Антитіло проти інтерлейкіну-17 (іл-17) людини та його застосування

Реферат: Винахід стосується антитіла, що зв'язується з інтерлейкіном-17 (ІЛ-17) людини, корисного для лікування запальних захворювань. UA 103499 C2 (12) UA 103499 C2 UA 103499 C2 5 10 15 20 25 30 35 Даний винахід відноситься до антитіл проти ІЛ-17А людини (антитіло ІЛ-17), способів їх одержання, фармацевтичних композицій, що містять зазначені антитіла, та їх застосуванню. Рівень техніки Інтерлейкін 17А людини (CTLA-8, Swiss Prot Q16552, далі позначається "ІЛ-17") є прозапальним цитокіном, який виробляється підгрупою Т-клітин пам'яті (називаються Th17), що беруть участь у патогенезі розсіяного склерозу (РС). ІЛ-17A бере участь в індукції інших запальних цитокінів, хемокінів і молекул адгезії. Лікування тварин за допомогою антитіл, що нейтралізують ІЛ-17A, знижує сферу охоплення й тяжкість аутоімунного енцефаломієліту (Komiyama Y. та ін., J. Immunol. 177, 2006, сс. 566-573). ІЛ-17A надекспресується у цереброспинальній рідині пацієнтів з розсіяним склерозом (Hellings P.W. та ін., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28, 2003, сс. 42-50; Matusevicius D. та ін., Multiple Sclerosis 5, 1999, сс. 101-104; WO 2005/051422). Крім того, антитіла, що нейтралізують ІЛ-17A, знижують тяжкість й сферу охоплення індукованого колагеном артриту у моделі ревматоїдного артриту (РА) у мишей, і високі рівні ІЛ-17А можуть бути виявлені у синовіальній рідині запалених суглобів у пацієнтів з РА (Ziolkowska M. та ін., J. Immunol. 164, 2000, сс. 2832-2838; Kotake S. та ін., J. Clin. Invest. 103, 1999, сс. 345-1352; Hellings P.W. та ін., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28, 2003, сс. 42-50). WO 96/17939, US 5,716,623; WO 95/18826; WO 97/15320; WO 99/35276 і WO 00/69436 WO 95/18826 US 6,274,711, US 6,274,711, WO 97/15320, US 6,063,372, WO 2006/013107 і WO200802115 відносяться до ІЛ-17A і антитіл проти ІЛ-17A. Короткий опис винаходу Даний винахід включає антитіло, що зв'язується з ІЛ-17, яке відрізняється тим, що варіабельний домен важкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 або 9 і область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3, а також тим, що варіабельний домен легкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 5 і область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 6. Краще антитіло відрізняється тим, що варіабельний домен важкого ланцюга включає SEQ ID NO: 7 або 10. Краще антитіло відрізняється тим, що варіабельний домен важкого ланцюга включає SEQ ID NO: 7 або 10, а варіабельний домен легкого ланцюга включає SEQ ID NO: 8. Краще антитіло, що зв'язує ІЛ-17 і відрізняється зазначеними вище амінокислотними послідовностями й фрагментами амінокислотних послідовностей, є ізотипом IgG1 людини, модифікованим у шарнірній області за положенням амінокислот 216-240, переважно за положенням амінокислот 220-240, між CH1 і CH2, і/або у другій внутрішньодоменній області за положенням амінокислот 327-331 між CH2 і CH3. Краще антитіло включає мутації L234A (аланін замість лейцину за положенням амінокислоти 234) і L235A. Краща константна область важкого ланцюга, що включає мутації L234A і L235A, показана у SEQ ID NO: 11. Краща лінія гібридомних клітин за даним винаходом, 1A1.3C1 (антитіло 3C1) депонована у колекції Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Брауншвейг, Німеччина. Лінія клітин 1A1.3C1 Номер у колекції DSM ACC2941 Дата депонування 12 серпня 2008 40 45 50 55 Антитіло, яке одержують зі зазначеної лінії клітин (антитіло 3C1), є кращим варіантом здійснення даного винаходу. Іншим об'єктом за даним винаходом є химерним, гуманізованим або виснаженим за епітопом Т-клітин варіантом антитіла 3C1 (DSM ACC2941). Антитіло специфічно зв'язується з ІЛ-17 з величиною IC50, рівною 1 нМ або менше. Кращими версіями 3C1 є Mab 106 і Mab 107. Даний винахід також відноситься до антитіла, що зв'язує ІЛ-17 і відрізняється тим, що зв'язується з тим же епітопом ІЛ-17, з яким зв'язується моноклональне антитіло 3С1. Антитіло, -8 -1 -12 -1 що зв'язується з ІЛ-17 зі спорідненістю, що становить щонайменше від 10 M дo 10 M , є ізотипом IgG1 людини, модифікованим у шарнірній області за положенням амінокислот 216-240, переважно за положенням амінокислот 220-240, між CH1 і CH2, і/або у другій внутрішньодоменній області за положенням амінокислот 327-331 між CH2 і CH3. Краще антитіло є ізотипом IgG1 людини, що включає мутації L234A (аланін замість лейцину за положенням амінокислоти 234) і L235A. Краще антитіло є гуманізованим або антитілом людини. Краще антитіло за даним винаходом інгібує у концентрації 100 нг/мл індуковану ІЛ-17A макаки крабоїда вироблення ІЛ-6 і ІЛ-8 в аналізі вивільнення цитокіну з величиною IC50, рівною 1,5 нМ або нижче, використовуючи шкірні фібробласти макаки крабоїда. 1 UA 103499 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В іншому варіанті здійснення даного винаходу представлена фармацевтична композиція антитіла за даним винаходом. Переважно фармацевтична композиція включає антитіло, яке відрізняється зв'язуванням з тим же епітопом ІЛ-17, з яким зв'язується моноклональне антитіло 3С1. Краще антитіло фармацевтичної композиції, що зв'язується з ІЛ-17 зі ступенем -8 -1 -12 -1 спорідненості, яке становить щонайменше від 10 M дo 10 M , є ізотипом IgG1 людини, модифікованим у шарнірній області за положенням амінокислот 216-240, переважно за положенням амінокислот 220-240, між CH1 і CH2, і/або у другій внутрішньодоменній області за положенням амінокислот 327-331 між CH2 і CH3. Переважно антитілом є ізотип IgG1 людини, що включає мутації L234A (аланін замість лейцину за положенням амінокислоти 234) і L235A. В іншому варіанті здійснення даного винаходу застосовують антитіло за даним винаходом для одержання фармацевтичної композиції. Переважно фармацевтична композиція включає антитіло, яке відрізняється зв'язуванням з тим же епітопом ІЛ-17, з яким зв'язується моноклональне антитіло 3C1. Краще антитіло фармацевтичної композиції, що зв'язується з ІЛ-8 -1 -12 -1 17 зі ступенем спорідненості, що становить щонайменше від 10 M дo 10 M , є ізотипом IgG1 людини, модифікованим у шарнірній області за положенням амінокислот 216-240, переважно за положенням амінокислот 220-240, між CH1 і CH2, і/або у другій внутрішньодоменній області за положенням амінокислот 327-331 між CH2 і CH3. Краще антитіло є ізотипом IgG1 людини, що включає мутації L234A (аланін замість лейцину за положенням амінокислоти 234) і L235A. В іншому варіанті здійснення даного винаходу застосовують антитіло за даним винаходом для лікування розсіяного склерозу, ревматоїдного артриту, псоріазу, хвороби Крона, хронічного обструктивного захворювання легенів (ХОЗЛ), астми й відторгнення трансплантата. В іншому варіанті здійснення даного винаходу передбачений спосіб одержання фармацевтичної композиції, що включає антитіло за даним винаходом. Переважно фармацевтична композиція включає антитіло, яке відрізняється зв'язуванням з тим же епітопом ІЛ-17, з яким зв'язується моноклональне антитіло 3C1. Краще антитіло фармацевтичної композиції, що зв'язується з ІЛ-8 -1 -12 -1 17 зі ступенем спорідненості, що становить щонайменше від 10 M дo 10 M , є ізотипом IgG1 людини, модифікованим у шарнірній області за положенням амінокислот 216-240, переважно за положенням амінокислот 220-240, між CH1 і CH2, і/або у другій внутрішньодоменній області за положенням амінокислот 327-331 між CH2 і CH3. Краще антитіло є ізотипом IgG1 людини, що включає мутації L234A (аланін замість лейцину за положенням амінокислоти 234) і L235A. Іншим об'єктом даного винаходу є нуклеїнова кислота, що кодує важкий ланцюг антитіла, що зв'язується з ІЛ-17, яке відрізняється включенням області CDR3 важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1, і переважно мутацій L234A і L235A у константний домен важкого ланцюга IgG1. Краще антитіло включає також область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 або 9 і область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3. Іншим об'єктом даного винаходу є нуклеїнова кислота, що кодує легкий ланцюг антитіла, що зв'язується з ІЛ-17, яке відрізняється включенням області CDR3 легкого ланцюга за даним винаходом й переважно мутацій L234A і L235A у константний домен важкого ланцюга IgG1. Краще антитіло включає також область CDR2 важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2 або 9 і область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3. Іншим об'єктом даного винаходу є нуклеїнова кислота, що кодує антитіло за даним винаходом, яке відрізняється включенням варіабельного домену важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 7 або 10 і варіабельного домену легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 8 і переважно мутацій L234A і L235A у константному домені важкого ланцюга IgG1. Антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що константні ланцюги походять від людини. Такі константні ланцюги відомі у даній області й, наприклад, описані Kabat (див., наприклад, Johnson G. і Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, сс. 214-218). Наприклад, корисна константна область важкого ланцюга людини включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 11 з мутаціями L234A і L235A. Наприклад, корисна константна область легкого ланцюга людини включає амінокислотну послідовність константної області каппа-легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 12. Також переважно, щоб антитіло походило від миші й включало основу варіабельної послідовності антитіла миші за Kabat (див., наприклад, Johnson G. і Wu T.T., Nucleic Кислотаs Res. 28, 2000, сс. 214-218). Антитіло за даним винаходом особливо відрізняється придушенням виділення інтерлейкіну8 (ІЛ-8) з клітин CCD25-SK. Антитіло за даним винаходом специфічно нейтралізує опосередковану ІЛ-17 активацію клітин із величиною IC50, рівною 0,5 нМ (16 нг/мл) або менше. Антитіло за даним винаходом специфічно зв'язується з ІЛ-17 з величиною IC50, рівною 1 нМ або менше. 2 UA 103499 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіло за даним винаходом переважно є ізотипом IgG1 людини. Кращі константні області γ1 важкого ланцюга показані у SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 11 без мутацій L234A і L235A. Антитіло за даним винаходом переважно відрізняється відсутністю зв'язування фактора C1q комплементу людини й, отже, не має ефекторної функції CDC. Антитіло за даним винаходом переважно є ізотипом IgG1 людини, модифікованим у шарнірній області за положенням амінокислот 216-240, переважно за положенням амінокислот 220-240, між CH1 і CH2, і/або у другій внутрішньодоменній області за положенням амінокислот 327-331 між CH2 і CH3. Антитіло за даним винаходом переважно відрізняється приналежністю до ізотипу IgG1 людини, що містить щонайменше одну мутацію, L234 (лейцину за положенням амінокислот 234), L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 і/або P329 (нумерація за індексом EU). Краще антитіло є ізотипом IgG1 людини, що включає мутації L234A (аланін замість лейцину за положенням амінокислоти 234) і L235A. Даний винахід також передбачає вектори експресії, що містять нуклеїнову кислоту за даним винаходом, які здатні експресувати зазначену нуклеїнову кислоту у прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяїнах, і клітини-хазяїни, що містять такі вектори, для одержання шляхом рекомбінації такого антитіла. Даний винахід також включає прокаріотичні або еукаріотичні клітини-хазяїни, що включають вектор за даним винаходом. Даний винахід також включає спосіб одержання рекомбінантного антитіла людини або гуманізованого антитіла за даним винаходом, яке відрізняється експресією нуклеїнової кислоти за даним винаходом у прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяїнах, і виділення зазначеного антитіла зі зазначених клітин або супернатанта культури клітин. Даний винахід також включає антитіло, яке одержують таким рекомбінантним методом. Антитіла за даним винаходом демонструють користь для пацієнтів, які потребують ІЛ-17 терапії, що націлює. Антитіла за даним винаходом мають нові й патентоспроможні властивості, що приносять користь для пацієнта з наступними імунологічними захворюваннями, особливо з розсіяним склерозом, ревматоїдним артритом, псоріазом, хворобою Крона, хронічним обструктивним захворюванням легенів (ХОЗЛ), астмою або відторгненням трансплантата. Антитіла за даним винаходом не викликають чутливості до стафілококової і кишкової бактеріальної інфекції у пацієнтів, що піддаються лікуванню. Даний винахід додатково передбачає спосіб лікування пацієнта з розсіяним склерозом, ревматоїдним артритом, псоріазом, хворобою Крона, хронічним обструктивним захворюванням легенів (ХОЗЛ), астмою або відторгненням трансплантата, що включає введення пацієнтові з установленим зазначеним захворюванням (і, отже, що потребує такої терапії) ефективної кількості антитіла, що зв'язується з ІЛ-17 за даним винаходом. Антитіла переважно вводять у фармацевтичній композиції. В іншому варіанті здійснення даного винаходу передбачений спосіб лікування пацієнта з розсіяним склерозом, ревматоїдним артритом, псоріазом, хворобою Крона, хронічним обструктивним захворюванням легенів (ХОЗЛ), астмою або відторгненням трансплантата, який відрізняється введенням пацієнтові антитіла за даним винаходом. Даний винахід також включає застосування антитіла за даним винаходом для лікування пацієнта з розсіяним склерозом, ревматоїдним артритом, псоріазом, хворобою Крона, хронічним обструктивним захворюванням легенів (ХОЗЛ), астмою або відторгненням трансплантата й для одержання фармацевтичної композиції за даним винаходом. Крім того, даний винахід також включає спосіб одержання фармацевтичної композиції за даним винаходом. Даний винахід також включає фармацевтичну композицію, що включає антитіло за даним винаходом, необов'язково разом із буфером і/або ад'ювантом, для складу антитіл для фармацевтичних потреб. Даний винахід також передбачає фармацевтичні композиції, що включають антитіло за даним винаходом у фармацевтично прийнятному носії. В одному варіанті здійснення даного винаходу фармацевтична композиція може бути включена у виріб або у набір. Докладний опис винаходу Поняття "антитіло" охоплює різні форми структур антитіл, включаючи, але ними не обмежуючись, цілі антитіла й фрагменти антитіл. Антитіло за даним винаходом переважно є гуманізованим антитілом, химерним антитілом або іншим генетично сконструйованим антитілом, зміненим, але, яке не втратило специфічних властивостей за даним винаходом. Поняття "фрагменти антитіла" включають частину антитіла повної довжини, переважно його варіабельний домен, або щонайменше його сайт зв'язування антигену. До прикладів фрагментів антитіл відносяться двовалентні антитіла, молекули одноланцюгових антитіл і поліспецифічних антитіл, сформованих із фрагментів антитіл. Антитілами scFv є, наприклад, антитіла, описані у роботі Huston J.S., Methods in Enzymol. 203, 1991, сс. 46-52. Крім того, фрагменти антитіл включають одноланцюгові поліпептиди, що мають властивості домену V H, тобто здатні 3 UA 103499 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з'єднуватися разом із доменом VL, або з доменом VL, що зв'язується з ІЛ-17, тобто здатні з'єднуватися разом із доменом VH з функціональним антиген-єднальним сайтом і тим самим забезпечувати властивості антитіла за даним винаходом. Поняття "моноклональне антитіло" або "композиція моноклонального антитіла", які використовуються у даному винаході, відносяться до одержання молекул антитіл однієї амінокислотної композиції. Поняття "гуманізоване антитіло" відноситься до антитіл, у яких каркасна ділянка й/або "комплементарно детерміновані області (сomplementary determining regions-CDR)» модифіковані для включення CDR імуноглобуліну від іншого виду у порівнянні з CDR вихідного імуноглобуліну. У кращому варіанті здійснення даного винаходу CDR миші пересаджують у каркасну ділянку антитіла людини для одержання "гуманізованого антитіла". Див., наприклад, Riechmann L. та ін., Nature 332, 1988, сс. 323-327; і Neuberger M.S. та ін., Nature 314, 1985, сс. 268-270. Поняття "зв'язування з ІЛ-17", яке використовується у даному винаході, означає зв'язування антитіла з ІЛ-17 людини в аналізі зв'язування ELISA. Зв'язування встановлюють, якщо антитіло викликає співвідношення С/Ш (сигнал/шум) 7:1 або більше при концентрації антитіла 1 мкг/мл. Антитіло за даним винаходом специфічно зв'язується з ІЛ-17A людини з величиною IC50, рівною 1 нМ (0,15 мкг/мл) або нижче. Антитіло не зв'язується з ІЛ-17 B, C, D, E і F (співвідношення С/Ш (сигнал/шум) нижче 7:1) і, отже, специфічно зв'язується з ІЛ-17A. Зв'язування з ІЛ-17A і варіантами проводять методом ELISA, використовуючи імобілізований ІЛ-17 або його варіант. Поняття "епітоп" означає білковий детермінант, здатний специфічно зв'язуватися з антитілом. Епітопи звичайно складаються з хімічно активних поверхневих угруповань молекул, наприклад, амінокислот або бічних ланцюгів цукрів, і звичайно епітопи мають специфічні тривимірні просторові структурні характеристики, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні й неконформаційні епітопи відрізняються тим, що зв'язування з першими, але не з другими, втрачається у присутності денатуруючих розчинників. Краще антитіло за даним винаходом зв'язується специфічно з нативним, але не денатурованим ІЛ-17. Антитіло ІЛ-17 за даним винаходом зв'язується з тим же епітопом на ІЛ-17, з яким зв'язується антитіло Mab317. Властивість зв'язувати епітоп антитіла ІЛ-17 за даним винаходом може бути визначена, використовуючи методи, відомі у даному винаході. Антитіло ІЛ-17 тестують in vitro за допомогою аналізу перехресного блокуючого зв'язування для визначення здатності досліджуваного антитіла перешкоджати зв'язуванню антитіла Mab317 з ІЛ-17. Якщо відбувається витиснення досліджуваного антитіла антитілом Mab317 щонайменше на 15 %, тоді епітопи перебувають у безпосередній близькості. Поняття "варіабельний домен" (варіабельний домен легкого ланцюга (V L), варіабельний домен важкого ланцюга (VH)) у контексті даного винаходу означає кожний з доменів пари легкого й важкого ланцюга, які безпосередньо залучені у зв'язування антитіла з антигеном. Варіабельні домени легкого і важкого ланцюгів мають ту ж загальну структуру, і кожний домен включає чотири області каркасних ділянок (FR), послідовності яких, у високому ступені консервативні, з'єднані трьома "гіперваріабельними областями" (або комплементарно детермінованими областями - CDR). Каркасні ділянки приймають конфігурацію β-площини й CDR можуть формувати петлі, що з'єднують структуру β-площини. Області CDR у кожному ланцюзі підтримуються у властивій їм тривимірній структурі каркасними ділянками й формують разом із областями CDR з іншого ланцюга сайт зв'язування антигену. Області CDR3 легкого ланцюга антитіла грають особливо важливу роль у специфічному зв'язуванні/спорідненості антитіл за даним винаходом й, отже, передбачають інший об'єкт за даним винаходом. Поняття "антиген-єднальна частина антитіла", яке використовується у даному винаході, відноситься до амінокислотних залишків антитіла, відповідальних за зв'язування антигену. Антиген-єднальна частина антитіла включає амінокислотні залишки з "комплементарно детермінованих областей (CDR)". Поняття "каркасна ділянка (Framework-FR)" або "області FR" відносяться до тих варіабельних областей доменів, які відрізняються від залишків гіперваріабельних областей, описаних у даному винаході. Таким чином, варіабельні домени легкого й важкого ланцюгів антитіл включають від N- дo C-кінця домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. Особливо CDR3 важкого ланцюга є областю, яка найбільшим чином сприяє зв'язуванню антигену й обумовлює властивості антитіла. Області CDR і FR визначають за стандартним визначенням Kabat та ін. у кн.: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1991, 5-е вид., вид. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Меріленд, і/або за такими залишками з "гіперваріабельної петлі". Поняття "амінокислота", яке використовується у даному винаході, означає групу природних карбоксі-α-амінокислот, включаючи аланін (за трибуквеним кодом: ala, за однобуквеним кодом: A), аргінін (arg, R), аспарагін (asn, N), аспарагінову кислоту (asp, D), цистеїн (cys, C), глутамін (gln, Q), глутамінову кислоту (glu, E), гліцин (gly, G), гістидин (his, H), ізолейцин (ile, I), лейцин 4 UA 103499 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (leu, L), лізин (lys, K), метіонін (met, M), фенілаланін (phe, F), пролін (pro, P), серин (ser, S), треонін (thr, T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) і валін (val, V). Поняття "нуклеїнова кислота" або "молекула нуклеїнової кислоти" у контексті даного винаходу означає молекули ДНК і молекули РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але переважно є дволанцюговою ДНК. Нуклеїнова кислота є "оперативно зв'язаною", якщо вона розташована у функціональному зв'язку з іншою нуклеїновою кислотою. Наприклад, ДНК послідовності-попередника або секреторного лідера оперативно пов'язана з ДНК поліпептиду, якщо він експресується як білок-попередник, що бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер оперативно пов'язані з послідовністю, що кодує, якщо вони впливають на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосоми є оперативно пов'язаним із послідовністю, що кодує, якщо він розташований таким чином, щоб сприяти трансляції. Звичайно "оперативно зв'язаний" означає, що послідовності ДНК, будучи зв'язаними, лежать на одній прямій, і у випадку секреторного лідера стикаються у рамці зчитування. Однак енхансери не повинні стикатися. Зв'язування доповнюється лігуванням за відповідними сайтами рестрикції. Якщо таких сайтів немає, використовують синтетичні олігонуклеотидні адаптори або лінкери згідно зі звичайною практикою. У контексті даного винаходу поняття "клітини", "клітинні лінії" і "культури клітин" використовують взаємозамінно, і всі ці позначення включають наступні генерації. Таким чином, поняття "трансформанти" і "трансформовані клітини" включають клітини головного суб'єкта й культури, похідні від них, незалежно від числа пересівань. Також варто розуміти, що всі наступні генерації можуть бути повністю неідентичними за ДНК через сплановані або випадкові мутації. До цих понять також відносяться варіанти наступних генерацій, що мають ту ж функцію або ту ж біологічну дію, що й спочатку трансформовані клітини. "Частина Fc" антитіла не бере участь безпосередньо у зв'язуванні антитіла з антигеном, але проявляє різні ефекторні функції. Термін "частина Fc антитіла" відомий фахівцям у даній області й визначається за розщепленням антитіл папаїном. Залежно від амінокислотної послідовності константної області їхніх важких ланцюгів, антитіла або імуноглобуліни діляться на класи: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, і деякі з них можуть бути додатково поділені на підкласи (ізотипи), наприклад IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4, IgA1 і IgA2. За константними областями важкого ланцюга різні класи імуноглобулінів називаються α, δ, ε γ і μ відповідно. Частина Fc антитіла безпосередньо включена в ADCC (antitilo-dependent cell-mediated cytotoxicity - антитілообумовлену клітиннозалежну цитотоксичність) і CDC (complement-dependent cytotoxicity комплемент-залежну цитотоксичність), засновані на активації комплементу, зв'язуванні C1q і зв'язуванні рецептора Fc. Активація комплементу (CDC) ініціюється зв'язуванням фактора комплементу C1q з частиною Fc більшості антитіл підкласу IgG. Хоча вплив антитіла на систему комплементу залежить від певних умов, зв'язування з C1q обумовлене певними сайтами зв'язування у частині Fc. Такі сайти зв'язування відомі у даній області й описані, наприклад, Boakle R.J. та ін., Nature 282, 1979, сс. 742-743; Lukas T.J. та ін., J. Immunol. 127, 1981, сс. 25552560; Brunhouse R. і Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, сс. 907-917; Burton D.R. та ін., Nature 288, 1980, сс. 338-344; Thommesen J.E. та ін., Mol. Immunol. 37, 2000, сс. 995-1004; Idusogie E.E. та ін., J. Immunol. 164, 2000, сс. 4178-4184; Hezareh M. та ін., J. Virology 75, 2001, сс. 12161-12168; Morgan A. та ін., Immunology 86, 1995, сс. 319-324; EP 0307434. Такими сайтами зв'язування є, наприклад, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 і P329 (нумерацію за індексом EU за Kabat, див. нижче). Антитіла підкласів IgG1, IgG2 і IgG3 звичайно проявляють активування комплементу й зв'язування C1q, хоча IgG4 не активує систему комплементу й не зв'язує C1q. Антитіло за даним винаходом включає частину Fc, яка походить від людини, що є частиною Fc антитіла людини підкласу IgG1. Для частини Fc антитіла за даним винаходом переважно не можна виявити зв'язування C1q, відповідно до описаного нижче. Таким чином, даний винахід включає антитіло за даним винаходом, яке відрізняється тим, що зазначене антитіло зв'язує ІЛ-17, що містить частину Fc, яка походить від людини, і не зв'язує фактор C1q комплементу людини й, отже, уникає ефекторної функції CDC. Краще антитіло за даним винаходом зв'язується з рецептором Fcγ підкласу IgG1 або IgG2 людини, з мутацією у L234, L235 і/або D265, і/або мутацією PVA236. Кращі мутації L234A, L235A, L235E і/або PVA236 (PVA236 означає, що амінокислотна послідовність ELLG (за однобуквеним кодом амінокислот) у положеннях амінокислот 233-236 в IgG1 або EFLG в IgG4 заміщена на PVA). Таким чином, даний винахід також передбачає антитіло за даним винаходом, яке відрізняється тим, що зазначене антитіло є антитілом підкласу IgG1 людини, що включає щонайменше одну мутацію L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 і/або P329. В одному з варіантів здійснення даного винаходу антитіло є антитілом людини. В іншому варіанті здійснення даного винаходу антитіло є гуманізованим. В іншому варіанті здійснення 5 UA 103499 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 даного винаходу передбачене антитіло за даним винаходом, що містить частину Fc, похідну від антитіла людини, і яке відрізняється тим, що зазначене антитіло є антитілом людини підкласу IgG1, що містить щонайменше одну мутацію у L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 і -8 зазначене антитіло зв'язується з ІЛ-17 з величиною KD менше 10 M в аналізі BIAcore. В іншому -11 -9 варіанті здійснення даного винаходу діапазон KD становить від 10 дo 10 M. Зв'язування C1q може бути виміряне за Idusogie E.E. та ін., J. Immunol. 164, 2000, сс. 41784184. Але зв'язування C1q за даним винаходом відрізняється тим, що у такому аналізі, в якому планшет ELISA покритий різними концентраціями антитіла, додають C1q людини. Зв'язування C1q визначають за допомогою антитіла, спрямованого проти C1q людини, з наступним виявленням кон'югату, міченого пероксидазою, з субстратом для пероксидази ABTS® (2,2'азино-ді- [3-етилбензтіазолінсульфонатом]). За даним винаходом не встановлене зв'язування C1q, якщо оптична щільність (ОЩ) при 405 нм досліджуваного антитіла нижче 0,05 при концентрації антитіла 10 мкг/мл. Антитіло за даним винаходом переважно відрізняється тим, що константні ланцюги походять від людини. Такі константні ланцюги відомі у даній області й описані, наприклад, Kabat (див., наприклад, Johnson G. і Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, сс. 214-218). Наприклад, корисна константна область важкого ланцюга людини включає SEQ ID NO: 23. Наприклад, корисна константна область легкого ланцюга людини включає амінокислотну послідовність константної області каппа-легкого ланцюга SEQ ID NO: 12. В іншому варіанті здійснення даного винаходу передбачена нуклеїнова кислота, що кодує важкий й легкий ланцюги антитіла за даним винаходом. Даний винахід включає спосіб лікування пацієнта, що потребує такого лікування, який відрізняється введенням пацієнтові терапевтично ефективної кількості антитіла за даним винаходом. Даний винахід включає застосування антитіла за даним винаходом для лікування. Даний винахід включає застосування антитіла за даним винаходом для одержання лікарського засобу для профілактики й лікування запальних і тромботичних розладів. Даний винахід включає застосування антитіла за даним винаходом для лікування запальних захворювань, переважно для лікування хронічного обструктивного захворювання легенів (ХОЗЛ), розсіяного склерозу й ревматоїдного артриту. До антитіл за даним винаходом також відносяться такі антитіла з "модифікаціями консервативних послідовностей" (варіанти антитіл), модифікаціями нуклеотидних і амінокислотних послідовностей, які не впливають або не змінюють зазначені вище характеристики антитіла за даним винаходом. Модифікації можуть бути інтродуковані стандартними методами, відомими у даній області, наприклад, сайт-спрямованим мутагенезом і ПЛР-опосередкованим мутагенезом. До консервативних амінокислотних заміщень відносяться ті, в яких амінокислотний залишок заміщений амінокислотним залишком, що має подібний бічний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, визначені у даній області. До цих сімейств відносяться амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), бетарозгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Tаким чином, амінокислотні залишки, що прогнозувалися, в анти-ІЛ-17 антитілі людини можуть бути переважно заміщені іншими амінокислотними залишками з сімейства з тим же бічним ланцюгом. "Варіантом" анти-ІЛ-17 антитіла у контексті даного винаходу називається молекула, яка відрізняється за амінокислотною послідовності від "вихідної" амінокислотної послідовності анти-ІЛ-17 антитіла десятьма, переважно приблизно двома - п'ятьма, додаваннями, делеціями й/або заміщеннями в одній або декількох варіабельних областях вихідного антитіла. Амінокислотні заміщення можуть бути отримані мутагенезом, заснованим на молекулярному моделюванні, описаному Riechmann L. та ін., Nature 332, 1988, сс. 323-327, і Queen C. та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 10029-10033. Інший варіант здійснення даного винаходу передбачає спосіб одержання антитіла проти ІЛ17, що не зв'язує рецептор Fcγ і/або C1q, який відрізняється тим, що послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг антитіла типу IgG1 людини, що зв'язується з ІЛ-17, модифікована таким чином, що зазначене модифіковане антитіло не зв'язується з C1q і/або Fcγ рецептором, зазначена модифікована нуклеїнова кислота й нуклеїнова кислота, що кодує легкий ланцюг зазначеного антитіла, інсертовані у вектор експресії, зазначений вектор 6 UA 103499 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інсертований в еукаріотичну клітину-хазяїна, кодований білок експресується й виділяється з клітин-хазяїнів або з супернатанта. Ідентичність або гомологія послідовностей у даному винаході виражена у вигляді відсотка амінокислотних залишків у досліджуваній послідовності, ідентичній з вихідною послідовністю, після вирівнювання послідовностей і інтродукції гепів при необхідності для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей. Жодна з N-кінцевої, C-кінцевої або внутрішньої мутації за типом протяжного відрізка, делеції, або інсерції у послідовність антитіла не може бути сконструйована в якості визначаючої ідентичність або гомологію послідовності. Варіант зберігає здатність зв'язувати ІЛ-17 людини і переважно має властивості, що перевершують властивості вихідного антитіла. Наприклад, варіант може проявляти знижені побічні ефекти при лікуванні. "Вихідне" антитіло включає області CDR антитіла 3C1 і переважно використовується для одержання варіанта. Переважно вихідне антитіло містить каркасну ділянку й, якщо є, містить константну область антитіла людини або константні домени антитіла людини. Наприклад, вихідне антитіло може бути гуманізованим антитілом або антитілом людини. Антитіла за даним винаходом переважно одержують методами рекомбінації. Такі методи добре відомі у даній області й включають експресію білка у прокаріотичних і еукаріотичних клітинах із наступним виділенням поліпептиду антитіла й звичайно очищенням до фармацевтично прийнятної чистоти. Для експресії білка нуклеїнові кислоти, що кодують легкий й важкий ланцюги або їх фрагменти, інсертують у вектори експресії стандартними методами. Експресію проводять у відповідних прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяїнах, наприклад, клітинах CHO, клітинах NS0, клітинах SP2/0, клітинах HEK293, клітинах COS, у дріжджах або клітинах E. coli, і антитіло виділяють з клітин (з супернатанта або після лізису клітин). Рекомбінантне одержання антитіл відоме у даній області й описане, наприклад, в оглядових статтях Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, сс. 183-202; Geisse S. та ін., Protein Expr. Purif. 8, 1996, сс. 271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, сс. 151-160; Werner R.G., Drug Res. 48, 1998, сс. 870-880. Антитіла можуть бути присутніми у цілих клітинах, у лізатах клітин або у частково очищеній або істотно очищеній формі. Очищення проводять для елімінації інших клітинних компонентів або інших контамінантів, наприклад, інших клітинних нуклеїнових кислот або білків, стандартними методами, включаючи колонкову хроматографію й інші, добре відомі у даній області. Див. кн.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1987, під ред. Ausubel F. та ін., вид-во Greene Publishing and Wiley Interscience, Нью-Йорк. Експресію у клітинах NS0 описують, наприклад, Barnes L.M. та ін., Cytotechnology 32, 2000, сс. 109-123; Barnes L.M. та ін., Biotech. Bioeng. 73, 2001, сс. 261-270. Короткочасну експресію описують, наприклад, Durocher Y. та ін., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, с. E9. Клонування варіабельних доменів описують Orlandi R. та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 3833-3837; Carter P. та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, сс. 4285-4289; Norderhaug L. та ін., J. Immunol. Methods 204, 1997, сс. 77-87. Система кращої короткочасної експресії (HEK 293) описана Schlaeger E.-J. і Christensen K., Cytotechnology 30, 1999, сс. 71-83, і Schlaeger E.-J., J. Immunol. Methods 194, 1996, сс. 191-199. Моноклональні антитіла відповідним чином відокремлюють від культурального середовища звичайними методами очищення імуноглобуліну, наприклад, хроматографією зі застосуванням білка А-цефарози, гідроксилапатиту, гель-електрофорезом, діалізом або афінною хроматографією. ДНК і РНК, що кодують моноклональні антитіла, легко виділити й секвенувати, використовуючи звичайні процедури. Гібридомні клітини можуть служити джерелом таких ДНК і РНК. Після виділення ДНК може бути інсертована у вектори експресії, які потім трансфекують у клітини-хазяїни, наприклад, клітини HEK 293, клітини CHO або клітини мієломи, які іншим способом не виробляють білок, для синтезу рекомбінантних моноклональних антитіл у клітинах-хазяїнах. Варіанти амінокислотної послідовності антитіла ІЛ-17 людини одержують шляхом впровадження відповідних нуклеотидних змін у ДНК, що кодує антитіло, або синтезом пептиду. Однак такі модифікації можуть бути здійснені тільки у досить обмеженому діапазоні, наприклад, описаному вище. Наприклад, модифікації не змінюють зазначених вище властивостей антитіла, наприклад, ізотипу IgG і зв'язування епітопу, але можуть поліпшити вихід рекомбінантного продукту, стабільність білка або полегшити очищення. Який-небудь залишок цистеїну, що не бере участь у підтримці правильної конформації aнти-ІЛ-17 антитіла, також може бути заміщений, звичайно серином, для поліпшення окисної стабільності молекули й для попередження порушеного перехресного схрещування. Навпроти, цистеїнові зв'язки (зв'язок) можуть бути додані до антитіла для поліпшення його стабільності (особливо якщо антитіло є фрагментом антитіла, наприклад, фрагментом Fv). Інший тип варіанта амінокислоти антитіла змінює первісний варіант глікозилування антитіла. Поняття "зміна" означає видалення однієї 7 UA 103499 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або декількох вуглеводневих частин молекул, виявлених в антитілі, і/або видалення одного або декількох сайтів глікозилування, яких немає в антитілі. Глікозилування антитіл звичайно Nзв'язане. Поняття "N-зв'язане" відноситься до приєднання вуглеводної частини молекули до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-X-серин і аспарагін-Xтреонін, де X означає яку-небудь кислоту крім проліну, є послідовностями розпізнавання для ферментативного приєднання вуглеводної частини молекули до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, наявність якої-небудь з цих трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилування. Додавання сайтів глікозилування до антитіла легко доповнюється зміною амінокислотної послідовності таким чином, що воно містить одну або декілька описаних вище трипептидних послідовностей (для N-зв'язаних сайтів глікозилування). Молекули нуклеїнових кислот, що кодують варіанти амінокислотних послідовностей анти-ІЛ17 антитіла, одержують різними методами, відомими у даній області. Ці методи включають, але ними не обмежуються, виділення з природного джерела (у випадку варіантів природних амінокислотних послідовностей) або одержання олігонуклеотид-опосередкованим (або сайтспрямованим) мутагенезом, ПЛР мутагенез і касетний мутагенез раніше отриманих варіантів або неваріантної версії гуманізованого анти-ІЛ-17 антитіла. Інший тип ковалентної модифікації антитіла включає зв'язування антитіла з одним із варіантів небілкових полімерів, наприклад, з поліетиленгліколем, поліпропіленгліколем або поліоксіалкіленами способом, описаним в US 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192, 4179337. Варіабельні домени важкого й легкого ланцюга за даним винаходом комбінують з послідовностями промотору, ініціації трансляції, константної області, 3'-нетрансльованої області, поліаденілювання й термінації транскрипції для формування конструкцій вектора експресії. Конструкції експресії важкого й легкого ланцюга можуть комбінуватися в одному векторі, спільно трансфекуватися, трансфекуватися серіями або окремо у клітини-хазяїни, які потім гібридизують для формування клітин-хазяїнів, які експресують обидва ланцюги. В іншому об'єкті даного винаходу передбачають композицію, наприклад, фармацевтичну композицію, що включає одне моноклональне антитіло або комбінацію моноклональних антитіл, або їх антиген-єднальну частину, за даним винаходом, перероблений разом із фармацевтично прийнятним носієм. У контексті даного винаходу поняття "фармацевтично прийнятний носій" включає який-небудь або всі розчинники, дисперсійні середовища, покривні матеріали, антибактеріальні й протигрибкові агенти, ізотонічні агенти й агенти абсорбції/ресорбції та інші фізіологічно сумісні. Переважно носій придатний для ін'єкції або інфузії. Композиція за даним винаходом може вводитися різними методами, відомими у даній області. Фахівцям відомо, що шлях і/або спосіб введення може варіюватися залежно від необхідних результатів. До фармацевтично прийнятних носіїв відносяться стерильні водні розчини або дисперсії й стерильні порошки для готування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. Застосування таких середовищ і агентів для фармацевтично діючих речовин відоме у даній області. Крім води носієм може бути, наприклад, ізотонічний буферний сольовий розчин. Незалежно від вибраного шляху введення, сполуки за даним винаходом, які можуть застосовуватися у відповідній гідратованій формі, і/або фармацевтичні композиції за даним винаходом переробляють у фармацевтично прийнятні дозовані форми шляхом звичайних методів, відомих фахівцям у даній області. Фактичні рівні дозування діючих інгредієнтів у фармацевтичних композиціях даного винаходу можуть варіюватися таким чином, щоб одержати кількість діючого інгредієнта, яка ефективна для досягнення необхідної терапевтичної відповіді для певного пацієнта, композиції й способу введення, без прояву токсичності для пацієнта (ефективної кількості). Вибрані рівні дозування можуть залежати від різних фармакокінетичних факторів, включаючи дію певних застосовуваних композицій за даним винаходом, або їх складних ефірів, солей або амідів, способу введення, часу введення, швидкості екскреції певної застосовуваної сполуки, інших лікарських засобів, сполук і/або матеріалів, які використовуються у комбінації з певними застосовуваними композиціями, віку, статі, маси тіла, стану, загального стану здоров'я й попередньої історії хвороби пацієнта, що піддається лікуванню, і від інших факторів, відомих у медицині. Даний винахід включає застосування антитіл за даним винаходом для лікування пацієнта з розсіяним склерозом, ревматоїдним артритом (РА), псоріазом, хворобою Крона, хронічним обструктивним захворюванням легенів (ХОЗЛ), астмою або відторгненням трансплантата. В іншому варіанті здійснення даного винаходу передбачене застосування анти-ІЛ-17 антитіла, переважно антитіла за даним винаходом, для лікування пацієнта з ревматоїдним артритом, який не відповідає помірковано або не відповідає на лікування антагоністами ФНП, анти-CD20 антитілом, CTLA4Ig або анти-ІЛ-6 антитілом. В іншому варіанті здійснення даного 8 UA 103499 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 винаходу передбачене застосування анти-ІЛ-17 антитіла, переважно антитіла за даним винаходом, для одержання лікарського засобу для лікування пацієнта з ревматоїдним артритом, який відповідає помірковано або не відповідає на лікування антагоністом ФНП, антиCD20 антитілом, CTLA4Ig або анти-ІЛ-6 антитілом. Антагоністами ФНП для лікування ревматоїдного артриту, є, наприклад, інфліксимаб (IFX, продукт Remicade®), етанерсепт (ETA, продукт Enbrel®) і адалімумаб (ADA, продукт Humira®). Анти-ІЛ-17 антитіло переважно вводять пацієнтові, який відповідає помірковано або не відповідає на лікування антагоністом фактора некрозу пухлини (ФНП), анти-CD20 антитілом, CTLA4Ig або анти-IL6 антитілом протягом щонайменше 3 місяців, переважно протягом 6 місяців. Даний винахід також передбачає спосіб одержання фармацевтичної композиції, що включає ефективну кількість антитіла за даним винаходом разом із фармацевтично прийнятним носієм і застосування антитіла за даним винаходом для такого способу. Даний винахід також передбачає застосування антитіла за даним винаходом в ефективній кількості для одержання фармацевтичного агента, переважно разом із фармацевтично прийнятним носієм, для лікування пацієнта з розсіяним склерозом, ревматоїдним артритом, псоріазом, хворобою Крона, хронічним обструктивним захворюванням легенів (ХОЗЛ), астмою або відторгненням трансплантата. Даний винахід також передбачає застосування антитіла за даним винаходом в ефективній кількості для одержання фармацевтичного агента, переважно разом із фармацевтично прийнятним носієм, для лікування пацієнта з розсіяним склерозом, ревматоїдним артритом, псоріазом, хворобою Крона, хронічним обструктивним захворюванням легенів (ХОЗЛ), астмою й відторгненням трансплантата. Опис послідовностей SEQ ID NO: 1 важкий ланцюг CDR3, Mab 106 і Mab 107 SEQ ID NO: 2 важкий ланцюг CDR2, Mab 106 SEQ ID NO: 3 важкий ланцюг CDR1, Mab 106 і Mab 107 SEQ ID NO: 4 легкий ланцюг CDR3, Mab 106 і Mab 107 SEQ ID NO: 5 легкий ланцюг CDR2, Mab 106 і Mab 107 SEQ ID NO: 6 легкий ланцюг CDR1, Mab 106 і Mab 107 SEQ ID NO: 7 варіабельний домен важкого ланцюга, Mab 106 SEQ ID NO: 8 варіабельний домен легкого ланцюга, Mab 106 і Mab 107 SEQ ID NO: 9 важкий ланцюг CDR2, Mab 107 SEQ ID NO: 10 варіабельний домен важкого ланцюга, Mab 106 SEQ ID NO: 11 константна область γ1 важкого ланцюга SEQ ID NO: 12 константна область k легкого ланцюга Приклади Приклад 1. Опис імунізації Імунізацію проводять протягом 20 тижнів, використовуючи 5 самок мишей лінії Balb/c, застосовуючи 250 (1×) і 100 мкг (3×) рекомбінантного ІЛ-17 людини від фірми Peprotech (http://www.peprotech.com; Cat.Nr.: 200-17 в 1 % ФСБ з 1 % альбуміном) на мишу. Приклад 2. Зв'язування з ІЛ-17, вимірюване методом ELISA Планшети NUNC® Maxisorp (96-ямкові) покривають рекомбінантним ІЛ-17 людини (фірми Peprotech # 200-17, www.peprotech.com) у концентрації 0,5 мкг/мл у ФСБ (100 мл/лунку). Планшети інкубують при 37 °C на круговій качалці при перемішуванні протягом 2 год. Потім покривний розчин видаляють і додають по 100 мкл/лунку ФСБТСЦ (фосфатно-сольовий буфер, 0,05 % Tween®20, 2 % сироватки курчати). Планшети інкубують при кімнатній температурі протягом 1 год. Блокуючий розчин видаляють і зразки вносять у планшет (100 мкл/лунку) (контроль: ФСБТСЦ, зразки (10 мкг/мл у ФСБ): антитіла проти ІЛ-17 людини 3C1 і Mab 106 за даним винаходом; Mab 16-7178-85 фірми eBioscience (www.ebioscience.com); MAB 317 фірми R&D Systems (www.rndsystems.com), NVP-AIN-497 (WO 2006013107). Планшети інкубують при кімнатній температурі з перемішуванням. Зразки видаляють, планшети промивають тричі 200 мкл/лунку ФСБ (фосфатно-сольовий буфер, 0,05 % Tween® 20) і додають друге антитіло (козяче антитіло проти IgG людини, Fc гамма, кон'югат із ферментом пероксидазою хріну (horseradish peroxidase – HRP); фірма Chemicon AP127P, www.millipore.com) для виявлення антитіл миші або козячого антитіла проти IgG людини, Fc гамма, кон'югат HRP (фірма Chemicon AP113P) для виявлення гуманізованих антитіл. Друге антитіло розводять 1:10000 у ФСБТСЦ і планшети інкубують протягом 1 год. при кімнатній температурі з перемішуванням. Друге антитіло видаляють, планшети промивають тричі 200 мкл/лунку ФСБ (фосфатно-сольовий буфер, 0,05 % Tween®20) і додають 100 мкл/лунку ABTS® (Roche Diagnostics GmbH). Оптичну щільність вимірюють при 405/492 нм щодо зв'язування з ІЛ-17A (прийнятого за 100 %). 9 UA 103499 C2 Зв'язування з іншими підтипами ІЛ-17 людини (ІЛ-17B, ІЛ-17C, ІЛ-17D, ІЛ-17E і ІЛ-17F) одержують у тому же форматі дослідження. Результати представлені у табл. 1. Таблиця 1 Антитіло 3C1 106 Mab 317 16-7178-85 NVP-AIN-497 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Зв'язування (зв'язування ІЛ-17A прийняте за 100 %) ІЛ-17A ІЛ-17B ІЛ-17C ІЛ-17D 100 0 1 0 100 0 0 0 100 0 0 0 100 7 97 6 100 2 2 0 ІЛ-17E 0 1 0 5 3 ІЛ-17F 0 0 0 5 62 Приклад 3. Одержання плазміди експресії для імуноглобуліну класу IgG1 Плазміда 6454 (надалі позначувана "p6454") є плазмідою експресії для експресії ІЛ-17антитіла (геномно організованої касети експресії зі збереженою організацією екзон-інтрон) в еукаріотичних клітинах. Вона включає наступні функціональні елементи: - реплікон, що відбувається від вектора pUC18 (джерело pUC), - ген ß(бета)-лактамази, що обумовлює стійкість до ампіциліну в E. coli (Amp), - касету експресії для експресії гамма 1-важкого ланцюга, що включає наступні елементи: - головний передранішній промотор і енхансер із цитомегаловірусу людини (hCMV IE1 промотор), - синтетична 5'-кінцева нетрансльована область (5'UTR), що включає послідовність Kozak, - сигнальна послідовність важкого ланцюга імуноглобуліну гризунів, що включає інтрон сигнальної послідовності (L1_інтрон_L2), - кДНК для варіабельної області важкого ланцюга (VH), зібрана з сайтом сплайсингу донора за 3'-кінцем, - область μ-енхансера імуноглобуліну миші, - ген гамма-1 важкого ланцюга імуноглобуліну людини (human immunoglobulin heavy chain gamma 1-gene-IGHG1), що включає екзони CH1, шарнірну область, CH2 і CH3, інтрони й область 3'UTR, що несе сигнальну послідовність поліаденілювання, - касета експресії для експресії каппа-легкого ланцюга, що включає наступні елементи: - головний передранішній промотор і енхансер із цитомегаловірусу людини (hCMV IE1 промотор), - синтетична область 5'UTR, що включає послідовність Kozak, - сигнальна послідовність важкого ланцюга імуноглобуліну гризунів, що включає інтрон сигнальної послідовності (L1_інтрон_L2), - кДНК варіабельної області легкого ланцюга, зібраної з сайтом сплайсингу донора, за 3' кінцем (VL), - інтронна область енхансера Ig-каппа миші, - ген імуноглобуліну каппа (human immunoglobulin kappa gene-IGK), що включає екзон IGKC і IGK 3'UTR, що несе сигнальну послідовність поліаденілювання, - касета експресії для експресії дигідрофолатредуктази гризунів (dihydrofolate reductaseDHFR), застосовної для ауксотрофної селекції в еукаріотичних клітинах, що включає - укорочену версію раннього промотору й початку реплікації SV40, - послідовність, що кодує, DHFR гризунів, - раннього сигналу поліаденілювання SV40. P6454 трансфекують у клітини CHO-K1, виділяють стабільні лінії клітин після селекції з метотрексатом (Methotrexate-MTX) і проводять скринінг на одержання антитіла людини методом ELISA для IgG людини. Приклад 4. Дослідження активування системи комплементу (C1q зв'язування ELISA) Для вивчення зв'язування C1q антитіла за даним винаходом використовують підхід ELISA. C1q є частиною адаптивної імунної системи й при зв'язуванні з імунними комплексами індукує послідовне активування декількох зимогенів. Ферменти у свою чергу викликають розщеплення молекул C3, що може привести до початку запальних реакцій, опсонізації чужорідних або аберантних часток і лізису клітинних мембран. Планшет MTP (фірма Nunc) покривають досліджуваними антитілами у ФСБ-буфері протягом ночі при 4 °C у 7 концентраціях від 10 мкг/мл до 0,156 мкг/мл, 100 мкл/лунку. Блокування вільних сайтів зв'язування проводять за допомогою 3 % BPLA (фірма Roche) у ФСБ протягом 1 год. при кімнатній температурі, 200 мкл/лунку. Планшет MTP інкубують з 2 мкг/мл C1q (фірма Quiddel) у 10 UA 103499 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 3 % BPLA у ФСБ, 100 мкг/мл. Планшет MTP промивають тричі при кімнатній температурі 0,1 % Tween®20 у ФСБ. Зв'язування виявляють шляхом додавання поліклонального антитіла кролика проти C1q (фірма DAKO) у кількості 0,25 мкг/мл у 3 % BPLA, 0,1 % Tween®20 у ФСБ, 100 мкл/лунку протягом 1 год. при кімнатній температурі. Планшет MTP промивають тричі при кімнатній температурі 0,1 % Tween20 у ФСБ. Друге антитіло кози проти IgG кролика POD (фірма Jackson Immuno Research) додають у кількості 0,1 мкг/мл у 3 % Tween 20 у ФСБ протягом 1 год. при кімнатній температурі, 100 мкл/лунку. Після трикратного промивання планшета MTP за допомогою 0,1 % Tween20 у ФСБ при кімнатній температурі планшет MTP інкубують з розчином ABTS (фірма Roche) і вимірюють поглинання при довжині хвилі 405 нм з початковою довжиною хвилі 490 нм. Фонові сигнали визначають у лунках, не покритих антитілами, але оброблених в однаковій процедурі. Не встановлене зв'язування C1q, якщо оптична щільність (ОЩ) при 405 нм для тестованого антитіла нижче 0,05 при концентрації антитіла 10 мкг/мл. Приклад 5. Картування області епітопу за допомогою експериментів перехресного блокування BIAcore Всі вимірювання проводять, використовуючи сенсор BIAcore 3000 при 25 °C. Використовують систему й буфер для зразків HBS-EP (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3,4 мМ EDTA, 0,005 об. % полісорбат 20). Сенсорний чіп BIAcore CM5 піддають попередній обробці. Послідовно 0,1 % SDS, 50 мМ NaOH, 10 мМ HCl і 100 мМ H3PO4 вводять ін'єкцією протягом 30 с поверх проточних касет FC1, FC2, FC3 і FC4. Процедуру приєднання аміну проводять за інструкціями виробника, використовуючи програмне забезпечення BIAcore 3000 wizard v. 4.1. Для проведення експериментів по перехресному блокуванню химерними або гуманізованими антитілами після активування EDC/NHS сенсорної поверхні поліклональне козяче антитіло проти IgG людини (фірма Jackson) іммобілізують на сенсорних проточних кюветах (FC). 30 мкг/мл поліклонального козячого антитіла проти IgG людини у 10 мМ NaAc pH 5,0 використовують у кількості 10 мкл/хв протягом 7 хв для іммобілізації 10000 RU системи вловлювача антитіл. Поверхню дезактивують насиченням етаноламіном. Сенсор системи вловлювача людини обумовлюється 5 циклами зв'язування речовини huIgG (фірма Bayer) у кількості 10 мкл/хв протягом 2 хв і регенерацією з 10 мМ гліцином pH 1,7 у кількості 30 мкл/хв протягом 3 хв. Зі швидкістю струму 10 мкл/хв первісне mAb ін'єкують протягом 3 хв у кювети FC1-FC4. Вільне зв'язування сенсорної системи вловлювача блокують, використовуючи 3 хв ін'єкції e кювети FC1-FC4 у кількості 10 мкл/хв суміші з 50 мкг/мл huIgG (фірма Bayer) у буфері HBS-EP. Згодом антиген rhuIL17-A ін'єкують у кількості 10 мкл/хв протягом 3 хв у кювети FC1-FC4 для насичення єднальної здатності основних антитіл. Другу ін'єкцію у кювети FC1-FC4 у кількості 30 мкл/хв протягом 3 хв проводять до окремої ін'єкції вторинних антитіл у кількості 30 мкл/хв протягом 3 хв у проточні кювети FC1, FC2, FC3 і FC4. Сенсор регенерують, використовуючи 10 мМ гліцин pH 1,75 у кількості 30 мкл/хв протягом 3 хв. Спочатку ін'єкцію 0 нМ аналізованої речовини віднімають зі всіх сенсограм для корекції дисоціації первинних антитіл від поліклональної козячої системи захоплення проти IgG людини. Показник виражають за відповідним сигналом вторинного антитіла й первинного антитіла. Показник називають мольним відношенням (МВ), що показує досяжність області епітопу. Величини молярних відношень перераховані у матриці. Комбінації гомологічних mAb виступають як контроль того, чи успішно були проведені процедури блокування. Відсікання визначають за допомогою комбінацій гомологічних mAb. Відсікання в експериментах по перехресному блокуванню встановлюють за форматом гомогенного Mab106 аналізу (9 %). Величини зазначених вище молярних відношень (МВ) = 15 % щодо незалежних епітопів. Результати картування епітопу (див. табл.2) показують, що Mab K106 та його похідне Mab107 зв'язуються з різними областями епітопу, на відміну від NVP-AIN-497. Крім того, Mab K106 накриває інший епітоп на відміну від eBio64CAP17, і ту ж епітопну область, що й Mab317. 11 UA 103499 C2 Таблиця 2 Результати картування епітопів Антитіло 1 eBio64CAP17 NVP-AIN-497 Mab317 NVP-AIN-497 Mab317 106 eBio64CAP17 NVP-AIN-497 5 10 15 20 25 30 35 Антитіло 2 106 106 106 107 Mab317 106 eBio64CAP17 NVP-AIN-497 Мольне співвідношення (%) 41 17 11 21 0 9 7 6 Відсікання аналізу виражають за допомогою комбінацій однорідних аналізів. (106, 9 %); (AIN457, 6 %); (eBio64CAP17, 7 %); (Mab317, 0 %). Відсікання тут установлюють за гомогенним Mab106 аналізом. Приклад 6. Аналіз вивільнення цитокіну, інгібування ІЛ-17A, індуковане вивільненням hIL-8 Проведення аналізу полягає в ідентифікації вироблення лІЛ-8 клітинами CCD-25SK після стимуляції за допомогою ІЛ-17A і ФНП-альфа з попередньою інкубацією анти-ІЛ-17 антитіл. Клітини CCD-25SK мають рецептор ІЛ-17. Розчинний ІЛ-17A зв'язується з цим рецептором ІЛ17. Антитіла проти ІЛ-17A зв'язуються з ІЛ-17A. Механізм працює тільки у присутності ФНПальфа. За допомогою зв'язування ІЛ-17A з рецептором ІЛ-17 клітини виробляють лІЛ-8, який можна виявити методом ELISA шляхом зчитування результату. Вимірюваний лІЛ-8 подає інформацію, відповідно до якої концентрації анти-ІЛ-17 антитіл інгібують стимуляцію клітин CCD-25SK за рахунок ІЛ-17. 4 Клітини CCD-25SK засівають при щільності 2,5×x10 клітин/лунку у 48-ямковий планшет (об'єм 0,45 мл/лунку) та інкубують протягом 24 год. при 37 °C і 5 %CO2. Після інкубації протягом ночі клітини обробляють анти-ІЛ-17 антитілами протягом 30 хв з кінцевими концентраціями 9000, 3000, 1000, 333,3, 111,1, 37,03, 12,34 і 4,11 нг/мл. Серійні розведення кожного антитіла роблять у середовищі, 50 мкл/лунку (10× концентрація). Через 30 хв клітини стимулюють сумішшю 10 нг/мл ІЛ-17A і 50 пг/мл ФНП-альфа. 50 мкл/лунку (10x концентрація) та інкубують протягом 24 год. при 37 °C і 5 %CO2. Після інкубування протягом ночі супернатанти переносять у 96-ямкові планшети й заморожують при -20 °C як проміжні продукти для лІЛ-8 ELISA. Метод лІЛ-8 ELISA проводять у такий спосіб. 100 мкл розведеного захопленого антитіла додають у кожну лунку та інкубують протягом ночі при 4 °C. Роблять розведення покривним буфером. Планшети аспірують, промивають тричі за допомогою 200 мкл/лунку, блокують за допомогою 200 мкл/лунку розчинника та інкубують протягом 1 год. при кімнатній температурі. Планшети аспірують і промивають тричі за допомогою 200 мкл/лунку. За 100 мкл стандартом й зразків додають та інкубують протягом 2 год. при кімнатній температурі. Серії стандартних розведень: 400 пг/мл; 200 пг/мл; 100 пг/мл; 50 пг/мл; 25 пг/мл; 12,5 пг/мл; 6,3 пг/мл і розчинник як негативний контроль. Розведення зразків становить 1:200. Планшети аспірують і 4 рази промивають за допомогою 250 мкл/лунку. По 100 мкл кон'югату додають у кожну лунку. Кон'югат одержують при виявленні антитіла й ферментного реагенту при розведенні 1:250 у розчиннику. Планшети аспірують і промивають за допомогою 250 мкл/лунку 6 разів. По 100 мкл субстрату додають у кожну лунку та інкубують протягом 12 хв. Після інкубування реакцію зупиняють за допомогою 50 мкл/лунку 1M H2SO4. Зчитування проводять при 450 нм за 30 хв з λ корекцією при 570 нм. Результати представлені у табл. 3 (величини IC50 вимірюють щодо максимального придушення 80 %). 12 UA 103499 C2 Таблиця 3 Антитіла 3С1 106 Mab 317 5 10 15 20 25 Нейтралізація ІЛ6 IC50 (нМ) 1,0 1,0 5,5 Нейтралізація ІЛ8 IC50 (нМ) 1,0 1,0 5,5 Приклад 7. Аналіз вивільнення синовіоцитного цитокіну, придушення ІЛ-17A індукованого лІЛ-6 і лІЛ-8 Первинні фібробласти людини типу синовіоцитів (ФЛТВ) утворюють лІЛ-6 і лІЛ-8 у відповідь на стимуляцію за допомогою ІЛ-17A. Аналіз проводять для вимірювання придушення такого простимульованого за допомогою ІЛ-17A вироблення лІЛ-6 і лІЛ-8 клітинами ФЛТВ після попередньої інкубації клітин із анти-ІЛ-17 антитілами перед стимуляцією. 5 Клітини ФЛТВ висівають при щільності клітин 4×10 кліток/мл в об'єм 0,5 мл у лунки 48ямкового планшета та інкубують протягом ночі при 37 °C і 5 %CO2 для адгезії. Після інкубації протягом ночі середовище заміщають на 400 мкл свіжого середовища й клітини обробляють анти-ІЛ-17 антитілами протягом 30 хв у діапазоні концентрацій антитіла (10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 0 нг/мл). Серії розведень кожного антитіла одержують у середовищі, використовуючи 50 мкл/лунку (10× концентрація). Через 30 хв клітини стимулюють 100 нг/мл ІЛ17A (50 мкл 1000 нг/мл 10× концентрація) та інкубують протягом ночі (18 год.) при 37 °C і 5 %CO2. Після періоду інкубування надосади переносять у нові пробірки й негайно аналізують або зберігають при -80 °C до проведення аналізу ELISA. Для аналізу лІЛ-6 і лІЛ-8 ELISA у кожну лунку додають по 100 мкл розведеного захопленого антитіла та інкубують протягом ночі при 4 °C. Розводять у покривному буфері. Планшети аспірують, тричі промивають 200 мкл/лунку, блокують 200 мкл/лунку розчинника та інкубують протягом 1 год. при кімнатній температурі. Планшети аспірують і тричі промивають 200 мкл/лунку. Додають по 100 мкл стандарту й зразків та інкубують протягом 2 год. при кімнатній температурі за інструкціями виробника. Планшети аспірують і промивають щонайменше тричі за допомогою 250 мкл/лунку. По 100 мкл кон'югату додають у кожну лунку. Кон'югат одержують при виявленні антитіла й ферментного реагенту при розведенні 1:250 у розчиннику. Планшети аспірують і щонайменше тричі промивають за допомогою 250 мкл/лунку. По 100 мкл субстрату додають у кожну лунку та інкубують доти, поки не сформується фарбування, достатнє для прочитання. Після інкубування реакцію зупиняють за допомогою 50 мкл/лунку 1M H2SO4 і прочитують на рідері для планшетів при довжині хвилі 450 нм протягом 30 хв. Результати показані у табл. 4. 30 Таблиця 4 Антитіло 3C1 106 NVP-AIN-457 Нейтралізація ІЛ6 IC50 (нМ) Нейтралізація ІЛ8 IC50 (нМ) (використовуючи 100 нг/мл ІЛ17А) (використовуючи 100 нг/мл ІЛ17А) 1,9 1,4 2,1 1,6 5,0 4,2 Приклад 8. Перехресна дія з ІЛ-17А макаки крабоїда (аналіз зв'язування) Аналіз зв'язування проводять відповідно до опису, наведеному у прикладі 2. Результати представлені у табл. 5. 35 13 UA 103499 C2 Таблиця 5 Антитіло 3C1 106 106 (IgG4) 106 (IgG1-LALA) NVP-AIN-497 5 10 15 20 25 30 Відносне зв'язування з ІЛ17А людини 1 1 1 1 1 Відносне зв'язування з ІЛ17А макаки крабоїда Дані відсутні 0,87 0,87 1,0 0,6 Приклад 9. Аналіз вивільнення цитокіну макаки крабоїда (Maccaca Fasicularis), придушення індукованого ІЛ-17A макаки крабоїда вироблення ІЛ-6 і ІЛ-8 Шкірні фібробласти макак (ШФМ) утворюють ІЛ-6 і ІЛ-8 макаки крабоїда у відповідь на стимуляцію за допомогою ІЛ-17A людини або макаки крабоїда. Аналіз проводять для вимірювання придушення такого простимульованого ІЛ-17A макаки крабоїда утворення ІЛ-6 і ІЛ8 клітинами ШФМ з наступною попередньою інкубацією клітин із анти-ІЛ-17 антитілами, сформованими проти ІЛ-17 людини перед стимуляцією. 5 Клітини CDF висівають з щільністю 2×10 клітин/мл в об'єм 0,5 мл у лунки 48-ямкового планшета та інкубують протягом ночі при 37 °C і 5 %CO2 для адгезії. Після інкубування протягом ночі середовища заміщають 400 мкл свіжого середовища й клітини обробляють анти-ІЛ-17 антитілами протягом 30 хв у діапазоні концентрацій антитіла (10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 0 нг/мл). Серію розведення кожного антитіла одержують у середовищі, використовуючи 50 мкл/лунку (10× концентрація). Через 30 хв клітини стимулюють за допомогою 100 нг/мл ІЛ-17A (50 мкл 1000 нг/мл з концентрацією 10×) та інкубують протягом ночі (18 год.) при 37 °C і 5 % CO2. Після періоду інкубування надосади переносять у нові пробірки й або відразу аналізують, або зберігають при -80 °C до аналізу методом ELISA. Показано, що лІЛ-6 і лІЛ-8 ELISA мають перехресну реакційну здатність з відповідними цитокінами макаки крабоїда й використовують для підрахунку рівнів цитокінів. Для методу ELISA 100 мкл розведеного мобілізованого антитіла додають у кожну лунку та інкубують протягом ночі при 4 °C. Розведення роблять у покривному буфері. Планшети аспірують, тричі промивають 200 мкл/лунку, блокують 200 мкл/лунку розчинником, та інкубують протягом 1 год. при кімнатній температурі. Планшети аспірують і тричі промивають 200 мкл/лунку. По 100 мкл стандарту й зразків додають та інкубують протягом 2 год. при кімнатній температурі за інструкціями виробника. Планшети аспірують і промивають об'ємом 250 мкл/лунку щонайменше тричі. По 100 мкл кон'югату додають у кожну лунку. Кон'югат одержують при виявленні антитіла й ферментного реагенту при розведенні 1:250 у розчиннику. Планшети аспірують і промивають об'ємом 250 мкл/лунку щонайменше тричі. По 100 мкл субстрату додають у кожну лунку та інкубують до розвитку фарбування, достатнього для зчитування. Після інкубації реакцію зупиняють за допомогою 50 мкл/лунку 1M H 2SO4 і одержують результати на рідері для планшетів при довжині хвилі 450 нм протягом 30 хв. Результати показані у табл. 6. Таблиця 6 Антитіло 3C1 106 NVP-AIN-457 35 40 Нейтралізація ІЛ6 IC50 (нМ) (використовуючи 100 нг/мл ІЛ17А) 1,3 0,7 >10 Нейтралізація ІЛ8 IC50 (нМ) (використовуючи 100 нг/мл ІЛ17А) 1,1 0,6 >10 Приклад 10 Аналіз ADCC на основі европія Лімфоцити периферичної крові (ЛПК) виділяють за допомогою центрифугування у градієнті Ficoll Paque Plus: оброблені гепарином зразки крові розводять 1:1 у ФСБ. Нашаровують 8 мл розведеної крові на Ficoll і центрифугують протягом 30 хв при 800 g. Клітини (ЛПК) збирають, промивають RPMI1640/10 % ФСТ і ресуспендують у середовищі для культивування клітин. 6 Клітини розводять до 2,5×10 клітин/мл (це може привести до ефекторного/цільового 3 співвідношення 25:1, оскільки використовують 5×10 клітин-мішеней на лунку). Клітини-мішені мітять за допомогою BADTA (2,2´:6´,2´´ -терпіридин-6,6´´- ацетометиловий ефір дикарбонової кислоти): клітини збирають додаванням продукту Accutase™ (фірма 6 Millipore), однократно промивають і розводять до 1×10 клітин/мл. Додають 2,5 мкл 14 UA 103499 C2 6 5 10 15 20 25 30 35 BADTA/1×10 клітин та інкубують протягом 35 хв при 37 °C і 5 % CO2. Після періоду нанесення мітки клітини розводять у 10 мл культурального середовища, центрифугують у режимі 200 g протягом 10 хв і надосад аспірують. Цю стадію повторюють тричі з культуральним 5 середовищем/2 мМ пробеніцидом і зразок розводять до 1×10 клітин/мл, центрифугують у режимі 300 g протягом 5 хв, надосад видаляють і 50 мкл переносять піпеткою у лунки, призначені для контролів тла. Тло: аліквота 50 мкл, розведена за допомогою 100 мкл середовища. Спонтанний лізис: 50 мкл суспензії мічених клітин-мішеней; додають 100 мкл культурального середовища та інкубують 2 год./37 °C як залишок зразків. Максимальний лізис: 50 мкл/лунку суспензії мічених клітин-мішеней; додають 100 мкл Triton® X-100 (0,5 % у ФСБ) та інкубують 2 год./37 °C. Контроль лізису без антитіл: 50 мкл/лунку суспензії мічених клітин-мішеней; додають 50 мкл культурального середовища; додають 50 мкл ефекторних клітин, 2 год. при 37 °C. Контроль лізису без ефекторних клітин: 50 мкл/лунку суспензії мічених клітин-мішеней; додають 50 мкл культурального середовища, додають 50 мл розчину антитіла у найвищій використовуваній концентрації та інкубують 2 год./37 °C. До кінця періоду інкубування 96-ямковий планшет центрифугують при 100 об./хв. По 20 мкл кожного надосаду переносять в OptiPlate™ HTRF-96 (фірма Packard), додають 200 мл розчину европія та інкубують протягом 15 хв на качалці. Флуоресценцію вимірюють у вигляді залежної від часу флуоресценції й спонтанного вивільнення, а специфічне вивільнення розраховують за наступною формулою: Специфічне = специфічний лізис (рахунок)- спонтанний лізис (рахунок) × 100 вивільнення (%) максимальний лізис (рахунок) - спонтанний лізис (рахунок) Специфічне вивільнення (ADCC) не вдається виміряти після додавання антитіла 106. Приклад 11. Аналіз CDC 5 Клітини збирають додаванням трипсину, промивають, розводять до 1×10 клітин/мл і додають по 100 мкл/лунку у 96-ямковий планшет для мікротитрування з плоским дном. Антитіло додають (комплекс антитіло-ліганд, відповідно) у 6-кратній кінцевій концентрації в об'ємі 25 мкл у середовищі. Після 30 хв інкубування додають 25 мкл свіжерозведеного комплементу кроленяти (фірма Cedarlane, продукт CL3441, 1 мл ліофілізованого свіжерозведеного у 4 мл бідистильованої води) до кінцевої концентрації 1:24. Після періоду інкубування тривалістю 20 год. відбирають 50 мкл надосаду й додають 100 мкл реагенту Cell Titer Glo® (фірма Promega Corp.) до 100 мкл надосаду, що залишилися. Планшети струшують протягом 2 хв на круговій качалці, 100 мкл/лунку переносять у чорні люмінесцентні планшети для мікротитрування (фірма Costar) і вимірюють люмінесценцію. Контролі: контроль середовища (клітини-мішені + 50 мкл середовища), максимальний лізис (клітини-мішені + 50 мкл 0,5 % Triton X-100), контроль комплементу (клітини-мішені + 25 мкл середовища + 25 мкл комплементу). Результати: не виявлено комплемент-залежної цитотоксичності (complement dependent cytotoxicity – CDC) при використанні анти-ІЛ17 антитіла 106. 40 15 UA 103499 C2 16 UA 103499 C2 17 UA 103499 C2 18 UA 103499 C2 19 UA 103499 C2 20 UA 103499 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 1. Антитіло, що зв'язується з інтерлейкіном-17 (ІЛ-17) людини, яке відрізняється тим, що варіабельний домен важкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NО: 1, область CDR2 послідовності SEQ ID NО: 2 і область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3, а варіабельний домен легкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NО: 4, область CDR2 послідовності SEQ ID NО: 5 і область CDR1 послідовності SEQ ID NО: 6. 2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що воно інгібує у концентрації 100 нг/мл індуковану ІЛ-17А макаки крабоїда вироблення ІЛ-6 і ІЛ-8 в аналізі вивільнення цитокіну з величиною IC50, рівною 1,5 нМ або нижче, використовуючи шкірні фібробласти макаки крабоїда. 3. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що варіабельний домен важкого ланцюга включає SEQ ID NО: 7, а варіабельний домен легкого ланцюга включає послідовність SEQ ID NО: 8. 4. Антитіло за пп. 1-3, яке відрізняється тим, що воно є ізотипом IgGl людини, модифікованим у шарнірній області за положенням амінокислот 216-240, і/або у другій внутрішньодоменній області за положенням амінокислот 327-331 між СН2 і СН3. 5. Антитіло за п. 4, яке відрізняється тим, що включає мутації L234A (аланін замість лейцину за положенням амінокислот 234) і L235A. 6. Фармацевтична композиція, яка відрізняється тим, що включає антитіло за пп. 1-5. 7. Антитіло за пп. 1-5 для застосування для лікування розсіяного склерозу, ревматоїдного артриту, псоріазу, хвороби Крона, хронічного обструктивного захворювання легенів (ХОЗЛ), астми й відторгнення трансплантата. 8. Нуклеїнова кислота, що кодує важкий ланцюг антитіла, що зв'язується з ІЛ-17, яка відрізняється тим, що зазначене антитіло включає область CDR3 важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1, область CDR2 важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2, область CDR1 важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 3, область CDR3 легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 4, область CDR2 легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 5 і область CDR1 легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 6. 9. Вектор експресії, який відрізняється тим, що включає нуклеїнову кислоту за п. 8 для експресії антитіла, що зв'язується з ІЛ-17, за п. 1, у прокаріотичних або еукаріотичних клітинаххазяїнах. 21 UA 103499 C2 10. Спосіб одержання рекомбінантного антитіла, що зв'язується з ІЛ-17, який відрізняється тим, що в ньому здійснюють експресію нуклеїнової кислоти за п. 8 у прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяїнах і виділяють зазначене антитіло із зазначених клітин або супернатанта культури клітин. 5 Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 22