні, характерному для обробки з інтервалом в один день із використанням високої анаболічної дози PTH, що описано в прикладі 10. Поняття "Kassoc" або "Ka" у контексті даного опису відноситься до швидкості асоціації взаємодії конкретного антитіла-антигену, а поняття "Kdis" або "Kd" у контексті даного опису відноситься до швидкості дисоціації взаємодії конкретного антитіла-антигену. У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "KD" відноситься до константи дисоціації, яку одержують зі 6 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 співвідношення Kd до Ka (тобто Kd/Ka) і виражають у молярній концентрації (M). Значення KD для антитіл можна визначати за допомогою методів, добре відомих у даній області. Метод визначення значення KD антитіла являє собою метод, заснований на резонансі поверхневого плазмону, або метод, заснований на застосуванні біосенсорної системи, такої як система Biacore®. У контексті даного опису поняття "афінність" відноситься до сили взаємодії між антитілом і антигеном в індивідуальних антигенних сайтах. У кожному антигенному сайті варіабельна галузь "плеча" антитіла взаємодіє за допомогою слабких нековалентних сил з антигеном у численних сайтах; причому чим більше взаємодій, тим сильніше афінність. У контексті даного опису поняття "авідність" відноситься до інформативного критерію загальної стабільності або силі комплексу антитіло-антиген. Вона контролюється трьома основними факторами: афінністю антитіла до епітопу; валентністю і антигену, і антитіла; і структурною організацією взаємодіючих ділянок. В остаточному підсумку, ці фактори визначають специфічність антитіла, тобто ймовірність того, що конкретне антитіло зв'язується з певним антигенним епітопом. Для одержання зонда, що має більшу авідність, можна конструювати димерний кон'югат, створюючи тим самим взаємодії, що мають низьку афінність, (як у випадку зародкової лінії антитіла), які легше виявляти за допомогою FACS. Крім того, інші методи підвищення авідности антигенного зв'язування передбачають створення димерів, тримерів або мультимерів кожної із представлених у даному описі конструкцій антитіл до склеростину. Зазначені мультимери можна створювати, здійснюючи ковалентне зв'язування між індивідуальними модулями, наприклад, шляхом імітації зв'язування C-кінця з N-кінцем, що зустрічається в природних умовах, або шляхом імітації димерів антитіл, які поєднуються одне з одним через їх константні області. Зв'язки, що створюються на границі розділу Fc/Fc, можуть бути ковалентними або нековалентними. Крім того, у гібридах склеростину можна використовувати партнери для димеризації або мультимеризації, відмінні від Fc, для створення структур ще вищого порядку. Наприклад, можна використовувати домени для мультимеризації, такий як домен для тримеризації, описаний в Borean (WO 2004/039841), або домен для пентамеризації, описаний в опублікованій заявці WO 98/18943. У контексті даного опису поняття "перехресна реактивність" відноситься до антитіла або популяції антитіл, які зв'язуються з епітопами на інших антигенах. Це може бути обумовлено або низькою авідністю або низькою специфічністю, або наявністю безлічі різних антигенів, які мають однакові або дуже подібні епітопи. Іноді перехресна реактивність є бажаною, коли існує потреба у загальному зв'язуванні зі спорідненою групою антигенів або при спробі здійснення мічення видів, що схрещуються (крос-видів), коли послідовність антигенного епітопу в процесі еволюції не набуває високу консервативність. У контексті даного опису поняття "висока афінність" або "висока специфічність" відносно антитіла ізотипу IgG відноситься до антитіла, для якого значення KD відносно антигену-мішені становить 10-8M або менше, 10-9M або менше, або 10-10M або менше. Однак "висока афінність" зв'язування може бути іншою для інших ізотипов антитіл. Наприклад, "висока афінність" зв'язування відносно ізотипу IgM відноситься до антитіла, для якого значення KD становить 10-7M або менше або 10-8M або менше. У контексті даного опису поняття "індивідуум" відноситься до будь-якої людини або тварини крім людини. Поняття "тварина крім людини" включає всіх хребетних тварин, наприклад, ссавців і тварин, що не відносяться до ссавців, у тому числі відноситься до приматів крім людини, вівцям, собакам, кішкам, коням, коровам, курям, амфібіям, рептиліям і т.д. У контексті даного опису поняття "оптимізована" означає, що нуклеотидна послідовність змінена з позиції кодування амінокислотної послідовності за допомогою кодонів, кращих для продуктивних клітин або організмів, як правило, еукаріотичної клітини, наприклад, клітини Pichia або Trichoderma, клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO) або людської клітини. Оптимізовану нуклеотидну послідовність створюють так, щоб вона повністю або максимально можливо зберігала здатність кодувати амінокислотну послідовність і кількість залишків, які кодуються спочатку вихідною нуклеотидною послідовністю, котру називають також "батьківською" послідовністю. У контексті даного опису оптимізовані послідовності створюють так, щоб вони мали кодони, кращі для клітин ссавців, однак передбачається також оптимізована експресія цих послідовностей в інших еукаріотичних клітинах. Амінокислотні послідовності, що кодуються оптимізованими нуклеотидними послідовностями, позначають також як оптимізовані. Різні об'єкти винаходу описані більш докладно в наведених нижче підрозділах. Стандартні аналізи, призначені для оцінки здатності до зв'язування антитіл зі склеростином різних видів, відомі в даній області і включають, наприклад, ELISA, Вестерн-блоттінг і РІА. 7 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прийнятні аналізи описані докладно в прикладах. Кінетичні характеристики зв'язування (наприклад, афінність до зв'язування) антитіл також можна визначати за допомогою стандартних аналізів, відомих у даній області, таких як BIAcore-аналіз. Аналізи, призначені для оцінки впливів антитіл на функціональні властивості склеростину (наприклад, зв'язування з рецептором, попередження або полегшення остеолізу), описані більш докладно в прикладах. Таким чином, варто розуміти, що антитіло, "яке інгібує" одну або декілька з видів функціональної активності склеростину (наприклад, біохімічну, імунохімічну, клітинну, фізіологічну або інші види біологічної активності або т.п.), що визначають на основі методик, відомих у даній області і представлених у даному описі, статистично значимо знижує конкретний вид активності у порівнянні з варіантом без антитіла (або, наприклад, коли присутнє контрольне антитіло з невідповідною специфічністю). Антитіло, яке інгібує активність склеростину, викликає статистично значиме зниження оцінюваного параметра щонайменше на 10 %, щонайменше на 50 %, 80 % або 90 %, і в конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло, запропоноване у винаході, може інгібувати більш ніж на 95 %, 98 % або 99 % функціональну активність склеростину. Поняття "перехресно блокує", "перехресно блокований" і "перехресна блокада" у контексті даного опису використовують взаємозамінно, і вони відносяться до здатності антитіла або іншого єднального агенту впливати на зв'язування інших антитіл або єднальних агентів зі склеростином при оцінці за допомогою стандартного аналізу конкурентного зв'язування. Здатність або ступінь, з якою антитіло або інший єднальний агент може впливати на зв'язування іншого антитіла або єднальної молекули зі склеростином і, відповідно, чи можна це віднести до перехресного блокування відповідно до винаходу, можна визначати за допомогою стандартних аналізів конкурентного зв'язування. Одним із прийнятних аналізів є застосування технології Biacore (наприклад, з використанням пристрою типу BIAcore 3000 (фірма Biacore, Уппсала, Швеція)), за допомогою якого можна оцінювати ступінь взаємодій на основі методу резонансу поверхневого плазмону. Іншим аналізом, що застосовують для оцінки перехресного зв'язування, є підхід, заснований на застосуванні ELISA. Обидва методи більш докладно описані в прикладах. Відповідно до винаходу перехресно блокуюче антитіло або інший єднальний агент, запропонований у винаході, зв'язується зі склеростином при аналізі перехресної блокади за допомогою BIAcore таким чином, що виявлене зв'язування комбінації (суміші) антитіл або єднальних агентів становить від 80 до 0,1 % (наприклад, від 80 до 4 від максимального теоретичного зв'язування, зокрема від 75 до 0,1 % (наприклад, від 75 до 4 %) від максимального теоретичного зв'язування, і ще конкретніше від 70 до 0,1 % (наприклад, від 70 до 4 %), і ще краще від 65 до 0,1 % (наприклад, від 65 до 4 %) від максимального теоретичного зв'язування (як зазначено вище) двох антитіл або єднальних агентів, що входять у комбінацію. Антитіло розглядається як перехресно блокуюче при аналізі за допомогою ELISA, що описаний у прикладах, якщо присутнє в розчинній фазі антитіло до склеростину має здатність викликати зниження на рівні від 60 до 100 %, зокрема від 70 до 100 %, і ще конкретніше від 80 до 100 % сигнал виявлення склеростину (тобто кількість склеростину, зв'язаного сенсибілізованим антитілом) у порівнянні із сигналом виявлення склеростину, виявленим у відсутності присутнього в розчинній фазі антитіла до склеростину (тобто в лунках, що застосовуються як позитивний контроль). Моноклональні антитіла Антитіла, запропоновані у винаході, являють собою людські моноклональні антитіла, наприклад, виділені згідно з описаними у прикладах методами. Амінокислотні послідовності VH виділених антитіл, запропонованих у винаході, представлені в SEQ ID NO: 69-77. Амінокислотні послідовності VL виділених антитіл, запропонованих у винаході, представлені в SEQ ID NO: 8088 відповідно. Відповідні кращі повнорозмірні амінокислотні послідовності важких ланцюгів антитіл, запропонованих у винаході, представлені в SEQ ID NO: 113-121. Відповідні кращі повнорозмірні амінокислотні послідовності легких ланцюгів антитіл, запропонованих у винаході, представлені в SEQ ID NO: 124-132 відповідно. Інші антитіла, запропоновані у винаході, включають мутантні амінокислоти, при цьому їх послідовності ще ідентичні щонайменше на 60, 70, 80, 90 або 95 % в CDR-ділянках, де послідовності CDR-ділянок представлені вище. У деяких варіантах здійснення винаходу винахід відноситься до мутантних амінокислотних послідовностей, у яких не більше 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот в CDR-ділянках змінені в результаті мутацій у порівнянні з CDR-ділянками, послідовності яких описані вище. Крім того, батьківські нуклеотидні послідовності варіабельних областей важких ланцюгів представлені в SEQ ID NO: 89-90. Батьківські нуклеотидні послідовності варіабельних областей важких ланцюгів представлені в SEQ ID NO: 100-101. Повнорозмірні нуклеотидні послідовності 8 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 легких ланцюгів, оптимізовані для експресії в клітинах ссавців, представлені в SEQ ID NO: 146154. Повнорозмірні нуклеотидні послідовності важких ланцюгів, оптимізовані для експресії в клітинах ссавців, представлені в SEQ ID NO: 135-143. Повнорозмірні амінокислотні послідовності легких ланцюгів, що кодуються оптимізованими нуклеотидними послідовностями легких ланцюгів, представлені в SEQ ID NO: 124-132. Повнорозмірні амінокислотні послідовності важких ланцюгів, що кодуються оптимізованими нуклеотидними послідовностями важких ланцюгів, представлені в SEQ ID NO: 113-121. Інші антитіла, запропоновані у винаході, включають мутантні амінокислоти або нуклеїнові кислоти, послідовності яких ще ідентичні щонайменше на 60, 70, 80, 90 або 95 % або більше описаним вище послідовностям. У деяких варіантах здійснення винаходу винахід відноситься до мутантних амінокислотних послідовностей, у яких не більше 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот у варіабельних областях змінені в результаті мутацій у порівнянні з варіабельними областями, послідовності яких описані вище, зберігаючи при цьому практично таку ж терапевтичну активність. Оскільки кожне з цих антитіл може зв'язуватися зі склеростином, то послідовності VH, VL, повнорозмірного легкого ланцюга і повнорозмірного важкого ланцюга (нуклеотидні послідовності і амінокислотні послідовності) можуть бути "змішані і сполучені (відповідним чином підібрані одна до одної)» для створення інших єднальних молекул антитіл до склеростину, запропонованих у винаході. Зв'язування склеростину із зазначеними "змішаними і сполученими" антитілами можна оцінювати за допомогою аналізів зв'язування, які описані вище і у прикладах (наприклад, ELISA). Коли зазначені ланцюги змішують і сполучають, то VHпослідовність із конкретної пари VH/VL можна заміняти структурно подібною VH-послідовністю. Аналогічно цьому послідовність повнорозмірного важкого ланцюга з конкретної пари повнорозмірний легкий ланцюг/повнорозмірний важкий ланцюг можна заміняти структурно подібною послідовністю повнорозмірного важкого ланцюга. Аналогічно цьому VL-послідовність із конкретної пари VH/VL можна заміняти структурно схожою VL-послідовністю. Аналогічно цьому послідовність повнорозмірного легкого ланцюга з конкретної пари повнорозмірний важкий ланцюг/повнорозмірний легкий ланцюг можна заміняти структурно подібною послідовністю повнорозмірного легкого ланцюга. Таким чином, одним з об'єктів винаходу є виділене моноклональне антитіло або його антигензв'язувальна ділянка, яке/яка містить: варіабельну область важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 69-77; і варіабельну область легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 80-88; де антитіло специфічно зв'язується зі склеростином. Іншим об'єктом винаходу є: (I) виділене моноклональне антитіло, що містить: повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність, оптимізовану для експресії в клітині ссавця, яку вибирають із групи, що включає SEQ ID NO: 113-121; і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність, оптимізовану для експресії в клітині ссавця, яку вибирають із групи, що включає SEQ ID NO: 124-132; або (II) функціональний білок, який містить його антигензв'язувальну ділянку. Іншим об'єктом винаходу є: (I) виділене моноклональне антитіло, що містить: повнорозмірний важкий ланцюг, який включає нуклеотидну послідовність, оптимізовану для експресії в клітині ссавця, яку вибирають із групи, що включає SEQ ID NO: 135-143; і повнорозмірний легкий ланцюг, який включає нуклеотидну послідовність, оптимізовану для експресії в клітині ссавця, яку вибирають із групи, що включає SEQ ID NO: 146-154; або (II) функціональний білок, який містить його антигензв'язувальну ділянку. Ще одним об'єктом винаходу є антитіла, які містять CDR1, CDR2 і CDR3 важких ланцюгів і легких ланцюгів, або їх комбінації. Амінокислотні послідовності CDR1 VH антитіл представлені в SEQ ID NO: 1-11. Амінокислотні послідовності CDR2 VH антитіл представлені в SEQ ID NO: 1222. Амінокислотні послідовності CDR3 VH антитіл представлені в SEQ ID NO: 23-33. Амінокислотні послідовності CDR1 VL антитіл представлені в SEQ ID NO: 34-44. Амінокислотні послідовності CDR2 VL антитіл представлені в SEQ ID NO: 45-55. Амінокислотні послідовності CDR3 VL антитіл представлені в SEQ ID NO: 56-66. CDR-ділянки описують за системою Кебота (Kabat E. A. та ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-те вид., вид-в U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991). З урахуванням того, що кожне із зазначених антитіл може зв'язуватися зі склеростином і що специфічність до зв'язування з антигеном забезпечується насамперед CDR1-, 2- і 3-ділянками, послідовності CDR1, 2 і 3 VH і послідовності CDR1, 2 і 3 VL можна "змішувати і сполучати" (тобто можна змішувати і сполучати CDR з різних антитіл, хоча кожне антитіло повинно містити 9 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR1, 2 і 3 VH і CDR1, 2 і 3 VL для створення інших спрямованих проти склеростину єднальних молекул, запропонованих у винаході. Зв'язування склеростину з такими "змішаними і сполученими антитілами" можна тестувати із використанням аналізів зв'язування, які описані вище і у прикладах (наприклад, ELISA). Коли змішують і сполучають CDR-послідовності VH, те послідовності CDR1, CDR2 і/або CDR3 з конкретної послідовності VH варто заміщати структурно подібної(ними) CDR-послідовністю(ями). Аналогічно цьому, коли CDR-послідовності VL змішують і сполучають, то послідовності CDR1, CDR2 і/або CDR3 з конкретної послідовності VL варто заміщати структурно подібною(ними) CDR-послідовністю(ями). Як повинно бути очевидно зазвичайму фахівцеві в даній області, нові послідовності VH і VL можна створювати шляхом заміни однієї або декількох послідовностей CDR-ділянки VH і/або VL структурно подібними послідовностями з CDR-послідовностей, описаних для моноклональних антитіл, запропонованих у даному винаході. Виділене моноклональне антитіло або його антигензв'язувальна ділянка містять: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 1-11; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 12-22; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 23-33; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 34-44; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 45-55; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 56-66; де антитіло специфічно зв'язується зі склеростином. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 3; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 14; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 25; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 36; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 47; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 58. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 4; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 15; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 26; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 37; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 48; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 59. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 5; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 16; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 27; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 38; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 49; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 60. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 6; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 17; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 28; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 39; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 50; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 61. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 7; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 18; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 29; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 40; 10 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 51; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 62. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 8; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 19; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 30; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 41; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 52; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 63. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 9; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 20; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 31; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 42; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 53; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 64. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 10; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 21; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 32; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 43; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 54; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 65. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 11; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 22; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 33; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 44; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 55; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 66. У контексті даного опису людське антитіло містить варіабельні області важкого або легкого ланцюга або повнорозмірні важкі або легкі ланцюги, які є "продуктом" або "виведені з" конкретної послідовності зародкової лінії, якщо варіабельні області або повнорозмірні ланцюги одержують із системи, у якій як джерело послідовностей використовують гени імуноглобуліну людської зародкової лінії. Для створення однієї з таких систем здійснюють імунізацію трансгенної миші, що несе людські гени імуноглобулінів, що представляють інтерес антигеном або здійснюють скринінг фагової дисплейної бібліотеки людських генів імуноглубулінів антигеном, що представляє інтерес. Людське антитіло, що "є продуктом" або "виведено з" послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, можна ідентифікувати індивідуально шляхом порівняння амінокислотної послідовності людського антитіла і амінокислотних послідовностей імуноглобулінів людської зародкової лінії та відбору послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, яка є найбільш близькою за послідовністю (тобто має найвищий % ідентичності) з послідовністю людського антитіла. Людське антитіло, що "є продуктом" або "виведено з" конкретної послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, може мати розходження в амінокислотах у порівнянні з послідовністю зародкової лінії, наприклад, у результаті соматичних мутацій, що зустрічаються в природних умовах, або штучних сайтнаправлених мутацій. Однак амінокислотна послідовність відібраного людського антитіла, як правило, щонайменше на 90 % ідентична амінокислотній послідовності, що кодується геном імуноглобуліну людської зародкової лінії, і містить амінокислотні залишки, які свідчать про те, що людське антитіло є людським, при порівнянні з амінокислотними послідовностями імуноглобулінів зародкових ліній інших видів (наприклад, послідовності мишачої зародкової лінії). У певних випадках амінокислотна послідовність людського антитіла може бути щонайменше на 60, 70, 80, 90 або щонайменше на 95 % або навіть щонайменше на 96, 97, 98 або 99 % ідентична амінокислотній послідовності, що кодується геном імуноглобуліну зародкової лінії. Як правило, послідовності людського антитіла, виведені з конкретної 11 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності людської зародкової лінії, повинні мати не більше 10 амінокислотних розходжень у порівнянні з амінокислотною послідовністю, що кодується геном імуноглобуліну людської зародкової лінії. У певних випадках людське антитіло може відрізнятися не більше ніж на 5 або навіть не більше ніж на 4, 3, 2 або 1 амінокислоту від амінокислотної послідовності, що кодується геном імуноглобуліну зародкової лінії. У деяких варіантах здійснення винаходу амінокислотні послідовності імуноглубуліну людської зародкової лінії вибирають із групи, що включає послідовності варіабельних областей важких ланцюгів, які представлені в SEQ ID NO: 67-68 відповідно, послідовності варіабельних областей легких ланцюгів, які представлені в SEQ ID NO: 78-79 відповідно. Гомологічні антитіла Згідно з ще одним варіантом здійснення винаходу антитіло, запропоноване у винаході, має амінокислотні послідовності повнорозмірного важкого і легкого ланцюга, нуклеотидні послідовності повнорозмірного важкого і легкого ланцюга або варіабельні області важкого і легкого ланцюга, амінокислотні послідовності яких гомологічні амінокислотним і нуклеотидним послідовностям представлених у даному описі антитіл, і при цьому антитіла зберігають необхідні функціональні властивості антитіл до склеростину, запропонованих у винаході. Наприклад, у винаході запропоноване виділене моноклональне антитіло (або його функціональний білок, який містить його антигензв'язувальну ділянку), яке містить варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, при цьому: варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % ідентична амінокислотній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 67-77; варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % ідентична амінокислотній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 78-88; антитіло специфічно зв'язується зі склеростином, і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу передачі сигналу wnt, антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу мінералізації або блокує інгібуючу дія склеростину при оцінці фосфорилювання Smad1, або антитіло інгібує зв'язування склеростину з LRP-6, або антитіло підсилює формування кістки, підвищує її масу і щільність. Іншим варіантом здійснення винаходу є виділене моноклональне антитіло (або його функціональний білок, який містить його антигензв'язувальну ділянку), що містить повнорозмірний важкий ланцюг і повнорозмірний легкий ланцюг, при цьому: повнорозмірний важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % ідентична амінокислотній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 111-121; повнорозмірний легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % ідентична амінокислотній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO 122-132; антитіло специфічно зв'язується зі склеростином, і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу передачі сигналу wnt, антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу мінералізації або блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці фосфорилювання Smad1, або антитіло інгібує зв'язування склеростину з LRP-6, або антитіло підсилює формування кістки, підвищує її масу та щільність. Іншим варіантом здійснення винаходу є виділене моноклональне антитіло (або його функціональний білок, який містить його антигензв'язувальну ділянку), яке містить повнорозмірний важкий ланцюг і повнорозмірний легкий ланцюг, при цьому: повнорозмірний важкий ланцюг кодується нуклеотидною послідовністю, яка щонайменше на 80 % ідентична нуклеотидній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 133-143; повнорозмірний легкий ланцюг кодується нуклеотидною послідовністю, яка щонайменше на 80 % ідентична нуклеотидній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO 144-154; антитіло специфічно зв'язується зі склеростином, і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональний властивостей: антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу передачі сигналу wnt, антитіло блокує інгібуючу дія склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу мінералізації або блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці фосфорилювання Smad1, або антитіло інгібує зв'язування склеростину з LRP-6, або антитіло підсилює формування кістки, підвищує її масу й щільність. У різних варіантах здійснення винаходу антитіло може мати одну або декілька, дві або більше або три з описаних вище функціональних властивостей. Антитіло може являти собою, наприклад, людське антитіло, гуманізоване антитіло або химерне антитіло. В інших варіантах здійснення винаходу амінокислотні послідовності VH і/або VL можуть бути ідентичні на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 % зазначеним вище послідовностям. В інших 12 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантах здійснення винаходу амінокислотні послідовності VH і/або VL можуть бути ідентичні за винятком амінокислотної заміни не більш ніж в 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних положеннях. Антитіло, що має VH- і VL-області, що мають високу (тобто 80 % або більше) ступінь ідентичності з VH- і VL-областями, послідовності яких представлені в SEQ ID NO: 67-77 і SEQ ID NO: 78-88 відповідно, можна одержувати за допомогою мутагенезу (наприклад, сайтнаправленого або ПЦР-опосередковуваного мутагенезу) молекул нуклеїнових кислот, які кодують SEQ ID NO: 89-99 і 100-110 відповідно, з наступною оцінкою зміненого антитіла, що кодується, у відношенні збереження у нього функціональної активності (тобто зазначених вище функцій) з використанням функціональних аналізів, представлених у даному описі. В інших варіантах здійснення винаходу амінокислотні послідовності повнорозмірного важкого ланцюга і/або повнорозмірного легкого ланцюга можуть бути на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 % ідентичні представленими вище послідовностям. Антитіло, що має повнорозмірний важкий ланцюг і повнорозмірний легкий ланцюг, послідовності яких мають високий (тобто 80 % або більше) ступінь ідентичності з послідовностями повнорозмірних важких ланцюгів, які представлені в кожній з SEQ ID NO: 111-121, і з послідовностями повнорозмірних легких ланцюгів, які представлені в кожній з SEQ ID NO: 122-132 відповідно, можна одержувати за допомогою мутагенезу (наприклад, сайтнаправленого або ПЦР-опосередковуваного мутагенезу) молекул нуклеїнових кислот, які кодують SEQ ID NO: 133-134 і 144-154 відповідно, з наступною оцінкою зміненого антитіла, що кодується, відносно збереження у нього функціональної активності (тобто зазначених вище функцій) з використанням функціональних аналізів, представлених у даному описі. В інших варіантах здійснення винаходу нуклеотидні послідовності повнорозмірного важкого ланцюга і/або повнорозмірного легкого ланцюга можуть бути ідентичні на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 % послідовностям, представленим у даному описі. В інших варіантах здійснення винаходу нуклеотидні послідовності варіабельних областей важкого ланцюга і/або повнорозмірного легкого ланцюга можуть бути ідентичні на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 % послідовностям, представленим у даному описі. Згідно із даним описом відсоток ідентичності двох послідовностей є функцією кількості ідентичних положень у послідовностях (тобто % ідентичності = кількість ідентичних положень/загальна кількість положень ×100), беручи до уваги кількість проломів і довжину кожного пролому, яку необхідно інтродуціювати для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Порівняння послідовностей і визначення відсотка ідентичності двох послідовностей можна здійснювати за допомогою математичного алгоритму, що описаний нижче в прикладах, які не обмежують об'єм винаходу. Відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна визначати за допомогою алгоритму E. Meyers і W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4, 988, сс. 11-17), що включений у програму ALIGN (версія 2.0), з використанням таблиці зважених залишків PAM120, штрафу за довжину пролому 12 і штрафу за пролом 4. Крім того, відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна визначати за допомогою алгоритму Needleman і Wunsch (J. Mol, Biol. 48, 1970, сс. 444-453), який включений у програму GAP, що входить у пакет програм GCG (яка доступна на сайті http://www.gcg.com), з використанням матриці Blossom 62 або матриці PAM250 і ваги пролому 16, 14, 12, 10, 8, 6 або 4 і ваги довжини 1, 2, 3, 4, 5 або 6. В іншому або додатковому варіанті білкові послідовності, запропоновані в даному винаході, можна застосовувати також як "запитувану послідовність" при здійсненні пошуку в доступних науковій громадськістки базах даних, наприклад, відносно ідентичності зі спорідненими послідовностями. Такий пошук можна здійснювати з використанням програми XBLAST (версія 2.0), розробленої Altschul та ін., J.Mol. Biol. 215, 1990, сс. 403-410. BLAST-пошук білків можна здійснювати за допомогою програми XBLAST, у якій бал = 50, довжина слова = 3, для встановлення рівня гомології амінокислотних послідовностей з амінокислотними послідовностями молекул антитіл, запропонованих у винаході. Для створення лінеаризованих послідовностей, що містять проломи, для цілей порівняння можна використовувати програму Gapped BLAST, описану в Altschul та ін., Nucleic Acids Res. 25(17), 1997, сс. 3389-3402. При застосуванні програм BLAST і Gapped BLAST можна використовувати прийняті за замовчуванням параметри, які застосовуються у відповідних програмах (наприклад, XBLAST і NBLAST) (див. http:Ilwww.ncbi.nhn.nih.gov). Антитіла з консервативними модифікаціями У конкретних варіантах здійснення антитіло, запропоноване у винаході, має варіабельну область важкого ланцюга, яка містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, де одна або декількох зазначених послідовностей CDR являє собою специфічні амінокислотні послідовності, 13 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 характерні для антитіл, запропонованих у даному винаході, або їх консервативні модифікації, і де антитіла зберігають необхідні функціональні властивості антитіл до склеростину, запропонованих у винаході. Таким чином, у винаході зазапропоновані виділене моноклональне антитіло або функціональний білок, яке/який містить антигензв'язувальну ділянку, що складається з варіабельної області важкого ланцюга, який містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельної області легкого, котрий містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, де: амінокислотні послідовності CDR1 варіабельної області важкого ланцюга обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 1-11 і їх консервативні модифікації; амінокислотні послідовності CDR2 варіабельної області важкого ланцюга обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 12-22 та їх консервативні модифікації; амінокислотні послідовності CDR3 варіабельної області важкого ланцюга обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 23-33 та їх консервативні модифікації; амінокислотні послідовності CDR1 варіабельної області легкого ланцюга обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 34-44 та їх консервативні модифікації; амінокислотні послідовності CDR2 варіабельної області легкого ланцюга обрані з групи, що включає SEQ ID NO: 45-55 та їх консервативні модифікації; амінокислотні послідовності CDR3 варіабельної області легкого ланцюга обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 56-66 та їх консервативні модифікації; і антитіло специфічно зв'язується зі склеростином, і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу передачі сигналу wnt, антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу мінералізації або блокує інгібуючу дія склеростину при оцінці фосфорилювання Smad1, або антитіло інгібує зв'язування склеростину з LRP-6, або антитіло підсилює формування кістки, підвищує її масу та щільність. У різних варіантах здійснення винаходу антитіло може мати одну або декілька, дві або більше або три або більше з описаних вище функціональних властивостей. Антитіла можуть являти собою, наприклад, людські антитіла, гуманізовані антитіла або химерні антитіла. В інших варіантах здійснення винаходу антитіло, запропоноване у винаході, оптимізоване для експресії в клітині, має послідовність повнорозмірного важкого ланцюга і послідовність повнорозмірного легкого ланцюга, де одна або декілька із зазначених послідовностей мають специфічні амінокислотні послідовності, характерні для представлених у даному описі антитіл, або їх консервативні модифікації, і де антитіла зберігають необхідні функціональні властивості антитіл до склеростину, запропонованих у винаході. Таким чином, у винаході запропоноване виділене моноклональне антитіло, оптимізоване для експресії в клітині ссавця, що складається з повнорозмірного важкого ланцюга і повнорозмірного легкого ланцюга, де: амінокислотна послідовність повнорозмірного важкого ланцюга обрана із групи, що включає SEQ ID NO: 111121, та їх консервативні модифікації; і амінокислотна послідовність повнорозмірного легкого ланцюга обрана із групи, що включає SEQ ID NO: 122-132, та їх консервативні модифікації; антитіло специфічно зв'язується зі склеростином, і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу передачі сигналу wnt, антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу мінералізації або блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці фосфорилювання Smad1, або антитіло інгібує зв'язування склеростину з LRP-6, або антитіло підсилює формування кістки, підвищує її масу та щільність. У різних варіантах здійснення винаходу антитіло може мати одну або декілька, дві або більше або три або більше з описаних вище функціональних властивостей. Антитіла можуть являти собою, наприклад, людські антитіла, гуманізовані антитіла або химерні антитіла. У контексті даного опису поняття "консервативні модифікації послідовностей" відноситься до амінокислотних модифікацій, які не чинять істотного впливу або не істотно змінюють характеристики зв'язування антитіла, яке містить зазначену амінокислотну послідовність. Зазначені консервативні модифікації включають амінокислотні заміни, додавання або делеції. Модифікації можна інтродуціювати в антитіло, запропоноване у винаході, за допомогою стандартних методів, відомих у даній галузі, таких як сайтнаправлений мутагенез і ПЦРопосередковуваний мутагенез. Консервативні амінокислотні заміни являють собою заміни, за яких амінокислотний залишок заміщають амінокислотним залишком, який має подібний бічний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків з подібними бічними ланцюгами відомі в даній області. Ці сімейства включають амінокислотні залишки з оснόвними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), бета 14 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, один або кілька амінокислотних залишків в CDR-ділянках антитіла, запропонованого у винаході, можна заміняти на інші амінокислотні залишки з того самого сімейства бічних ланцюгів, і змінене антитіло можна оцінювати відносно збереження їм функції за допомогою представлених у даному описі функціональних аналізів. Антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, що й антитіла до склеростину, запропоновані у винаході Іншим варіантом здійснення винаходу є антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, що й різні специфічні антитіла до склеростину, запропоновані у винаході і представлені в даному описі. При створенні винаходу зненацька було встановлено, що всі антитіла, описані в прикладах, які мають здатність: (I) блокувати інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу передачі сигналу wnt; (II) блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу мінералізації; (III) інгібує зв'язування склеростину з LRP-6; і, (IV) підсилює формування кістки, підвищує її масу та щільність, зв'язуються з тим самим епітопом у склеростині з високою афінністю, де епітоп являє собою конформаційний епітоп, який включає амінокислоти, представлені як в SEQ ID NO: 156, так і в SEQ ID NO: 157. Поза залежністю від якої-небудь конкретної моделі можна припустити, що амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 156 і SEQ ID NO: 157 описують одну область конформаційного епітопу в поліпептиді склеростину, який розпізнається антитілами, запропонованими у винаході. Таким чином, додаткові антитіла можна ідентифікувати на основта їх здатності перехресно конкурувати (наприклад, конкурентно інгібувати зв'язування статистично значимим чином) з іншими антитілами, запропонованими у винаході, при оцінці за допомогою стандартних аналізів зв'язування склеростину. Здатність антитіла, що тестується, інгібувати зв'язування антитіл, запропонованих у даному винаході, з людським склеростином демонструє, що антитіло, що тестується, може конкурувати із цим антитілом за зв'язування з людським склеростином; не вдаючись у яку-небудь теорію, можна припустити, що таке антитіло зв'язується з таким же або спорідненим (наприклад, структурно подібним або перебуває в просторовій близькості) епітопом на людському склеростині, що й антитіло, з яким воно конкурує. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з тим же епітопом на людському склеростином, що й антитіла, запропоновані в даному винаході, являє собою людське моноклональне антитіло. Такі людські моноклональні антитіла можна одержувати й виділяти відповідно до методів, описаних у прикладах. Сконструйовані та модифіковані антитіла Антитіло, запропоноване у винаході, можна одержувати також з використанням антитіла, яке має одну або декілька зазначених у даному описі послідовностей VH і/або VL, як вихідний матеріал для створення модифікованого антитіла, де модифіковане антитіло може мати змінені властивості у порівнянні з вихідним антитілом. Антитіло можна створювати шляхом модифікації одного або декількох залишків в одній або обох варіабельних областях (тобто VH і/або VL), наприклад, в одному або декількох CDR-ділянках і/або в одній або декількох каркасних ділянках. У додатковому або альтернативному варіанті антитіло можна створювати шляхом модифікації залишків у константній(их) області(ях), наприклад, для зміни ефекторної(их) функції(ій) антитіла. Для здійснення одного з типів конструювання варіабельної області можна застосовувати трансплантацію CDR. Антитіла взаємодіють із антигенами-мішенями в основному за допомогою амінокислотних залишків, локалізованих у шести гіперваріабельних ділянках (CDR) важкого і легкого ланцюга. Із цієї причини між амінокислотними залишками в CDR індивідуальних антитіл є ще істотніші розходження, ніж між послідовностями, локалізованими поза CDR. Оскільки послідовності CDR відповідальні за більшу частину взаємодій антитіло-антиген, можна експресувати рекомбінантні антитіла, які імітують властивості конкретних антитіл, що зустрічаються в природних умовах, шляхом конструювання векторів експресії, які містять послідовності CDR з конкретного антитіла, що зустрічається в природних умовах, отримані шляхом трансплантації у послідовності каркасних ділянок з інших антитіл з іншими властивостями (див., наприклад Riechmann L. та ін., Nature 332, 1998, сс. 323-327; Jones P. та ін., Nature, 321, 1986, сс. 522-525; Queen C. та ін., Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 86, 1989, сс. 10029 15 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10033; US 5225539 на ім'я Winter і US 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Queen зі співавторами). Таким чином, наступним об'єктом винаходу є виділене моноклональне антитіло або функціональний білок, яке/який містить антигензв'язувальну ділянку, що містить послідовності CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 1-11; послідовності CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 12-22; послідовності CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 23-33 відповідно; і послідовності CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 34-44; послідовності CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 45-55; і послідовності CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, які містять амінокислотні послідовності, обрані з групи, що включає SEQ ID NO: 56-66 відповідно. Таким чином, зазначені антитіла містять послідовності CDR VH і VL моноклональних антитіл, крім того, вони можуть містити різні послідовності каркасних ділянок зазначених антитіл. Зазначені послідовності каркасних ділянок, які містять послідовності генів антитіл зародкової лінії, можна одержувати з публічних баз даних ДНК або опублікованих посилань. Наприклад, послідовності ДНК людської зародкової лінії генів варіабельних областей важких і легких ланцюгів можна знайти в базі даних послідовностей людської зародкової лінії "Vbase" (доступної в мережі Інтернет на сайті www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а також в Kabat E. A. та ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 15-те вид., вид-в U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991; Tomlinson I. M. та ін., J. fol. Biol. 227, 1992, сс. 776-798; і Cox J. P. L. та ін., Eur. J Immunol. 24, 1994, сс. 827-836; зміст кожної з яких спеціально включено в даний опис як посилання. Прикладами послідовностей каркасних ділянок, призначених для застосування в антитілах, запропонованих у винаході, є послідовності, структурно подібні до послідовностей каркасних ділянок, які входять у відібрані антитіла, запропоновані у винаході, наприклад, консенсусні послідовності і/або послідовності каркасних ділянок, які входять у моноклональні антитіла, запропоновані у винаході. Послідовності CDR1, 2 і 3 VH і послідовності CDR1, 2 і 3 VL можна трансплантувати у каркасні ділянки, які мають послідовність, ідентичну з послідовністю гена імуноглобуліну зародків лінії, з якого виведена послідовність каркасної ділянки, або послідовності CDR можна трансплантувати у каркасні ділянки, які містять одну або кілька мутацій у порівнянні з послідовностями зародкової лінії. Наприклад, було встановлено, що в певних випадках доцільно змінювати за допомогою мутації залишки в каркасних ділянках для підтримки або підвищення здатності антитіла зв'язуватися з антигеном (див., наприклад, US 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Queen зі співавторами). Іншим типом модифікації варіабельної області є мутація амінокислотних залишків в CDR1, CDR2 і/або CDR3 VH- і/або VL-областей, що підвищує тим самим одну або кілька здатностей до зв'язування (наприклад, афінність) антитіла, що викликає інтерес, що називають "дозріванням афінності". Для інтродукції мутації(й) і здійснення впливу на зв'язування антитіла або на іншу функціональну властивість, що представляє інтерес, можна застосовувати сайтнаправлений мутагенез або ПЦР-опосередковуваний мутагенез, що можна оцінювати за допомогою аналізів in vitro або in vivo, описаних нижче в прикладах. Можна інтродуціювати консервативні модифікації (зазначені вище). Мутації можуть являти собою амінокислотні заміни, додавання або делеції. Крім того, як правило, змінюють не більше 1, 2, 3, 4 або 5 залишків в CDR-ділянці. Таким чином, іншим варіантом здійснення винаходу є виділені моноклональні антитіла до склеростину або функціональний білок, які містять антигензв'язувальну ділянку, що складається з варіабельної області важкого ланцюга, яка має: CDR1 VH-області, що складається з амінокислотної послідовності, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 1-11, або амінокислотної послідовності, яка має 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних замін, делецій або додавань у порівнянні з SEQ ID NO:1-11; CDR2 VH-області, що складається з амінокислотної послідовності, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 12-22, або амінокислотної послідовності, яка має 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних замін, делецій або додавань у порівнянні з SEQ ID NO: 12-22; CDR3 VH-області, що складається з амінокислотної послідовності, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 23-33, або амінокислотної послідовності, яка має 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних замін, делецій або додавань у порівнянні з SEQ ID NO: 23-33; CDR1 VLобласті, що складається з амінокислотної послідовності, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 34-44, або амінокислотної послідовності, яка має 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних замін, 16 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 делецій або додавань у порівнянні з SEQ ID NO: 34-44; CDR2 VL-області, що складається з амінокислотної послідовності, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 45-55, або амінокислотної послідовності, яка має 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних замін, делецій або додавань у порівнянні з SEQ ID NO: 45-55; CDR3 VL-області, що складається з амінокислотної послідовності, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 56-66, або амінокислотної послідовності, яка має 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних замін, делецій або додавань у порівнянні з SEQ ID NO: 56-66. Трансплантація антигензв'язувальних доменів в альтернативні кістяки або каркаси Широка розмаїтість кістяків або каркасів антитіл/імуноглобулінів можна застосовувати, якщо поліпептид, що утворився, включає щонайменше одну єднальну ділянку, яка специфічно зв'язується зі склеростином. Такі кістяки або каркаси включають 5 основних ідіотипів людських імуноглобулінів або їх фрагментів (які представлені в даному описі), і включають імуноглобуліни інших видів тварин, які краще мають гуманізовані аспекти. Одноланцюгові антитіла, наприклад, ідентифіковані в представниках верблюжих, є найкращими в цьому плані. Фахівці в даній області продовжують відкривати і створювати нові кістяки, каркаси і фрагменти. Одним з об'єктів винаходу є створення антитіл на основі неімуноглобулінових кістяків з використанням неімуноглобулінових каркасів, у які можна трансплантувати CDR, запропоновані у винаході. Можна застосовувати відомі або відкриті в майбутньому неімуноглобулінові кістяки і каркаси, якщо вони містять єднальну ділянку, специфічну для білка-мішені, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 155. Зазначені сполуки позначені в даному описі як "поліпептиди, що містять специфічну для мішені єднальну ділянку". Приклади неімуноглобулінових кістяків додатково описані в розділах нижче (верблюжі антитіла і каркаси, відмінні від характерних для антитіл каркасів). Верблюжі антитіла Білки антитіл, отримані із представників сімейства двогорбих і одногорбих верблюдів (Camelus bactrianus і Calelus dromaderius), включаючи представників тварин Нового Світла, таких як різні види лам (Lama paccos, Lama glama і Lama vicugna), охарактеризовані відносно їх розміру, структурної комплексності та антигенності відносно людини. Встановлено, що деякі антитіла типу IgG із цього сімейства ссавців у природних умовах позбавлені легких ланцюгів і тому відрізняються за структурою від типової четвертинної структури, що складається із чотирьох ланцюгів, із двома важкими і двома легкими ланцюгами, характерної для антитіл з організму інших тварин (див. PCT/EP93/02214 (WO 94/04678, опублікована 3 березня 1994 р.)). Ділянка верблюжого антитіла, що представляє собою невелику індивідуальну варіабельну область, позначену як VHH, можна створювати за допомогою генної інженерії з одержанням невеликого білка, що має високу афінність до мішені, що приводить до утворення низькомолекулярного виведеного з антитіла білка, позначеного як "верблюже нанотіло" (див. US 5759808, виданий 2 червня1998 р.; див. також Stijlemans B. та ін., J Biol Chem 279, 2004, сс. 1256-1261; Dumoulin M. та ін., Nature 424, 2003, сс. 783-788; Pleschberger M. та ін. Bioconjugate Chem 14, 2003, сс. 440-448; Cortez-Retamozo V. та ін., Int J Cancer 89, 2002, сс. 456-462; і Lauwereys M. та ін., EMBO J 17, 1998, сс. 3512-3520). Створені бібліотеки верблюжих антитіл і фрагментів антитіл доступні на комерційній основі, наприклад, від фірми Ablynx, Гент, Бельгія. Аналогічно іншим антитілам, отриманим з видів крім людини, амінокислотну послідовність верблюжого антитіла можна змінювати рекомбінантно з одержанням послідовності, що більшою мірою нагадує людську послідовність, тобто нанотіло можна "гуманізувати". Таким шляхом можна додатково знижувати природну низьку антигенність верблюжих антитіл для людей. Верблюже нанотіло має молекулярну масу, що складає приблизно 1/10 від молекулярної маси людського IgG, а фізичний діаметр білка становить лише кілька нанометрів. Однією з пов'язаних з малим розміром особливостей є здатність верблюжих нанотіл зв'язуватися з антигенними сайтами, які є функціонально непомітними для більших білкових антитіл, тобто верблюжі нанотіла можна застосовувати як реагенти, що виявляють антигени, які залишаються схованими при використанні класичних імунологічних методів, і можливо як терапевтичних агентів. Таким чином, інший, пов'язаної з малим розміром особливістю верблюжого нанотіла, є здатність інгібувати зв'язування зі специфічним сайтом у борозенці або вузькій ущелині білкамішені, і тому їх можна застосовувати як субстанції, що більше нагадує за своєю функцією класичний низькомолекулярний лікарський засіб, ніж класичне антитіло. Невелика молекулярна маса і компактний розмір обумовлює також дуже високу термостабільність, стабільність при екстремальних значеннях рН і стабільність до протеолітичного розщеплення і низьку антигенність верблюжих нанотіл. Ще одним наслідком зазначених особливостей є те, що верблюжі нанотіла легко проникають із кровоносної системи в тканині і навіть проникають через гематоенцефалічний бар'єр та їх можна застосовувати для 17 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лікування захворювань, що вражають нервову тканину. Нанотіла можуть полегшувати також транспорт лікарських засобів через гематоенцефалічний бар'єр (див. заявку на патент США 20040161738, опубліковану 19 серпня 2004 г). Ці особливості в сполученні з низкою антигенністю у відношенні людей свідчать про їх великий терапевтичний потенціал. Крім того, ці молекули можна повністю експресувати у прокаріотичних клітинах, таких як E. сoli, і експресувати у вигляді злитих білків з бактеріофагом, і вони є функціонально активними. Таким чином, відмітною ознакою даного винаходу є верблюже антитіло або нанотіло, що має високу афінність до склеростину. У конкретних варіантах здійснення винаходу верблюже антитіло або нанотіло одержують у природних умовах у тварин із сімейства верблюжих, тобто воно продукується в організмі представника верблюжих після імунізації склеростином або його пептидним фрагментом при застосуванні методів, описаних для інших антитіл. В іншому варіанті верблюже нанотіло до склеростину конструюють, тобто одержують шляхом відбору, наприклад, з фагових дисплейних бібліотек відповідним чином мутованих білком верблюжих нанотіл, за допомогою методу пенінгу з використанням як мішені склеростину, як описано у наведених в даному описі прикладах. Сконструйовані нанотіла можна додатково вдосконалити за допомогою генної інженерії таким чином, щоб час їх напівжиття в реципієнті становив від 45 хв до 2 тижнів. У конкретному варіанті здійснення винаходу верблюже антитіло або нанотіло одержують шляхом трансплантації послідовностей CDR важкого або легкого ланцюга людських антитіл, запропонованих у винаході, у нанотіло або у послідовності каркасних ділянок однодоменного антитіла відповідно до методу, описаного, наприклад, в PCT/EP93/02214 (WO 94/04678). Нехарактерні для антитіл каркаси Відомі неімуноглобулінові кістяки або каркаси включають (але не обмежуючись тільки ними) аднектини (фібронектин) (фірма Compound Therapeutics, Inc., Уолтем, шт. Массачусетс), анкірин (фірма Molecular Partners AG, Цюріх, Швейцарія), домени антитіл (фірма Domantis, Ltd (Кембрідж, шт. Массачусетс) і аблінкс (Ablynx nv) (Цвінаарде, Бельгія)), ліпокалін (антикалин) (фірма Pieris Proteolab AG, Фрейзінг, Німеччина), невеликі модульні імунологічні фармацевтичні агенти (фірма Trubion Pharmaceuticals Inc., Сіетл, шт. Вашингтон), макситіла (фірма Avidia, Inc. (Маунтин-В'ю, шт. Каліфорнія), білок A (фірма Affibody AG, Швеція) і афілін (гамма-кристалін або убікітин) (фірма Scil Proteins Gmb, Галлі, Німеччина), міметики білкових епітопів (фірма Polyphor Ltd, Аллшвіль, Швейцарія). (I) Аднектини - фірма Compound Therapeutics Основою аднектинових каркасів є домен фібронектину типу III (наприклад, десятий модуль фібронектину типу III (домен 10 Fn3). Домен фібронектину типу III несе 7 або 8 бета-ланцюгів, які розподілені між двома бета-складками, які самі запаковані один навпроти одного з утворенням ядра білка, і додатково містять петлі (аналоги CDR), які з'єднують бета-ланцюги один з одним і є доступними для розчинника. Відомо щонайменше три таких петлі на кожному краї бета-складчастого сендвіча, при цьому край є границею білка, перпендикулярною до напрямку бета-ланцюгів (US 6818418). Ці каркаси, основою яких є фібронектин, не являють собою імуноглобулін, хоча загальна укладка дуже схожа на укладку найменшого фрагменту, що має функціональну активність фрагменту антитіла, тобто варіабельної області важкого ланцюга, який містить повний компонент, що розпізнає антиген, в IgG представників верблюжих і лам. Завдяки зазначеній структурі антитіло, що не представляє собою імуноглобулін, імітує антигензв'язувальні властивості, які нагадують за природою і афінністю властивості антитіл. Ці каркаси можна застосовувати для стратегії рандомізації петель і перестановки in vitro, подібної до процесу дозрівання афінності антитіл in vivo. Такі молекули, основою яких є фібронектин, можна застосовувати як каркаси, у яких області петель молекули можна заміняти на CDR, запропоновані у винаході, за допомогою стандартних методів клонування. (II) Анкірин - фірма Molecular Partners Технологія заснована на застосуванні білків, що несуть виведені з анкірину повторювані модулі як каркаси для варіабельних областей, які можна використовувати для зв'язування з різними мішенями. Анкіриновий модуль, що повторюється, являє собою поліпептид, що складається з 33 амінокислот, який містить дві антипаралельні α-спирали і β-петлі. Зв'язування варіабельних областей максимально оптимізують на основі доступності для рибосом. (III) Макситіла/авімери - фірма Avidia Авімери одержують із білка, що зустрічається в природних умовах та містить А-домен, такого як LRP-1. Ці домени використовуються в природних умовах для взаємодій типу білокбілок, і у людини структурною основою більше ніж 250 білків є A-домени. Авімери складаються з декількох різних мономерів « A-домену" (2-10), зчеплених за допомогою амінокислотних 18 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лінкерів. Можна створювати авімери, які можуть зв'язуватися з антигеном-мішенню, з використанням методології, описаної, наприклад в 20040175756; 20050053973; 20050048512; і 20060008844. (VI) Білок A - фірма Affibody Ліганди Affibody®, що мають афінність, являють собою невеликі прості білки, що складаються із трьохспірального пучка, основою якого є каркас одного з IgG-єднальних доменів білка A. Білок A являє собою поверхневий білок бактерії Staphylococcus aureus. Цей каркасний домен складається з 58 амінокислот, 13 з яких довільно використовували для створення бібліотек Affibody® з більшою кількістю варіантів ліганду (див., наприклад, US 5831012). Молекули Affibody® нагадують антитіла, їх молекулярна маса становить 6 кДа, для порівняння молекулярна маса антитіл становить 150 кДа. Незважаючи на невеликий розмір, сайт зв'язування молекул Affibody® подібний до сайту зв'язування антитіла. (V) Антикаліни - фірма Pieris Anticalins® являють собою продукти, розроблені компанією Pieris ProteoLab AG. Їх одержують із ліпокалінів, широко розповсюдженої групи невеликих і ефективних білків, які, як правило, беруть участь у фізіологічному транспорті або зберіганні чутливих до хімічних агентів або нерозчинних сполук. Декілька ліпокалінів, що зустрічаються в природних умовах, виявлено в тканинах або загальній воді організму людини. Їх білкова архітектура нагадує структуру імуноглобулінів з гіперваріабельними петлями на вершині твердого кістяка. Однак на відміну від антитіл або їх рекомбінантних фрагментів ліпокаліни складаються з одного поліпептидного ланцюга, що містить 160-180 амінокислотних залишків, тобто трохи більшої, ніж один домен імуноглобуліну. Набір із чотирьох петель, які утворюють єднальну кишеню, має виражену структурну пластичність і допускає широку розмаїтість бічних ланцюгів. Таким чином, при використанні відповідного процесу сайту зв'язування можна надавати нову форму, призначену для розпізнавання з високою афінністю і специфічністю заздалегідь визначених молекул-мішеней різної форми. Один з білків сімейства ліпокалінів, а саме єднальний білін білок (BBP) з Pieris brassicae (капустяна білявка), використовували для створення антикалінів шляхом мутагенезу, що зачіпає чотири петлі. Однією із заявок на патент, у яких описані "антикаліни", наведеної як приклад, є PCT WO 199916873. (VI) Афілін (Affilin) - білки фірми Scil Proteins Молекули Affilin™ являють собою невеликі неімуноглобулінові білки, які розроблені з метою досягнення специфічних афінностей до білків і невеликих молекул. Нові молекули Affilin™ можна дуже швидко відбирати із двох бібліотек, основою кожної з яких є різні отримані з людського організму білки-каркаси. Молекули Affilin™ не мають якої-небудь структурної гомології з білками імуноглобулінів. На фірмі Scil Proteins застосовують два Affilin™-каркаси, одним із яких є гамма-кристалін, людський структурний білок кришталика ока, а іншим є білки суперсімейства "убікітину". Обидва людських каркаси мають дуже малий розмір, характеризуються високою температуростійкістю і практично стійкі до змін значень pH і дії денатуруючих агентів. Зазначена висока стабільність головним чином є результатом розширеної бета-складчастої конформації білків. Приклади виведених з гамма-кристаліну білків описані в WO 200104144, а приклади "убкітиноподібних" білків описані в WO 2004106368. (VII) Міметики білкових епітопів (PEM) PEM являють собою циклічні молекули (ММ 1-2 кДа), що нагадують пептиди та мають середній розмір, які імітують вторинні структури білків типу бета-«шпителек", тобто основну вторинну структуру, що бере участь у взаємодіях типу білок-білок. У більш загальному випадку будь-який поліпептид, що імітує 3-мірну структуру епітопу описаних антитіл, є частиною даного винаходу. Кращими варіантуми є поліпептиди, що складаються з 30-100 амінокислот, які містять щонайменше такі поліпептиди, як E1-L-E2, де E1 позначає SEQ ID NO: 156 і E2 позначає SEQ ID NO: 157 і L позначає поліпептидний лінкер, який дозволяє E1 і E2 відтворювати 3-мірну структуру області, що розпізнається антитілами, запропонованими у винаході. У кращому варіанті здійснення винаходу L позначає лінкер, що складається з 10-20 амінокислот, вибраний із гліцинінових і серинових залишків. Краще лінкер L містить пептид GGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: X/SEQ ID NO: 158) або GGGGSGGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:Y/SEQ ID NO: 159), ще краще лінкер L практично складається з SEQ ID NO: X або SEQ ID NO:Y. Зазначені поліпептиди повинні зберігати високу афінність до антитіл, запропонованиху винаході. Ці поліпептиди доцільно також використовувати як імуногенів для одержання антитіл до склеростину. 19 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зазначені поліпептиди можна застосовувати також як антагоністи або агоністи склеростину, і тому вони можуть знайти застосування, подібне до застосування, яке зазначено для антитіл, запропонованих у даному винаході. Поліпептиди з однією або декількома амінокислотними замінами або делеціями, що краще зачіпають не менше 1, 2 або 3 амінокислот замінами або делеціями в послідовності E1 і/або E2, також є частиною винаходу. Ці поліпептиди можна також конструювати так, щоб вони мали подовжений час напівжиття або поліпшену стабільність. Насамперед злиті конструкції цих поліпептидів із сироватковими білками, такими як Fc-фрагменти IgG або людський сироватковий альбумін, можна створювати таким чином, щоб вони мали подовжений час напівжиття, подібно створенню Fc, що описано в наступному параграфі для молекул фрагментів антитіл, запропонованих у винаході. Конструювання каркасних ділянок або Fc До сконструйованих антитіл, запропонованих у винаході, відносяться антитіла, у яких зроблені модифікації в залишках каркасних ділянок у VH і/або VL, наприклад, з метою поліпшення властивостей антитіла. Як правило, такі модифікації каркасних ділянок здійснюють для зниження імуногенності антитіла. Наприклад, один з підходів являє собою "зворотне мутування" одного або декількох залишків каркасної ділянки з одержанням відповідної послідовності зародкової лінії. Ще конкретніше, антитіло, яке було піддано соматичній мутації, може містити залишки каркасної ділянки, що відрізняються від послідовності зародкової лінії, з якої виведене антитіло. Такі залишки можна ідентифікувати шляхом порівняння послідовностей каркасних ділянок антитіла з послідовностями зародкової лінії, з якої виведене антитіло. Для повернення послідовностей каркасної ділянки до вихідної конфігурації зародків лінії соматичні мутації можна піддавати "зворотному мутуванню" з одержанням послідовності зародкової лінії, наприклад, за допомогою сайтнаправленого мутагенезу або ПЦР-опосередковуваного мутагенезу. Такі антитіла зі "зворотними мутаціями" підпадають також під об'єм даного винаходу. Інший тип модифікації каркасної ділянки включає зміну шляхом мутації одного або декількох залишків у каркасній ділянці або навіть в одній або декількох CDR-ділянках для видалення Tклітинних епітопів з метою зниження потенційної імуногенності антитіла. Цей підхід позначають також як "деімунізація", і він описаний більш докладно в опублікованому US 20030153043 на ім'я Carr зі співавторами. У додатковому або альтернативному варіанті крім модифікацій у каркасних ділянках або CDR антитіла, запропоновані у винаході, можуть включати модифікації в Fc-фрагменті, як правило, для зміни одного або декількох функціональних властивостей антитіла, таких як час напівжиття в сироватці, фіксація комплементу, зв'язування Fc-рецептора і/або антитілообумовлена клітиннозалежна цитотоксичність. Крім того, антитіло, запропоноване у винаході, можна модифікувати хімічно (наприклад, до антитіла можна приєднувати один або кілька хімічних фрагментів) або можна модифікувати для зміни його глікозилювання, і в цьому випадку з метою зміни одного або декількох функціональних властивостей антитіла. Кожний із зазначених варіантів здійснення винаходу буде додатково описаний нижче. Нумерація залишків в Fc-фрагменті відповідає нумерації EU за Кеботом. В одному з варіантів здійснення винаходу модифікують шарнірну область CH1 так, щоб змінювати, наприклад, збільшувати або знижувати, кількість цистеїнових залишків у шарнірній області. Цей підхід описаний також в US 5677425 на ім'я Bodmer зі співавторами. Кількість цистеїнових залишків у шарнірній області CH1 змінюють, наприклад, для полегшення складання легких і важких ланцюгів або для підвищення або зниження стабільності антитіла. В іншому варіанті здійснення винаходу шарнірну область Fc-фрагменту антитіла можна змінювати за допомогою мутації для зниження біологічного часу напівжиття антитіла. Ще конкретніше, інтродуціюють одну або кілька амінокислотних мутацій в область контакту CH2CH3-доменів шарнірної області Fc-фрагменту для погіршення зв'язування антитіла з білком А золотавим стафілококом Staphylococcyl (Sp) у порівнянні зі зв'язуванням нативної шарнірної області Fc-фрагменту з Sp. Цей підхід описаний ще докладніше в US 6165745 на ім'я Ward зі співавторами. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло модифікують для подовження біологічного часу напівжиття. При цьому можливо застосування різних підходів. Наприклад, можна інтродуціювати одну або декілька з наступних мутацій: T252L, T254S, T256F, описаних в US 6277375 на ім'я Ward. В іншому варіанті для подовження біологічного часу напівжиття можна змінювати антитіло в CH1- або CL-області шляхом інтродукції епітопу, що з рецептором«рятувальником", отриманого із двох петель CH2-домену Fc-фрагменту IgG, як описано в US 5869046 і US 6121022 на ім'я Presta зі співавторами. 20 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В інших варіантах здійснення винаходу Fc-фрагмент змінюють шляхом заміни щонайменше одного амінокислотного залишку на інший амінокислотний залишок для зміни ефекторних функцій антитіла. Наприклад, один або кілька амінокислотних залишків можна заміняти на інший амінокислотний залишок так, щоб у такого антитіла змінювалася афінність до ефекторного ліганду, але зберігалася антигензв'язувальна здатність батьківського антитіла. Ефекторний ліганд, афінність до якого змінюють, може являти собою, наприклад, Fc-рецептор або C1-компонентів комплементу. Цей підхід описаний ще докладніше в US 5624821 і US 5648260, обидва на ім'я Winter зі співавторами. В іншому варіанті здійснення винаходу один або кілька амінокислотних залишків амінокислотної послідовності можна заміняти іншим амінокислотним залишком так, щоб антитіло мало змінену здатність до C1q-зв'язування і/або знижену комплементзалежну цитотоксичність (CDC) або щоб у нього була відсутня CDC. Цей підхід описаний ще докладніше в US 6194551 на ім'я Idusogie зі співавторами. В іншому варіанті здійснення винаходу один або кілька амінокислотних залишків модифікують, змінюючи тим самим здатність антитіла до фіксації комплементу. Цей підхід описаний також в опублікованій заявці PCT WO 94/29351 на ім'я Bodmer зі співавторами. У ще одному варіанті здійснення винаходу Fc-фрагмент модифікують для підвищення здатності антитіла викликати антитіло-обумовлену клітиннозалежну цитотоксичність (ADCC) і/або для підвищення афінності антитіла до Fcγ-рецептору за допомогою модифікації однієї або декількох амінокислот. Цей підхід описаний ще докладніше в опублікованій заявці PCT WO 00/42072 на ім'я Presta. Крім того, були маповані сайти зв'язування людського IgG1 з FcγRl, FcγRII, FcγRIII і FcRn, і описані варіанти з поліпшеною здатністю до зв'язування (див. Shields R.L. та ін. J. Biol. Chen. 276, 2001, сс. 6591-6604). У наступному варіанті здійснення винаходу модифікують глікозилювання антитіла. Наприклад, можна створювати аглікозильоване антитіло (тобто антитіло, у якому відсутнє глікозилювання). Глікозилювання можна змінювати, наприклад, для підвищення афінності антитіла до "антигену". Такі вуглеводні модифікації можна здійснювати шляхом, наприклад, зміни одного або декількох сайтів глікозилювання в послідовності антитіла. Наприклад, можна здійснювати одну або кілька амінокислотних замін, які приводять до елімінації одного або декількох сайтів глікозилювання каркасної ділянки варіабельної області, усуваючи тим самим глікозилювання в цьому сайті. Зазначене аглікозилювання може підвищувати афінність антитіла до антигену. Цей підхід описаний ще докладніше в US 5714350 і US 6350861 на ім'я Co зі співавторами. У додатковому або альтернативному варіанті можна створювати антитіло зі зміненим типом глікозилювання, наприклад, гіпофукозильоване антитіло, яке має знижену кількість фукозильних залишків, або антитіло з підвищеним вмістом поділяючих навпіл GlcNac-структур. Було продемонстровано, що такі змінені схеми глікозилювання підвищують ADCC-активність антитіл. Зазначені вуглеводні модифікації можна здійснювати, наприклад, шляхом експресії антитіла в клітині-хазяїні зі зміненим механізмом глікозилювання. Клітини зі зміненим механізмом глікозилювання відомі в даній галузі, та їх можна застосовувати як клітини-хазяї, у яких експресують рекомбінантні антитіла, запропоновані у винаході, для одержання тим самим антитіл зі зміненим глікозилюванням. Наприклад, в EP 1176195 на ім'я Hang зі співавторами описана лінія клітин з функціонально порушеним геном FUT8, який кодує фукозилтрансферазу, у результаті чого антитіла, що експресуються в такій клітинній лінії, характеризуються гіпофукозилюванням. В опублікованій заявці PCT WO 03/035835 на ім'я Presta описаний варіант лінії CHO-клітин, Lecl3-клітини, зі зниженою здатністю приєднувати фукозу до пов'язаних з Asn(297) вуглеводів, що приводить також до гіпофукозилювання антитіл, що експресуються у цій клітині-хазяїні (див. також Shields R.L. та ін., J. Biol. Chem. 277, 2002, сс. 26733-26740). В опублікованій заявці PCT WO 99/54342 на ім'я Umana зі співавторам, описані лінії клітин, сконструйовані для експресії глікозилтрансфераз, що модифікують глікопротеїн (наприклад, бета(1,4)-N-ацетилглюкозамінілтрансферази III (GnTIII)), у результаті чого антитіла, які експресуються в сконструйованих лініях клітин, характеризуються підвищеним вмістом поділяючих навпіл GlcNac-структур, що приводить до підвищеної ADCC-активності антитіл (див. також Umana та ін., Nat. Biotech. 17, 1999, сс. 176-180). Іншою модифікацією антитіл, що підпадає під об'єм винаходу, є пегілювання. Антитіло можна пегілювати, наприклад, для подовження біологічного (наприклад, у сироватці) часу напівжиття антитіла. Для пегілювання антитіла, як правило, антитіло або його фрагмент піддають взаємодії з поліетиленгліколем (ПЕГ), таким як реакційноздатний складний ефір або альдегідне похідне ПЕГ, в умовах, за яких одна або декілька ПЕГ-груп приєднується до антитіла або фрагменту антитіла. Пегілювання можна здійснювати за допомогою реакції ацилювання або 21 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 реакції алкілювання з реакційноздатною молекулою ПЕГ (або аналогічним реакційноздатним водорозчинним полімером). У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "поліетиленгліколь" відноситься до будь-яких форм ПЕГ, які використовують для дериватизації інших білків, таким як моно(C1-C10)алкокси- або арилоксиполіетиленгліколь або поліетиленглікольмалеімід. У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло, що підлягає пегілюванню, являє собою агліколізоване антитіло. Методи пегілювання білків відомі в даній галузі, та їх можна застосовувати до антитіл, запропонованих у винаході (див., наприклад, EP 0154316 на ім'я Nishimura зі співавторами і EP 0401384 на ім'я Ishikawa зі співавторами). Іншою модифікацією антитіл, що підпадає під об'єм винаходу, є кон'югат або злитий білок, що містить щонайменше антигензв'язувальну ділянку антитіла, запропонованого у винаході, із сироватковим білком, таким як людський сироватковий альбумін або його фрагмент, з метою подовження часу напівжиття молекули, що утворилася. Такий підхід описаний, наприклад, в Ballance зі співавторами в EP0322094. Іншим можливим варіантом є злиття щонайменше однієї антигензв'язувальної ділянки антитіла, запропонованого у винаході, з білками, які можуть зв'язуватися із сироватковими білками, такими як людський сироватковий альбумін, подовжуючи час напівжиття молекули, що утворилася. Такий підхід описаний в Nygren зі співавторами в EP0486525. Методи створення змінених антитіл Як зазначено вище, антитіла до склеростину, які мають послідовності VH і VL або послідовності повнорозмірного важкого і легкого ланцюга, представлені в даному описі, можна застосовувати для створення нових антитіл до склеростину шляхом модифікації послідовностей повнорозмірного важкого ланцюга і/або легкого ланцюга, послідовностей VH і/або VL або приєднаних до них константних областей. Таким чином, відповідно до іншого об'єкта винаходу структурні особливості антитіла до склеростину, запропонованого у винаході, використовують для створення структурно споріднених антитіл до склеростину, які зберігають щонайменше одну з функціональних властивостей антитіл, запропонованих у винаході, таких як зв'язування з людським склеростином, а також інгібування однієї або декількох функціональних властивостей склеростину (наприклад, зв'язування з рецептором, попередження або зниження остеолізу). Наприклад, одну або декілька CDR-ділянок антитіл, запропонованих у даному винаході, або їх мутантів можна поєднувати рекомбінантно з відомими каркасними ділянками і/або іншими CDR для створення додаткових, створених з використанням рекомбінантної ДНК антитіл до склеростину, запропонованих у винаході, за допомогою зазначених вище методів. Інші типи модифікаційвключають модифікації, описані в попередньому розділі. Вихідним матеріалом для конструювання є одна або кілька послідовностей VH і/або VL, представлених у даному описі, або один або декілька з їх CDR-ділянок. Для створення сконструйованого антитіла не є необхідним фактичне одержання (тобто експресія у вигляді білка) антитіла, яке має одну або декілька з послідовностей VH і/або VL, представлених у даному описі, або однієї або декількох їх CDR-ділянок. Краще інформацію, що міститься в послідовності(ях), використовують як вихідний матеріал для створення послідовності(ей) "другого покоління", виведеної(их) з вихідної(их) послідовності(ей), і потім одержують послідовність(ті) другого покоління та експресують у вигляді білка. Таким чином, ще одним варіантом здійснення винаходу є спосіб одержання антитіла до склеростину, що складається з: послідовності варіабельної області важкого ланцюга антитіла, що містить послідовність CDR1, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 1-11, послідовність CDR2, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 12-22, і/або послідовність CDR3, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 23-33; послідовності варіабельної області легкого ланцюга антитіла, що містить послідовність CDR1, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 34-44, послідовність CDR2, вибрану із групи, що включає SEQ NO: 45-55, і/або послідовність CDR3, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 56-66; що порлягає в тому, що змінюють щонайменше один амінокислотний залишок у послідовності варіабельної області важкого ланцюга антитіла і/або варіабельної області легкого ланцюга антитіла для створення щонайменше однієї зміненої послідовності антитіла; і експресують змінену послідовність антитіла у вигляді білка. Таким чином, іншим варіантом здійснення винаходу є спосіб одержання антитіла до склеростину, оптимізованого для експресії в клітині ссавця, яке складається з: повнорозмірної послідовності важкого ланцюга антитіла, яка має послідовність, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 111-121; повнорозмірної послідовності легкого ланцюга антитіла, яка має послідовність, вибрану із групи, що включає SEQ ID NO: 122-132; що полягає в тому, що змінюють щонайменше один амінокислотний залишок у повнорозмірній послідовності важкого ланцюга антитіла і/або у повнорозмірній послідовності легкого ланцюга антитіла для створення 22 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше однієї зміненої послідовності антитіла; і експресують змінену послідовність антитіла у вигляді білка. Змінену послідовність антитіла можна створювати також шляхом скринінгу бібліотек антитіл, які мають фіксовані послідовності CDR3, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 23-33, або мінімальні єднальні детермінанти, що мають вирішальні значення, описані в US 20050255552, і різноманітні послідовності CDR1 і CDR2. Скринінг можна здійснювати з використанням будьякого методу скринінгу, придатного для скринінгу антитіл з бібліотек антитіл, такого як технологія фагового дисплея. Для одержання й експресії зміненої послідовності антитіла можна застосовувати стандартні методи молекулярної біології. Антитіло, що кодується зміненою(ими) послідовністю(ями), являє собою антитіло, яке зберігає одну, декілька або всі функціональні властивості антитіл до склеростину, представлених у даному описі, де функціональні властивості являють собою (але не обмежуючись тільки ними) специфічне зв'язування з людським склеростином; і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу передачі сигналу wnt, антитіло блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці за допомогою клітинного аналізу мінералізації або блокує інгібуючу дію склеростину при оцінці фосфорилювання Smad1, або антитіло інгібує зв'язування склеростину з LRP-6, або антитіло підсилює формування кістки, підвищує її масу та щільність. Змінене антитіло може мати одну або декілька, дві або більше або три або більше із зазначених вище функціональних властивостей. Функціональні властивості змінених антитіл можна оцінювати за допомогою стандартних аналізів, відомих у даній галузі і/або представлених у даному описі, таких як описані в прикладах (наприклад, ELISA). У конкретних варіантах способів створення антитіл, запропонованих у винаході, мутації можна інтродуціювати довільно або вибірково у всю або в частину послідовності антитіла, що кодує, до склеростину і отримані в результаті модифіковані антитіла до склеростину можна піддавати скринінгу відносно єднальної активності і/або інших описаних вище функціональних властивостей. Методи інтродукції мутацій відомі в даній галузі. Наприклад, в опублікованій заявці PCT WO 02/092780 на ім'я Short описані методи створення і скринінгу мутацій антитіл за допомогою мутагенезу, що насичує, синтетичного складання лігуванням або за допомогою комбінації цих методів. В опублікованій заявці PCT WO 03/074679 на ім'я Lazar зі співавторами описані альтернативні методи, засновані на обчислювальному скринінзі для оптимізації фізикохімічних властивостей антитіл. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують антитіла, запропоновані у винаході Наступним об'єктом винаходу є молекули нуклеїнових кислот, які кодують антитіла, запропоновані у винаході. Прикладами батьківських нуклеотидних послідовностей повнорозмірного легкого ланцюга є послідовності, представлені в SEQ ID NO: 144-145. Прикладами батьківських нуклеотидних послідовностей повнорозмірного важкого ланцюга є послідовності, представлені в SEQ ID NO: 133-134. Прикладами батьківських нуклеотидних послідовностей повнорозмірного легкого ланцюга, оптимізованих для експресії в клітині ссавця, є послідовності, представлені в SEQ ID NO: 146-154. Прикладами батьківських нуклеотидних послідовностей повнорозмірного важкого ланцюга, оптимізованих для експресії в клітині ссавця, є послідовності, представлені в SEQ ID NO: 135-143. Нуклеїнові кислоти можуть бути присутні у цілих клітинах, у клітинних лізатах або можуть являти собою нуклеїнові кислоти в частково очищеній або практично чистій формі. Нуклеїнову кислоту "виділяють" або "одержують її в практично очищеному вигляді", коли її очищають від інших клітинних компонентів або інших забруднювачів, наприклад, інших присутніх у клітині нуклеїнових кислот або білків, за допомогою стандартних методів, включаючи обробку лугом/ДСН, CsCl-бендінг, хроматографію на колонках, електрофорез в агарозному гелі та інших методах, добре відомих у даній галузі (див. Current Protocols in Molecular Biology, за ред. F. Ausubel та ін., вид-в Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987). Нуклеїнова кислота, запропонована у винаході, може являти собою, наприклад, ДНК або РНК, і може містити інтронні послідовності або не містити їх. В одному з варіантів здійснення винаходу нуклеїнова кислота являє собою молекулу кДНК. Нуклеїнова кислота може бути присутня у векторі, такому як фаговий дисплейний вектоp або рекомбінантний плазмідний вектор. Нуклеїнові кислоти, запропоновані у винаході, можна одержувати за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Для антитіл, що експресуються гібридомами (наприклад, гібридомами, отриманими із трансгенних мишей, які несуть гени людських імуноглобулінів, що буде описано нижче), кДНК, які кодують легкі і важкі ланцюги антитіла, створені з використанням гібридоми, можна одержувати за допомогою стандартних методів ПЦР 23 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ампліфікації або клонування кДНК. Для антитіл, які одержують із бібліотеки генів імуноглобулінів (наприклад, за допомогою методу фагового дисплея), нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, можна виділяти з різних фагових клонів, які є компонентами бібліотеки. Після одержання ДНК-фрагментів, що кодують VH- і VL-області, ці ДНК-фрагменти можна піддавати додатковій обробці за допомогою стандартних методів рекомбінантної ДНК, наприклад, для перетворення генів варіабельної області в гени повнорозмірного ланцюга антитіла, у гени Fab-фрагменту або в ген scFv-фрагменту. При здійсненні цього процесу ДНКфрагмент, що кодує VL або VH, функціонально зв'язують із іншою молекулою ДНК або фрагментом, яка кодує/який кодує інший білок, такий як константна область антитіла або гнучкий лінкер. Поняття "функціонально зв'язаний" у контексті даного опису означає, що два ДНК-фрагменти з'єднують функціональним чином, у результаті чого амінокислотні послідовності, що кодуються двома ДНК-фрагментами, зберігаються в рамці зчитування, або в результаті чого білок експресується під контролем необхідного промотору. Виділену ДНК, що кодує VH-область, можна перетворювати в ген повнорозмірного важкого ланцюга шляхом функціонального зв'язування ДНК, яка кодує VH, з іншою молекулою ДНК, яка кодує константні області важкого ланцюга (CH1, CH2 і CH3). Послідовності генів константної області важкого ланцюга відомі в даній галузі (див., наприклад, Kabat E.A. та ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 15-те вид., вид-в U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242, 1991), і ДНК-фрагменти, що включають ці області, можна одержувати за допомогою стандартної ПЦР-ампліфікації. Константна область може являти собою константну область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD. Краще константну область важкого ланцюга вибирають серед IgG2-ізотипів. У випадку гена Fab-фрагменту важкого ланцюга ДНК, що кодує VH, можна функціонально зв'язувати з іншою молекулою ДНК, яка кодує тільки константну область CH1 важкого ланцюга. Виділену ДНК, що кодує VL-область, можна перетворювати в ген повнорозмірного легкого ланцюга (а також у ген легкого ланцюга Fab-фрагменту) шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує VL, з іншою молекулою ДНК, яка кодує константну область легкого ланцюга, тобто CL. Послідовності людських генів константної області легкого ланцюга відомі в даній галузі (див., наприклад, Kabat E.A. та ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 15-те вид., вид-в U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991), і ДНК-фрагменти, що включають ці області, можна одержувати за допомогою стандартної ПЦРампліфікації. Константна область легкого ланцюга може являти собою константну область капаабо лямбда-ланцюга. Для створення гена scFv ДНК-фрагменти, які кодують VH і VL, функціонально зв'язують із іншим фрагментом, який кодує гнучкий лінкер, наприклад, який кодує амінокислотну послідовність (Gly4-Ser)3, у результаті чого послідовності VH і VL можна експресувати у вигляді суміжного одноланцюгового білка, у якому VL- і VH-області з'єднані гнучкими лінкером (див., наприклад, Bird та ін., Science 242, 1988, сс. 423-426; Huston та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, сс. 5879-5883; McCafferty та ін., Nature 348, 1990, сс. 552-554). Створення моноклональних антитіл, запропонованих у винаході Моноклональні антитіла (МАт) можна одержувати за допомогою різних методів, включаючи загальноприйняті методи одержання моноклональних антитіл, наприклад, за допомогою стандартного методу гібридизації соматичних клітин, описаного в Kohler і Milstein, Nature 256, 1975, с. 495. Для одержання моноклональних антитіл можна застосовувати численні методики, наприклад, трансформацію В-лімфоцитів вірусами або онкогенами. Система тваринного походження, що застосовується для одержання гібридом, являє собою систему, засновану на використанні мишей. Створення гібридоми в миші є добре відомою процедурою. Протоколи імунізації та методи виділення імунізованих спленоцитів, призначених для злиття, добре відомі в даній галузі. Компоненти, що беруть участь у злитті (наприклад, клітини мишачої мієломи), і процедури злиття також добре відомі. Химерні або гуманізовані антитіла, запропоновані в даному винаході, можна одержувати на основі послідовності мишачого моноклонального антитіла, отриманого відповідно до описаного вище методу. ДНК, що кодує важкі та легкі ланцюга імуноглобулінів, можна одержувати із мишачої гібридоми, що представляє інтерес, і створювати так, щоб вона містила немишачі (наприклад, людські) послідовності імуноглобулінів, за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Наприклад, для створення химерного антитіла мишачі варіабельні області можна зв'язувати з людськими константними областями з використанням відомих у даній галузі методів (див., наприклад, US 4816567 на ім'я Cabilly зі співавторами). Для створення гуманізованого антитіла мишачі CDR-ділянки можна вбудовувати в людську каркасну 24 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ділянку за допомогою відомих у даній галузі методів (див., наприклад, US 5225539 на ім'я Winter і US 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Queen зі співавторами). У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, являють собою людські моноклональні антитіла. Такі людські моноклональні антитіла до склеростину можна створювати з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть фрагменти людської, а не мишачої імунної системи. До цих трансгенних і трансхромосомних мишей відносяться миші, позначені в контексті даного описуяк HuMAb-миші і KM-миші відповідно, і мишей обох зазначених ліній позначають у контексті даного опису як "мишей, що несуть людський Ig". Миші лінії HuMAb (HuMAb mouse®, фірма Medarex, Inc.) містять мінілокуси гена людського імуноглобуліну, що кодує неперегруповані послідовності людського важкого (µ і γ) та легкого κланцюга імуноглобуліну, у сполученні із цільовими мутаціями, які інактивують ендогенні локуси µ- і κ-ланцюга (див., наприклад, Lonberg та ін., Nature 368(6474), 1994, сс. 856-859). Таким чином, у миші знижена здатність експресувати мишачий IgM або κ-ланцюг, і у відповідь на імунізацію інтродуційовані трансгени людського важкого та легкого ланцюга піддаються перемиканню класу і соматичному мутуванню з утворенням людського моноклонального IgGκ, що має високу афінність (Lonberg N. та ін., 1994, вище; оглядова стаття Lonberg N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 1994, сс. 49-101; Lonberg N. і Huszar D., Intern. Rev. Immunol. 13, 1995, сс. 65-93 і Harding F. і Lonberg N., Ann. N. Y. Acad. Sci. 764, 1995, сс. 536-546). Одержання і застосування мишей лінії HuMAb і геномні модифікації, які несуть такі миші, описані також в Taylor L. та ін., Nucleic Acids Research 20, 1992, сс. 6287-6295; Chen J. Та ін., International Immunology 5, 1993, сс. 647-656; Tuaillon та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1993, сс. 3720-3724; Choi та ін., Nature Genetics 4, 1993, сс. 117-123; Chen J. та ін., EMBO J. 12, 1993, сс. 821-830; Tuaillon та ін., J. Immunol. 152, 1994, сс. 2912-2920; Taylor L. та ін., International Immunology, 1994, сс. 579-591; і Fishwild D. та ін., Nature Biotechnology 14, 1996, сс. 845-851, зміст всіх публікацій спеціально повністю включено в даний опис як посилання (див. також US 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 і 5770429; усе на ім'я Lonberg і Kay; US 5545807 на ім'я Surani зі співавторами; опубліковані заявки PCT WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 і WO 99/45962, усе на ім'я Lonberg і Kay; і опубліковану заявку PCT WO 01/14424 на ім'я Korman зі співавторами). В іншому варіанті здійснення винаходу людські антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати з використанням миші, яка несе послідовності людського імуноглобуліну на трансгенах і трансхромосомах, наприклад, миші, яка несе трансген людського важкого ланцюга і трансхромосому людського легкого ланцюга. Такі миші, позначені в контексті даного описуяк "KM-миші", описані докладно в публікації PCT WO 02/43478 на ім'я Ishida зі співавторами. У даній галузі відомі також інші системи на основі трансгенних тварин, що експресують гени людського імуноглобуліну, та їх можна застосовувати для одержання антитіл до склеростину, запропонованих у винаході. Наприклад, можна використовувати іншу трансгенну систему, позначену як Xenomouse (фірма Abgenix, Inc.); такі миші описані, наприклад, в US 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 і 6162963 на ім'я Kucherlapati зі співавторами. Крім того, у даній галузі відомі також інші транхромосомні системи, створені на основі тварин, для експресії генів людського імуноглобуліну, та їх можна застосовувати для одержання антитіл до склеростину, запропонованих у винаході. Наприклад, можна використовувати мишей, що несуть як трансхромосому людського важкого ланцюга, так і трансхромосому людського легкого ланцюга, які позначені як "TC-миші"; такі миші описані, наприклад, в Tomizuka та ін. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, сс. 722-727. Крім того, у даній галузі відомі корови, що несуть трансхромосоми людського важкого і легкого ланцюга (Kuroiwa та ін., Nature Biotechnology 20, 2002, сс. 889-894) та їх можна застосовувати для одержання антитіл до склеростину, запропонованих у винаході. Людські моноклональні антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати також з використанням методів фагового дисплея для скринінгу бібліотек генів людських імуноглобулінів. У даній галузі розроблені такі методи фагового дисплея для виділення людських антитіл (див., наприклад: US 5223409; 5403484 і 5571698 на ім'я Ladner зі співавторами; US 5427908 і 5580717 на ім'я Dower зі співавторами; US 5969108 і 6172197 на ім'я McCafferty зі співавторами і US 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 і 6593081 на ім'я Griffiths зі співавторами). Людські моноклональні антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати також з використанням SCID-мишей (миші з важким комбінованим імунодефіцитом), у яких відновлювали людські імуноцити для того, щоб при імунізації можна було одержувати людську 25 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гуморальну імунну відповідь. Такі миші описані, наприклад, в US 5476996 і 5698767 на ім'я Wilson зі співавторами. Створення гібридом, що продукують людські моноклональні антитіла Для створення гібридом, які продукують людські моноклональні антитіла, запропоновані у винаході, можна виділяти спленоцити і/або клітини лімфатичних вузлів з імунізованих мишей і зливати з відповідною імморталізованою лінією клітин, такою як лінія клітин мишачої мієломи. Гібридоми, що утворилися, можна піддавати скринінгу відносно виробництва специфічних для антигену антитіл. Наприклад, суспензії індивідуальних клітин селезінкових лімфоцитів з імунізованих мишей можна зливати в кількості, що становить одну шосту частину від кількості клітин мишачої мієломи лінії P3 × 63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580), що несекретується, за допомогою 50 % ПЕГ. Клітини висівають приблизно з розрахунку 2×105/лунку в плоскодонні титраційні мікропланшети, потім інкубують протягом 2 тижнів у середовищі для селекції, що містить 20 % фетальної сироватки (Clone), кондиціонованого середовища "653", 5 % оригену (фірма IGEN), 4мМ L-глутамін, 1мМ піруват натрію, 5мМ HEPES, 0,055мМ 2-меркаптоетанол, 50 ед./мл пеніциліни, 50 мкг/мл стрептоміцину, 50 мкг/мл гентаміцину і 1×ГАТ (фірма Sigma; ГАТ додають через 24 год. після злиття). Приблизно через 2 тижні клітини можна культивувати в середовищі, у якому ГАТ замінений на ГТ. Потім індивідуальні лунки можна піддавати скринінгу за допомогою ELISA у відношенні людських моноклональних антитіл у вигляді IgM і IgG. Після досягнення інтенсивного зростання гібридом здійснюють моніторинг середовища, як правило, через 10-14 днів. Гібридоми, що секретують антитіла, можна пересівати, знову піддавати скринінгу і, якщо усе ще зберігається позитивна реакція у відношенні людського IgG, то людські моноклональні антитіла можна субклонувати щонайменше двічі з використанням обмежуючого розведення. Потім стабільні субклони можна культивувати in vitro для одержання невеликих кількостей антитіл у середовищі для культури тканини з метою подальшої характеризації. Для очищення людських моноклональних антитіл відібрані гібридоми можна вирощувати в 2-літрових обертових колбах з метою очищення моноклональних антитіл. Супернатанти можна фільтрувати і концентрувати перед здійсненням афінної хроматографії з використанням білка A-сефарози (фірма Pharmacia, Піскатавей, шт. Нью-Джерсі). Елюйований IgG можна перевіряти за допомогою гель-електрофорезау і рідинної хроматографії високої роздільної здатності для гарантії чистоти. Буферний розчин можна заміняти на ЗФР і концентрацію визначати на основі ОП280 з використанням коефіцієнта екстинкції 1,43. Моноклональні антитіла можна розділяти на аліквоти і зберігати при -80 °C. Створення трансфектом, що продукують моноклональні антитіла Антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати також у трансфектомі клітинихазяїна з використанням, наприклад, комбінації методів рекомбінантної ДНК і методів генної трансфекції, які добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Morrison S., Science 229, 1985, с. 1202). Наприклад, для експресії антитіл або фрагментів антитіл ДНК, які кодують часткові або повнорозмірні легкі й важкі ланцюги, можна одержувати за допомогою стандартних методів молекулярної біології (наприклад, за допомогою ПЦР-ампліфікації або клонування кДНК із використанням гібридом, які експресують антитіло, що представляє інтерес, ), і ДНК можна вбудовувати у вектори експресії таким чином, щоб гени були функціонально пов'язані з послідовностями, що контролюють транскрипцію і трансляцію. У цьому контексті мається на увазі, що поняття "функціонально зв'язаний" означає, що ген антитіла вбудовують шляхом лігування у вектор таким чином, щоб присутні у векторі послідовності, що контролюють транскрипцію і трансляцію, виконували властиві їм функції регуляції транскрипції і трансляції гена антитіла. Обрані вектор експресії і послідовності, що контролюють експресію, повинні бути сумісні із клітиною-хазяїном, що застосовується для експресії. Ген легкого ланцюга антитіла і ген важкого ланцюга антитіла можна вбудовувати в різні вектори або, як правило, обидва гени вбудовують у той самий вектор експресії. Гени антитіла вбудовують в вектор експресії стандартними методами (наприклад, вбудовують шляхом лігування комплементарних сайтів рестрикції на фрагменті гена антитіла і вектора, або шляхом лігування "затуплених" кінців, якщо відсутні які-небудь сайти рестрикції). Варіабельні області легких і важких ланцюгів антитіл, запропонованих у винаході, можна використовувати для створення повнорозмірних генів антитіл будь-яких ізотипів шляхом вбудовування їх у вектори експресії, які вже кодують константні області важкого ланцюга і константні області легкого ланцюга необхідного ізотипу, таким чином, щоб VH-область була функціонально пов'язана з CH-сегментом(ами) у векторі, а VL-область функціонально пов'язана з CL-областю у векторі. В іншому або додатковому варіанті здійснення винаходу рекомбінантний вектор експресії може кодувати сигнальний пептид, який полегшує секрецію ланцюга антитіла із клітини-хазяїна. Ген ланцюга антитіла 26 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна клонувати у векторі так, щоб сигнальний пептид був зв'язаний у рамці зчитування з Nкінцем гена ланцюга антитіла. Сигнальний пептид може являти собою сигнальний пептид імуноглобуліну або гетерологічний сигнальний пептид (тобто сигнальний пептид з білка, що не відноситься до імуноглобулінів). Крім генів ланцюга антитіла рекомбінантні вектори експресії, запропоновані у винаході, несуть регуляторні послідовності, які контролюють експресію генів ланцюга антитіла в клітиніхазяїні. Мається на увазі, що поняття "регуляторна послідовність" відноситься до промоторів, енхансерів та інших елементів, що контролюють експресію (наприклад, сигнали поліаденілювання), які контролюють транскрипцію або трансляцію генів ланцюга антитіла. Зазначені регуляторні послідовності описані, наприклад, в Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, вид-в Academic Press, San Diego, CA1990). Фахівцям у даній галузі повинно бути очевидно, що створення вектора експресії, включаючи вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна для трансформації, необхідний рівень експресії білка і т.д. Регуляторні послідовності для експресії в клітинах ссавців включають вірусні елементи, які забезпечують високі рівні експресії білка в клітинах ссавців, такі як промотори і/або енхансери, виведені із цитомегаловірусу (CMV), мавпячого вірусу 40 (SV40), аденовірусу (наприклад, головний пізній промотор аденовірусу (AdMLP)) і вірусу поліоми. В альтернативному варіанті можна використовувати невірусні регуляторні послідовності, такі як промотор убікітину або промотор P-глобіну. Крім того, можна застосовувати регуляторні елементи, що складаються з отриманих з різних джерел послідовностей, такі як промоторна система Sra, яка містить послідовності раннього промотору SV40 і довгий кінцевий повтор вірусу типу 1 людського Т-клітинного лейкозу (Takebe Y. та ін., Mol. Cell. Biol. 8, 1988, сс. 466-472). Крім генів ланцюга антитіла і регуляторних послідовностей рекомбінантні вектори експресії, запропоновані у винаході, можуть нести додаткові послідовності, наприклад, послідовності, які регулюють реплікацію вектора в клітинах-хазяїнах (наприклад, сайти ініціації реплікації) і гени маркерів, що селектуються. Гени маркерів, що селектуються, полегшують відбір клітин-хазяїв, у які інтродуційовано вектор (див., наприклад, US №№ 4399216, 4634665 і 5179017, усе на ім'я Axel зі співавторами). Наприклад, як правило, ген маркера, що селектується, обумовлює стійкість клітини-хазяїна, у яку інтродуційовано вектор, до лікарських засобів, таких як G418, гігроміцин або метотрексат. До генів маркерів, що селектуються, відносяться ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для застосування в dhfr- клітинах-хазяїнах при селекції/ампліфікації в присутності метотрексату) і ген neo (для відбору в присутності G418). Для експресії легких і важких ланцюгів вектором(ами) експресії, що кодує(ють) важкі і легкі ланцюги, трансфектують клітину-хазяїна за допомогою стандартних методів. Під різні форми поняття "трансфекція" підпадає широка розмаїтість методів, що зазвичай застосовуються для інтродукції екзогенної ДНК у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, наприклад, електропорація, осадження фосфатом кальцію, трансфекція з використанням ДЕАЕ ((диетиламіно)етилцелюлоза)-декстрану і т.п. Теоретично можна експресувати антитіла, запропоновані у винаході, як у прокаріотичних, так і в еукаріотичних клітинах-хазяїнах. Вважається, що варто здійснювати експресію в еукаріотичних клітинах, насамперед у клітинаххазяїнах ссавців, оскільки зазначені еукаріотичні клітини і, насамперед клітини ссавців, з більшою ймовірністю, ніж прокаріотичні клітини, можуть забезпечувати складання та секрецію антитіла, що має правильну укладку і володіє імунологічною активністю. Встановлено, що експресія генів антитіл у прокаріотичних хазяях не може ефективно забезпечувати високі рівні виробництва активного антитіла (Boss M. A. і Wood C. R., Immunology Today 6, 1985, сс. 12-13). Клітини-хазяї ссавців, призначені для експресії рекомбінантних антитіл, запропонованих у винаході, являють собою клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO-клітини) (включаючи СНОклітини з дефіцитом dhfr (dhfr-), описані в Urlaub і Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1980, сс. 4216-4220, які застосовують у сполученні із маркером DHFR, що селектується, наприклад, як описано в R.J. Kaufman і P.A. Sharp, Mol. Biol. 159, 1982, сс. 601-621, клітини мієломи лінії NSO, COS-клітини і SP2-клітини. Зокрема, для застосування у сполученні із клітинами мієломи NSO використовують іншу систему експресії, що представляє собою систему експресії GS-гену, як описано в WO 87/04462, WO 89/01036 і EP 338,841. Коли рекомбінантні вектори експресії, що кодують гени антитіла, інтродуціюють у клітини-хазяї ссавців, то антитіла одержують шляхом культивування клітин-хазяїв протягом періоду часу, достатнього для здійснення експресії антитіла в клітині-хазяїні або секреції антитіла в культуральне середовище, у якому вирощують клітини-хазяї. Антитіла можна виділяти з культурального середовища за допомогою стандартних методів очищення білків. Біспецифічні молекули 27 UA 102075 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наступним об'єктом даного винаходу є біспецифічні молекули, що містять антитіло до склеростину або його фрагмент, запропоноване/запропонований у винаході. Антитіло, запропоноване у винаході, або його антигензв'язувальні ділянки можна дериватизувати або зв'язувати з іншою функціонально активною молекулою, наприклад, з іншим пептидом або білком (наприклад, з іншим антитілом або лігандом рецептора), з одержанням біспецифічної молекули, яка зв'язується щонайменше із двома різними сайтами зв'язування або молекуламимішенями. Антитіло, запропоноване у винаході, фактично можна дериватизувати або зв'язувати більш ніж з однією іншою функціонально активною молекулою з утворенням мультиспецифічних молекул, які зв'язуються більш ніж із двома різними сайтами зв'язування і/або молекуламимішенями; мається на увазі, що в контексті даного опису зазначені мультиспецифічні молекули також підпадають під поняття "біспецифічна молекула". Для створення біспецифічної молекули, запропонованої у винаході, антитіло, запропоноване у винаході, можна функціонально зв'язувати (наприклад, шляхом хімічного сполучення, генетичного злиття, нековалентної асоціації або іншим способом) з однією або декількома іншими єднальними молекулами, такими як інше антитіло, фрагмент антитіла, пептид або єднальний міметик, з одержанням біспецифічної молекули. Таким чином, даний винахід відноситься до біспецифічних молекул, які мають щонайменше одну першу специфічність, що має здатність до зв'язування зі склеростином, і другу специфічність, що має здатність до зв'язування із другим епітопом-мішенню. Наприклад, другий епітоп-мішень являє собою другий епітоп склеростину, відмінний від першого епітопу-мішені. Іншим прикладом є біспецифічна молекула, що містить щонайменше одну першу специфічність, що має здатність до зв'язування зі склеростином, і другу специфічність, що має здатність до зв'язування з епітопом всередині Dkk-1. Ще одним прикладом є біспецифічна молекула, що містить щонайменше одну першу специфічність, що має здатність до зв'язування зі склеростином, і другу специфічність, що має здатність до зв'язування з епітопом всередині LRP4. Крім того, відповідно до варіанту здійснення винаходу, у якому біспецифічна молекула є мультиспецифічною, молекула може додатково включати третю специфічність, що має здатність до зв'язування, на додаток до першого і другого епітопу-мішені. В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічні молекули, запропоновані у винаході, містять як специфічність, що має здатність до зв'язування, щонайменше одне антитіло або фрагмент антитіла, наприклад, Fab, Fab', F(ab')2, Fv або одноланцюговий Fv. Антитіло може являти собою також димер легких ланцюгів або важких ланцюгів або будь-який його мінімальний фрагмент, такий як Fv, або одноланцюгову конструкцію, описану в Ladner та ін., US №4946778, зміст якого спеціально включено в даний опис як посилання. До інших антитіл, які можна застосовувати в біспецифічних молекулах, запропонованих у винаході, відносяться мишачі, химерні і гуманізовані моноклональні антитіла. Біспецифічні молекули, запропоновані в даному винаході, можна одержувати шляхом кон'югації компонентів, що представляють собою такі, що мають здатність до зв'язування специфічності, за допомогою методів, відомих у даній галузі. Наприклад, кожну специфічність біспецифічної молекули, що має здатність до зв'язування, можна створювати окремо і потім кон'югувати одну з одною. Коли специфічності, що мають здатність до зв'язування, являють собою білки або пептиди, для ковалентної кон'югації можна використовувати цілий ряд агентів для зв'язування або перехресного зшивання. Прикладами перехреснозшиваючих агентів є білок A, карбодиімід, N-сукцинімідил-S-ацетилтіоацетат (SATA), 5,5'-дитіобіс(2-нітробензойна кислота) (DTNB), o-фенілендималеімід (oPDM), N-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (SPDP) і сульфосукцинімідил-4-(N-малеімідометил)циклогексан-l-карбоксилат (сульфо-SMCC) (див., наприклад, Karpovsky та ін., J. Exp. Med. 160, 1984, с. 1686; Liu M.A. та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, с. 8648). Інші методи являють собою методи, описані в Paulus, Behring Ins. Mitt. No. 78, 1985, сс. 118-132; Brennan та ін., Science 229, 1985, сс. 81-83) і Glennie та ін., J. Immunol. 139, 1987, сс. 2367-2375). Такі призначені для кон'югації агенти, як SATA і сульфоSMCC, обидва надходять у продаж від фірми Pierce Chemical Co. (Рокфорд, шт. Іллінойс). Коли специфічності, що мають здатність до зв'язування, являють собою антитіла, то їх можна кон'югувати за допомогою сульфгідрильного зв'язку C-кінцевих шарнірних областей двох важких ланцюгів. У конкретному варіанті здійснення винаходу шарнірну область модифікують так, щоб вона до кон'югації містила непарну кількість сульфгідрильних залишків, наприклад, один. В альтернативному варіанті обидві специфічності, що мають здатність до зв'язування, можна кодувати в тому самому векторі та експресувати і збирати в одній і тій же клітині-хазяїні. Цей метод є найдоцільнішим, коли біспецифічна молекула являє собою злитий білок, такий як 28