Композиція та спосіб коригування систематичної похибки ампліфікації в множинних плр-реакціях

Реферат: Винахід стосується композиції для стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, способу визначення нерівномірного потенціалу ампліфікації нуклеїнової кислоти, способу кількісного визначення множин молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, способу обчислення середнього коефіцієнта ампліфікації в аналізі множинної ПЛР-реакції, способу коригування систематичної похибки ампліфікації в одній множинній ПЛР-ампліфікації для молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, а також винахід стосується комплекту, що містить зазначену композицію, та інструкцію з визначення нерівномірного потенціалу ампліфікації нуклеїнової кислоти серед елементів набору елементів нуклеотидних праймерів, здатних до ампліфікації молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, що кодують один або декілька рецепторів адаптивної імунної системи у біологічному зразку, який містить молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти лімфоїдних клітин ссавців. UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки У даній заявці заявляється пріоритет до попередньої заявки на патент США № 61/726,489, поданої 14 листопада 2012 р. та попередньої заявки на патент США № 61/644,294, поданої 8 травня 2012 р., повний опис винаходів за цими заявками у повному обсязі включений у даний документ шляхом посилання та у всіх відношеннях. Передумова винаходу Предмет винаходу Даний винахід загалом стосується кількісного високопродуктивного секвенування ДНК, яка кодує рецептор адаптивної імунної системи (наприклад, ДНК, яка кодує Т-клітинні рецептори (TCR) та імуноглобуліни (IG) у множинних реакціях ампліфікації нуклеїнової кислоти. Зокрема, описані у даному документі композиції та способи дозволяють уникнути небажаних спотворень результатів кількісного аналізу послідовностей, що кодують рецептори адаптивної імунної системи, які (спотворення) можуть виникати внаслідок шкідливого надмірного використання та/або недовикористання специфічних олігонуклеотидних праймерів у множинній ампліфікації ДНК. Опис спорідненого рівня техніки Адаптивна імунна система використовує декілька стратегій для створення спектру Т- та Вклітинних антигенних рецепторів, тобто рецепторів адаптивної імунної системи, різноманітності яких достатньо для розпізнавання великої кількості потенційних патогенів. Здатність Т-клітин до розпізнавання широкого спектру антигенів, асоційованих з різними злоякісними пухлинами або інфекційними організмами, обумовлена наявністю Т-клітинного антигенного рецептора (TCR), що є гетеродимером α (альфа)-ланцюга локусу TCRA та β (бета)-ланцюга локусу TCRB або гетеродимером γ (гамма)-ланцюга локусу TCRG і δ (дельта)-ланцюга локусу TCRD. Білки, які формують дані ланцюги, кодує ДНК, що використовує унікальний механізм перегрупування у лімфоїдних клітинах з метою створення величезної різноманітності TCR. Даний мультисубодиничний імунний рецептор розпізнавання об'єднується з комплексом СD3 та приєднується до пептидів, представлених білками або головним комплексом гістосумісності (MHC) І класу чи MHC ІІ класу на поверхні антигенпрезентуючих клітин (АПК). Зв'язування TCR з антигенним пептидом на АПК — це ключова подія в активації Т-клітин, що відбувається в імунологічному синапсі у точці контакту між Т-клітиною та АПК. Кожний пептид TCR містить варіабельні області, що визначають комплементарність (CDR), каркасні області (FR) та постійну область. Різноманітність послідовностей αβ Т-клітин значною мірою визначається амінокислотною послідовністю петель третьої області (CDR3), що визначає комплементарність, α та β варіабельних доменів ланцюга, різноманітність яких є результатом рекомбінації між сегментами гена варіабельної (Vβ), додаткової (Dβ) і зв'язувальної (Jβ) області в β-локусі ланцюга та між аналогічними сегментами Vα та Jα генів у α-локусі ланцюга, відповідно. Існування великої кількості таких сегментів гена у α і β-локусах ланцюга TCR дозволяє закодувати велику кількість окремих послідовностей CDR3. Різноманітність послідовностей CDR3 зростає ще більше завдяки незалежному доповненню та делеції нуклеотидів у місцях з'єднання Vβ-Dβ, Dβ-Jβ та Vα-Jα під час процесу перегрупування гена TCR. Саме тому імунокомпетентність є наслідком різноманітності TCR. Гетеродимер TCR γδ відрізняється від TCR αβ тим, що він кодує рецептор, який тісно взаємодіє з вродженою імунною системою та розпізнає антиген у незалежний від HLA спосіб. TCRγδ експресує на ранній стадії розвитку і характеризується особливим анатомічним розподілом, унікальною патогенною та низькомолекулярною специфічністю, а також широким спектром вроджених та адаптивних клітинних взаємодій. Відхилення у схемі експресії V- та Jсегментів, що належать до TCRγ, встановлюються на ранній стадії онтогенезу. Отже, наявність широкого спектру TCR γ у зрілих тканинах є результатом широкої периферійної експансії, що виникає внаслідок контакту з патогенами та токсичними молекулами в умовах навколишнього середовища. Імуноглобуліни (Ig, або IG), що у даному документі згадуються як рецептори В клітин (BCR), — це білки, які експресують В-клітини, складаються з чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких ланцюгів (Н-ланцюгів) локусу IGH та двох легких ланцюгів (L-ланцюгів) локусу IGH або IGL, утворюючи при цьому структуру H2L2. Кожний з ланцюгів H і L містить три ділянки, що визначають комплементарність (CDR) і беруть участь у розпізнаванні антигену, а також каркасні області та постійний домен, аналогічний TCR. Н-ланцюги імуноглобулінів спочатку експресуються у вигляді мембран-зв'язаних ізоформ за допомогою екзонів IGD або IGM постійної області, однак після розпізнавання антигену постійна область здатна перемикатися на декілька додаткових ізотипів, у тому числі IGG, IGE та IGA. Як і у випадку з TCR, різноманітність інтактних імуноглобулінів у кожного окремого індивідуума в першу чергу залежить від 1 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гіперваріабельності областей, що визначають комплементарність (CDR). Подібно до TCRB, домен CDR3 Н-ланцюгів утворюється комбінаторним зв'язуванням сегментів гена VH, DH та JH. Різноманітність послідовностей гіперваріабельного домену зростає ще більше завдяки незалежним доповненню та делеції нуклеотидів у місцях з'єднання V H-DH, DH-JH та VH-JH під час процесу перегрупування генів Ig. На відміну від TCR, різноманітність послідовності Ig ще більше зростає внаслідок соматичної гіпермутації (СГМ) усього перегрупованого гена IG після того, як інтактна В-клітина вперше розпізнала антиген. Процес СГМ не обмежується лише CDR3, а тому може внести зміни у каркасні області послідовності зародкової лінії, CDR1 та CDR2, а також у соматично перегруповану CDR3. Оскільки функціонування адаптивної імунної системи частково забезпечується клональною експансією клітин, що експресують унікальні TCR та BCR, точне вимірювання змін у загальній чисельності кожного клону Т- або В-клітин є дуже важливим для розуміння динаміки адаптивної імунної відповіді. Наприклад, здорова людина має декілька мільйонів унікальних перегрупованих ланцюгів TCRβ, кожен з яких переносить сотні або навіть тисячі клональних Тклітин. Для порівняння: всього у здоровому організмі міститься приблизно трильйон Т-клітин. Завдяки досягненням високопродуктивного секвенування нещодавно виник новий напрямок молекулярної імунології, спрямований на дослідження широкого спектру TCR та BCR. Композиції та способи секвенування перегрупованих послідовностей генів рецепторів адаптивної імунної системи і визначення клонотипу рецептора адаптивної імунної системи описані у заявці на патент США № 13/217,126; заявка на патент США № 12/794,507; PCT/US2011/026373 та PCT/US2011/049012, які у повному обсязі включені у даний документ шляхом посилання. Дотепер застосовували декілька різних способів кількісного секвенування нуклеїнових кислот, що кодують рецептори адаптивної імунної системи з високою продуктивністю, дані стратегії розрізняють, наприклад, за способом, що використовується для ампліфікації CDR3кодуючих областей, та вибором геномної ДНК (гДНК) чи матричної РНК (мРНК), що секвенується. Секвенування мРНК є потенційно простішим способом, ніж секвенування гДНК, оскільки під час сплайсингу мРНК відбувається видалення інтронів між сегментами J та С. Це дозволяє при ампліфікації рецепторів адаптивної імунної системи (наприклад, TCR або Ig) отримати різні Vта J-області, використовуючи звичайний 3' ПЛР-праймер в області С. Наприклад, у кожному TCRβ довжина всіх тринадцяти J-сегментів менша, ніж 60 пар нуклеотидів (bp). Таким чином, сплайсинг дозволяє отримати ідентичні нуклеотидні послідовності, що кодують постійні області TCRβ (незалежно від того, які V- та J-послідовності застосовують), довжиною до 100 пар нуклеотидів перегрупованого з'єднання VDJ. Молекулу мРНК, що зазнала сплайсингу, далі можна зворотно транскрибувати у комплементарну ДНК (кДНК) за допомогою праймерів поліdT, комплементарних до хвоста полі-А мРНК, випадкових невеликих праймерів (зазвичай гексамерів чи нонамерів) або олігонуклеотидів, специфічних до С-сегментів. Таким чином отримують об'єктивну бібліотеку TCR кДНК (оскільки праймером для всіх кДНК був один і той самий олігонуклеотид — чи то полі-dT, чи випадковий гексамер, чи олігомер, специфічний до Cсегментів), які потім можна секвенувати для отримання інформації про сегмент V та J, використаний для кожного перегрупування, а також специфічної послідовності CDR3. При такому секвенуванні можна застосувати як технологію зчитування довгих ділянок CDR3 без дроблення, так і спосіб дробовика, при якому для роботи з довшими послідовностями використовують фрагментовані бібліотеки та високопродуктивні коротші послідовності зчитування. Однак дії, спрямовані на підрахунок кількості клітин у зразку, що експресують конкретний перегрупований TCR (або Ig) на основі секвенування мРНК, важко інтерпретувати, оскільки кожна клітина потенційно експресує різну кількість TCR мРНК. Наприклад, активовані in vitro Tклітини містять у 10–100 разів більше мРНК на кожну клітину, ніж неактивні Т-клітини. На сьогодні існує дуже обмежена інформація стосовно відносної кількості TCR мРНК у Т-клітинах за різних функціональних станів, і тому підрахунок загальної кількості мРНК не завжди дозволяє визначити точну кількість клітин, що переносять кожне клональне перегрупування TCR. З іншого боку, більшість Т-клітин має один продуктивно перегрупований ген TCRα та один продуктивно перегрупований ген TCRβ (або два перегрупованих гени TCRα та TCRβ); більшість В-клітин має один продуктивно перегрупований ген Ig важкого ланцюга та один продуктивно перегрупований ген Ig легкого ланцюга (IGK або IGL). Таким чином, кількісне визначення у зразку геномної ДНК, що кодує TCR чи BCR, повинно безпосередньо корелювати з кількістю клітин Т або В у зразку. Геномне секвенування полінуклеотидів, що кодують один або більше ланцюгів рецепторів адаптивної імунної системи, має супроводжуватися ампліфікацією з 2 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 однаковою ефективністю для всіх можливих перегрупованих послідовностей CDR3, що присутні в зразку, який містить ДНК із лімфоїдних клітин об'єкта. Далі відбувається кількісне секвенування, в результаті якого можна виконати кількісне вимірювання відносної чисельності кожного перегрупованого клонотипу CDR3. Однак такі способи наштовхуються на певні труднощі: не одразу вдається досягти однакової ефективності ампліфікації та секвенування для кожного перегрупованого клону з використанням множинної ПЛР-реакції. Наприклад, у TCRB кожен клон використовує один із 54 можливих генів, що кодують V-область-зародкової лінії та один із 13 можливих генів, що кодують J-область. Для створення різноманітного адаптивного імунного спектру послідовності ДНК V- та J-сегментів обов'язково мають бути різними. Така різноманітність послідовностей робить неможливим створення єдиної, універсальної послідовності праймерів, що гібридизуватиме до всіх Vсегментів (або сегментів J) з однаковою афінністю, та продукує зразки комплексів ДНК, в яких точно визначити багато різних послідовностей заважають певні технічні обмеження щодо можливості одночасного кількісного підрахунку множини типів молекул за допомогою множинної ампліфікації та високопродуктивного секвенування. Один або декілька факторів можуть зумовити появу артефактів, що спотворюють кореляцію між даними секвенування та кількістю копій вихідного клонотипу. У такому випадку ставиться під загрозу можливість отримати надійні кількісні дані за допомогою способів секвенування, що ґрунтуються на множинній ампліфікації дуже різноманітної сукупності матриць гена TCRβ. Ці артефакти часто виникають внаслідок неоднакового використання різноманітних праймерів на етапі множинної ампліфікації. Таке хибне використання одного або більше олігонуклеотидних праймерів у множинній реакції з різними матрицями ампліфікації може виникнути як функція диференційної кінетики гібридизації внаслідок однієї або більше відмінностей у нуклеотидній основі композиції матриць і/або олігонуклеотидних праймерів, різниці довжини матриць і/або праймерів, зокрема полімерази, яку використовують, температур реакції ампліфікації (наприклад, температури гібридизації, розтягу та/або денатурації) та/або інших факторів (див., наприклад, Kanagawa, 2003 р. J. Biosci. Bioeng. 96:317; Day et al., 1996 р. Hum. Mol. Genet. 5:2039; Ogino et al., 2002 р. J. Mol. Diagnost. 4:185; Barnard et al., 1998 р. Biotechniques 25:684; Aird et al., 2011 р. Genome Biol. 12:R18). Очевидно, що і надалі є потреба у покращених композиціях і способах, які б дозволяли проводити точне кількісне визначення рецепторів адаптивної імунної системи, які кодуються різноманітними послідовностями ДНК у складних зразках. Такі операції кількісного визначення не повинні допускати викривлень результатів, наприклад, надмірної або недостатньої представленості окремих послідовностей внаслідок відхилень ампліфікації специфічних матриць у наборі олігонуклеотидних праймерів, які використовують для множинної ампліфікації складної популяції матричної ДНК. Описаний у даному документі варіант втілення винаходу відповідає цій потребі та забезпечує інші відповідні переваги. Суть винаходу Композиція для стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, що здатний ампліфікувати молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти, які кодують один або більше рецепторів адаптивної імунної системи у біологічному зразку, який містить перегруповані молекули нуклеїнових кислот лімфоїдних клітин ссавців, кожний рецептор адаптивної імунної системи містить варіабельну та зв'язувальну області, композиція містить множину матричних олігонуклеотидів, які мають множину олігонуклеотидних послідовностей загальної формули: 5’-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3" [I], де: (а) V — полінуклеотид, що містить принаймні 20, але не більше 1000 суміжних нуклеотидів послідовності гена, що кодує варіабельну область (V) рецепторів адаптивної імунної системи, або його комплемент, та кожен V-полінуклеотид містить унікальну олігонуклеотидну послідовність; (b) J — полінуклеотид, що містить принаймні 15, але не більше 600 суміжних нуклеотидів послідовності гена, що кодує з'єднувальну область (J) рецепторів адаптивної імунної системи, або його комплемент, та кожен J-полінуклеотид містить унікальну олігонуклеотидну послідовність; (c) U1 нічого не містить або містить олігонуклеотидну послідовність, обрану з (і) першої універсальної адаптерної олігонуклеотидної послідовності та (іі) першої специфічної до секвенуючої платформи олігонуклеотидної послідовності, з'єднаної та розташованої у позиції 5' відносно першої універсальної адаптерної олігонуклеотидної послідовності; (d) U2 нічого не містить або містить олігонуклеотидну послідовність, вибрану з (і) другої універсальної адаптерної олігонуклеотидної послідовності та (іі) другої специфічної до секвенуючої платформи олігонуклеотидної послідовності, з'єднаної та розташованої у позиції 5" відносно другої універсальної адаптерної олігонуклеотидної послідовності; (е) B1, B2, B3 та B4: кожний окремо нічого не містить або кожний містить олігонуклеотид В, що містить послідовність штрих-коду із 3–25 суміжних 3 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидів, де кожен з В1, В2, В3 та В4 містить олігонуклеотидну послідовність, яка ідентифікується виключно як парна комбінація: (і) унікальна V-олігонуклеотидна послідовність (a) та (іі) унікальна J-олігонуклеотидна послідовність (b); (f) R нічого не містить або містить сайт розпізнавання рестриктази і містить олігонуклеотидну послідовність, яка відсутня у (а)–(е), (g) множина матричних олігонуклеотидів, що містить принаймні а або b унікальних олігонуклеотидних послідовностей, в залежності від того, яке з цих значень є більшим, де a — кількість сегментів гена, що кодує V-область унікального рецептора адаптивної імунної системи в об'єкті, b — кількість сегментів гена, що кодує J-область унікального рецептора адаптивної імунної системи в об'єкті, та композиція містить принаймні один матричний олігонуклеотид для кожного унікального V-полінуклеотиду та принаймні один матричний олігонуклеотид для кожного унікального J-полінуклеотиду. В одному варіанті втілення a знаходиться в межах від 1 до максимального числа сегментів V-гена у геномі ссавців. В іншому варіанті втілення b знаходиться в межах від 1 до максимального числа сегментів J-гена у геномі ссавців. В усіх інших варіантах втілення a=1 або b=1. У деяких варіантах втілення множина матричних нуклеотидів містить принаймні а x b унікальних олігонуклеотидних послідовностей, де а — кількість унікальних сегментів гена, що кодує V-область унікального рецептора адаптивної імунної системи у ссавців; b — кількість унікальних сегментів гена, що кодує J-область унікального рецептора адаптивної імунної системи у ссавців, та композиція містить принаймні один матричний олігонуклеотид для кожної можливої комбінації сегмента гена, що кодує V-область, та сегмента гена, що кодує J-область. В одному варіанті втілення J містить постійну область послідовності гена, що кодує J-область рецептора адаптивної імунної системи. В іншому варіанті втілення рецептор адаптивної імунної системи обирається з групи, що складається з TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK та IGL. У деяких варіантах втілення Vполінуклеотид із (а) кодує рецептор TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK або IGL поліпептиду V-області. В інших варіантах J полінуклеотид із (b) кодує рецептор TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK або IGL поліпептиду J-області. Деякі варіанти втілення передбачають наявність термінуючого кодона між V та B2. В одному з варіантів втілення кожний матричний олігонуклеотид у множині матричних олігонуклеотидів присутній у по суті еквімолярній кількості. В іншому варіанті втілення множина матричних олігонуклеотидів має множину послідовностей загальної формули (I), що обирають з: (1) множини олігонуклеотидних послідовностей загальною формулою (І), де V- та Jполінуклеотиди мають послідовності TCRB V та J, викладені у принаймні одному наборі з 68 TCRB V та J SEQ ID NO на Фіг. 5a–5l як набір 1 TCRB V/J, набір 2 TCRB V/J, набір 3 TCRB V/J, набір 4 TCRB V/J, набір 5 TCRB V/J, набір 6 TCRB V/J, набір 7 TCRB V/J, набір 8 TCRB V/J, набір 9 TCRB V/J, набір 10 TCRB V/J, набір 11 TCRB V/J, набір 12 TCRB V/J та набір 13 TCRB V/J; (2) множини олігонуклеотидних послідовностей загальної формули (І), де V- та Jполінуклеотиди мають послідовності TCRG V та J, викладені у принаймні одному наборі з 14 TCRG V та J SEQ ID NO на Фіг. 6a та 6b як набір 1 TCRG V/J, набір 2 TCRG V/J, набір 3 TCRG V/J, набір 4 TCRG V/J та набір 5 TCRG V/J; (3) множини олігонуклеотидних послідовностей загальної формули (І), де V- та J-полінуклеотиди мають послідовності TCRB V та J, викладені у принаймні одному наборі з 127 IGH V та J, SEQ ID NO на Фіг. 7a–7m як набір 1 IGH V/J, набір 2 IGH V/J, набір 3 IGH V/J, набір 4 IGH V/J, набір 5 IGH V/J, набір 6 IGH V/J, набір 7 IGH V/J, набір 8 IGH V/J та набір 9 IGH V/J; (4) множини олігонуклеотидних послідовностей загальної формули (І), як викладено у SEQ ID NO: 3157–4014; (5) множини олігонуклеотидних послідовностей загальної формули (І), як викладено у SEQ ID NO: 4015–4084; (6) множини олігонуклеотидних послідовностей загальної формули (І), як викладено у SEQ ID NO: 4085–5200; (7) множини олігонуклеотидних послідовностей загальної формули (І), як викладено у SEQ ID NO: 5579– 5821; (8) множини олігонуклеотидних послідовностей загальної формули (І), як викладено у SEQ ID NO: 5822–6066; та (9) множини олігонуклеотидних послідовностей із загальною формулою (І), представленою в SEQ ID NO: 6067–6191. У деяких варіантах втілення V є полінуклеотидом, що містить принаймні 30, 60, 90, 120, 150, 180 або 210 суміжних нуклеотидів послідовності гена, що кодує V-область рецептора адаптивної імунної системи, або його комплемент. В іншому варіанті втілення V є полінуклеотидом, що містить не більше, ніж 900, 800, 700, 600 або 500 суміжних нуклеотидів суміжних нуклеотидів послідовності гена, що кодує V-область рецептора адаптивної імунної системи, або його комплемент. В інших варіантах втілення J є полінуклеотидом, що містить принаймні 16–30, 31–60, 61–90, 91–120 або 120–150 суміжних нуклеотидів послідовності гена, що кодує J-область рецептора 4 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 адаптивної імунної системи, або його комплемент. В іншому варіанті втілення J є полінуклеотидом, що містить не більше, ніж 500, 400, 300 або 200 суміжних нуклеотидів послідовності гена, що кодує J-область рецептора адаптивної імунної системи, або його комплемент. У деяких варіантах втілення кожен матричний олігонуклеотид має довжину менше, ніж 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 або 200 нуклеотидів. В інших варіантах втілення композиція включає набір олігонуклеотидних праймерів, здатних до ампліфікації молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, які кодують один або більше рецепторів адаптивної імунної системи, що містять множину а" унікальних олігонуклеотидних праймерів V-сегмента та множину b" унікальних олігонуклеотидних праймерів J-сегмента. У деяких варіантах втілення a" знаходиться в межах від 1 до максимальної кількості сегментів Vгена у геномі ссавців, а b" знаходиться в межах від 1 до максимальної кількості сегментів J-гена у геномі ссавців. В одному варіанті втілення a" — це a. В іншому варіанті втілення b" — це b. У ще одному варіанті втілення кожен олігонуклеотидний праймер V-сегмента та кожен олігонуклеотидний праймер J-сегмента в наборі олігонуклеотидних праймерів здатен до специфічної гібридизації до принаймні одного матричного олігонуклеотиду у множині матричних олігонуклеотидів. В інших варіантах кожен олігонуклеотидний праймер V-сегмента містить послідовність принаймні з 15 суміжних нуклеотидів, що є комплементарними до принаймні одного сегмента гена, що кодує V-область рецептора адаптивної імунної системи. В іншому варіанті втілення кожен олігонуклеотидний праймер J-сегмента містить послідовність принаймні з 15 суміжних нуклеотидів, що є комплементарними до принаймні одного сегмента гена, що кодує J-область рецептора адаптивної імунної системи. В інших варіантах втілення композиція містить принаймні один матричний олігонуклеотид, що має послідовність олігонуклеотидів загальної формули (І), з якою може специфічно гібридизувати кожен олігонуклеотидний праймер V-сегмента, та принаймні один матричний олігонуклеотид з послідовністю олігонуклеотидів загальної формули (І), до якої може специфічно гібридизувати кожен олігонуклеотидний праймер J-сегмента. Винахід містить спосіб визначення нерівномірного потенціалу ампліфікації нуклеїнової кислоти серед елементів набору олігонуклеотидних праймерів, здатних до ампліфікації молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, які кодують один або більше рецепторів адаптивної імунної системи у біологічному зразку, що містить молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти лімфоїдних клітин ссавців. Даний спосіб включає етапи для: (а) ампліфікації композиції в ПЛРреакції, як описано у даному документі, з метою отримання множини ампліфікованих матричних олігонуклеотидів; (b) секвенування вказаної множини ампліфікованих матричних нуклеотидів для визначення для кожного унікального матричного нуклеотиду, що містить вказану множину, (і) послідовності матричних олігонуклеотидів та (іі) частоти випадків вказаної послідовності матричних нуклеотидів; (с) порівняння частоти випадків послідовностей кожного вказаного матричного нуклеотиду з очікуваним розподілом, який ґрунтується на заздалегідь визначених молярних співвідношеннях даної множини матричних олігонуклеотидів, що містять вказану композицію, та де відхилення між вказаною частотою випадків вказаних послідовностей матричних олігонуклеотидів та вказаним очікуваним розподілом свідчить про наявність нерівномірного потенціалу ампліфікації серед елементів набору олігонуклеотидних праймерів ампліфікації. В одному з варіантів втілення задані молярні співвідношення є еквімолярними. В іншому варіанті очікуваний розподіл містить рівномірний рівень ампліфікації для вказаного набору матричних олігонуклеотидів, ампліфікованих за участю вказаного набору олігонуклеотидних праймерів. В іншому варіанті втілення кожний матричний олігонуклеотид є завдовжки менше, ніж 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80 або 70 нуклеотидів. Спосіб включає в себе етапи, які, для кожного елементу набору олігонуклеотидних праймерів, що представляє нерівномірний потенціал ампліфікації відносно очікуваного розподілу, містять регуляцію відносного представництва елементів олігонуклеотидних праймерів у наборі олігонуклеотидних праймерів ампліфікації. В одному варіанті втілення регуляція містить підвищення відносного представництва елементів набору олігонуклеотидних праймерів, таким чином відбувається корекція нерівномірного потенціалу ампліфікації нуклеїнових кислот серед елементів набору олігонуклеотидних праймерів. В іншому варіанті втілення регуляція містить зниження відносного представництва елементів набору олігонуклеотидних праймерів, таким чином відбувається корекція нерівномірного потенціалу ампліфікації нуклеїнових кислот серед елементів набору олігонуклеотидних праймерів. 5 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В інших варіантах втілення набір олігонуклеотидних праймерів не включає олігонуклеотидні праймери, специфічно гібридизовані до псевдогену V-області чи орфона, або псевдогену Jобласті чи орфона. Даний спосіб також включає в себе наступні етапи, які, для кожного елементу набору олігонуклеотидних праймерів, що має нерівномірний потенціал ампліфікації відносно очікуваного розподілу, містять розрахунок пропорційного зростання або зменшення частоти випадків ампліфікованих матричних молекул нуклеїнових кислот, ампліфікації яких сприяють вказані елементи, таким чином відбувається корекція нерівномірного потенціалу ампліфікації нуклеїнових кислот серед елементів набору олігонуклеотидних праймерів. Винахід включає спосіб кількісного визначення множини молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, що кодують один або множину рецепторів адаптивної імунної системи у біологічному зразку, який містить молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти лімфоїдних клітин ссавців, кожен рецептор адаптивної імунної системи містить варіабельну (V) область та зв'язувальну (J) область, даний спосіб містить: (А) ампліфікацію молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти в множинній полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР), яка містить: (1) молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти з біологічного зразка, який містить лімфоїдні клітини ссавця; (2) композицію матриці, як описано у даному документі, у якій присутня відома кількість кожного з множини матричних олігонуклеотидів, що мають унікальну олігонуклеотидну послідовність, (3) набір олігонуклеотидних праймерів ампліфікації, здатний ампліфікувати молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти, що кодує один або множину рецепторів адаптивної імунної системи з біологічного зразка. У деяких варіантах втілення набір праймерів містить: (а) у по суті еквімолярних кількостях множину олігонуклеотидних праймерів V-сегмента, кожен з яких незалежно здатний до специфічної гібридизації до принаймні одного полінуклеотиду, що кодує поліпептид V-області рецептора адаптивної імунної системи, або до його комплемента, де кожен праймер V-сегмента містить нуклеотидну послідовність із принаймні 15 суміжних нуклеотидів, комплементарну до принаймні одного функціонального сегмента гена, що кодує V-область рецептора адаптивної імунної системи, та, де множина праймерів V-сегмента специфічно гібридизує по суті зі всіма присутніми в композиції функціональними сегментами гена, що кодує V-область рецептора адаптивної імунної системи, та (b) у по суті еквімолярних кількостях, множину олігонуклеотидних праймерів J-сегмента, кожен з яких незалежно здатний до специфічної гібридизації до принаймні одного полінуклеотиду, що кодує поліпептид J-області рецептора адаптивної імунної системи, або до його комплемента, де кожен праймер J-сегмента містить нуклеотидну послідовність із принаймні 15 суміжних нуклеотидів, комплементарну до принаймні одного функціонального сегмента гена, що кодує J-область рецептора адаптивної імунної системи, та, де множина праймерів J-сегмента специфічно гібридизує по суті зі всіма присутніми в композиції функціональними сегментами гена, що кодує J-область рецептора адаптивної імунної системи, В іншому варіанті втілення олігонуклеотидні праймери V-сегмента та J-сегмента здатні стимулювати ампліфікацію у вказаній множинній полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) (і) по суті всіх матричних нуклеотидів у композиції для продукції множини ампліфікованих матричних нуклеотидів, вказана множина ампліфікованих матричних молекул нуклеїнової кислоти є достатньою для кількісної оцінки різноманітності матричних олігонуклеотидів у композиції; та (іі) по суті всіх молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, що кодують рецептори адаптивної імунної системи у біологічному зразку для продукції множини ампліфікованих молекул перегрупованих ДНК, де вказаної множини ампліфікованих матричних молекул нуклеїнової кислоти достатньо для кількісної оцінки різноманітності молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти у ДНК із біологічного зразка. В одному з варіантів втілення кожна ампліфікована молекула нуклеїнової кислоти в множині ампліфікованих матричних олігонуклеотидів та в множині ампліфікованих молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти має довжину менше 1000 нуклеотидів; (В) кількісне секвенування вказаних ампліфікованих матричних олігонуклеотидів та вказаних ампліфікованих молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти для підрахунку (і) кількості матричного продукту ампліфікованих матричних олігонуклеотидів, що містять принаймні одну олігонуклеотидну послідовність штрих-коду, та (іі) кількості перегрупованого продукту ампліфікованих молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, які не мають олігонуклеотидної послідовності штрих-коду; (С) обчислення коефіцієнта ампліфікації шляхом ділення кількості матричного продукту (В) (і) на відому кількість кожної множини матричних олігонуклеотидів, що мають унікальну олігонуклеотидну послідовність (А)(2); та (D) ділення кількості перегрупованого продукту (В)(іі) 6 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на коефіцієнт ампліфікації, обчислений у (С), для визначення у зразку кількості унікальних молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, що кодують рецептор адаптивної імунної системи. В інших варіантах втілення підрахована кількість унікальних рецепторів адаптивної імунної системи, що кодують молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти у зразку, — це кількість унікальних матриць геному Т- або В-клітин у зразку. Винахід включає спосіб розрахунку середнього коефіцієнта ампліфікації у множинній ПЛРреакції, що містить: отримання біологічного зразка з молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти з лімфоїдних клітин ссавців; контактування вказаного зразка з відомою кількістю матричних олігонуклеотидів, які містять композицію, як описано у даному документі; ампліфікацію матричних олігонуклеотидів та молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти з лімфоїдних клітин ссавців у множинній ПЛР-реакції з метою отримання множини ампліфікованих матричних олігонуклеотидів та множини молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти; секвенування вказаної множини ампліфікованих матричних нуклеотидів для визначення для кожного унікального матричного нуклеотиду, що містить вказану множину, (і) послідовності матричних олігонуклеотидів та (іі) частоти випадків вказаної послідовності матричних нуклеотидів; та визначення середнього коефіцієнта ампліфікації для вказаної множинної ПЛР-реакції на основі середнього числа копій вказаної множини ампліфікованих матричних олігонуклеотидів і вказаної відомої кількості матричних олігонуклеотидів. Спосіб також включає секвенування вказаної множини ампліфікованих молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти лімфоїдних клітин ссавців для визначення для кожного унікального матричного нуклеотиду, який входить до складу цієї множини, (і) послідовності молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти та (іі) частоти випадків вказаної послідовності молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти; та визначення числа лімфоїдних клітин у вказаному зразку на основі показника середнього коефіцієнта ампліфікації для вказаної ПЛРреакції і вказаної частоти випадків вказаної послідовності молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти. В інших варіантах втілення спосіб містить визначення кількості лімфоїдних клітин у вказаному зразку, що містить отримання суми випадків кожної із вказаних послідовностей ампліфікованої перегрупованої нуклеїнової кислоти та ділення вказаної отриманої суми на вказаний середній коефіцієнт ампліфікації. У деяких варіантах втілення відома кількість є однією копією кожного з вказаних матричних олігонуклеотидів. В одному варіанті втілення 100 ≤ a ≤ 500. В іншому варіанті втілення 100 ≤ b ≤ 500. Пропонується спосіб для корекції систематичної похибки ампліфікації, в множинній ПЛРампліфікації з метою кількісного визначення молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, що кодують один або множину рецепторів адаптивної імунної системи у біологічному зразку, який містить молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти лімфоїдних клітин ссавців, що містить: (а) контактування вказаного зразка з описаною у даному документі композицією для отримання зразка з відомою кількістю доданої матриці; де вказані матриці та вказані молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти містять відповідні послідовності областей V та J; (b) ампліфікацію вказаного зразка з відомою кількістю доданої матриці у множинній ПЛР-реакції з метою отримання множини ампліфікованих матричних олігонуклеотидів та множини ампліфікованих молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, що кодують множину рецепторів адаптивної імунної системи; (с) секвенування вказаної множини ампліфікованих матричних нуклеотидів для визначення для кожного унікального матричного нуклеотиду, який містить вказану множину, (і) послідовності матричних олігонуклеотидів та (іі) частоти випадків вказаної послідовності матричних нуклеотидів; (d) секвенування вказаної множини ампліфікованих молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, що кодує один або множину рецепторів адаптивної імунної системи, для кожної унікальної перегрупованої молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує вказану множину рецепторів адаптивної імунної системи, що містить вказану множину, (і) послідовність молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти та (іі) частоту випадків вказаної послідовності молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти; (e) порівняння частоти випадків вказаних послідовностей матричного олігонуклеотиду з очікуваним розподілом, який ґрунтується на заздалегідь визначених молярних співвідношеннях вказаної множини матричних олігонуклеотидів, що містять вказану композицію; та де відхилення між вказаною частотою випадків вказаних послідовностей матричних олігонуклеотидів та вказаним очікуваним розподілом свідчить про нерівномірність потенціалу ампліфікації нуклеїнової кислоти серед елементів набору праймерів ампліфікації олігонуклеотидів; (f) створення набору значень поправок для набору молекул матриці та послідовностей молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, ампліфікація яких проходила за участю вказаних елементів набору олігонуклеотидних праймерів ампліфікації, які мають вказаний нерівномірний потенціал ампліфікації нуклеїнової 7 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислоти, де вказаний набір значень поправок призначений для корекції відхилення ампліфікації у вказаній множинній ПЛР-реакції; та (g) за необхідності застосування вказаного набору значень поправок до вказаної частоти випадків вказаних послідовностей молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти з метою корекції відхилення ампліфікації у вказаній множинній ПЛР-реакції. Винахід містить комплект, що включає реагенти, які містять композицію, що містить множину матричних олігонуклеотидів та набір олігонуклеотидних праймерів, як описано у даному документі; інструкції з визначення нерівномірного потенціалу ампліфікації нуклеїнової кислоти серед елементів набору олігонуклеотидних праймерів, здатних до ампліфікації молекул перегрупованої нуклеїнової кислоти, що кодують один або більше рецепторів адаптивної імунної системи у біологічному зразку, який містить молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти лімфоїдних клітин ссавців. В іншому варіанті втілення комплект містить інструкції щодо корекції одного або більше елементів набору олігонуклеотидних праймерів, які мають нерівномірний потенціал ампліфікації нуклеїнової кислоти. В інших варіантах втілення комплект містить інструкції з визначення кількості унікальних рецепторів адаптивної імунної системи, які кодують молекули перегрупованої нуклеїнової кислоти у зразку. Ці та інші аспекти описаних у цьому документі варіантів втілення винаходу стануть очевидними після перегляду детального опису та рисунків, що додаються. Усі патенти США, опубліковані заявки на патент США, заявки на патент США, іноземні патенти, заявки на іноземні патенти та безпатентні публікації, на які є посилання у даній специфікації та/або перелічені в інструкції з використання, у повному обсязі включено у даний документ шляхом посилання, так, якби кожен з них було включено окремо. За необхідності аспекти та варіанти втілення винаходу можна змінити з метою застосування концепцій різних патентів, заявок і публікацій для того, щоб отримати інші варіанти втілення. Короткий опис кількох проекцій рисунків Вказані у даному документі та інші особливості, ознаки і переваги цього винаходу стануть краще зрозумілими при розгляді наведеного нижче опису та супровідних рисунків, де: Фігура (Фіг.) 1 — схематичне зображення зразка матричного олігонуклеотиду для використання у стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, здатного ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує рецептор адаптивної імунної системи (TCR або BCR). U1, U2 — універсальні адаптерні олігонуклеотиди; В1–4 — олігонуклеотиди штрих-коду; V — варіабельна область олігонуклеотиду; J — зв'язувальна область олігонуклеотиду; R — сайт розпізнання рестриктази; S — опціональний термінуючий кодон. Фіг. 2 — постампліфікаційні частотності індивідуальних послідовностей сегментів V-гена TCRB, ампліфікованих зі стандартизуючої композиції матриць олігонуклеотидів (еквімолярний пул матриць викладений у SEQ ID NO: 872–1560 з використанням еквімолярного (нескоректованого) об'єднання праймерів 52 PCR (SEQ ID NO: 1753–1804) і кількісно секвенованих на секвенаторі ДНК Illumina HiSeq™. Обчислена частотність при відсутності відхилень дорівнює 0,0188. Фіг. 3 — результати кількісного секвенування після перехресної ампліфікації матричних олігонуклеотидів з використанням специфічних для V-області TCRB праймерів. Вісь Y означає індивідуальні праймери ампліфікації (SEQ ID NO: 1753–1804), які були присутні у кожній окремій реакції ампліфікації при подвоєній молярній концентрації (2Х) інших праймерів з того ж самого набору праймерів для ампліфікації стандартизуючої композиції матричних олігонуклеотидів (еквімолярний пул матриць викладений у SEQ ID NO: 872–1560); Вісь Х не позначена, проте точки графіку представлені у тому ж порядку, що і на осі Y, при цьому на осі Х показано відповідні ампліфіковані матриці гену V, як це було визначено кількісним секвенуванням. Чорні прямокутники показують відсутність змін ступеня ампліфікації з відповідним праймером, наявним у подвійній концентрації відносно еквімолярних концентрацій усіх інших праймерів; білі прямокутники вказують на 10-кратне збільшення ампліфікації; сірі прямокутники вказують на проміжні рівні (різні градації сірого) ампліфікації — між нулем та 10-кратним збільшенням. Діагональна лінія білих прямокутників вказує на те, що подвійна концентрація для заданого праймера викликає приблизно 10-кратне збільшення ампліфікації відповідної матриці для більшості праймерів. Білі прямокутники поза діагоналлю вказують на невідповідні матриці, до яких певні праймери були спроможні гібридизувати та ампліфікувати. Фіг. 4 — постампліфікаційні частотності індивідуальних послідовностей сегментів V-гена TCRB, ампліфікованих зі стандартизуючої композиції матриць олігонуклеотидів (еквімолярний пул матриць викладений у SEQ ID NO: 872–1560) з використанням еквімолярних концентрацій усіх елементів набору праймерів ампліфікації TCRB (SEQ ID NO: 1753–1804) до коригування 8 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 систематичної похибки утилізації праймерів (чорні стовпчики: усі праймери V-області присутні в еквімолярній концентрації) і також із застосуванням того ж набору праймерів (SEQ ID NO: 1753– 1804) після коригування концентрацій множини індивідуальних праймерів з метою компенсації похибок (сірі стовпчики: концентрації високоефективних праймерів зменшилися, а концентрації малоефективних праймерів, навпаки, збільшилися; див. Таблицю 6). Постампліфікаційні частотності визначалися за допомогою кількісного секвенування на секвенаторі ДНК Illumina HiSeq™. Фіг. 5а–5l показують набори TCRB V/J (68 V+13 J) для використання у композиціях матриці, які містять множину олігонуклеотидних послідовностей загальної формули 5’-U1-B1-V-B2-R-B3J-B4-U2-3" [I], з метою застосування у стандартизуванні ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, здатного ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує один або множину ланцюгових поліпептидів T-клітинного рецептора β (TCRB) людини. Фіг. 6а та 6b показують набори TCRB V/J (14 V+5 J) для використання у композиціях матриці, які містять множину олігонуклеотидних послідовностей загальної формули 5’-U1-B1-V-B2-R-B3J-B4-U2-3" [I], з метою застосування у стандартизуванні ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, здатного ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує один або множину ланцюгових поліпептидів T-клітинного рецептора γ (TCRG) людини. Фіг. 7а–7m показують набори IGH V/J (127 V+9 J) для використання у композиціях матриці, які містять множину олігонуклеотидних послідовностей із загальною формулою 5’-U1-B1-V-B2R-B3-J-B4-U2-3" [I], з метою застосування у стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, здатного ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує один або множину важких ланцюгових поліпептидів імуноглобуліну людини (IGH). Фіг. 8 демонструє результати розрахунку коефіцієнта ампліфікації для кожної пари VJ у композиції матриці, доданій до множинної ПЛР-реакції ампліфікації послідовностей IGH, і з подальшим виконанням усереднення коефіцієнта ампліфікації серед усіх синтетичних матриць з метою оцінки кратності охоплення послідовності всіх молекул синтетичної матриці. Фіг. 9 показує порівняння кількості В-клітин, проаналізованих за допомогою синтетичної композиції матриці та коефіцієнта ампліфікації, як описано у даному документі, з відомою кількістю В-клітин, що використовувалися як джерело природних матриць ДНК. Фіг. 10 демонструє кількісні показники секвенування перед виконанням ПЛР ампліфікації для кожної з 1116 контролюючих систематичну похибку молекул IGH VJ та 243 контролюючі систематичну похибку молекули IGH DJ. Фіг. 11 показує ітерації праймера TCRB для синтетичних матриць TCRB VJ, графічно зображених в залежності від відносної систематичної похибки ампліфікації. Фіг. 12 показує ітерації праймерa IGH для синтетичних матриць IGH VJ, графічно зображених в залежності від відносної систематичної похибки ампліфікації. Фіг. 13 показує відносну систематичну похибку ампліфікації, для 27 синтетичних матриць IGH DJ V-гена. Фіг. 14а–d показують ітерації праймера TCRG для 55 синтетичних матриць TCRG VJ. Відносна систематична похибка ампліфікації, була визначена для праймерів TCRG VJ перед контрольним хімічним коригуванням похибки (Фіг. 14а), першою ітерацією хімічного коригування (Фіг. 14b), другою ітерацією хімічного коригування (Фіг. 14c) і кінцевою ітерацією хімічного коригування (Фіг. 14d). Детальний опис винаходу Цей винахід забезпечує, у певних варіантах втілення та згідно наданого в цьому документі опису, композиції та способи, які можна успішно застосовувати для надійного підрахунку великих і різноманітних за структурою популяцій перегрупованих генів, кодуючих рецептори адаптивної імунної системи, наприклад, імуноглобуліни (Ig) та/або рецептори Т-клітин (TCR). Ці перегруповані гени можуть бути присутні у біологічному зразку, що містить ДНК лімфоїдних клітин суб'єкта або біологічного джерела, зокрема людини. "Молекула перегрупованої нуклеїнової кислоти" в контексті даного документа може включати будь-яку геномну ДНК, кДНК або мДНК, отриману безпосередньо чи опосередковано з лінії лімфоїдних клітин, що включає послідовності, які кодують перегрупований рецептор адаптивної імунної системи. У даному документі розкриті несподівано корисні підходи до стандартизації та калібрування складних наборів олігонуклеотидних праймерів, що використовуються у множинних реакціях ампліфікації нуклеїнової кислоти для генерації популяції ампліфікованих перегрупованих молекул ДНК з біологічного зразка, який містить перегруповані гени, що кодують рецептори адаптивної імунної системи, перед кількісним високопродуктивним секвенуванням таких ампліфікованих продуктів. Множинна ампліфікація та високопродуктивне секвенування 9 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перегрупованих TCR та BCR(IG), що кодують послідовності ДНК, описані, наприклад, у Robins et al., 2009 р. Blood 114, 4099; Robins et al., 2010 р. Sci. Translat. Med. 2:47ra64; Robins et al., 2011 р. J. Immunol. Meth. doi:10.1016/j.jim.2011.09. 001; Sherwood et al. 2011 р. Sci. Translat. Med. 3:90ra61; заявка на патент США № 13/217,126 (Публікація США № 2012/0058902), заявка на патент США № 12/794 507 (Публікація США № 2010/0330571), WO/2010/151416, WO/2011/106738 (PCT/US2011/026373), WO2012/027503 (PCT/US2011/049012), заявка на патент США № 61/550,311, та заявка на патент США № 61/569,118; відповідно, дані винаходи включені у даний документ шляхом посилання і можуть бути адаптовані для використання у відповідності з описаними в даному документі варіантами втілення. Коротко та відповідно до концепції необмеження, такі набори та способи дозволяють позбутися спотворень, які можуть виникати у сучасних способах для підрахунку різноманітності генів TCR і BCR шляхом секвенування продуктів множинної ампліфікації нуклеїнової кислоти. Щоб пристосуватися до великого різноманіття послідовностей матриць генів TCR і BCR, які можуть бути присутні у біологічному зразку, набори олігонуклеотидних праймерів, що використовуються у множинних реакціях ампліфікації, переважно містять велике різноманіття довжин послідовностей і нуклеотидних наборів (наприклад, вміст GC). Відповідно, при заданому наборі умов проведення реакції ампліфікації ефективність гібридизації різних праймерів та їхньої підтримки ампліфікації споріднених матричних послідовностей може суттєво відрізнятися, що призводить до неоднорідного використання різних праймерів і, як наслідок, до штучних відхилень у кількісній репрезентації окремо визначених продуктів ампліфікації. Наприклад, відносно надмірне використання певних високоефективних праймерів призводить до надмірної репрезентації деяких продуктів ампліфікації, а відносно недостатнє використання певних інших неефективних праймерів призводить до недостатньої репрезентації певних інших продуктів ампліфікації. Оцінка відносної кількості кожного виду матриць у зразку з ДНК лімфоїдних клітин, отриманого шляхом секвенування продуктів ампліфікації, може призвести до отримання хибної інформації щодо реальної відносної наявності окремих видів матриць у зразку до проведення ампліфікації. У пілотних дослідженнях, наприклад, спостерігали, що множинна ПЛР-реакція, якій завдяки використанню набору олігонуклеотидних праймерів надана здатність ампліфікувати послідовності будь-яких можливих людських генів варіабельної (V) області TCRB з матриць ДНК лімфоїдної клітини людини, нерівномірно ампліфікувала сегменти V-гена TCRB. Натомість відбувалася відносно надмірна ампліфікація деяких сегментів V-гена (представлено приблизно 10 % від усіх послідовностей) та відносно -3 % недостатня ампліфікація інших сегментів V-гена (представлено приблизно 4 × 10 від усіх послідовностей); також див., наприклад, Фіг. 2. З метою подолання таких відхилень у використанні субпопуляцій праймерів ампліфікації у цьому винаході вперше пропонуються композиція матриці та спосіб стандартизації ефективності ампліфікації елементів набору олігонуклеотидних праймерів, за яких набір праймерів здатен ампліфікувати перегруповану ДНК, яка кодує множину рецепторів адаптивної імунної системи (TCR або Ig) у біологічному зразку з ДНК лімфоїдних клітин. Композиція матриці містить множину різноманітних матричних олігонуклеотидів із загальною формулою (І), як більш докладно описано в цьому документі: 5’-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3" (I) Складові матричні олігонуклеотиди, з яких складається композиція матриць, різняться за нуклеотидними послідовностями окремих матричних олігонуклеотидів. Таким чином, окремі матричні нуклеотиди можуть суттєво відрізнятися один від одного за нуклеотидною послідовністю, що пояснюється значною варіабельністю послідовності серед великої кількості можливих полінуклеотидів варіабельної (V) та зв'язувальної (J) областей TCR або BCR. Послідовності окремих видів матричних олігонуклеотидів також можуть відрізнятися одна від одної завдяки відмінностям послідовності в олігонуклеотидах U1, U2, B (B1, B2, B3, та B4) і R, включених в певну матрицю серед різноманітної множини матриць. У деяких варіантах втілення олігонуклеотиди штрих-коду B (B1, B2, B3, та B4) можуть незалежно та необов'язково містити олігонуклеотидну послідовність штрих-коду, в якій штрихкодова послідовність вибирається для унікальної ідентифікації певної парної комбінації певної унікальної олігонуклеотидної послідовності V та певної унікальної олігонуклеотидної послідовності J. Відносне розташування олігонуклеотидів штрих-коду В1, В4 та універсальних адаптерів дозволяє швидко ідентифікувати та здійснити кількісну оцінку продуктів ампліфікації конкретного унікального матричного олігонуклеотиду шляхом зчитувань коротких послідовностей та секвенування спарених кінців у автоматизованих секвенаторах ДНК (наприклад, Illumina HiSeq™, Illumina MiSEQ®, чи GeneAnalyzer™-2, Illumina Corp., м. Сан-Дієго, штат Каліфорнія, США). Зокрема, ці та інші, пов'язані з ними, варіанти втілення дозволяють 10 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виконувати швидке високопродуктивне визначення специфічних комбінацій послідовностей V та J, присутніх в продукті ампліфікації, для проведення таким чином характеризування відносної ефективності ампліфікації кожного специфічного для V та кожного специфічного для J праймера, що можуть знаходитися в наборі праймерів, здатному до ампліфікації перегрупованих TCR чи BCR, які кодують ДНК у зразку. Перевірку ідентичності та/або кількості продуктів ампліфікації можна виконати шляхом зчитувань довших послідовностей, додатково включаючи зчитування послідовностей, які простягаються до В2. Під час застосування кожний матричний олігонуклеотид у множині матричних олігонуклеотидів представлений в по суті еквімолярних кількостях, що у деяких бажаних варіантах втілення включає формули, в яких молярні концентрації всіх олігонуклеотидів знаходяться в межах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 % один відносно одного. У деяких інших бажаних варіантах втілення, що пропонуються у даному документі, матричні олігонуклеотиди представлені в по суті еквімолярних кількостях, тоді як молярні концентрації усіх інших олігонуклеотидів є в межах одного порядку величини один відносно одного, включаючи формули, в яких найбільша молярна концентрація будь-якого виду унікального матричного олігонуклеотиду не є більшою, ніж на 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 440, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 або 30 %, за молярну концентрацію, при якій присутні види унікальних матричних олігонуклеотидів, що мають найменшу концентрацію в наборі. Аналогічним чином деякі розкриті у даному документі варіанти втілення включають набори олігонуклеотидних праймерів для ампліфікації, в яких праймери можуть бути в по суті еквімолярних кількостях. Як також описано у даному документі, в деяких інших варіантах втілення концентрацію одного або більше праймерів у наборі можна навмисно регулювати таким чином, щоб окремі праймери були присутні або не в еквімолярній, або в по суті еквімолярних кількостях. Описана в даному документі композиція матриці у деяких бажаних варіантах втілення може використовуватися як матриця ампліфікації нуклеїнової кислоти (наприклад, ПЛР) з метою опису набору праймерів олігонуклеотидів, таких як складні набори праймерів олігонуклеотидів сегментів V та J, що можуть бути використані у множинній ампліфікації перегрупованих генів TCR або Ig, наприклад, набір праймерів, що пропонується у даному документі, або будь-який набір праймерів, описаний у публікаціях Robins et al., 2009 р. Blood 114, 4099; Robins et al., 2010 р. Sci. Translat. Med. 2:47ra64; Robins et al., 2011 р. J. Immunol. Meth. doi:10.1016/j.jim.2011.09. 001; Sherwood et al. 2011 р. Sci. Translat. Med. 3:90ra61; заявка на патент США № 13/217,126 (Публікація США № 2012/0058902), заявка на патент США № 12/794 507 (Публікація США № 2010/0330571), WO/2010/151416, WO/2011/106738 (PCT/US2011/026373), WO2012/027503 (PCT/US2011/049012), заявка на патент США № 61/550,311, та заявка на патент США № 61/569,118; та подібне. Переважно всі матриці в композиції матриці для стандартизації ефективності ампліфікації, яка описана у даному документі та містить множину матричних олігонуклеотидів з різноманітними послідовностями та структурою загальної формули (І), є олігонуклеотидами з по суті однаковою довжиною. Якщо не обмежуватися конкретною теорією, зазвичай вважають, що у такій реакції ампліфікації ДНК, як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), довжина матричної ДНК може впливати на ефективність ампліфікації олігонуклеотидних праймерів шляхом впливу на кінетику взаємодій між праймерами та молекулами матричної ДНК, до яких гібридизують праймери, шляхом специфічної гібридизації, яку спрямовують нуклеотидні послідовності, на основі базової комплементарності нуклеотидів. Зазвичай вважається, що довші матриці діють з меншою ефективністю, ніж відносно коротші матриці. В деяких варіантах втілення представлена композиція матриці для стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, здатного до ампліфікації перегрупованої ДНК, яка кодує різні TCR або BCR, містить множину матричних олігонуклеотидів загальної формули (І), як описано в цьому документі, де матричні олігонуклеотиди мають однакову або по суті однакову довжину, що не перевищує 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 або 100 нуклеотидів, включаючи всі цілі значення між ними. Відповідно, щоб зменшити, усунути або мінімізувати потенційний вплив на виникнення небажаних похибок у використанні олігонуклеотидних праймерів під час множинної ампліфікації, розкриті у даному документі бажані варіанти втілення можуть містити множину матричних олігонуклеотидів, в яких всі матричні олігонуклеотиди в множині матричних олігонуклеотидів з різноманітним чергуванням послідовностей мають по суті ідентичну довжину. Матричні олігонуклеотиди однієї множини можуть мати по суті однакову довжину, коли всі (100 %) або більшість (більше 50 %) таких олігонуклеотидів у композиції матриці є олігонуклеотидами, що 11 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мають абсолютно однакове число нуклеотидів, або у випадку, коли один або більше матричних олігонуклеотидів у композиції матриці можуть відрізнятися за довжиною один від одного не більше, ніж на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 нуклеотидів. Із цього винаходу буде зрозуміло, що навіть у ситуаціях, коли не всі матричні нуклеотиди мають абсолютно однакову довжину, описані в цьому документі набори та способи можна використовувати з метою визначення або, за необхідності, регулювання нерівномірного потенціалу ампліфікації нуклеїнових кислот серед елементів набору олігонуклеотидних праймерів ампліфікації. Згідно з деякими розкритими у даному документі варіантами втілення (і) кожен матричний олігонуклеотид описаної композиції матриці представлений в по суті еквімолярних кількостях; (іі) набір олігонуклеотидних праймерів, здатний до ампліфікації перегрупованої ДНК, що кодує множину рецепторів адаптивної імунної системи, містить множину олігонуклеотидних праймерів V-сегмента, представлених у по суті еквімолярних кількостях; (ііі) набір олігонуклеотидних праймерів, здатний до ампліфікації перегрупованої ДНК, яка кодує множину рецепторів адаптивної імунної системи, містить множину олігонуклеотидних праймерів J-сегмента, представлених в по суті еквімолярних кількостях; та (iv) ампліфікація лінійно зростає разом з кількістю початкових матриць заданої послідовності. Отже, очікуваний вихід продуктів ампліфікації кожної матриці можна розрахувати, а також довільно задати значення теоретичного рівномірного рівня ампліфікації 100 %. Після забезпечення можливості наборам праймерів ампліфікувати послідовності матричних олігонуклеотидів у реакції ампліфікації будь-яке статистично значуще відхилення від суттєвої еквівалентності, що спостерігається серед відносних пропорцій певних продуктів ампліфікації, вказує на наявність систематичної похибки (тобто неоднорідної ефективності) у використанні праймерів під час ампліфікації. Тобто кількісні відмінності у відносних кількостях різних отриманих продуктів ампліфікації свідчать про те, що не всі праймери в наборі ампліфікували відповідні до них матриці з зіставними ефективностями. У певних варіантах втілення межі допустимих значень встановлюються вище та нижче теоретичного 100 % результату, таким чином, будь-який показник рівня ампліфікації в межах допустимих значень може розглядатися як по суті еквівалентний. У певних таких варіантах втілення межі виходу продуктів ампліфікації можуть розглядатися як по суті еквівалентні, коли виходи продуктів знаходяться в межах одного порядку величини (наприклад, відрізняються менше ніж у десять разів). У певних інших варіантах втілення межі виходу продуктів ампліфікації можуть розглядатися як по суті еквівалентні, коли виходи продуктів відрізняються один від одного не більше, ніж у дев'ять, вісім, сім, шість, п'ять, чотири або три рази. У певних варіантах втілення виходи продуктів можуть бути розцінені як такі, що знаходяться в межах прийнятного діапазону допустимих значень і при цьому бути більше або менше розрахованого 100 % виходу на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 100, або 200 %. Оскільки даний спосіб передбачає визначення нуклеотидної послідовності кожного продукту ампліфікації з використанням відомих способів в рамках процесу кількісної оцінки, праймери, відповідальні за ампліфікацію кожного унікального (як встановлено послідовністю) продукту, можуть бути ідентифіковані, а їхня відносна кількість в наборі праймерів — відповідно скоригована (наприклад, збільшена або зменшена статистично значущим чином). Концентрацію надмірно ефективних праймерів у наборі можна зменшити порівняно з концентраціями інших праймерів таким чином, щоб рівень специфічної ампліфікації матриць, яку виконують ці праймери в описаній у даному документі композиції матриці, був по суті еквівалентним рівню ампліфікації, який забезпечує більшість праймерів, які надають теоретично рівномірний рівень ампліфікації або рівень ампліфікації в межах прийнятних допустимих значень. Концентрацію малоефективних праймерів у наборі можна збільшити порівняно з концентраціями інших праймерів таким чином, щоб рівень специфічної ампліфікації матриць, яку виконують ці праймери в описаній у даному документі композиції матриці, був по суті еквівалентним рівню ампліфікації, що забезпечує більшість праймерів, які надають теоретично рівномірний рівень ампліфікації або рівень ампліфікації в межах прийнятних допустимих значень. Отже, згідно з наведеним в цьому документі описом винаходу, пропонується композиція матриці для стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, призначеного для ампліфікації послідовностей кодування для повного спектру вибраного ланцюга TCR чи Ig; спосіб для визначення нерівномірної ефективності ампліфікації ("нерівномірного потенціалу ампліфікації") серед елементів такого набору праймерів; та спосіб коригування такого нерівномірного потенціалу ампліфікації. За умови, що описана у даному 12 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 документі композиція матриці буде використовуватися в якості стандарту для забезпечення можливості калібрування наборів олігонуклеотидних праймерів та із застосуванням запропонованих варіантів втілення, де кожен матричний олігонуклеотид представлений в по суті еквімолярних кількостях для того, щоб можна було скоригувати концентрації індивідуальних праймерів для досягнення по суті рівномірної ампліфікації структурно різноманітних елементів продуктів ампліфікації, даний винахід дозволяє таким чином успішно подолати згадані вище проблеми, пов'язані з систематичною похибкою в ефективності окремих праймерів. За допомогою композицій і способів, описаних в цьому документі, в окремих праймерів можна виявити наявність нерівномірного потенціалу ампліфікації, викликаного їхнім сприянням нерівномірній ампліфікації, про що свідчить зростання (наприклад, статистично значуще збільшення) або зменшення (наприклад, статистично значуще зменшення) ампліфікації специфічних матричних олігонуклеотидів відносно рімномірного рівня ампліфікації, незважаючи на присутність в реакції ампліфікації (і) усіх матричних олігонуклеотидів в по суті еквімолярних кількостях один відносно одного, (іі) усіх праймерів V-сегмента в по суті еквімолярних кількостях один відносно одного та (ііі) усіх праймерів J-сегмента в по суті еквімолярних кількостях один відносно одного. Відносні концентрації таких праймерів потім можна збільшити або зменшити для того, щоб отримати повний модифікований набір праймерів, в якому всі праймери представлені не в по суті еквімолярних кількостях один відносно одного, щоб відповідно компенсувати збільшений чи зменшений рівень ампліфікації відносно рівномірного рівня ампліфікації. Далі можна виконати повторне тестування набору праймерів для визначення його здатності до ампліфікації усіх послідовностей у розкритій у даному документі композиції матриці на рівномірному рівні ампліфікації або в межах прийнятного діапазону допустимих значень. Процедуру тестування модифікованих наборів праймерів на їх здатність до ампліфікації розкритої у даному документі композиції матриці, де всі матричні олігонуклеотиди пропонуються в по суті еквімолярних кількостях один відносно одного, можна багаторазово повторювати до досягнення ампліфікації всіх продуктів на рівномірному рівні ампліфікації або в межах прийнятного діапазону допустимих значень. За допомогою такої процедури із застосуванням розкритої в цьому документі композиції матриці можна стандартизувати ефективність ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, здатного ампліфікувати продуктивно перегруповану ДНК, яка кодує один або множину рецепторів адаптивної імунної системи у біологічному зразку, який містить ДНК лімфоїдних клітин суб'єкта. Згідно цього винаходу додатково або альтернативно можна визначити, чи демонструє будьяка конкретна пара олігонуклеотидних праймерів ампліфікації нерівномірний потенціал ампліфікації, наприклад, збільшення або зменшення ампліфікації композиції матриці відносно рівномірного рівня ампліфікації, що демонструє більшість олігонуклеотидних праймерів ампліфікації, та нормалізуючий коефіцієнт коригування можна використовувати для розрахунку, відповідно, пропорційного зменшення або зростання частоти появи продуктів ампліфікації, які стимулювала кожна така пара праймерів ампліфікації. Таким чином, дані композиції матриці у деяких варіантах втілення забезпечують спосіб коригування нерівномірного потенціалу ампліфікації нуклеїнової кислоти серед елементів набору олігонуклеотидних праймерів ампліфікації. Деякі такі варіанти втілення можуть дозволяти успішно виконувати коригування, калібрування, стандартизацію, нормалізацію та подібні дії з даними, отриманими внаслідок нерівномірної ампліфікації. Отже, ці варіанти втілення дозволяють виправити неточності в даних, які можуть виникати через систематичні похибки при використанні олігонуклеотидних праймерів, без необхідності багаторазового коригування концентрації одного або більше праймерів ампліфікації та повторення етапів ампліфікації описаної у даному документі композиції матриці. Таким чином, підвищення ефективності можна досягти у тому випадку, коли вдається уникнути повторення етапів кількісного секвенування продуктів ампліфікації. Однак у деяких інших варіантах втілення, які розглядаються, може застосовуватися такий ітеративний підхід. Відповідно, як викладено у даному документі, в даному винаході пропонується композиція матриці для стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, разом з способами використання такої композиції матриці для визначення нерівномірного потенціалу ампліфікації нуклеїнової кислоти (наприклад, встановлення систематичної похибки) серед окремих елементів набору олігонуклеотидних праймерів. Також у даному документі описані способи коригування таких нерівномірних потенціалів ампліфікації нуклеїнової кислоти (наприклад, систематичної похибки) серед елементів набору олігонуклеотидних праймерів. У цих та інших пов'язаних з ними варіантах втілення використовуються раніше невідомі переваги, 13 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 які отримують шляхом калібрування складних наборів олігонуклеотидних праймерів з метою компенсації небажаних систематичних похибок ампліфікації, застосовуючи композицію матриці для стандартизації ефективності ампліфікації, що має описані у даному документі ознаки, згадані переваги пропонованого винаходу можна використовувати для покращення (порівняно з раніше описаними методиками) точності кількісного оцінювання специфічних клонотипів TCR та/або Ig, що кодують послідовності ДНК. Як також було зазначено вище й описано в іншому розділі даного документу, перед створенням цього винаходу існували незадовільні та важко розпізнавані розбіжності між (і) фактичним кількісним розподілом перегрупованих матриць ДНК, що кодують рецептори адаптивної імунної системи, з унікальною послідовністю в біологічному зразку лімфоїдних клітин суб'єкта та (іі) відносним представленням продуктів ампліфікації нуклеїнової кислоти таких матриць, що виникали після множинної ампліфікації за допомогою складного набору олігонуклеотидних праймерів, створених для збільшення кількості по суті всіх продуктивно перегрупованих генів рецепторів адаптивної імунної системи у зразку. Часто можуть зустрічатися значні диспропорції в ефективності ампліфікації різних праймерів ампліфікації, викликані, наприклад, гетерогенністю матричної популяції та набору праймерів ампліфікації, що призводить до істотного дисбалансу у відносному співвідношенні отриманих продуктів ампліфікації та кількісного секвенування після реакції ампліфікації. Матриці та праймери Таким чином, згідно з певними преважними варіантами втілення, пропонується матриця для стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидного праймера, здатного ампліфікувати перегруповану ДНК (яка в певних варіантах втілення може бути продуктивно перегрупованою ДНК, але в певних інших варіантах втілення не потребує такого обмеження), що кодує один або множину рецепторів адаптивної імунної системи в біологічному зразку, який містить ДНК з лімфоїдних клітин суб'єкта; матриця містить множину матричних олігонуклеотидів загальної формули (I): 5’-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3" (I), як описано в цьому документі. В певних переважних варіантах втілення кожен матричний олігонуклеотид присутній у множині матричних олігонуклеотидів у по суті еквімолярних кількостях, яка в певних варіантах втілення, як зазначалося вище, може бути набором, в якому кожен з матричних олігонуклеотидів присутній в еквімолярній концентрації або у молярній концентрації, що відхиляється від еквімолярної не більше ніж на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 100 або 200 % в молярному відношенні та яка у певних інших варіантах втілення може бути набором, в якому всі матричні олігонуклеотиди присутні в молярних концентраціях, що знаходяться в порядку величини одна одної. Множина матриць може містити принаймні 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 або більше дискретних видів олігонуклеотиду, кожен з яких має окрему нуклеотидну послідовність, включаючи кожне проміжне ціле число між ними. Таким чином, описана в цьому документі матриця являє собою множину матричних олігонуклеотидів загальної формули: 5’-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3" [I], де, як деталізовано в інших розділах цього документа, згідно з певними переважними варіантами втілення: V є полінуклеотидом, що містить не менше 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 або 210 і не більше 1000, 900, 800, 700, 600 або 500 суміжних нуклеотидів послідовності гена, що кодує варіабельну область (V) рецептора адаптивної імунної системи, або його комплементом, і в кожній із множин матричних олігонуклеотидних послідовностей V містить унікальну олігонуклеотидну послідовність; J є полінуклеотидом, що містить не менше 15–30, 31–60, 61–90, 91–120 або 120–150 і не більше 600, 500, 400, 300 або 200 суміжних нуклеотидів послідовності гена, що кодує з'єднувальну область (J) рецептора адаптивної імунної системи, або його комплемент, і в кожній із множин матричних олігонуклеотидних послідовностей J містить унікальну олігонуклеотидну послідовність; кожен з U1 і U2 нічого не містить або є олігонуклеотидом, який, незалежно від інших, містить послідовність, обрану з (i) олігонуклеотидної послідовності універсального адаптера та (ii) специфічної для секвенуючої платформи олігонуклеотидної послідовності, пов'язаної з і розташованої в позиції 5" відносно олігонуклеотидної послідовності універсального адаптера; незалежно один від одного кожен з В1, В2, В3 і В4 нічого не містить або є олігонуклеотидом B, який містить олігонуклеотидну послідовність штрих-коду із 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 14 UA 115783 C2 5 10 15 20 900 або 1000 суміжних нуклеотидів (включаючи всі цілі числа між ними), причому в кожній із множин матричних олігонуклеотидних послідовностей B являє собою унікальну олігонуклеотидну послідовність, яка унікальним чином ідентифікує (або ідентифікує в якості спареної комбінації) (i) унікальну олігонуклеотидну послідовність матричного олігонуклеотиду V та (ii) унікальну олігонуклеотидну послідовність матричного олігонуклеотиду J; та R нічого не містить або є сайтом розпізнавання рестриктази, що являє собою олігонуклеотидну послідовність, відсутню в V, J, U1, U2, B1, В2, В3 і В4. В деяких варіантах втілення композиція матричного олігонуклеотиду включає додаткові некодуючі або випадкові олігонуклеотиди. Ці олігонуклеотиди можна вставити в різних ділянках між або всередині компонентів в загальній формулі I (5’-U1-В1-В2-V-R-В3-В4-J-U2-3"); вони також можуть бути різними за довжиною. В одному варіанті втілення a знаходиться в межах від 1 до максимального числа сегментів V-гена у геномі ссавців. В іншому варіанті втілення b знаходиться в межах від 1 до максимального числа сегментів J-гена у геномі ссавців. В усіх інших варіантах втілення a=1 або b=1. В деяких варіантах втілення a може варіюватися від 1 до 54 сегментів V-гена для TCRA, 1– 76 сегментів V-гена для TCRB, 1–15 сегментів V-гена для TCRG, 1–7 сегментів V-гена для TCRD, 1–165 сегментів V-гена для IGH, 1–111 — для IGK або 1–79 сегментів V-гена для IGL. В інших варіантах втілення b може варіюватися від 1 до 61 сегмента J-гена для TCRA, 1–14 сегментів J-гена для TCRB, 1–5 сегментів J-гена для TCRG, 1–4 сегментів J-гена для TCRD, 1–9 сегментів J-гена для IGH, 1–5 сегментів J-гена для IGK або 1–11 сегментів J-гена для IGL. У наведеній нижче таблиці вказано кількість сегментів V-гена (a) та сегментів J-гена (b) для кожного локусу рецептора адаптивної імунної системи людини, в тому числі функціональних Vта J-сегментів. Сегменти V * TCRA TCRB TCRG TCRD IGH IGK IGL 54 76 15 7 165 111 79 Функціональні сегменти V ** 45 48 6 7 51 44 33 Сегменти J * 61 14 5 4 9 5 11 Функціональні сегменти J ** 50 13 5 4 6 5 7 25 30 35 40 45 50 * Загальна кількість генів варіабельних і з'єднувальних областей ** Гени варіабельної та з'єднувальної областей з принаймні однією функціональною алеллю В деяких варіантах втілення J-полінуклеотид містить принаймні 15–30, 31–60, 61–90, 91–120 або 120–150 і не більше 600, 500, 400, 300 або 200 суміжних нуклеотидів постійної J-області рецептора адаптивної імунної системи або їхній комплемент. У певних варіантах втілення множина матричних олігонуклеотидів містить принаймні (a x b) унікальних олігонуклеотидних послідовностей, де a — кількість унікальних сегментів гена, що кодує V-область рецепторів адаптивної імунної системи в суб'єкті, та b — кількість унікальних сегментів гена, що кодує J-область у суб'єкті, а композиція містить принаймні один матричний олігонуклеотид для кожної можливої комбінації сегмента гена, що кодує V-область, та сегмента гена, що кодує J-область. Однак описаний в цьому документі винахід не слід обмежувати таким чином, щоб у певних варіантах втілення можна було ефективно використати суттєво меншу кількість матричних олігонуклеотидів. У цих та споріднених варіантах втілення, де a — це кількість унікальних сегментів гена, що кодує V-область рецепторів адаптивної імунної системи в суб'єкті, та b — це кількість унікальних сегментів гена, що кодує J-область рецепторів адаптивної імунної системи в суб'єкті, мінімальну кількість унікальних олігонуклеотидних послідовностей, з яких складається множина матричних олігонуклеотидів, можна визначити в залежності від того, яке з двох значень (a чи b) є більшим, за умови, що кожна унікальна V-полінуклеотидна послідовність і кожна унікальна J-полінуклеотидна послідовність присутні у принаймні одному матричному олігонуклеотиді в матриці. Таким чином, в певних споріднених варіантах втілення винаходу матриця може містити принаймні один матричний олігонуклеотид для кожного унікального Vполінуклеотиду, наприклад, такий, що включає по одному унікальному V-полінуклеотиду відповідно до загальної формули (I), та принаймні один матричний олігонуклеотид для кожного унікального J-полінуклеотиду, наприклад, такий, що включає по одному унікальному Jполінуклеотиду відповідно до загальної формули (I). 15 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В певних інших варіантах втілення матриця містить принаймні один матричний олігонуклеотид, з яким може гібридизувати кожен праймер ампліфікації олігонуклеотиду в наборі праймерів ампліфікації. Тобто в певних варіантах втілення матриця містить принаймні один матричний олігонуклеотид, що має олігонуклеотидну послідовність загальної формули (I), в якій кожен олігонуклеотидний праймер V-сегмента може специфічно гібридизувати, та принаймні один матричний олігонуклеотид, що має олігонуклеотидну послідовність загальної формули (I), в якій кожен олігонуклеотидний праймер J-сегмента може специфічно гібридизувати. В таких варіантах втілення набір олігонуклеотидних праймерів, здатний ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує один або множину рецепторів адаптивної імунної системи, містить множину a" унікальних олігонуклеотидних праймерів V-сегмента і множину b" унікальних олігонуклеотидних праймерів J-сегмента. З множини a" олігонуклеотидних праймерів Vсегмента кожен незалежно здатний до гібридизації або специфічної гібридизації з принаймні одним полінуклеотидом, що кодує поліпептид V-області рецептора адаптивної імунної системи, або з його комплементом, при цьому кожен праймер V-сегмента містить нуклеотидну послідовність з принаймні 15 суміжних нуклеотидів, комплементарних принаймні одному сегменту гена, що кодує V-область рецептора адаптивної імунної системи. З множини b" олігонуклеотидних праймерів J-сегмента кожен незалежно здатний до гібридизації або специфічної гібридизації з принаймні одним полінуклеотидом, що кодує поліпептид J-області рецептора адаптивної імунної системи, або з його комплементом, при цьому кожен праймер Jсегмента містить нуклеотидну послідовність з принаймні 15 суміжних нуклеотидів, комплементарних принаймні одному сегменту гена, що кодує J-область рецептора адаптивної імунної системи. У деяких варіантах втілення a" є таким же, як a (як описано вище для матричних олігонуклеотидів). У інших варіантах втілення b" є таким же як b (як описано вище для матричних олігонуклеотидів). Таким чином, в певних варіантах втілення і, як також було описано в інших розділах цього документа, матрицю з таким складом можна використати в реакціях ампліфікації з праймерами ампліфікації, призначеними для ампліфікації всіх перегрупованих послідовностей генів, що кодують рецептори адаптивної імунної системи, в тому числі ті, які не експресують, тоді як в певних інших варіантах втілення матрицю та праймери ампліфікації можна створити таким чином, щоб вони не давали продуктів ампліфікації перегрупованих генів, які не експресують (наприклад, псевдогени, орфони). У зв'язку з цим слід розуміти, що в певних варіантах втілення можна за бажанням ампліфікувати лише підмножину перегрупованих генів, що кодують рецептори адаптивної імунної системи, наприклад, таким чином, що відповідні підмножини праймера ампліфікації можна створити та використати для ампліфікації тільки тих перегрупованих послідовностей V-J, які представляють інтерес. Відповідно, в цих та інших подібних варіантах втілення описану в цьому документі матрицю, що містить лише підмножину перегрупованих послідовностей V-J, яка представляє інтерес, можна використати за умови, що матриця містить принаймні один матричний олігонуклеотид, з яким може гібридизувати кожен праймер ампліфікації олігонуклеотиду в наборі праймера ампліфікації. Таким чином, фактична кількість матричних олігонуклеотидів у матриці може значно варіюватися серед передбачуваних варіантів втілення залежно від набору праймерів ампліфікації, який планується використати. Наприклад, в певних споріднених варіантах втілення множина матричних олігонуклеотидів в матриці може мати множину послідовностей загальної формули (I), обрану з (1) множини олігонуклеотидних послідовностей загальної формули (I), в якій V- та J-полінуклеотиди мають послідовності TCRB V та J, викладені в принаймні одному наборі з 68 TCRB V та J SEQ ID NO відповідно, як представлено на Фіг. 5а–5l як набір 1 TCRB V/J, набір 2 TCRB V/J, набір 3 TCRB V/J, набір 4 TCRB V/J, набір 5 TCRB V/J, набір 6 TCRB V/J, набір 7 TCRB V/J, набір 8 TCRB V/J, набір 9 TCRB V/J, набір 10 TCRB V/J, набір 11 TCRB V/J, набір 12 TCRB V/J і набір 13 TCRB V/J; (2) множини олігонуклеотидних послідовностей загальної формули (I), в якій V- та Jполінуклеотиди мають послідовності TCRG V та J, викладені в принаймні одному наборі з 14 TCRG V та J SEQ ID NO відповідно, як представлено на Фіг. 6 як набір 1 TCRG V/J, набір 2 TCRG V/J, набір 3 TCRG V/J, набір 4 TCRG V/J і набір 5 TCRG V/J; і (3) множини олігонуклеотидних послідовностей загальної формули (I), в якій V- та J-полінуклеотиди мають послідовності IGH V та J, викладені в принаймні одному наборі з 127 IGH V та J SEQ ID NO відповідно, як представлено на Фіг. 7 як набір 1 IGH V/J, набір 2 IGH V/J, набір 3 IGH V/J, набір 4 IGH V/J, набір 5 IGH V/J, набір 6 IGH V/J, набір 7 IGH V/J, набір 8 IGH V/J і набір 9 IGH V/J. В певних варіантах втілення V — це полінуклеотидна послідовність, яка кодує принаймні 10– 70 замінних амінокислот V-області рецептора адаптивної імунної системи, або її комплемент; J 16 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 — це полінуклеотидна послідовність, яка кодує принаймні 5–30 замінних амінокислот J-області рецептора адаптивної імунної системи, або її комплемент; U1 і U2 дорівнюють нулю або являють собою олігонуклеотиди, що містять нуклеотидну послідовність, обрану з (i) олігонуклеотидної послідовності універсального адаптера та (ii) специфічної для секвенуючої платформи олігонуклеотидної послідовності, пов'язаної з і розташованої в позиції 5" відносно олігонуклеотидної послідовності універсального адаптера; незалежно один від одного, кожен з В1, В2, В3 і В4 нічого не містить або є олігонуклеотидом B, який являє собою олігонуклеотидну послідовність штрих-коду з 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 суміжних нуклеотидів, причому в кожній із множин олігонуклеотидних послідовностей B являє собою унікальну олігонуклеотидну послідовність, яка унікально ідентифікує або ідентифікує в якості спареної комбінації, (i) унікальну V-олігонуклеотидну послідовність та (ii) унікальну Jолігонуклеотидну послідовність; R нічого не містить або є сайтом розпізнавання рестриктази, що являє собою олігонуклеотидну послідовність, відсутню з V, J, U1, U2, B1, В2, В3 і В4. У певних переважних варіантах втілення множина матричних олігонуклеотидів містить принаймні унікальні олігонуклеотидні послідовності a або b, де a — це кількість унікальних сегментів гена, що кодує V-область рецепторів адаптивної імунної системи в суб'єкті, та b — це кількість унікальних сегментів гена, що кодує J-область рецепторів адаптивної імунної системи в суб'єкті; композиція включає множину матричних олігонуклеотидів, які містять принаймні більшу з послідовностей унікальних матричних олігонуклеотидів a та b за умови, що включено принаймні один V-полінуклеотид, який відповідає кожному сегменту гена, що кодує V-область, і принаймні один J-полінуклеотид, що відповідає кожному сегменту гена, що кодує J-область. Велика кількість послідовностей генів варіабельної (V) області рецептора адаптивної імунної системи та послідовностей генів з'єднувальної (J) області відома як послідовності нуклеотидів та/або амінокислот, в тому числі, неперегруповані геномні послідовності ДНК локусів TCR і Ig та продуктивно перегруповані послідовності ДНК в таких локусах та їхні кодовані продукти, а також псевдогени в цих локусах та споріднені орфони. Див., наприклад, заявку на патент США № 13/217,126; заявку на патент США № 12/794,507; PCT/US2011/026373; PCT/US2011/049012. Ці та інші відомі в галузі послідовності можна використати, відповідно до цього винаходу, для розробки і продукції матричних олігонуклеотидів, які необхідно включити в матрицю, що наразі пропонується, для стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, а також для плнування і створення набору олігонуклеотидних праймерів, здатного ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує поліпептидні ланцюги TCR або Ig, перегрупована ДНК яких може бути присутньою в біологічному зразку, що містить ДНК лімфоїдних клітин. У формулі (I) V — це полінуклеотидна послідовність із принаймні 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400 або 450 і не більше 1000, 900, 800, 700, 600 або 500 суміжних нуклеотидів послідовностей генів варіабельної (V) області рецептора адаптивної імунної системи (наприклад, TCR і BCR) або з її комплемент; в кожній з множин олігонуклеотидних послідовностей V являє собою унікальну олігонуклеотидну послідовність. З відкритих баз даних, таких як Genbank, відомі і доступні геномні послідовності для генів Vобласті TCR і BCR людини та інших видів; послідовності генів V-області включають полінуклеотидні послідовності, які кодують продукти експресованих, перегрупованих генів TCR і BCR, а також включають полінуклеотидні послідовності псевдогенів, ідентифіковані в локусах Vобласті. Різноманітні V-полінуклеотидні послідовності, які можуть міститись у викладених в цьому документі матрицях загальної формули (I), можуть широко варіюватися за довжиною, нуклеотидним складом (наприклад, вмістом GC) і фактичною лінійною полінуклеотидною послідовністю, та, наприклад, включати "гарячі точки" або гіперваріабельні області, які демонструють особливу різноманітність послідовності. V-полінуклеотид в загальній формулі (I) (або його комплемент) включає послідовності, до яких можуть специфічно гібридизувати члени наборів олігонуклеотидних праймерів, специфічних для генів TCR або BCR. Набори праймерів, здатні ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує множину TCR або BCR, описані, наприклад, у заявці на патент США № 13/217,126; заявку на патент США № 12/794,507; PCT/US2011/026373; або PCT/US2011/049012 та подібне; або, як описано в цьому документі, можуть бути розраховані на вміст олігонуклеотидних послідовностей, які можуть специфічно гібридизувати з кожним унікальним V-геном і кожним J-геном в конкретному локусі гена TCR або BCR (наприклад, TCR α, β, γ або δ, або IgH µ, γ, δ, α або ε, або IgL κ або λ). Наприклад, в якості ілюстрації, але без обмежень, олігонуклеотидний праймер набору ампліфікації олігонуклеотидних праймерів, здатного ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує один або множину TCR або BCR, як правило, може включати нуклеотидну послідовність з 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 17 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 або 40 чи більше суміжних нуклеотидів і специфічно гібридизувати з комплементарною послідовністю з 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 або 40 суміжних нуклеотидів V- або Jполінуклеотиду, як пропонується в цьому документі. У певних варіантах втілення ці праймери можуть містити принаймні 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 нуклеотидів, а в конкретному варіанті втілення праймери можуть містити послідовності не більше ніж 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 або 40 суміжних нуклеотидів. В цьому документі також розглядаються праймери та сайти гібридизації праймерів з іншими довжинами. Повна полінуклеотидна послідовність кожного V-полінуклеотиду в загальній формулі (I) може, але не обов'язково, складатися виключно з суміжних нуклеотидів з кожного окремого Vгена. Наприклад, в певних варіантах втілення кожен V-полінуклеотид формули (I) у складі описаної в цьому документі матриці повинен лише мати принаймні область, яка містить унікальну V-олігонуклеотидну послідовність, яка знаходиться в одному V-гені та з якою може специфічно гібридизувати одиночний праймер V-області в наборі праймерів. Таким чином, Vполінуклеотид формули (I) може містити всю або будь-яку задану частину (наприклад, принаймні 15, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 або 210 суміжних нуклеотидів або будь-яке ціле число між ними) природної послідовності V-гена (у тому числі послідовності V-псевдогена) до тих пір, поки включено принаймні одну унікальну область V-олігонуклеотидної послідовності (сайт гібридизації праймера), не включену в інший матричний V-полінуклеотид. У певних варіантах втілення переважною може бути довжина множини V-полінуклеотидів, присутніх в описаній в цьому документі композиції матриці, яка імітує загальну довжину відомих нуклеотидних послідовностей природних V-генів, навіть коли ці специфічні нуклеотидні послідовності відрізняються між матрицею V-області і будь-яким природним V-геном. Довжини V-областей в описаних в цьому документі матрицях можуть відрізнятися від довжин природних послідовностей V-генів не більше ніж на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 відсотків. Таким чином, у певних варіантах втілення V-полінуклеотид у формулі (I) може містити нуклеотидну послідовність, що має довжину, яка є такою ж або аналогічною довжині типового Vгена від його початкового кодона до його області CDR3, що кодує, та може, але не обов'язково, містити нуклеотидну послідовність, що кодує область CDR3. Нуклеотидні послідовності, що кодують CDR3, і довжини послідовностей можуть істотно відрізнятися, та їх характеризують за допомогою кількох різних схем нумерації (наприклад, Lefranc, 1999 р. The Immunologist 7:132; Kabat et al., 1991 р. In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication 91-3242; Chothia et al., 1987 р. J. Mol. Biol. 196:901; Chothia et al., 1989 р. Nature 342:877; Al-Lazikani et al., 1997 р. J. Mol. Biol. 273:927; див. також, наприклад, Rock et al., 1994 р. J. Exp. Med. 179:323; Saada et al., 2007 р. Immunol. Cell Biol. 85:323). Коротко, область CDR3, як правило, охоплює поліпептидну частину, що проходить від висококонсервативного залишку цистеїну (кодується тринуклеотидним кодоном TGY, Y=T або C) в сегменті V до висококонсервативного залишку фенілаланіну (кодується TTY) в сегменті J TCR або до висококонсервативного триптофану (кодується TGG) в IGH. Більше 90 % природних продуктивних перегрупувань у локусі TCRB мають довжину кодування CDR3 за цим критерієм між 24 і 54 нуклеотидами, що відповідає проміжку між 9 і 17 кодованими амінокислотами. Для будь-якого заданого локусу TCR або BCR довжини CDR3 синтетичних матричних олігонуклеотидів, згідно цього винаходу, повинні потрапляти в той же діапазон, що й 95 % природних перегрупувань. Таким чином, наприклад, в описаній в цьому документі матриці для стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, здатного ампліфікувати перегруповану ДНК, яка кодує множину поліпептидів TCRB, частина Vполінуклеотиду, що кодує CDR3, може мати довжину від 24 до 54 нуклеотидів, включаючи кожне ціле число між ними. На описаних вище схемах нумерації для областей, що кодують CDR3, позначено позиції консервативних кодонів цистеїну, фенілаланіну і триптофану; також ці схеми нумерації можна застосувати до псевдогенів, в яких один або більше кодонів, що кодують ці консервативні амінокислоти, можна замінити кодоном, що кодує інші амінокислоти. Для псевдогенів, які не використовують ці консервативні амінокислоти, довжину CDR3 можна визначити по відношенню до відповідної позиції, в якій би спостерігалася відсутність заміщення консервативного залишку відповідно до однієї із згаданих вище встановлених схем нумерації позицій послідовності CDR3. Крім того, у певних варіантах втілення винаходу переважною може бути множина Vполінуклеотидів, присутніх в описаній в цьому документі композиції матриці, яка має набір нуклеотидів (наприклад, відсоток вмісту GC), що імітують загальні нуклеотидні набори відомих 18 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 природних послідовностей V-генів, навіть коли специфічні нуклеотидні послідовності різні. Такі нуклеотидні матриці V-області можуть відрізнятися від нуклеотидних наборів природних послідовностей V-генів не більше ніж на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 відсотків. Опціонально та згідно з певними варіантами втілення V-полінуклеотид описаного в цьому документі матричного олігонуклеотиду включає термінуючий кодон на або поблизу 3’-кінця V в загальній формулі (I). У загальній формулі (I) J є полінуклеотидом, що містить принаймні 15–30, 31–60, 61–90, 91– 120 або 120–150 і не більше 600, 500, 400, 300 або 200 суміжних нуклеотидів послідовності гена, що кодує з'єднувальну область (J) рецептора адаптивної імунної системи, або його комплементом, і в кожній із множин J-олігонуклеотидних послідовностей містить унікальну олігонуклеотидну послідовність; Полінуклеотид J у загальній формулі (I) (або його комплемент) включає послідовності, до яких можуть специфічно гібридизувати члени наборів олігонуклеотидних праймерів, специфічних для генів TCR або BCR. Набори праймерів, здатні ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує множину TCR або BCR, описані, наприклад, у заявці на патент США № 13/217,126; заявку на патент США № 12/794,507; PCT/US2011/026373; або PCT/US2011/049012 та подібне; або, як описано в цьому документі, можуть бути розраховані на вміст олігонуклеотидних послідовностей, які можуть специфічно гібридизувати з кожним унікальним V-геном і кожним унікальним J-геном в конкретному локусі гена TCR або BCR (наприклад, TCR α, β, γ або δ, або IgH µ, γ, δ, α, або ε, або IgL κ, або λ). Вся полінуклеотидна послідовність кожного J-полінуклеотиду у загальній формулі (I) може, але не обов'язково, складатися виключно з суміжних нуклеотидів з кожного окремого V-гена. Наприклад, в певних варіантах втілення кожен J-полінуклеотид формули (I) у складі описаної в цьому документі матриці повинен лише мати принаймні область, яка містить унікальну Jолігонуклеотидну послідовність, яка знаходиться в одному J-гені та з якою може специфічно гібридизувати одиночний праймер V-області в наборі праймерів. Таким чином, V-полінуклеотид формули (I) може містити всі або будь-яку задану частину (наприклад, принаймні 15, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 або 210 суміжних нуклеотидів або будь-яке ціле число між ними) з природної послідовності V-гена (у тому числі послідовності V-псевдогена) за умови включення принаймні однієї унікальної області V-олігонуклеотидної послідовності (сайт гібридизації праймера), не включеної в інший матричний J-полінуклеотид. У певних варіантах втілення переважною може бути множина J полінуклеотидів, присутніх в описаній в цьому документі матриці, яка має набір нуклеотидів (наприклад, відсоток вмісту GC), довжини яких імітують загальні довжини нуклеотидних послідовностей відомих природних Jгенів, навіть коли специфічні нуклеотидні послідовності відрізняються між областю матриці J та будь-яким природним J-геном. Довжини J-областей в описаних в цьому документі матрицях можуть відрізнятися від довжин природних послідовностей J-генів не більше ніж на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 відсотків. Таким чином, у певних варіантах втілення J-полінуклеотид у формулі (I) може містити нуклеотидну послідовність, що має довжину, яка є такою ж або аналогічною довжині типового природного J-гена та може, але не обов'язково, містити нуклеотидну послідовність, що кодує область CDR3, як було описано вище. Геномні послідовності генів TCR і BCR J-області людини та інших видів відомі і доступні з відкритих баз даних, таких як Genbank; послідовності генів J-області включають полінуклеотидні послідовності, які кодують продукти експресованих та неекспресованих перегрупованих генів TCR і BCR. Різноманітні полінуклеотидні послідовності J, які можуть міститись у викладених в цьому документі матрицях загальної формули (I) можуть широко варіюватися за довжиною, нуклеотидним складом (наприклад, вміст GC) і фактичною лінійною полінуклеотидною послідовністю. На основі цього винаходу з використанням знань в цій галузі щодо опублікованих послідовностей генів для V- та J-областей, які кодують гени, для кожної субодиниці TCR і Ig фахівець в цій галузі може обрати альтернативи для описаних в цьому документі послідовностей V та J для використання в конструкції описаних в цьому документі матричних олігонуклеотидів та/або олігонуклеотидних праймерів V- та J-сегментів. Посилання на записи Genbank щодо послідовностей рецепторів адаптивної імунної системи людини включають: TCRα: (TCRA/D): NC_000014.8 (chr14:22090057…23021075); TCRβ: (TCRB): NC_000007.13 (chr7:141998851…142510972); TCRγ: (TCRG): NC_000007.13 (chr7:38279625…38407656); важкий ланцюг імуноглобуліна, IgH (IGH): NC_000014.8 (chr14: 106032614…107288051); легкий ланцюг імуноглобуліна — каппа, IgLκ (IGK): NC_000002.11 (chr2: 89156874…90274235); та легкий ланцюг імуноглобуліна — лямбда, IgLλ (IGL): NC_000022.10 (chr22: 19 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 22380474…23265085). Посилання на записи Genbank щодо локусних послідовностей рецепторів адаптивної імунної системи миші включають: TCRβ: (TCRB): NC_000072.5 (chr6: 40841295…41508370) та важкий ланцюг імуноглобуліна, IgH (IGH): NC_000078.5 (chr12:114496979…117248165). Аналіз конструкції матриці та праймера, а також розгляд вибору сайту-мішені можна виконати, наприклад, з використанням програмного забезпечення для аналізу праймера OLIGO та/або програмного алгоритму BLASTN 2.0.5 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997 р., 25 (17): 3389–402) та інших доступних в галузі аналогічних програм. Таким чином, на основі цього винаходу та з урахуванням відомих послідовностей генів рецептора адаптивної імунної системи і методологій створення олігонуклеотиду для включення в матричні олігонуклеотиди фахівці галузі можуть створити множину специфічних для V-області та J-області полінуклеотидних послідовностей, які незалежно одна від одної містять олігонуклеотидні послідовності, унікальні для конкретного V- та J-гена (відповідно). Аналогічним чином, з цього винаходу та з урахуванням відомих послідовностей рецепторів адаптивної імунної системи, фахівці в цій галузі можуть також створювати набір праймерів, що містить множину специфічних для V-області та J-області олігонуклеотидних праймерів, які незалежно один від одного здатні гібридизувати із специфічною послідовністю, унікальною відповідно для конкретного V- та J-гена, в результаті чого множина праймерів здатна ампліфікувати практично всі V- та J-гени в конерктному локусі, що кодує рецептор адаптивної імунної системи (наприклад, локусі TCR або IgH людини). Такі набори праймерів дозволяють здійснювати генерацію продуктів ампліфікації, які мають перший кінець, що кодується перегрупованим сегментом гена, що кодує V-область, і другий кінець, що кодується перегрупованим сегментом гена, що кодує J-область, за допомогою множинної (наприклад, з використанням множинних прямих і реверсних пар праймерів) ПЛР. Як правило та в певних варіантах втілення такі продукти ампліфікації можуть включати послідовність, що кодує CDR3, хоча цей винахід не повинен таким чином обмежуватися і передбачає продукти ампліфікації, які не містять послідовності, що кодує CDR3. Перевагу можуть надавати створенню праймерів для отримання продуктів ампліфікації, що мають достатні частини V- та J-послідовностей та/або (B) V-J послідовностей штрих-коду, як описано в цьому документі, таким чином, що шляхом секвенування продуктів (ампліконів) на основі послідовностей, які є унікальними для кожного сегмента гена, можна визначити (i) конкретний Vген та (ii) конкретний J-ген, в безпосередній близькості від якого V-ген пройшов перегрупування з утворенням функціонального гена, що кодує рецептор адаптивної імунної системи. Як правило, у переважних варіантах втілення продукти ампліфікації ПЛР не більші за розміром за 600 пар основ, які, відповідно до теорії необмеження, не включать продукти ампліфікації від неперегрупованих генів рецепторів адаптивної імунної системи. В певних інших переважних варіантах втілення розмір продуктів ампліфікації не буде більшим ніж 500, 400, 300, 250, 200, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 або 20 пар основ, які можуть забезпечити швидке, високопродуктивне кількісне визначення ампліконів, які відрізняються послідовностями, за показниками короткої послідовності. У певних переважних варіантах втілення множина матричних олігонуклеотидів містить принаймні a або принаймні bунікальних олігонуклеотидних послідовностей, де a — кількість унікальних сегментів гена, що кодує V-область рецепторів адаптивної імунної системи в суб'єкті, та b — кількість унікальних сегментів гена, що кодує J-область рецепторів адаптивної імунної системи в суб'єкті; композиція містить принаймні один матричний олігонуклеотид для кожного унікального V-полінуклеотиду та принаймні один матричний олігонуклеотид для кожного унікального J-полінуклеотиду. Слід мати на увазі, що оскільки матричні олігонуклеотиди мають множину олігонуклеотидних послідовностей із загальною формулою (I), яка включає Vполінуклеотид та J-полінуклеотид, матриця може містити менше ніж (a x b) унікальних олігонуклеотидних послідовностей, але буде містити принаймні більшу з унікальних олігонуклеотидних послідовностей a та b. Таким чином, композиція може містити принаймні один екземпляр кожної унікальної V-полінуклеотидної послідовності і принаймні один екземпляр кожної унікальної J-полінуклеотидної послідовності; в деяких випадках принаймні один екземпляр конкретного унікального V-полінуклеотиду присутній в тому ж матричному олігонуклеотиді, в якому може знаходитись принаймні один екземпляр конкретного унікального J-полінуклеотиду. Так, наприклад, "принаймні один матричний олігонуклеотид для кожного унікального V-полінуклеотиду та принаймні один матричний олігонуклеотид для кожного унікального J-полінуклеотиду" в деяких випадках можуть відноситися до одного матричного олігонуклеотиду, в якому присутні один унікальний V-полінуклеотид та один унікальний Jполінуклеотид. 20 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також, як розкрито в інших розділах цього документа, у певних інших переважних варіантах втілення винаходу матриця містить принаймні один матричний олігонуклеотид, з яким може гібридизувати кожен праймер ампліфікації олігонуклеотиду в наборі праймерів ампліфікації. Таким чином, композиція може містити менше a або b унікальних послідовностей, наприклад, коли набір праймерів ампліфікації не може включати унікальний праймер для кожної можливої послідовності V та/або J. Слід зазначити, що певні варіанти втілення передбачають матрицю для стандартизації ефективності ампліфікації набору олігонуклеотидних праймерів, здатного продуктивно ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує один або множину рецепторів адаптивної імунної системи в біологічному зразку, який містить ДНК з лімфоїдних клітин суб'єкта, як пропонується в цьому винаході, причому матриця містить множину матричних олігонуклеотидів, що мають множину олігонуклеотидних послідовностей із загальною формулою 5'-U1-В1-В2-V-R-В3-В4-JU2-3 '(я), як описано в цьому документі. Відповідно до цих та споріднених варіантів втілення і як описано в інших розділах цього документа, набір олігонуклеотидних праймерів здатний продуктивно ампліфікувати перегруповану ДНК, може не включати будь-який з олігонуклеотидних праймерів, які специфічно гібридизують з псевдогеном або орфоном Vобласті чи з псевдогеном або орфоном J-області. Отже, в таких варіантах втілення винаходу бажано, щоб матриця не включала матричні олігонуклеотиди із загальною формулою (I), в якій унікальні олігонуклеотидні послідовності V та/або унікальні олігонуклеотидні послідовності J представляють собою послідовності, які, відповідно, унікальні для псевдогена або орфона Vобласті чи псевдогена або орфона J-області. У Переліку послідовностей (Sequence Listing) в SEQ ID NO: 3157–4014 розкрита взірцева композиція матриці TCRB, що містить 858 окремих матричних олігонуклеотидів. У Переліку послідовностей в SEQ ID NO: 1–871 розкрита інша взірцева композиція матриці TCRB, що містить 871 окремий матричний олігонуклеотид. У Переліку послідовностей в SEQ ID NO: 872– 1560 розкрита інша взірцева композиція матриці TCRB, що містить 689 окремий матричний олігонуклеотид. У Переліку послідовностей в SEQ ID NO: 4015–4084 розкрита взірцева композиція матриці TCRG, що містить 70 окремих матричних олігонуклеотидів. У Переліку послідовностей в SEQ ID NO: 1561–1630 також розкрита взірцева композиція матриці TCRG, що містить 70 окремих матричних олігонуклеотидів. У Переліку послідовностей в SEQ ID NO: 4085–5200 розкрита взірцева композиція матриці IGH, що містить 1116 окремих матричних олігонуклеотидів. У Переліку послідовностей в SEQ ID NO: 1805–2920 також розкрита взірцева композиція матриці IGH, що містить 1116 окремих матричних олігонуклеотидів. Також в цьому документі розкриті взірцеві набори V- та J-полінуклеотидів для включення в описані в цьому документі матричні олігонуклеотиди, що мають множину олігонуклеотидних послідовностей із загальною формулою (I). Для TCRB множина матричних олігонуклеотидів може мати множину олігонуклеотидних послідовностей із загальною формулою (I), в якій V- та J-полінуклеотиди мають послідовності TCRB V та J, зазначені в принаймні одному наборі з 68 TCRB V та J SEQ ID NO відповідно, як вказано на Фіг. 5 як набір 1 TCRB V/J, набір 2 TCRB V/J, набір 3 TCRB V/J, набір 4 TCRB V/J, набір 5 TCRB V/J, набір 6 TCRB V/J, набір 7 TCRB V/J, набір 8 TCRB V/J, набір 9 TCRB V/J, набір 10 TCRB V/J, набір 11 TCRB V/J, набір 12 TCRB V/J і набір 13 TCRB V/J. Для TCRG множина матричних олігонуклеотидів може мати множину олігонуклеотидних послідовностей із загальною формулою (I), в якій V- та J-полінуклеотиди мають послідовності TCRG V та J, зазначені в принаймні одному наборі з 14 TCRG V та J SEQ ID NO відповідно, як вказано на Фіг. 6 як набір 1 TCRG V/J, набір 2 TCRG V/J, набір 3 TCRG V/J, набір 4 TCRG V/J і набір 5 TCRG V/J. Для IGH множина матричних олігонуклеотидів може мати множину олігонуклеотидних послідовностей із загальною формулою (I), в якій V- та J-полінуклеотиди мають послідовності IGH V та J, зазначені в принаймні одному наборі з 127 IGH V та J SEQ ID NO відповідно, як вказано на Фіг. 7 як набір 1 IGH V/J, набір 2 IGH V/J, набір 3 IGH V/J, набір 4 IGH V/J, набір 5 IGH V/J, набір 6 IGH V/J, набір 7 IGH V/J, набір 8 IGH V/J, набір 9 IGH V/J. ПРАЙМЕРИ Відповідно до цього винаходу пропонуються праймери олігонуклеотидів у наборі олігонуклеотидних праймерів, який містить множину праймерів V-сегмента та множину праймерів J-сегмента, причому набір праймерів здатний ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує рецептори адаптивної імунної системи в біологічному зразку, який містить ДНК лімфоїдних клітин. Відповідні набори праймерів добре відомі в галузі та розкриті в цьому 21 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 документі, наприклад, набори праймерів в заявці на патент США № 13/217,126; заявку на патент США № 12/794,507; PCT/US2011/026373; або PCT/US2011/049012 та подібне; або ті, що представлено в Таблиці 1. В певних варіантах втілення винаходу набір праймерів повинен містити множину специфічних для послідовностей праймерів V, що включає принаймні один праймер, який може специфічно гібридизувати з унікальною послідовністю V-області для кожного унікального гена V-області (включаючи псевдогени) у зразку; і принаймні один праймер, який може специфічно гібридизувати з унікальною послідовністю J-області для кожного унікального гена J-області у зразку. Створення праймера може здійснюватися за звичайними методиками з урахуванням відомих геномних послідовностей TCR і BCR. Таким чином, перевага надається набору праймерів, здатному ампліфікувати всі комбінації VJ, які можуть виникнути в результаті перегрупувань ДНК в локусі TCR або BCR. Крім того, як описано нижче, певні варіанти втілення передбачають набори праймерів, в яких один або кілька V-праймерів здатні специфічно гібридизувати з "унікальною" послідовністю, яка може бути спільною для двох або більше Vобластей, але яка не є спільною для всіх V-областей та/або в якій один або більше J-праймерів здатні специфічно гібридизувати з "унікальною" послідовністю, яка може бути спільною для двох або більше J-областей, але яка не є спільною для всіх J-областей. У конкретних варіантах втілення винаходу олігонуклеотидні праймери для використання в описаних в цьому документі наборах і способах можуть містити або складатися з нуклеїнової кислоти завдовжки принаймні прибл. 15 нуклеотидів, яка має ту ж послідовність або комплементарна до безперервної послідовності довжиною 15 нуклеотидів сегментів-мішеней V або J (тобто частина геномного полінуклеотида, що кодує поліпептид V-області або J-області). В певних варіантах втілення можуть використовуватися довші праймери, наприклад, з довжиною приблизно 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45 або 50 нуклеотидів, які мають аналогічну послідовність або послідовність, комплементарну до безперервної послідовності полінуклеотидного сегмента, що кодує областімішені V або J. Для використання в цьому винаході розглядаються всі проміжні довжини описаних в цьому документі олігонуклеотидних праймерів. Фахівцю в цій галузі буде зрозуміло, що до праймерів можна додати послідовність, яка доповнює (наприклад, нуклеотиди, які можуть не бути аналогічними або комплементарними до полінуклеотидного сегмента, що кодує областімішені V або J), таку як сайти розпізнавання рестриктази, адаптерні послідовності для секвенування, послідовності штрих-коду тощо (див., наприклад, послідовності праймерів, представлені в Таблицях та переліку послідовностей в цьому документі). Таким чином, довжина праймерів може бути більшою, наприклад, приблизно 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 85, 90, 95, 100 або більше нуклеотидів залежно від специфічного використання або потреби. В певних варіантах втілення також передбачається використання різновидів олігонуклеотидного праймера V-сегмента або J-сегмента рецептора адаптивної імунної системи, що можуть передавати високий ступінь ідентичності послідовності олігонуклеотидним праймерам, для яких в цьому документі представлені нуклеотидні послідовності, в тому числі ті, що вказані у Переліку послідовностей. Таким чином, в цих та споріднених варіантах втілення варіанти олігонуклеотидних праймерів V-сегмента або J-сегмента рецептора адаптивної імунної системи можуть мати істотну ідентичність з розкритими в цьому документі послідовностями олігонуклеотидного праймера V-сегмента або J-сегмента рецептора адаптивної імунної системи; наприклад, такі варіанти олігонуклеотидних праймерів можуть мати ідентичність послідовності принаймні 70 %, переважніше принаймні 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % або вищу ідентичність послідовності в порівнянні з еталонною полінуклеотидною послідовністю, такою як послідовності розкритих в цьому документі олігонуклеотидних праймерів, з використанням описаних в цьому документі способів (наприклад, аналіз BLAST з використанням стандартних параметрів). Фахівцю в цій галузі техніки буде зрозуміло, що ці величини можна відповідним чином скоригувати для визначення відповідної здатності варіантів олігонуклеотидних праймерів гібридизувати до полінуклеотиду, що кодує сегмент рецептора адаптивної імунної системи, з урахуванням виродженості кодонів, позиціонування у рамках зчитування та подібного. Як правило, олігонуклеотидні праймери містять одне або кілька заміщень, доповнень, делецій та/або вставок, переважно таким чином, що здатність до гібридизації варіантного олігонуклеотиду істотно не знижується по відношенню до такої у зазначеної в цьому документі послідовності олігонуклеотидних праймерів V-сегмента або J-сегмента рецептора адаптивної імунної системи. 22 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 У Таблиці 1 в якості прикладу, але без обмежень, представлено набір олігонуклеотидних праймерів, здатний продуктивно ампліфікувати перегруповану ДНК, що кодує β-ланцюги TCR (TCRB) в біологічному зразку, який включає ДНК з лімфоїдних клітин суб'єкта. В даному наборі праймерів праймери J-сегмента мають спільну істотну гомологію послідовності і, отже, можуть крос-праймувати поміж більше ніж однією полінуклеотидною послідовністю-мішенню J, але праймери V-сегмента призначені для специфічної гібридизації з послідовностями-мішенями в області CDR2 V і тому є унікальними для кожного V-сегмента. Однак у випадку кількох праймерів V присутній виняток, в якому послідовності в межах сімейства близькоспоріднених генів-мішеней є ідентичними (наприклад, V6-2 і V6-3 ідентичні на рівні нуклеотидів всієї послідовності, що кодує сегмент V, і, отже, можуть мати одиночний праймер TRB2V6-2/3). У зв'язку з цим слід розуміти, що в певних варіантах втілення кількість різних матричних олігонуклеотидів у складі матриці та/або кількість різних олігонуклеотидних праймерів в наборі праймерів можна успішно зменшити шляхом створення матриці та/або праймерів для використання певних відомих подібностей у послідовностях V та/або J. Таким чином, в цих та споріднених варіантах втілення "унікальні" олігонуклеотидні послідовності, як описано в цьому документі, можуть включати специфічні полінуклеотидні послідовності V, які є спільними для 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 окремих матричних олігонуклеотидів, та/або специфічні полінуклеотидні послідовності J, які є спільними для 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або 13 окремих матричних олігонуклеотидів, причому такі матриці відрізняються одна від одної послідовностями, відмінними від спільних V- та/або Jпослідовностей. У деяких описаних в цьому документі варіантах втілення корисним може бути зниження (наприклад, статистично значуще) систематичної похибки ампліфікації матриці, такої як потенціал нерівномірної ампліфікації нуклеїнової кислоти між членами набору праймерів для ампліфікації, що може виникнути в результаті різних продуктивностей праймерів (наприклад, різного використання праймерів) тільки для обмеженої підмножини всіх природних V- та J-генів. Наприклад, в аналізах імунного спектру TCR або BCR, залученого в імунній відповіді на конкретний антиген, як у вакцині, або на тканину, як при автоімунному захворюванні, представляти інтерес можуть тільки продуктивні перегрупування TCR або IG. В таких умовах економічно вигідним може бути виявлення і коригування потенціалу нерівномірної ампліфікації нуклеїнових кислот лише для тих праймерів V- та J-сегментів, які сприяють продуктивним перегрупуванням ДНК, що кодує TCR або BCR, для виключення зусиль з коригування нерівномірної ампліфікації псевдогенів і орфонів (тобто сегментів V, що кодують області TCR або BCR, які були продубльовані на інших хромосомах). Наприклад, у локусі IGH людини база даних ImmunoGeneTics (IMGT) (M.-P. LeFranc, Université Montpellier, м. Монпелье, Франція; www.imgt.org) анотує 165 V-генів-сегмента, з яких 26 є орфонами на інших хромосомах, а 139 знаходяться в локусі IGH на хромосомі 14. Серед 139 сегментів V в межах локусу IGH 51 має принаймні одну функціональну алель, 6 — це ORF (відкриті рамки зчитування), в яких відсутній принаймні один висококонсервативний амінокислотний залишок, а ще 81 є псевдогенами. Псевдогени можуть включати сегменти V, які містять термінуючий кодон у рамці, в межах послідовності, що кодує сегмент V, зсув рамки зчитування між стартовим кодоном і послідовністю, що кодує CDR3, одну або більше вставок повторюваних елементів і делецій критичних областей, таких як перший екзон або RSS. Для характеризування функціональних перегрупувань Igh у зразку, уникаючи при цьому витрат часу та коштів на характеризування псевдогенів та/або орфонів, передбачають використання підмножини описаних в цьому документі синтетичних матричних олігонуклеотидів, які розраховані на вміст лише тих сегментів V, які беруть участь у функціональному перегрупуванні для кодування TCR або BCR, без необхідності синтезу або калібрування праймерів для ампліфікації та матричних олігонуклеотидів, специфічних для послідовностей псевдогенів. Таким чином досягають ефективностей, які, зокрема, знижують витрати часу і коштів. Таблиця 1 Взірцевий набір олігонуклеотидних праймерів (Праймери hsTCRB ПЛР) Назва TRBJ1-1 TRBJ1-2 TRBJ1-3 TRBJ1-4 Послідовність TTACCTACAACTGTGAGTCTGGTGCCTTGTCCAAA ACCTACAACGGTTAACCTGGTCCCCGAACCGAA ACCTACAACAGTGAGCCAACTTCCCTCTCCAAA CCAAGACAGAGAGCTGGGTTCCACTGCCAAA 23 SEQ ID NO: 1631 1632 1633 1634 UA 115783 C2 Таблиця 1 Взірцевий набір олігонуклеотидних праймерів (Праймери hsTCRB ПЛР) Назва TRBJ1-5 TRBJ1-6 TRBJ2-1 TRBJ2-2 TRBJ2-3 TRBJ2-4 TRBJ2-5 TRBJ2-6 TRBJ2-7 TRB2V10-1 TRB2V10-2 TRB2V10-3 TRB2V6-2/3 TRB2V6-8 TRB2V6-9 TRB2V6-5 TRB2V6-6 TRB2V6-7 TRB2V6-1 TRB2V6-4 TRB2V24-1 TRB2V25-1 TRB2V27 TRB2V26 TRB2V28 TRB2V19 TRB2V4-1 TRB2V4-2/3 TRB2V2P TRB2V3-1 TRB2V3-2 TRB2V16 TRB2V23-1 TRB2V18 TRB2V17 TRB2V14 TRB2V2 TRB2V12-1 TRB2V12-2 TRB2V12-3/4 TRB2V12-5 TRB2V7-9 TRB2V7-8 TRB2V7-4 TRB2V7-6/7 TRB2V7-2 TRB2V7-3 TRB2V7-1 TRB2V11-123 TRB2V13 TRB2V5-1 TRB2V5-3 TRB2V5-4 Послідовність ACCTAGGATGGAGAGTCGAGTCCCATCACCAAA CTGTCACAGTGAGCCTGGTCCCGTTCCCAAA CGGTGAGCCGTGTCCCTGGCCCGAA CCAGTACGGTCAGCCTAGAGCCTTCTCCAAA ACTGTCAGCCGGGTGCCTGGGCCAAA AGAGCCGGGTCCCGGCGCCGAA GGAGCCGCGTGCCTGGCCCGAA GTCAGCCTGCTGCCGGCCCCGAA GTGAGCCTGGTGCCCGGCCCGAA AACAAAGGAGAAGTCTCAGATGGCTACAG GATAAAGGAGAAGTCCCCGATGGCTATGT GACAAAGGAGAAGTCTCAGATGGCTATAG GCCAAAGGAGAGGTCCCTGATGGCTACAA CTCTAGATTAAACACAGAGGATTTCCCAC AAGGAGAAGTCCCCGATGGCTACAATGTA AAGGAGAAGTCCCCAATGGCTACAATGTC GACAAAGGAGAAGTCCCGAATGGCTACAAC GTTCCCAATGGCTACAATGTCTCCAGATC GTCCCCAATGGCTACAATGTCTCCAGATT GTCCCTGATGGTTATAGTGTCTCCAGAGC ATCTCTGATGGATACAGTGTCTCTCGACA TTTCCTCTGAGTCAACAGTCTCCAGAATA TCCTGAAGGGTACAAAGTCTCTCGAAAAG CTCTGAGAGGTATCATGTTTCTTGAAATA TCCTGAGGGGTACAGTGTCTCTAGAGAGA TATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGGG CTGAATGCCCCAACAGCTCTCTCTTAAAC CTGAATGCCCCAACAGCTCTCACTTATTC CCTGAATGCCCTGACAGCTCTCGCTTATA CCTAAATCTCCAGACAAAGCTCACTTAAA CTCACCTGACTCTCCAGACAAAGCTCAT TTCAGCTAAGTGCCTCCCAAATTCACCCT GATTCTCATCTCAATGCCCCAAGAACGC ATTTTCTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC ATTCACAGCTGAAAGACCTAACGGAACGT TCTTAGCTGAAAGGACTGGAGGGACGTAT TTCGATGATCAATTCTCAGTTGAAAGGCC TTGATTCTCAGCACAGATGCCTGATGT GCGATTCTCAGCTGAGAGGCCTGATGG TCGATTCTCAGCTAAGATGCCTAATGC TTCTCAGCAGAGATGCCTGATGCAACTTTA GGTTCTCTGCAGAGAGGCCTAAGGGATCT GCTGCCCAGTGATCGCTTCTTTGCAGAAA GGCGGCCCAGTGGTCGGTTCTCTGCAGAG ATGATCGGTTCTCTGCAGAGAGGCCTGAGG AGTGATCGCTTCTCTGCAGAGAGGACTGG GGCTGCCCAACGATCGGTTCTTTGCAGT TCCCCGTGATCGGTTCTCTGCACAGAGGT CTAAGGATCGATTTTCTGCAGAGAGGCTC CTGATCGATTCTCAGCTCAACAGTTCAGT TGGTCGATTCTCAGGGCGCCAGTTCTCTA TAATCGATTCTCAGGGCGCCAGTTCCATG TCCTAGATTCTCAGGTCTCCAGTTCCCTA 24 SEQ ID NO: 1635 1636 1637 1638 1639 1640 1641 1642 1643 1644 1645 1646 1647 1648 1649 1650 1651 1652 1653 1654 1655 1656 1657 1658 1659 1660 1661 1662 1663 1664 1665 1666 1667 1668 1669 1670 1671 1672 1673 1674 1675 1676 1677 1678 1679 1680 1681 1682 1683 1684 1685 1686 1687 UA 115783 C2 Таблиця 1 Взірцевий набір олігонуклеотидних праймерів (Праймери hsTCRB ПЛР) Назва TRB2V5-8 TRB2V5-5 TRB2V5-6 TRB2V9 TRB2V15 TRB2V30 TRB2V20-1 TRB2V29-1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Послідовність GGAAACTTCCCTCCTAGATTTTCAGGTCG AAGAGGAAACTTCCCTGATCGATTCTCAGC GGCAACTTCCCTGATCGATTCTCAGGTCA GTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAAC GCCGAACACTTCTTTCTGCTTTCTTGAC GACCCCAGGACCGGCAGTTCATCCTGAGT ATGCAAGCCTGACCTTGTCCACTCTGACA CATCAGCCGCCCAAACCTAACATTCTCAA SEQ ID NO: 1688 1689 1690 1691 1692 1693 1694 1695 В певних варіантах втілення олігонуклеотидні праймери V-сегмента і J-сегмента, як описано в цьому документі, розраховані на вміст нуклеотидних послідовностей, таким чином, що відповідна інформація присутня в послідовності продукту ампліфікації перегрупованого гена рецептора адаптивної імунної системи (TCR або Ig) для унікальної ідентифікації як специфічного V-гена, так і специфічного J-гена, які викликають ампліфікацію продукту в перегрупованому локусі рецептора адаптивної імунної системи (наприклад, принаймні 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 пар основ послідовності вище послідовності рекомбінаційного сигналу (RSS) V-гена; переважно — принаймні приблизно 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39 або 40 пар основ послідовності вище послідовності рекомбінаційного сигналу (RSS) V-гена, і в певних переважних варіантах втілення винаходу — більше 40 пар основ послідовності вище послідовності рекомбінаційного сигналу (RSS) V-гена і принаймні 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 пар основ нижче RSS J-гена; переважно — принаймні приблизно 22, 24, 26, 28 або 30 пар основ нижче RSS J-гена, а в певних переважних варіантах втілення — більше 30 пар основ нижче RSS J-гена). Ця особливість контрастує з описаними в цій галузі олігонуклеотидними праймерами для ампліфікації послідовностей генів, що кодують TCR або Ig, які, в першу чергу, ґрунтуються на реакції ампліфікації лише для виявлення присутності або відсутності продуктів відповідних розмірів для V- та J-сегментів (наприклад, присутність в продуктах ПЛР-реакції амплікону певного розміру вказує на присутність сегментів V або J, але не може продемонструвати послідовність продукту ампліфікації ПЛР і, отже, не може підтвердити свою ідентичність, як при поширеній практиці спектротипування). Олігонуклеотиди (наприклад, праймери) можна отримати за допомогою будь-якого відповідного способу, в тому числі прямого хімічного синтезу за допомогою, наприклад, таких способів, як фосфотриефірний спосіб, описаний в публікації Narang et al., 1979 р., Meth. Enzymol. 68:90–99; фосфодіестеровий спосіб, описаний в публікації Brown et al., 1979 р., Meth. Enzymol. 68:109–151; діетилфосфосфорамідитовий спосіб, описаний в публікації Beaucage et al., 1981 р., Tetrahedron Lett. 22:1859–1862; і спосіб твердої підкладки згідно патенту США № U.S. 4,458,066, кожен з яких включено в цей документ шляхом посилання. Огляд способів синтезу кон'югатів олігонуклеотидів і модифікованих нуклеотидів представлено в публікації Goodchild, 1990 р., Bioconjugate Chemistry 1(3): 165–187, включеній в цей документ шляхом посилання. В контексті цього документа термін "праймер" означає олігонуклеотид, здатний діяти в якості точки ініціації синтезу ДНК у відповідних умовах. Такі умови включають ті, в яких синтез продукту нарощування праймера, комплементарного до ланцюга нуклеїнової кислоти, індукується в присутності чотирьох різних нуклеозидтрифосфатів і реагента для нарощування (наприклад, ДНК-полімерази або зворотної транскриптази) у належному буфері та при відповідній температурі. Бажано, щоб праймер був одноланцюговою ДНК. Відповідна довжина праймера залежить від передбачуваного застосування праймера, але зазвичай знаходиться в діапазоні від 6 до 50 нуклеотидів або, в певних варіантах втілення, від 15 до 35 нуклеотидів. Короткі молекули праймера зазвичай вимагають нижчих температур для утворення достатньо стабільних гібридних комплексів з матрицею. Праймер не повинен відображати точну послідовність матричної нуклеїнової кислоти, але для гібридизації з матрицею він повинен бути достатньою мірою комплементарним. Конструкція відповідних праймерів для ампліфікації заданої послідовності-мішені добре відома в цій галузі й описана в літературі, зазначеній в цьому документі. 25 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як описано в цьому документі, праймери можуть мати додаткові функції, які дозволяють виявити або іммобілізувати праймер, але не змінюють основну властивість праймера, що полягає у його дії в якості точки ініціації синтезу ДНК. Наприклад, праймери можуть містити доповнення у вигляді послідовності нуклеїнової кислоти на кінці 5', що не гібридизує з нуклеїновою кислотою-мішенню, але полегшує клонування, виявлення або секвенування ампліфікованого продукту. Область праймера, який є достатньо комплементарним до матриці для гібридизації з нею, в цьому документі називається областю гібридизації. В контексті цього документа праймер є "специфічним" для послідовності-мішені, якщо при використанні в реакції ампліфікації в досить жорстких умовах праймер в першу чергу гібридизує з нуклеїновою кислотою-мішенню. Як правило, праймер є специфічним для послідовностімішені, якщо стабільність подвійної спіралі праймера-мішені є більшою за стабільність подвійної спіралі, утвореної між праймером та будь-якою іншою послідовністю у зразку. Фахівцю в цій галузі буде зрозуміло, що на специфічність праймера впливатимуть різні фактори, такі як вміст солі, а також набір основ праймера та розміщення невідповідностей, і що в багатьох випадках потрібна процедура експериментального підтвердження специфічності праймера. Можна обирати умови гібридизації, за яких праймер може утворювати стабільні подвійні спіралі лише з послідовністю-мішенню. Таким чином, використання специфічних для мішені праймерів в умовах відповідної жорсткості ампліфікації забезпечує можливість селективної ампліфікації тих послідовностей-мішеней, які містять сайти-мішені зв'язування праймерів. У конкретних варіантах втілення праймери для використання в описаних в цьому документі способах можуть містити або складатися з нуклеїнової кислоти завдовжки принаймні приблизно 15 нуклеотидів, яка має ту ж послідовність або комплементарна до безперервної послідовності довжиною 15 нуклеотидів сегментів-мішеней V або J. В певних варіантах втілення корисно використовувати довші праймери, наприклад, з довжиною приблизно 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45 або 50 нуклеотидів, які мають таку ж послідовність або послідовність, комплементарну до безперервної послідовності сегментів-мішеней V або J. Всі проміжні довжини згаданих раніше праймерів також розглядаються для використання в цьому винаході. Фахівцю в цій галузі буде зрозуміло, що до праймерів можна додати послідовність, яка доповнює (наприклад, нуклеотиди, які можуть не бути аналогічними або комплементарними до сегментів-мішеней V або J), таку як сайти розпізнавання рестриктази, адаптерні послідовності для секвенування, послідовності штрихкоду тощо (див., наприклад, послідовності праймерів, представлені в цьому документі та переліку послідовностей). Таким чином, довжина праймерів може бути більшою, наприклад, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75 нуклеотидів та більше залежно від специфічного застосування або потреби. Наприклад, в одному варіанті втілення і прямий, і реверсний праймери модифіковані на кінці 5' універсальною прямою послідовністю праймера, сумісного з секвенатором ДНК. В певних варіантах втілення також передбачається використання різновидів олігонуклеотидного праймера V-сегмента або J-сегмента рецептора адаптивної імунної системи, що можуть передавати високий ступінь ідентичності послідовності олігонуклеотидним праймерам, для яких в цьому документі представлені нуклеотидні послідовності, в тому числі ті, що вказані у Переліку послідовностей. Таким чином, в цих та споріднених варіантах втілення варіанти олігонуклеотидних праймерів V-сегмента або J-сегмента рецептора адаптивної імунної системи можуть мати істотну ідентичність з розкритими в цьому документі послідовностями олігонуклеотидного праймера V-сегмента або J-сегмента рецептора адаптивної імунної системи; наприклад, такі варіанти олігонуклеотидних праймерів можуть мати ідентичність послідовності принаймні 70 %, переважніше принаймні 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % або вищу ідентичність послідовності в порівнянні з еталонною полінуклеотидною послідовністю, такою як послідовності розкритих в цьому документі олігонуклеотидних праймерів, з використанням описаних в цьому документі способів (наприклад, аналіз BLAST з використанням стандартних параметрів). Фахівцю в цій галузі техніки буде зрозуміло, що ці величини можна відповідним чином скоригувати для визначення відповідної здатності варіантів олігонуклеотидних праймерів гібридизувати до полінуклеотиду, що кодує сегмент рецептора адаптивної імунної системи, з урахуванням виродженості кодонів, позиціонування у рамках зчитування та подібного. Як правило, олігонуклеотидні праймери містять одне або кілька заміщень, доповнень, делецій та/або вставок, переважно таким чином, що здатність до гібридизації варіантного олігонуклеотиду істотно не знижується по відношенню до такої у зазначеної в цьому документі послідовності олігонуклеотидних праймерів V-сегмента або J-сегмента рецептора адаптивної імунної системи. Крім того, як зазначено в інших розділах цього документа, у переважних варіантах втілення олігонуклеотидні праймери V-сегмента та J-сегмента рецептора адаптивної 26 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імунної системи за призначенням здатні ампліфікувати перегруповану послідовність TCR або Igh, що включає кодуючу область для CDR3. В деяких описаних в цьому документі варіантах втілення праймери для використання в способах множинної ПЛР-реакції згідно цього винаходу можуть бути функціонально заблоковані для запобігання неспецифічному праймуванню послідовностей, які не є Т- або В-клітинними. Наприклад, праймери можна блокувати за допомогою хімічних модифікацій, як описано в публікації заявки на патент США US2010/0167353. В деяких описаних в цьому документі варіантах втілення винаходу використання таких заблокованих праймерів у даних множинних ПЛР-реакціях задіє праймери, що можуть мати неактивну конфігурацію, в якій реплікація ДНК (тобто нарощування праймера) блокується, і продовжується активована конфігурація, в якій відбувається реплікація ДНК. Неактивна конфігурація праймера присутня, коли праймер є одноланцюговим або коли праймер специфічно гібридизує з послідовністю-мішенню ДНК, що представляє інтерес, але нарощування праймера залишається блокованим за допомогою хімічної функціональної групи, яка пов'язана з кінцем 3' праймера або розміщена близько до нього. Активована конфігурація праймера присутня, коли праймер гібридизований з послідовністюмішенню нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, і на нього згодом впливає РНКаза Н або інший розщеплюючий реагент для видалення блокуючої групи 3", таким чином дозволяючи ензиму (наприклад, ДНК- полімеразі) каталізувати нарощування праймера в реакції ампліфікації. Не обмежуючись теорією, вважають, що кінетика гібридизації таких праймерів є подібною до реакції другого порядку і, отже, залежить від концентрації послідовності гена Тклітин або В-клітин в суміші. Заблоковані праймери мінімізують неспецифічні реакції, вимагаючи гібридизацію з мішенню з подальшим розщепленням перед нарощуванням праймера. Якщо праймер неправильно гібридизує з послідовністю, пов'язаною з бажаною послідовністюмішенню, але при цьому відрізняється наявністю одного або кількох некомплементарних нуклеотидів, що призводять до помилкового спарювання основ, розщеплення праймера інгібується, особливо коли помилкове спарювання основ здійснюється на або поблизу сайта розщеплення. Цей підхід щодо покращення точності ампліфікації зменшує частоту помилкового праймування в подібних місцях і, таким чином, підвищує специфічність реакції. Фахівцю в цій галузі буде зрозуміло, що умови реакції, зокрема, концентрація РНК-ази Н і час, відведений для гібридизації та нарощування у кожному циклі, можна оптимізувати для максимізації відмінності в ефективності розщеплення між високоефективним розщепленням праймера, коли він правильно гібридизований з правильною для нього послідовністю-мішенню, та неналежним розщепленням праймера, коли існує невідповідність між праймером і матричною послідовністю, з якою він може бути неповністю гібридизований. Як описано в US2010/0167353, добре відомими в цій галузі є декілька блокуючих груп, які можна помістити на або поблизу кінця 3' олігонуклеотиду (наприклад, праймера) для запобігання нарощування. Для запобігання або інгібування ініціації синтезу ДНК можна модифікувати праймер або інший олігонуклеотид на 3'-термінальному нуклеотиді, наприклад, шляхом додавання 3' дезоксирибонуклеотидного залишку (наприклад, кордицепіну), 2', 3' дідезоксирибонуклеотидного залишку, ненуклеотидних зв'язків або алкано-діольних модифікацій (патент США № U.S. 5,554,516). Алкано-діольні модифікації, які можна використати для інгібування або блокування нарощування праймера, також описані в публікаціях Wilk et al., (1990 р. Nucleic Acids Res. 18 (8):2065) та Arnold et al. (Патент США № U.S. 6,031,091). Додаткові приклади відповідних блокуючих груп включають 3' гідроксильні заміщення (наприклад, 3'фосфат-, 3'-трифосфат або 3'-фосфат-діефіри з спиртами, такими як 3-гідроксипропіл), 2'3'циклічний фосфат, 2' гідроксильні заміщення термінальної основи РНК (наприклад, фосфатні або просторово об'ємні групи, такі як триізопропілсіліл (TIPS) або терт-бутил диметилсіліл (TBDMS)). 2'-алкільні сілільні групи, такі як TIPS та TBDMS, заміщені на кінці 3' олігонуклеотиду, описано в публікації Laikhter et al., заявка на патент США, сер. № U.S. 11/686,894, що включено в цей документ шляхом посилання. Для блокування нарощування праймера об'ємні заміщувачі також можуть бути включені в основу залишку олігонуклеотиду на кінці 3'. В певних варіантах втілення олігонуклеотид може містити домен розщеплення, розташований вище (наприклад, 5') блокуючої групи, використаної для інгібування нарощування праймера. Наприклад, домен розщеплення може бути доменом розщеплення РНК-ази Н або доменом розщеплення РНК-ази H2, що містить один залишок РНК; або ж олігонуклеотид може містити заміну основи РНК з одним або декількома альтернативними нуклеозидами. Додаткові ілюстративні домени розщеплення описані в патенті США № US2010/0167353. Таким чином, система множинної ПЛР-реакції може використовувати 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 або більше прямих праймерів, причому кожен прямий праймер комплементарний 27 UA 115783 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одному функціональному сегменту ТКС або Ig V або невеликій родині функціональних сегментів TCR чи Ig V, наприклад, сегмент TCR Vβ, (див., наприклад, праймери TCRBV, як показано в Таблиці 1, SEQ ID NO: 1644–1695), і, наприклад, тринадцять реверсних праймерів, кожен специфічний для сегмента TCR або Ig J, наприклад, сегмента TCR Jβ (див., наприклад, праймери TCRBJ у Таблиці 1, SEQ ID NO: 1631–1643). В іншому варіанті втілення множинна ПЛР-реакція може використовувати чотири прямі праймери, кожен х яких специфічний для одного або більше функціональних V-сегментів TCRγ, та чотири реверсних праймери, кожен з яких специфічний для одного або більше J-сегментів TCRγ. В іншому варіанті втілення множинна ПЛР-реакція може використовувати 84 прямі праймери, кожен з яких специфічний для одного або більше функціональних сегментів V, та шість реверсних праймерів, кожен з яких специфічний для одного або більше сегментів J. Умови циклічної температурної обробки можуть відповідати способам, відомі фахівцям в цій галузі. Наприклад, з використанням термоциклера ПЛР Express™ ПЛР (Hybaid, м. Ашфорд, Велика Британія) можна застосувати наступні циклічні умови: 1 цикл при 95 °C протягом 15 хвилин, від 25 до 40 циклів при 94 °C протягом 30 секунд, 59 °C протягом 30 секунд і 72 °C протягом 1 хвилини, після чого один цикл при 72 °C протягом 10 хвилин. Фахівцю в цій галузі буде зрозуміло, що умови циклічної температурної обробки можна оптимізувати, наприклад, шляхом зміни температури гібридизації, часу гібридизації, кількості циклів і часу нарощування. Фахівцю в цій галузі буде зрозуміло, що кількість праймерів та інших реагентів, що використовуються для ПЛР-реакції, а також параметри ПЛР-реакції (наприклад, температура гібридизації, час нарощування та кількості циклів) можна оптимізувати для досягнення бажаної ефективності ампліфікації ПЛР. Крім того, у певних описаних в цьому документі варіантах втілення винаходу для визначення кількості геномів-мішеней у зразку можна використати методи "цифрової" ПЛР, без необхідності в стандартній кривій. Цифрова ПЛР для одного зразка здійснюється в множині більше ніж 100 мікрокомірок або крапель, таким чином, що кожна крапля або ампліфікує (наприклад, утворення продукту ампліфікації свідчить про присутність принаймні однієї молекули матриці у мікрокомірці або краплі) або не ампліфікує (доказ того, що матриця не була присутня в даній мікрокомірці або краплі). Шляхом простого підрахунку кількості позитивних мікрокомірок можна безпосередньо визначити кількість геномів-мішеней, присутніх у вхідному зразку. Методи цифрової ПЛР зазвичай використовують кінцеву точку зчитування, а не звичайний кількісний сигнал ПЛР, виміряний після кожного циклу в температурній циклічній реакції (див., наприклад, Pekin et al., 2011 р. Lab. Chip 11(13):2156; Zhong et al., 2011 р. Lab. Chip 11(13):2167; Tewhey et al., 2009 р. Nature Biotechnol. 27:1025; 2010 р. Nature Biotechnol. 28:178; Vogelstein and Kinzler, 1999 р. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9236–41; Pohl and Shih, 2004 р. Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1);41–7, 2004 р.). У порівнянні з традиційною ПЛР, цифрова ПЛР (цПЛР) має наступні переваги: (1) немає необхідності керуватися посиланнями чи стандартами; (2) бажаної точності можна досягти за рахунок збільшення загальної кількості реплікацій ПЛР-реакції; (3) висока стійкість до інгібіторів, (4) придатність до аналізу складних сумішей та (5) забезпечення лінійної відповіді на кількість копій, присутніх у зразку, що забезпечує виявлення невеликої зміни кількості копій. Відповідно, будь-які з описаних в цьому документі наборів (наприклад, матриці та набори специфічних для генів олігонуклеотидних праймерів рецептора адаптивної імунної системи) і способів можна адаптувати для використання в таких цифрових системах ПЛР, як, наприклад, ABI QuantStudio™ 12K Flex System (Life Technologies, м. Карлсбад, штат Каліфорнія), система ПЛР QX100™ Droplet Digital™ (Bio-Rad, м. Геркулес, штат Каліфорнія), система цифрової ПЛР QuantaLife™ (BioRad, м. Геркулес, штат Каліфорнія) або система мікрокрапельної цифрової ПЛР Raindance™ (Raindance Technologies, м. Лексінгтон, штат Массачусетс). Адаптери Описані в цьому документі матричні олігонуклеотиди із загальною формулою (I) в певних варіантах втілення можуть також містити першу (U1) і другу (U2) універсальні послідовності адаптивних олігонуклеотидів або можуть не мати U1, U2 або обох. U1, таким чином, може дорівнювати нулю або бути олігонуклеотидом з послідовністю, обраної з (i) першої універсальної послідовності адаптивних олігонуклеотидів та (ii) першої секвенуючої специфічної для платформи олігонуклеотидної послідовності, пов'язаної з і розташованої в позиції 5' відносно першої універсальної послідовності адаптивних олігонуклеотидів; U2 може дорівнювати нулю або бути олігонуклеотидом з послідовністю, обраної з (i) другої універсальної послідовності адаптивних олігонуклеотидів та (ii) другої секвенуючої специфічної для платформи олігонуклеотидної послідовності, пов'язаної з і розташованої в позиції 5' відносно другої універсальної послідовності адаптивних олігонуклеотидів. 28