Аналог оксинтомодуліну

Реферат: Винахід належить до аналогу оксинтомодуліну, придатного для лікування діабету та/або ожиріння. UA 106399 C2 (12) UA 106399 C2 UA 106399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 АНАЛОГ ОКСИНТОМОДУЛІНУ Цей винахід стосується аналогів оксинтомодуліну та його пегільованих похідних для застосування в лікуванні діабету та/або ожиріння. Оксинтомодулін (OXM) являє собою пептидний гормон з 37 амінокислот, що вивільнюється разом з глюкагоноподібним пептидом 1 (GLP-1) з L-клітин тонкої кишки відповідно до споживання харчових продуктів. До його складу входить повна послідовність з 29 залишків глюкагону (Gcg) з октапептидним подовжувальним фрагментом на C-кінці як наслідок тканиноспецифічного альтернативного процесингу препроглюкагону. Ендогенний OXM швидко розкладається in vivo дипептиділпептидазою IV та іншими пептидазами. Специфічних рецепторів OXM поки що не виявлено. OXM зв'язується з і повністю активує як рецептор GLP-1 (GLP-1R), так і рецептор глюкагону (GcgR) in vitro з однаковою ефективністю на двох згаданих рецепторах. OXM приймає участь у регулюванні споживання харчових продуктів та маси тіла. Різке введення OXM суб'єктам з нормальною масою тіла зменшує відчуття голоду та скорочує об'єм споживання їжі на 19 %. Під час проведення 4-тижневого дослідження на суб'єктах з надмірною масою та ожирінням, наслідком триразового добового препрандіального підшкірного введення OXM було зниження маси тіла на 2,3 кг, порівняно з 0,5 кг у плацебо-групі. Під час проведення згаданого дослідження нудота, найпоширеніший побічний ефект, що пов'язується з терапією на основі GLP-1 (наприклад, ексенатид (exenatide) та ліраглутид (liraglutide)), була значно менше вираженою. OXM підвищує енергетичні витрати унаслідок стимулювання підвищеної фізичної активності у людей з надмірною масою та ожирінням незважаючи на те, що механізм згаданого ефекту є незрозумілим. OXM представляє декілька проблем для вирішення у разі розробки з метою перетворення його на комерційно прийнятний терапевтичний агент. Як згадувалось вище, він швидко розкладається in vivo, а також зазнає швидкого ниркового кліренсу внаслідок свого невеликого розміру. Бажано, таким чином, ідентифікувати аналоги OXM з поліпшеною метаболічною стабільністю та зниженою швидкістю кліренсу. Крім того, агоністична активність відносно GcgR, властива для OXM, представляє ризик справляння негативного впливу на глікемічний контроль. Отже, бажано також оптимізувати ефективність аналогу OXM, призначеного для терапевтичного застосування, з одночасним збереженням відповідного балансу між активністю на GLP-1R та GcgR. Активація GLP-1R відповідає за інсулінотропну дію, у той час як активація обох рецепторів, GLP-1R та GcgR, може відігравати роль у впливі на зменшення маси тіла. Таким чином, бажаним є продукування аналогу OXM, який має високий рівень інсулінотропної активності і стимулює зниження маси тіла для того, щоб він міг бути застосованим для лікування інсулінонезалежного діабету та/або ожиріння. Приклади OXM з амінокислотними замінами для поліпшення стабільності та з додатковими модифікаціями для уповільнення кліренсу, наприклад, пегілуванням та ліпідизацією, розкриті у WO2008/101017, WO2006/134340, WO2007/100535 та у статті Pocai et al. Diabetes 58:2258-2266, 2009. Разом з тим згадані пептиди, які є похідними OXM, можуть представляти потенційне поліпшення у зіставленні з пептидом дикого типу, дози, необхідні для досягнення відчутного зниження маси тіла у мишачої моделі з ожирінням, індукованим раціоном (DIO), є, як правило, більш високими, аніж це може вважатись прийнятним для комерціалізації фармацевтичних препаратів. Наприклад, Pocai et al (2009) повідомили про середнє 11 г (~25 %) зниження маси тіла після 13 днів введення препарату у дозі 1900 нмоль/кг (~8 мг/кг) через день (QOD). Незважаючи на доступність різних форм OXM та його аналогів, все ще існує потреба у більш ефективних, стабільних, тривало діючих та добре стерпних аналогах OXM з відношенням GcgR/GLP-1R активності, яке було б оптимізоване так, щоб ефективність та інсулінотропна активність згаданого пептиду забезпечувала можливість ефективного лікування діабету, переважно діабету 2 типу, та споріднених розладів. Бажано також надати аналоги OXM, які б забезпечували ефективне лікування з метою зниження маси тіла. Відповідно, цей винахід намагається надати ефективні лікарські засоби для лікування діабету та/або ожиріння. Цей винахід презентує аналог OXM з амінокислотними замінами, введеними для оптимізації метаболічної стабільності та модулювання відносної GcgR/GLP-1R активності з оптимізацією загальної ефективності. Крім того, аналог OXM за цим винаходомє пегільованим у вибраних положеннях для підвищення тривалості дії із забезпеченням тим самим більш рідкого введення дози. Цей винахід пропонує аналог оксинтомодуліну, який містить наведену нижче амінокислотну послідовність: 1 UA 106399 C2 5 де Xaa38 – Cys, Cys-PEG або відсутня, Xaa39 – Cys, Cys-PEG або відсутня, і де C-кінцева амінокислота факультативно є амідованою. Цей винахід пропонує аналог оксинтомодуліну, який містить наведену нижче амінокислотну послідовність: Крім того, цей винахід пропонує аналог оксинтомодуліну, який містить наведену нижче амінокислотну послідовність: 10 15 20 25 де залишок Cys у положенні 38 факультативно є пегільованим, і де залишок Cys, присутній у положенні 39, факультативно є пегільованим, а карбоксильна група залишку Cys у положенні 39 факультативно є амідованою. За варіантом, якому віддають перевагу, аналог оксинтомодуліну, представлений послідовністю SEQ ID NO: 2, є пегільованим або на залишку Cys у положенні 38, або на залишку Cys у положенні 39 або на обох молекулою PEG (40 кДа), ковалентно зв'язаною з тіоловою групою залишку Cys у цих положеннях. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, аналог оксинтомодуліну є пегільованим на кожному залишку Cys як у положенні 38, так і у положенні 39 молекулою PEG (20 кДа), ковалентно зв'язаною з кожною тіоловою групою кожного залишку Cys у цих положеннях. Факультативно залишок Cys у положенні 39 може бути відсутнім у послідовності SEQ ID NO: 2, завдяки чому залишається лише один сайт для пегілування у положенні 38. Аналог оксинтомодуліну, якому віддають більшу перевагу, містить наведену нижче амінокислотну послідовність: де карбоксильна група пегільованого залишку Cys у положенні 39 факультативно є амідованою. 2 UA 106399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Аналог оксинтомодуліну, якому віддають найбільшу перевагу, містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 3, де карбоксильна група пегільованого залишку Cys у положенні 39 є амідованою. Молекула PEG, яка застосовується за цим винаходом, може бути лінійною або розгалуженою, і, за варіантом, якому віддають перевагу, являє собою лінійну молекулу PEG. Цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка містить аналог оксинтомодуліну, визначений вище, та фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або допоміжну речовину. Крім того, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка містить аналог оксинтомодуліну, визначений вище, разом з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або допоміжною речовиною, та факультативно інші терапевтичні інгредієнти. Крім того, цей винахід пропонує спосіб лікування інсулінонезалежного (тип 2) діабету у суб'єкта, який цього потребує, який включає введення згаданому суб'єкту, який цього потребує, ефективної кількості аналогу оксинтомодуліну, визначеного вище. Більше того, цей винахід пропонує спосіб лікування інсулінозалежного (тип 1) діабету у суб'єкта, який цього потребує, який включає введення згаданому суб'єкту, який цього потребує, ефективної кількості аналогу оксинтомодуліну, визначеного вище. Цей винахід включає спосіб лікування ожиріння у суб'єкта, який цього потребує, який включає введення згаданому суб'єкту, який цього потребує, ефективної кількості аналогу оксинтомодуліну, визначеного вище. Крім того, цей винахід включає спосіб лікування інсулінонезалежного діабету та ожиріння у суб'єкта, який цього потребує, який включає введення суб'єкту, який цього потребує, ефективної кількості аналогу оксинтомодуліну, визначеного вище. Цей винахід пропонує аналог оксинтомодуліну, визначений вище, для застосування як лікарський засіб. Більше того, цей винахід пропонує аналог оксинтомодуліну, визначений вище, для застосування в лікуванні інсулінонезалежного діабету. Крім того, цей винахід пропонує аналог оксинтомодуліну, визначений вище, для застосування в лікуванні інсулінозалежного діабету. Крім того, цей винахід пропонує аналог оксинтомодуліну, визначений вище, для застосування в лікуванні ожиріння. Цей винахід включає аналог оксинтомодуліну, визначений вище, для застосування в лікуванні інсулінозалежного діабету та ожиріння. Цей винахід пропонує застосування аналогу оксинтомодуліну, визначеного вище, для виготовлення лікарського засобу для лікування інсулінонезалежного діабету. Більше того, цей винахід включає застосування аналогу оксинтомодуліну, визначеного вище, для виготовлення лікарського засобу для лікування інсулінозалежного діабету. Крім того, цей винахід пропонує застосування аналогу оксинтомодуліну, визначеного вище, для виготовлення лікарського засобу для лікування ожиріння. Крім того, цей винахід пропонує застосування аналогу оксинтомодуліну, визначеного вище, для виготовлення лікарського засобу для лікування інсулінонезалежного діабету та ожиріння. Аналоги OXM за цим винаходом ефективно зв'язуються з і активують як рецептор GLP-1 (GLP-1R), так і рецептор глюкагону (GcgR). Було встановлено також, що аналоги OXM за цим винаходом є більш стійкими до розкладу пептидазами, зокрема, дипептиділпептидазою IV, ніж нативний людський OXM. Як наслідок, аналоги OXM за цим винаходом мають поліпшену in vivo стабільність, у порівнянні з нативним людським OXM. Різні варіанти здійснення за цим винаходом є здатними до спричинення зменшення споживання харчових продуктів у суб'єктів з надмірною вагою та ожирінням. Особлива перевага цього винаходу полягає у тому, що частота виникнення побічних ефектів, наприклад, нудоти, яка традиційно пов'язується з терапією на основі GLP-1, наприклад, ексенатиду та ліраглутиду, зменшується або повністю виключається. Таким чином, цей винахід має зменшену кількість побічних ефектів, у порівнянні з терапією на основі GLP-1. Аналоги OXM за цим винаходом також справляють кращий ефект зменшення маси у порівнянні з ефектом, що справляється людським OXM дикого типу. Оксинтомодулін (OXM) є слабким коагоністом з повною ефективністю та врівноваженою активністю на hGLP-1R та hGcgR зі значеннями EC50 приблизно 6,7  2,7 нМ та 4,1  1,7 нМ, відповідно, на клітинах HEK293, що стабільно надекспресують відповідні рецептори. Послідовність нативного людського OXM наведена нижче: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-PheVal-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala (послідовність SEQ ID NO: 4) 3 UA 106399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Аналог OXM, представлений послідовністю SEQ ID NO: 3, де залишок Cys(PEG20k) у положенні 39 є амідованим, являє собою повністю ефективний та активний аналог оксинтомодуліну зі значеннями EC50 60,0  2,97 нМ та 6,58  0,87 нМ проти hGcgR та hGLP-1R, відповідно. Аналог OXM, представлений послідовністю SEQ ID NO: 3, де залишок Cys(PEG20k) у положенні 39 є амідованим, має баланс in vitro функціональної активності, що є приблизно у 9 разів більш селективним відносно hGLP-1R, у порівнянні з hGcgR. Порівнянні результати спостерігаються і для зв'язувальної спорідненості, Ki, де аналог OXM, представлений послідовністю SEQ ID NO: 3, де залишок Cys(PEG20k) у положенні 39 є амідованим, є у 3,6 рази більш селективним відносно hGLP-1R, у порівнянні з hGcgR, із значеннями Ki 1540  158 нМ та 5500  350 нМ, відповідно. Наслідком ковалентного приєднання однієї або декількох молекул PEG до конкретних залишків аналогу OXM є одержання пегільованого аналогу OXM з подовженим періодом напіввиведення та зниженою швидкістю кліренсу, при порівнянні з відповідними показниками непегільованого аналогу OXM, та з in vitro активністю на GLP-1R, подібною до активності нативного людського OXM. Приймаючи до уваги невеликий розмір аналогу OXM та відносно великий розмір молекул(-и) PEG, очікуваним було б те, що аналог OXM після пегілування втрачав би активність як наслідок виникнення стеричної перешкоди. Було встановлено, однак, що у разі розміщення оксинтомодуліну на кінці аналогу, а не у його середині, активність аналогу згаданого пептиду зберігається більшою мірою. Декілька замін у послідовності посилюють активність, компенсуючи таким чином втрату активності унаслідок пегілування з одночасним збереженням відповідного співвідношення активностей на GLP-1R та GcgR. Крім того, було встановлено, що присутність двох молекул PEG на C-кінці аналогу OXM є переважнішою за присутність однієї молекули PEG. Згадані послідовності за цим винаходом містять стандартні однолітерні або трилітерні умовні позначення двадцяти природних амінокислот. Інші застосовані умовні позначення визначаються таким чином: d або D=D-ізоформа (штучна) відповідної амінокислоти, наприклад, D-Ser=D-серин, dS=Dсерин Aib = альфа-аміноізомасляна кислота 1-Nal=1-нафтилаланін PEG = поліетиленгліколь PEG20K = молекула PEG із середньою молекулярною масою 20000 Да. Термін "PEG" у значенні, вживаному у цьому описі, означає молекулу поліетиленгліколю. У своїй типовій формі PEG являє собою лінійний полімер з кінцевими гідроксильними групами і має формулу HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH, де n становить від приблизно 8 до приблизно 4000. Як правило, n не є дискретною величиною, але складає діапазон з приблизно гаусівським розподілом довкола середнього значення. Кінцевий атом водню може заміщуватись захисною групою, наприклад, алкільною або алканоїльною групою. За варіантом, якому віддають перевагу, PEG має щонайменше одну гідроксильну групу, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, це є кінцева гідроксильна група. Ця гідроксильна група, за варіантом, якому віддають перевагу, приєднується до лінкерної складової, яка може вступати у реакцію з пептидом з утворенням ковалентного зв'язку. У цій галузі існують численні похідні PEG. (Дивись, наприклад, патенти США №№: 5,445,090; 5,900,461; 5,932,462; 6,436,386; 6,448,369; 6,437,025; 6,448,369; 6,495,659; 6,515,100 і 6,514,491 та статтю Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995). Молекула PEG, ковалентно приєднана до OXM за цим винаходом, може мати середню молекулярну масу приблизно 10000 Да, 20000 Да, 30000 Да або 40000 Да. Молекулярна маса молекули PEG, за варіантом, якому віддають перевагу, становить від 18000 Да до 22000 Да. Молекулярна маса молекули PEG, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, становить від 19000 Да до 21000 Да. Молекулярна маса молекули PEG, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, становить від 20000 Да до 21000 Да. За варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, вона становить приблизно 20000 Да. Пегілувальні реактиви можуть бути лінійними або розгалуженими молекулами, і можуть бути присутні окремо або послідовно спареними. Пегільовані аналоги OXM за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, мають послідовно спарені молекули PEG, приєднані до C-кінця згаданого пептиду. Молекули PEG, за варіантом, якому віддають перевагу, є приєднаними до двох залишків цистеїну на C-кінці згаданого пептиду за допомогою малеїніміду mPEG-20 кДа (Фіг. 1) або йодоацетаміду mPEG-20 kDa (Фіг. 2). На Фіг. 1 і Фіг. 2 n становить від 10 до 2500. За варіантом, якому віддають перевагу, n становить від 350 до 600. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, n становить від 425 до 475. 4 UA 106399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Зокрема, згаданими молекулами PEG, за варіантом, якому віддають перевагу, є молекули малеїніміду mPEG-20 кДа (CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)3NHCO(CH2)2-малеїнімід) (NOF Sunbright ME200MA), які є приєднаними до двох залишків цистеїну на C-кінці згаданого пептиду. Аналог оксинтомодуліну, якому віддають найбільшу перевагу, містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 3, де згаданими молекулами PEG є молекули малеїніміду mPEG-20 кДа (CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)3NHCO(CH2)2-малеїнімід) (NOF Sunbright ME200MA), і де карбоксильна група пегільованого залишку Cys у положенні 39 є амідованою (Фіг. 3). Фіг. 3 містить стандартне однолітерне умовне позначення амінокислот, за виключенням ділянок у прямокутниках, де структури цих амінокислотних залишків представлені у розширеному вигляді. Термін "пегілування" у значенні, вживаному у цьому описі, означає ковалентне приєднання однієї або декількох молекул PEG, визначених вище, до молекули, наприклад, аналогів OXM за цим винаходом. Словосполучення "інсулінотропна активність" означає здатність до стимулювання секреції інсуліну у відповідь на підвищені рівні глюкози, спричинюючи тим самим поглинання глюкози клітинами та зниження рівнів глюкози у плазмі крові. Інсулінотропна активність може визначатись методами, відомими у цій галузі техніки, у тому числі за допомогою in vitro експериментів, які визначають секрецію інсуліну лініями клітин інсуліноми або острівцями, чи за допомогою in vivo експериментів, таких як внутрішньовенна проба на толерантність до глюкози (IVGTT), внутрішньоочеревинна проба на толерантність до глюкози (IPGTT) та пероральна проба на толерантність до глюкози (OGTT). Інсулінотропну активність у людей традиційно визначають шляхом визначення рівнів інсуліну у плазмі крові або рівнів C-пептиду. Аналоги OXM за цим винаходом мають високий рівень інсулінотропної активності. "Активність in vitro", у значенні, вживаному у цьому описі, є критерієм здатності аналогу оксинтомодуліну до активації GLP-1R або GcgR у клітинному аналізі. Активність in vitro виражають як "EC50", що означає ефективну концентрацію сполуки, наслідком застосування якої є половина максимального значення підвищення вимірюваної реакції (у цьому випадку, продукування циклічного АМФ) при проведенні експерименту "доза-ефект". Словосполучення "час напіввиведення з плазми" означає час, необхідний для виведення половини відповідних молекул з плазми. Альтернативно застосовуваним є словосполучення "час напівочищення", що також означає час напіввиведення з плазми. Терміни "подовжений" або "триваліший", що застосовуються разом з вищезгаданими словосполученнями "час напіввиведення з плазми" або "час напівочищення", вказують на значне збільшення періоду напіввиведення пегільованого аналогу OXM, порівняно з відповідним часом напіввиведення еталонної молекули (наприклад, непегільованої форми пептиду або нативного пептиду), що визначається за порівнянних умов. Очікується, наприклад, що час напіввиведення нативного OXM у мавп буде меншим за 1 годину. Час напіввиведення пегільованих аналогів OXM за цим винаходом у мавп становить щонайменше 24 год., а за варіантом, якому віддають перевагу, – щонайменше 48 год. Час напіввиведення, що вказується у цьому описі, є часом напіввиведення, який відповідає кінцевій логарифмічній швидкості виведення. Фахівцю у цій галузі техніки буде зрозуміло, що час напіввиведення являє собою похідний параметр, який змінюється у залежності як від кліренсу, так і від об'єму розподілу. Словосполучення "агоніст GLP-1R тривалої дії" у значенні, вживаному у цьому описі, означає аналог GLP-1, ковалентно зв'язаний з однією або декількома молекулами 5 UA 106399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліетиленгліколю (PEG). Пегільовані сполуки GLP-1 описані у патенті США № 7,557,183. Кліренс є критерієм здатності організму до виведення лікарського засобу з кровообігу. У разі зменшення кліренсу внаслідок, наприклад, модифікацій лікарського засобу, очікується збільшення періоду напіввиведення. Однак точність дотримання цього зворотного співвідношення спостерігається лише у разі відсутності змін об'єму розподілу. Прийнятна приблизна залежність між кінцевим log-лінійним часом напіввиведення (t1/2), кліренсом (C) та об'ємом розподілу (V) виражена рівнянням: t1/2  0,693 (V/C). Кліренс показує не те, яка кількість лікарського препарату видаляється, а, скоріше, об'єм біологічної рідини, наприклад, крові або плазми, який повинен бути повністю звільненим від лікарського препарату для обчислення видалення. Кліренс виражають як об'єм на одиницю часу. Значення кліренсу пегільованих аналогів OXM за цим винаходом у мавп за варіантом, якому віддають перевагу, дорівнює 200 мл/год./кг або менше, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, – 180 мл/год./кг, 150 мл/год./кг, 120 мл/год./кг, 100 мл/год./кг, 80 мл/год./кг, 60 мл/год./кг або менше, і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, – 50 мл/год./кг, 40 мл/год./кг або 20 мл/год./кг або менше. Аналоги OXM за цим винаходом будуть вводитись, як правило, парентеральним шляхом. Парентеральне введення включає, наприклад, системне введення, наприклад, шляхом внутрішньом'язової, внутрішньовенної, підшкірної, внутрішньошкірної або внутрішньоочеревинної ін'єкції. Аналог згаданого пептиду вводять суб'єкту у поєднанні з прийнятним фармацевтичним носієм, розріджувачем або допоміжною речовиною як частину фармацевтичної композиції для лікування інсулінонезалежного (тип 2) діабету, NIDDM, або споріднених розладів, розглянутих нижче. Згадана фармацевтична композиція може бути розчином або суспензією аналогу OXM, наприклад, фармацевтичною композицією, у якій аналог OXM утворює комплекс з катіоном двовалентного металу, такого як цинк. Згаданому аналогу пептиду може надаватись форма твердої композиції, наприклад, шляхом ліофілізації або висушування розбризкуванням, яка у подальшому відновлюється у прийнятному розріджувачі перед введенням. Прийнятні фармацевтичні носії можуть містити інертні інгредієнти, які не взаємодіють з пептидом або похідною пептиду. Прийнятні фармацевтичні носії для парентерального введення включають, наприклад, стерильну воду, фізіологічний розчин, бактеріостатичний фізізологічний розчин (фізіологічний розчин, який містить приблизно 0,9 % мг/мл бензилового спирту), забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин Хенка, лактатний розчин Рінгера і т.ін. Деякі приклади відповідних допоміжних речовин включають лактозу, декстрозу, цукрозу, трегалозу, сорбіт і маніт та консерванти, такі як фенол та m-крезол. Можуть застосовуватись стандартні фармацевтичні методи одержання композицій, такі як описані у Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, PA). Аналогам OXM за цим винаходом може альтернативно надаватись форма для введення трансбукальним, пероральним, черезшкірним, назальним або легеневим шляхом. Аналогам OXM за цим винаходом може надаватись форма для пролонгованого вивільнення, завдяки чому рівні у плазмі крові підтримуються у ефективному діапазоні протягом тривалих періодів часу після введення. Аналоги OXM за цим винаходом можуть застосовуватись для лікування діабету, зокрема, діабету 2 типу (інсулінонезалежного цукрового діабету або NIDDM). До числа додаткових суб'єктів, яким може бути корисним лікування аналогами OXM за цим винаходом, належать суб'єкти з порушеною толерантністю до глюкози або з порушеними рівнями глюкози в крові натщесерце, суб'єкти, маса тіла яких приблизно на 25 % або більше перевищує нормальну масу тіла при зрості та будові тіла суб'єкта, суб'єкти, які мають одного або обох батьків з NIDDM, суб'єкти, які мають діабет вагітних, та суб'єкти з метаболічними розладами, наприклад, спричиненими зниженою секрецією ендогенного інсуліну. Аналог OXM може застосовуватись для запобігання розвитку діабету 2 типу у суб'єктів з порушеною толерантністю до глюкози, запобігання вичерпання панкреатичних β-клітин, індукування розмноження β-клітин, поліпшення функціонування β-клітин, активації "сплячих" β-клітин, стимулювання диференціації клітин у βклітини, стимулювання реплікації β-клітин та пригнічення апоптозу β-клітин. Інші захворювання та стани, які можуть лікуватись або запобігатись за допомогою сполук за цим винаходом способами за цим винаходом, включають: інсулінонезалежний цукровий діабет дорослого типу у молодих (MODY) (Herman, et al., Diabetes 43:40, 1994); латентний автоімунний діабет у дорослих (LADA) (Zimmet, et al., Diabetes Med. 11:299, 1994); порушену толерантність до глюкози (IGT) (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1):S5, 1999); порушені рівні глюкози у крові натщесерце (IFG) (Charles, et al., Diabetes 40:796, 1991); діабет вагітних (Metzger, Diabetes, 40:197, 1991); метаболічний синдром X, дисліпідемію, гіперглікемію, гіперінсулінемію, гіпертригліцеридемію та інсулінорезистентність. Аналоги OXM за цим винаходом можуть також застосовуватись у способах за цим 6 UA 106399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом для лікування вторинних причин діабету (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. l):S5, 1999). Такі вторинні причини включають надлишок глюкокортикоїдів, надлишок гормону росту, феохромоцитому та діабет, індукований лікарськими препаратами. Лікарські препарати, які можуть індукувати діабет, включають, але без обмеження ними, піримініл, нікотинову кислоту, глюкокортикоїди, фенітоїн, тиреоїдний гормон, β-адренергічні агенти, α-інтерферон та лікарські препарати, які застосовуються для лікування ВІЛ-інфекції. Аналоги OXM за цим винаходом можуть бути ефективними для пригнічення споживання харчових продуктів та лікування ожиріння. "Ефективною кількістю" аналогу OXM є така кількість, результатом застосування якої є бажаний терапевтичний та/або профілактичний ефект без спричинення неприйнятних побічних ефектів у разі введення суб'єкту. "Бажаний терапевтичний ефект" включає один або декілька з наведених нижче: 1) поліпшення симптому(-ів), пов'язаного(-их) із захворюванням або станом; 2) уповільнення появи симптомів, пов'язаних із захворюванням або станом; 3) збільшення тривалості життя, порівняно з відсутністю лікування; та 4) більш висока якість життя, порівняно з відсутністю лікування. Наприклад, "ефективною кількістю" аналогу OXM для лікування NIDDM є така кількість, результатом застосування якої був би більший контроль за концентрацією глюкози у крові, ніж за відсутності лікування, із спричиненням, тим самим, уповільнення появи діабетичних ускладнень, наприклад, ретинопатії, невропатії або хвороби нирок. "Ефективною кількістю" аналогу OXM для запобігання NIDDM, наприклад, у суб'єктів з порушеною толерантністю до глюкози або порушеними рівнями глюкози в крові натщесерце, є така кількість, результатом застосування якої було б уповільнення, у порівнянні з відсутністю лікування, появи підвищених рівнів глюкози в крові, які б потребували лікування антигіперглікемічними лікарськими засобами, наприклад, сульфонілсечовинами, тіазолідиндіонами, інсуліном та/або бісгуанідинами. "Ефективна кількість" аналогів OXM, яка вводиться суб'єкту, буде також залежати від типу та тяжкості захворювання та від характеристик суб'єкта, таких як загальний стан здоров'я, вік, стать, маса тіла та толерантність до лікарських засобів. Доза аналогу OXM, ефективна для нормалізації рівнів глюкози в крові у суб'єкта, буде залежати від ряду факторів, які включають, без обмеження, стать, масу та вік суб'єкта, тяжкість або нездатність регулювання рівнів глюкози в крові, шлях введення та біодоступність, фармакокінетичний профіль пептиду, активність та лікарську форму. Типова доза для введення один раз на тиждень пегільованих аналогів OXM за цим винаходом за варіантом, якому віддають перевагу, буде становити від приблизно 0,1 мг до приблизно 1000 мг (загальна маса кон'югату). За варіантом, якому віддають більшу перевагу, доза для введення один раз на тиждень буде становити від приблизно 1 мг до приблизно 100 мг або від приблизно 1 мг до приблизно 30 мг. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, доза для введення один раз на тиждень буде становити від приблизно 5 мг до приблизно 30 мг або від приблизно 1 мг до приблизно 5 мг. "Суб'єктом" є ссавець, за варіантом, якому віддають перевагу, – людина, але це може бути також тварина, у тому числі домашні тварини (наприклад, собаки, кішки і т.ін.), сільськогосподарські тварини (наприклад, корови, вівці, свині, коні і т.ін.) та лабораторні тварини (наприклад, пацюки, миші, морські свинки і т.ін.). Різні особливості та варіанти здійснення цього винаходу, яким надається перевага, будуть описані далі лише як приклади. Приклад 1: Пептидний синтез Аналог пептиду, представлений послідовністю SEQ ID NO: 1 та послідовністю SEQ ID NO: 2 за цим винаходом, одержують шляхом твердофазного пептидного синтезу на автоматичному пептидному синтезаторі Symphony (компанія Protein Technologies Inc.) або 433A (компанія Applied Biosystems). Синтез здійснюють на Fmoc-Rink-амідполістирольній смолі (компанія Rapp Polymere, Tubingen, Німеччина) із заміною приблизно 0,7 ммоль/г. Синтез здійснюють із застосуванням принципу Fmoc захисної групи головного ланцюгу. Застосовують такі похідні бічних ланцюгів амінокислот: Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(OtBu), Thr(OtBu), Trp(Boc) та Tyr(OtBu). Реакцію сполучення здійснюють із застосуванням приблизно 10 еквівалентів амінокислоти, активованої діізопропілкарбодіімідом (DIC) та гідроксибензотриазолом (HOBt) (молярне відношення 1:1:1) у диметилформаміді (DMF) або N-метилпіролідоні (NMP). Реакцію сполучення здійснюють протягом 45-90 хв при кімнатній температурі. Супровідне відщеплення від смоли та видалення захисних груп бічних ланцюгів здійснюють у розчині, який містить трифтороцтову кислоту (TFA): триізопропілсилан: 3,6-діокса-1,8 7 UA 106399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 октандитіол: метанол: анізол 90:4:2:2:2 (у в об'ємному відношенні) протягом 1,5-2 год. при кімнатній температурі. Розчин фільтрують і концентрують до 95 % чистоти з підтвердженням відповідності молекулярної маси обчисленому значенню з точністю до 1 одиниці атомної маси (amu). Приклад 2: Пегілування пептиду, який містить два залишки Cys, mPEG-MAL-20 кДа Ліофілізований аналог (послідовність SEQ ID NO: 2), який одержали за Прикладом 1, зважують (як правило, 30-50 мг). Малеїнімід mPEG-20 кДа, (CH3O(CH2CH2O)n(CH2)3NHCO(CH2)2-малеїнімід) (NOF Sunbright ME-200MA) (2,1-кратний молярний еквівалент), зважують і змішують з пептидом. Згадані реагенти розчиняють у суміші води/ацетонітрилу (50/50 (у об'ємному відношенні)) з одержанням концентрації пептиду приблизно 20 мг/мл. Розчин аналогу пептиду розбавляють вдвічі 100 мМ розчином ацетату амонію, 10 мМ розчином етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA), pH 7. Після цього одержану суміш перемішують при кімнатній температурі. Моніторинг реакційної суміші, який здійснюють засобами аналітичної HPLC з оберненою фазою (відокремлення засобами аналітичної HPLC здійснюють на колонці Waters SymmetryShield C18, 3,5 мкм, 4,6 мм (внутрішній діаметр)  10 см, при температурі 50°C за допомогою двостадійного лінійного AB градієнту від 0 % до 30 % B протягом 5 хв. та 30-90 % B протягом наступних 30 хв., де A=0,05 % TFA/H2O і B=0,05 % TFA/ацетонітрилі, і швидкості потоку 1 мл/хв.), після періоду проходження реакції тривалістю, як правило, 1-2 год. показує майже повне зникнення пептидного піку. Два піки, обумовлені моно- та дипегільованим пептидом, що з'являються у дипегільованого пептиду, складають, як правило, 90-95 % загальної площини піків. Зразок після цього розбавляють водою до приблизно 20 мл, і очищають, як у Прикладі 1, за допомогою двостадійного лінійного AB градієнту від 0 % до 30 % B протягом 20 хв. з подальшим 30-80 % B протягом 100 хв. Продукт, як правило, елююють 35-40 % ацетонітрилом. Кількісне визначення очищеного пептиду здійснюють шляхом визначення оптичної густини в УФ діапазоні при 280 нм із застосуванням обчисленого молярного коефіцієнту екстинкції на основі пептидної послідовності. Вихід після очищення знаходиться у межах 70-80 %, виходячи з кількості вихідного пептиду. Приклад 3: Аналіз зв'язування рецептора глюкагону (hGcgR) При проведенні аналізу зв'язування рецептора глюкагону застосовують клонований людський рецептор глюкагону (hGcgR) (Lok S., Kuijper J.L., Jelinek L.J., Kramer J.M., Whitmore T.E., Sprecher C.A., Mathewes S., Grant F.J., Biggs S.H., Rosenberg G.B. et al. Gene 140 (2), 203209 (1994)), виділений з мембран 293HEK. кДНК hGlucR субклонують у експресійній плазміді phD (Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell B.W., Berg D.T., Walls J. and Yan S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)). Цією плазмідною ДНК трансфекують клітини 293HEK з подальшим відбором за допомогою гігроміцину (200 мкг/мл). Неочищені плазмові мембрани одержують з клітин суспензійної культури. Клітини лізують на льоду у гіпотонічному буфері, який містить 25 мМ розчин трис-HCl, pH 7,5, 1 мМ розчин MgCl2, розчин ДНКази 1, 20 мкг/мл, і повний набір інгібіторів (без EDTA) (компанія Roche). Клітинну суспензію гомогенізують за допомогою скляного гомогенізатора Даунса із застосуванням тефлонового товкачика протягом 25 ходів. Одержаний гомогенат центрифугують при температурі 4°C при 1800g протягом 15 хв. Супернатант збирають, а осад ресуспендують у гіпотонічному буфері, і поновно гомогенізують. Одержану суміш центрифугують при 1800g протягом 15 хв. Другий супернатант змішують з першим супернатантом. Змішані супернатанти центрифугують при 1800g протягом 15 хв. для просвітлення. Просвітлений супернатант переносять до високошвидкісних пробірок і центрифугують при 25000g протягом 30 хв. при температурі 4 °C. Мембранний осад ресуспендують у гомогенізаційному буфері, і зберігають у вигляді заморожених аліквот у морозильній камері при температурі -80°C до застосування. 8 UA 106399 C2 125 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Глюкагон мітять радіоактивним йодом за допомогою I-лактопероксидази і очищають засобами HPLC з оберненою фазою на хроматографічній системі Perkin-Elmer/NEN (NEX207). Питома активність дорівнює приблизно 2200 Кюрі/ммоль. Визначення K D здійснюють шляхом гомологічного конкурування замість насичувального зв'язування внаслідок високого вмісту 125 пропанолу у I-міченому глюкагоні. За оцінкою, значення KD дорівнює 2,62 нМ, і це значення застосовують для обчислення значень Ki для усіх випробуваних сполук. Аналіз зв'язування рецептору здійснюють шляхом сцинтиляційного аналізу (SPA) із застосуванням МІПів з гранулами аглютиніну зародків пшениці (WGA), попередньо блокованих 1 % бичачим сироватковим альбуміном (BSA) без жирних кислот. Зв'язувальний буфер містить 25 мМ розчин 4-(2-гідроксиетил)-1-піперазинетансульфонової кислоти (HEPES), pH 7,4, 2,5 мМ розчин CaCl2, 1 мМ розчин MgCl2, 0,1 % BSA без жирних кислот, 0,003 % Твін 20 і повний набір інгібіторів (без EDTA) (компанія Roche). Глюкагон розчиняють у 0,01 N розчині HCl (1 мг/мл), і негайно заморожують 30 мкл аліквотами при температурі -80 °C. Аліквоти глюкагону розбавляють, і застосовують у аналізах зв'язування протягом 1 год. Аналог OXM розчиняють у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (PBS), і серійно розбавляють у зв'язувальному буфері. Після цього 10 мкл розведених сполук або PBS переносять до аналітичних планшетів Corning 3632 з прозорим дном, які містять 40 мкл аналітичного зв'язувального буферу або холодного глюкагону (неспецифічне зв'язування (NSB) при кінцевій концентрації 1 мкМ). Після 125 цього додають 90 мкл мембран (3 мкг/лунку), 50 мкл I-глюкагону (кінцева концентрація у реакційній суміші 0,15 нМ) та 50 мкл гранул WGA (150 мкг/лунку). Планшети герметизують, перемішують шляхом перевертання і зчитують за допомогою сцинтиляційного лічильника MicroBeta після 12 год. відстоювання при кімнатній температурі. 125 Результати обчислюють як відсоток специфічного зв'язування I-глюкагону у присутності сполуки. Абсолютну IC50 концентрацію сполуки визначають шляхом нелінійного регресійного 125 аналізу відсоткового специфічного зв'язування I-глюкагону у залежності від концентрації доданої сполуки. Значення IC50 перетворюють на Ki за допомогою рівняння Ченга-Прусоффа (Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973). Значення Ki аналогу OXM (послідовність SEQ ID NO: 3) з амідованим залишком Cys(PEG20k) у положенні 39 становить 5500350 нМ у разі зв'язування hGcgR. Приклад 4: Аналіз зв'язування рецептора глюкагоноподібного пептиду 1 (hGLP-1-R) При проведенні аналізу зв'язування рецептора GLP-1 застосовують клонований людський рецептор глюкагоноподібного пептиду 1 (hGLP-1R) (Graziano M.P., Hey P.J., Borkowski D., Chicchi G.G., Strader C.D., Biochem Biophys Res Commun. 1993 Oct 15;196(1):141-6), виділений з мембран 293HEK. кДНК hGLP-1R субклонують у експресійній плазміді phD (Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. and Yan, S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)). Цією плазмідною ДНК трансфекують клітини 293HEK з подальшим відбором за допомогою гігроміцину (200 мкг/мл). Неочищені плазмові мембрани одержують з клітин суспензійної культури. Клітини лізують на льоду у гіпотонічному буфері, що містить 25 мМ розчин трис-HCl, pH 7,5, 1 мМ розчин MgCl2, розчин ДНКази 1, 20 мкг/мл, і повний набір інгібіторів (без EDTA) (компанія Roche). Клітинну суспензію гомогенізують за допомогою скляного гомогенізатора Даунса із застосуванням тефлонового товкачика протягом 25 ходів. Одержаний гомогенат центрифугують при температурі 4°C при 1800g протягом 15 хв. Супернатант збирають, а осад ресуспендують у гіпотонічному буфері, і поновно гомогенізують. Одержану суміш центрифугують при 1800g протягом 15 хв. Другий супернатант змішують з першим супернатантом. Змішані супернатанти центрифугують при 1800g протягом 15 хв. для просвітлення. Просвітлений супернатант переносять до високошвидкісних пробірок і центрифугують при 25000g протягом 30 хв при температурі 4°C. Мембранний осад ресуспендують у гомогенізаційному буфері, і зберігають у вигляді заморожених аліквот у морозильній камері при температурі -80°C до застосування. 125 Глюкагоноподібний пептид 1 (GLP-1) мітять радіоактивним йодом за допомогою Iлактопероксидази і очищують засобами HPLC з оберненою фазою на хроматографічній системі Perkin-Elmer/NEN (NEX308). Питома активність дорівнює приблизно 2200 Кюрі/ммоль. Визначення KD здійснюють шляхом гомологічного конкурування замість насичувального 125 зв'язування внаслідок високого вмісту пропанолу у I-міченому GLP-1. За оцінкою, значення KD дорівнює 0,96 нМ, і це значення застосовують для обчислення значень Ki для усіх випробуваних сполук. Аналіз зв'язування рецептору здійснюють шляхом сцинтиляційного аналізу (SPA) із застосуванням МІПів з гранулами аглютиніну зародків пшениці (WGA), попередньо блокованих 1 % бичачим сироватковим альбуміном (BSA) без жирних кислот (компанія ICN). Зв'язувальний 9 UA 106399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буфер містить 25 мМ розчин HEPES, pH 7,4, 2,5 мМ розчин CaCl2, 1 мМ розчин MgCl2, 0,1 % BSA без жирних кислот, 0,003 % Твін20 і повний набір інгібіторів (без EDTA) (компанія Roche). GLP-1 розчиняють у PBS (1 мг/мл), і негайно заморожують 30 мкл аліквотами при температурі 80 °C. Аліквоти GLP-1 розбавляють і застосовують у аналізах зв'язування протягом 1 год. Аналог OXM розчиняють у PBS, і серійно розбавляють у зв'язувальному буфері. Після цього 10 мкл розведених сполук або PBS переносять до аналітичних планшетів Corning 3632 з прозорим дном, які містять 40 мкл аналітичного зв'язувального буферу або холодного GLP-1 (NSB при 125 кінцевій концентрації 1 мкМ). Після цього додають 90 мкл мембран (1 мкг/лунку), 50 мкл IGLP-1 (кінцева концентрація у реакційній суміші 0,15 нМ) та 50 мкл гранул WGA (150 мкг/лунку). Планшети герметизують, перемішують шляхом перевертання і зчитують за допомогою сцинтиляційного лічильника MicroBeta після 12 год. відстоювання при кімнатній температурі. 125 Результати обчислюють як відсоток специфічного зв'язування I-GLP-1 у присутності сполуки. Абсолютну IC50 концентрацію сполуки визначають шляхом нелінійного регресійного 125 аналізу відсоткового специфічного зв'язування I-GLP-1 у залежності від концентрації доданої сполуки. Значення IC50 перетворюють на Ki за допомогою рівняння Ченга-Прусоффа (Cheng Y., Prusoff W.H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973). Значення Ki аналогу OXM (послідовність SEQ ID NO: 3) з амідованим залишком Cys(PEG20k) у положенні 39 становить 1540±158 нМ у разі зв'язування hGLP-1R. Приклад 5: Функціональний аналіз цАМФ, стимульованого рецептором глюкагону При проведенні функціонального аналізу глюкагон-стимульованого цАМФ застосовують ту ж саму лінію клітин, що експресує клонований hGcgR, яка була застосована при проведенні аналізу зв'язування hGcgR, опис якого наведено вище у Прикладі 3. Клітини стимулюють аналогом OXM, і кількісне визначення цАМФ у клітині здійснюють за допомогою аналітичного набору Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (Alpha Screen) від компанії Perkin Elmer (6760625R). Стисло, цАМФ, індукований у клітині, конкурує з біотинілованим цАМФ згаданого набору за зв'язування з комплексом, до складу якого входить сенсибілізоване антицАМФ антитіло, акцепторна гранула та сенсибілізована стрептавідином донорна гранула. При підвищені рівня цАМФ у клітині комплекс акцепторна гранула-біотинілований цАМФ-донорна гранула руйнується, і відбувається зменшення сигналу, що спостерігається. Клітини hGcgR-HEK293 збирають на планшетах із субконфлуентною культурою тканин за допомогою розчину для дисоціації клітин без ферменту (Specialty Media 5-004-B). Одержані клітини осаджують при низькій швидкості і тричі промивають аналітичним буфером [25 мМ розчин HEPES у забуференому фізіологічному розчині (розчині Хенка) (HBSS) з Mg та Ca (GIBCO, 14025-092) з 0,1 % BSA (без жирних кислот)], після чого розбавляють до кінцевої концентрації 125000 клітин/мл. Біотинілований цАМФ з набору Alpha Screen додають до розведених клітин з кінцевою концентрацією 1 одиниця/0,04 мл. До згаданих розведених клітин додають також інгібітор фосфодіестераз, IBMX (250 мМ розчин у диметилсульфоксиді (DMSO)), з кінцевою концентрацією 500 мкM. Глюкагон спочатку розчиняють у 0,01 N розчині HCl (1 мг/мл), і негайно заморожують при температурі -80°C. У разі відтаювання, глюкагон повинен бути застосованим протягом 1 год. Глюкагон, стандарт цАМФ і аналог OXM серійно розбавляють в 6 разів у аналітичному буфері до кінцевої концентрації. Функціональний аналіз проводять у 96-лункових білих полістиролових планшетах Costar Plates (3688) невеликого об'єму. Реакцію розпочинають шляхом додавання 0,01 мл розбавленого аналогу OXM, глюкагону або цАМФ до 0,04 мл клітинної суміші. Після однієї години при кімнатній температурі реакцію зупиняють шляхом додавання 0,03 мл лізисного буферу [10 мМ розчин HEPES, pH 7,4, 1 % розчин NP40 та 0,01 %розчин BSA (без жирних кислот), кожна 1 одиниця яких містить 0,03 мл акцепторних та донорних гранул з набору Alpha Screen]. Додавання лізисного буферу здійснюють у темряві для запобігання знебарвлення детекторних гранул. Планшети обгортають фольгою, обережно струшують протягом 1 хв, після чого відставляють для зрівноваження протягом ночі при кімнатній температурі. Планшети зчитують за допомогою планшетного аналізатора Envision (компанія Perkin-Elmer). Одиниці Alpha Screen перетворюють на пмолі цАМФ, що одержали/лунку, виходячи із стандартної кривої цАМФ. Пмолі цАМФ, який одержали у кожній лунці, перетворюють на відсоток максимальної реакції, що спостерігалась з контролем глюкагону. Значення EC50 виводять за допомогою нелінійного регресійного аналізу, застосовуючи криву залежності між відсотковою максимальною реакцією та концентрацією доданого пептиду. Аналог OXM (послідовність SEQ ID NO: 3) з амідованим залишком Cys(PEG20k) у положенні 39, подібно до OXM дикого типу, був повністю ефективним та активним на hGcgR з EC50 60,02,97 нМ. Приклад 6: Функціональний аналіз цАМФ, стимульованого рецептором глюкагоноподібного пептиду 1 (hGLP-1) 10 UA 106399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 При проведенні функціонального аналізу GLP-1-стимульованого цАМФ застосовують ту ж саму лінію клітин, що експресує клонований hGLP-1R, яка була застосована при проведенні аналізу зв'язування hGLP-1R, опис якого наведено вище у Прикладі 4. Клітини стимулюють аналогом OXM, і кількісне визначення цАМФ у клітині здійснюють за допомогою аналітичного набору Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (Alpha Screen) від компанії Perkin Elmer (6760625R). Стисло, цАМФ, індукований у клітині, конкурує з біотинілованим цАМФ згаданого набору за зв'язування з комплексом, до складу якого входить сенсибілізоване антицАМФ антитіло, акцепторна гранула та сенсибілізована стрептавідином донорна гранула. При підвищені рівня цАМФ у клітині комплекс акцепторна гранула-біотинілований цАМФ-донорна гранула руйнується, і відбувається зменшення сигналу, що спостерігається. Клітини hGLP-1R-HEK293 збирають на планшетах із субконфлуентною культурою тканин за допомогою розчину для дисоціації клітин без ферменту (Specialty Media 5-004-B). Одержані клітини осаджують при низькій швидкості, і тричі промивають аналітичним буфером [25 мМ розчин HEPES у HBSS з Mg та Ca (GIBCO, 14025-092) з 0,1 % BSA (без жирних кислот)], після чого розбавляють до кінцевої концентрації 125000 клітин/мл. Біотинілований цАМФ з набору Alpha Screen додають до розведених клітин з кінцевою концентрацією 1 одиниця/0,04 мл. До згаданих розведених клітин додають також інгібітор фосфодіестераз, IBMX (250 мМ розчин у DMSO), з кінцевою концентрацією 500 мкM. GLP-1 зберігають (1 мг/мл) у PBS у вигляді заморожених аліквот при температурі -80°C. GLP-1, стандарт цАМФ і аналог OXM серійно розбавляють в 6 разів у аналітичному буфері до кінцевої концентрації. Функціональний аналіз проводять у 96-лункових білих полістиролових планшетах Costar Plates (3688) невеликого об'єму. Реакцію розпочинають шляхом додання 0,01 мл розбавленого аналогу OXM, GLP-1 або цАМФ до 0,04 мл клітинної суміші. Після однієї години при кімнатній температурі реакцію зупиняють шляхом додання 0,03 мл лізисного буферу [10 мМ розчин HEPES, pH 7,4, 1 % розчин NP40 та 0,01 % розчин BSA (без жирних кислот), кожна 1 одиниця яких містить 0,03 мл акцепторних та донорних гранул з набору Alpha Screen]. Додання лізисного буферу здійснюють у темряві для запобігання знебарвлення детекторних гранул. Планшети обгортають фольгою, обережно струшують протягом 1 хв., після чого відставляють для зрівноваження протягом ночі при кімнатній температурі. Планшети зчитують за допомогою планшетного аналізатора Envision (компанія Perkin-Elmer). Одиниці Alpha Screen перетворюють на пмолі цАМФ, що одержали/лунку, виходячи із стандартної кривої цАМФ. Пмолі цАМФ, який одержали у кожній лунці, перетворюють на відсоток максимальної реакції, що спостерігалась з контролем GLP-1. Значення EC50 виводять за допомогою нелінійного регресійного аналізу, застосовуючи криву залежності між відсотковою максимальною реакцією та концентрацією доданого пептиду. Аналог OXM (послідовність SEQ ID NO: 3) з амідованим залишком Cys(PEG20k) у положенні 39, подібно до OXM дикого типу, був повністю ефективним та активним на hGLP-1R з EC50 6,580,87 нМ. Приклад 7: Впливи на споживання корму, масу тіла та склад тканин тіла у мишей з ожирінням, індукованим раціоном (DIO) Мишей-самців віком від трьох до чотирьох місяців з ожирінням, індукованим раціоном (DIO), індивідуально розміщують у приміщенні з регульованою температурою (24C) з 12-годинним циклом чергування світла і темряви (світло включають о 22:00); тварини мають вільний доступ до кормута води. Після двотижневого звикання до приміщення мишей довільно розподіляють на експериментальні групи (n=8-10/групу), причому кожна група має однакову середню масу тіла та жирової компоненти маси тіла. Мишам підшкірно (sc) вводять розчин основи, і зважують протягом 2 днів для того, щоб призвичаїти їх до згаданих процедур. Основа або аналог OXM (доза у межах 7,5-30 нмоль/кг), розчинений у основі, вводять шляхом підшкірної ін'єкції ad libitum годованим DIO мишам за 30-90 хв. до початку циклу темряви кожні три дні протягом 2 тижнів (два повторні дослідження). Масу тіла і масу корму (плюс масу годівниці) визначають в один і той же час. Масу спожитого корму протягом попередніх 24 год. визначають шляхом віднімання теперішньої маси корму (плюс маса годівниці) від відповідної маси попереднього дня. Абсолютні зміни маси тіла обчислюють шляхом віднімання маси тіла тварини перед першою ін'єкцією. У дні 1 та 14 загальну масу жирової компоненти визначають за допомогою ядерного магнітного резонансу (NMR) із застосуванням обладнання від Echo Medical System (Houston, штат Техас). Масу тіла без жирової компоненти обчислюють шляхом віднімання маси жирової компоненти від загальної маси тіла. Дослідження 1 Аналог OXM (послідовність SEQ ID NO: 3) з амідованим залишком Cys(PEG20k) у положенні 39 вводять шляхом підшкірної ін'єкції мишам-самцям віком 4 місяці з ожирінням, індукованим 11 UA 106399 C2 5 10 раціоном (DIO). Згаданий аналог OXM вводять через кожні 3 дні протягом 2 тижнів у дозах 7,5 нмоль/кг, 15 нмоль/кг та 30 нмоль/кг, і порівнюють з мишами, які одержують основу, та позитивними контрольними мишами (агоніст GLP-1R тривалої дії у дозі 7,5 нмоль/кг через кожні 3 дні). Наслідком обробки аналогом OXM (послідовність SEQ ID NO: 3) з амідованим залишком Cys(PEG20k) у положенні 39 було дозозалежне зменшення споживання корму та маси тіла. На кінець 2-тижневого експериментального періоду сумарне споживання корму у групах, які одержували дози 15 нмоль/кг та 30 нмоль/кг, зменшилось на 21 % та 27 %, відповідно, в порівнянні з групою, яка одержувала основу. Сумарне зменшення маси у групі, яка одержувала дозу 7,5 нмоль/кг, було подібним до відповідного показника позитивної контрольної групи і дорівнювало приблизно 6 %, у порівнянні з групою, яка одержувала основу. Сумарне зменшення маси у групах, які одержували основу у дозі 15 нмоль/кг та 30 нмоль/кг, становило 10 % і 15 %, відповідно. Аналіз складу тканин тіла показав, що зменшення маси обумовлювалось, головним чином, зменшенням маси жирової компоненти тіла (Таблиця 1). 15 Таблиця 1 Зміна маси тіла у мишей з ожирінням, індукованим раціоном (DIO) протягом 14-денного експериментального періоду (середнє  SEM (середня квадратична помилка середнього); n=8) Доза аналогу OXM Загальне Загальне Зменшення маси жирової (послідовність SEQ ID NO: 3) з споживання корму зменшення маси компоненти тіла (зміна амідованим залишком (загальна кількість тіла (зміна маси у г маси жирової компоненти Cys(PEG20k) у положенні 39 у г протягом 14 протягом 14 днів) тіла у г протягом 14 днів) (нмоль/кг) днів) 0 (Основа) 0,7  0,2 39,6  0,7 0,4  0,2 7,5 -1,7  0,3* 36,5  1,2* -1,1  0,3* 15 -3,5  0,3* 31,4  0,9* -2,7  0,2* 30 -5,6  0,4* 29,0  1,3* -4,0  0,3* 20 25 Дослідження 2 Аналог OXM (послідовність SEQ ID NO: 3) з амідованим залишком Cys(PEG20k) у положенні 39 (7,5 нмоль/кг або 22,5 нмоль/кг) і позитивний контроль (агоніст GLP-1R тривалої дії у дозі 7,5 нмоль/кг або 22,5 нмоль/кг) вводять шляхом підшкірної ін'єкції мишам-самцям лінії C57BL/6 віком 4 місяці з ожирінням, індукованим раціоном (DIO), через кожні 3 дні протягом 2 тижнів. В усіх експериментальних групах спостерігалось значне зменшення сукупного споживання корму в порівнянні з контрольними тваринами, які одержували основу. Аналог OXM і позитивний контроль однаковою мірою зменшували масу тіла приблизно на 5 % і 10 % у разі низької і високої доз, відповідно. Аналіз складу тканин тіла підтвердив, що зменшення маси тіла, пов'язане з аналогом OXM і позитивним контролем, обумовлювалось, головним чином, зменшенням маси жирової компоненти тіла (Таблиця 2). Таблиця 2 Зміна маси тіла у мишей з ожирінням, індукованим раціоном (DIO) протягом 14-денного експериментального періоду (середнє  SEM; n=10) Доза аналогу OXM Зменшення маси Загальне (послідовність SEQ ID NO: 3) Загальне зменшення жирової компоненти тіла споживання корму з амідованим залишком маси тіла (зміна маси (зміна маси жирової (загальна кількість у Cys(PEG20k) у положенні 39 у г протягом 14 днів) компоненти тіла у г г протягом 14 днів) (нмоль/кг) протягом 14 днів) 0 (Основа) 0,1  0,2 38,8  0,5 0,0  0,2 7,5 -2,5  0,3* 33,3  0,6* -1,6  0,2* 22,5 -5,2  0,2* 28,7  0,6* -3,8  0,2* 30 Ці дані показують, що аналог OXM (послідовність SEQ ID NO: 3) з амідованим залишком Cys(PEG20k) у положенні 39 зменшував загальне споживання корму та масу тіла у двох 12 UA 106399 C2 5 10 15 20 повторних 14-денних дослідженнях на мишах з ожирінням, індукованим раціоном (DIO), порівняно з мишами, які одержували основу. Зменшення маси тіла обумовлювалось, головним чином, зменшенням маси жирової компоненти тіла. *p