Аналог еритропоетину людини (варіанти), молекула днк, що кодує аналог еритропоетину людини (варіанти), еукаріотична клітина-хазяїн, трансфікована молекулою днк (варіанти), фармацевтична композиція (варіанти)

1 Аналог эритропоэтина человека, содержащий, по крайней мере, один дополнительный сайт N-гликозилирования в остатке аспарагиновой кислоты в любом из аминокислотных положений 30, 51, 57, 88, 89, 136 и 138, где, по крайней мере, одна дополнительная N-присоединенная углеводная цепь присоединена по любому из указанных аминокислотных положений 2 Аналог по п 1, отличающийся тем, что представляет собой продукт экспрессии экзогенной последовательности ДНК 3 Аналог эритропоэтина человека, который представляет собой Asn30 Thr32 Val87 Asn8S Thr*0 ЕРО, 4 Аналог эритропоэтина человека по п 1, отличающийся тем, что выбран из группы, состоящей из M 32 Asn Tbr ЕРО, 51 Asn Thr" ЕРО, 57 54 7 se Asn Thr ЕРО, Val' Asn Thr™ ЕРО, Ser^Asn^Thr^EPO, 5 Аналог эритропоэтина человека, включающий удлинение из одной или нескольких аминокислот с карбокси-конца эритропоэтина, где удлинение содержит, по меньшей мере, один сайт гликозилирования 6 Аналог по п 5, отличающийся тем, что включает пептидный фрагмент, полученный из карбоксиконца хорионического гонадотропина человека 7 Аналог по п 6, отличающийся тем, что выбран из группы, состоящей из (a) эритропоэтина человека, имеющего аминокислотную последовательность Ser-Ser-Ser-Ser-LysAla-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-LeuPro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-lle-Leu-Pro-GIn, удлинняющуюся с карбокси-конца, (b) аналога (а), дополнительно содержащего последовательность Ser 8 7 Asn S 8 Th/°EPO; и (с) аналога (а), дополнительно содержащего последовательность 8 Аналог эритропоэтина человека, включающий делецию одного или нескольких сайтов гликозилирования эритропоэтина человека и вставку соответствующего количества не встречающихся в природе сайтов гликозилирования, посредством чего присоединяется углеводная цепь 9 Аналог по п 8, отличающийся тем, что не встречающийся в природе сайт гликозилирования представляет собой N-связанный углеводный сайт в аминокислотном положении 88 эритропоэтина человека 10 Аналог по п 9, отличающийся тем, что выбран из группы, состоящей из 8я* Аяі О1у ТЬі* ЕР0, GlnMSet*W8TWMEPO; Se^Asf^Thr^Thr^EPO, Gln 3 B Ser 8 7 A S n 8 8 Thr 9 0 EPO;H 7 я ю > Se^As^Thr^Ala'^EPO, Asn w Thr ! 1 SerST ASE SS Thr 90 Е Ю , W i l e * T V 1 ЕРО, Ser S 7 A S n 8 9 Ile w Thr 9 1 EPO, Asn136Tlir1JSEPO, и AsnBSThrT40EPO Gln^Ser^Asn^Thr90 ЕРО 11 Аналог эритропоэтина человека, содержащий дополнительный сайт О-гликозилирования в аминокислотном положении 123, где дополнительная О-связанная углеводная цепь присоединена в указанном аминокислотном положении О го 49793 12 Молекула ДНК, содержащая последовательность, кодирующую аналог эритропоэтина человека, имеющего, по крайней мере, один дополнительный сайт N-гликозилирования в остатке аспарагиновой кислоты в любом из аминокислотных положений 30, 51, 57, 88, 89, 136 и 138, где, по крайней мере, одна дополнительная Nприсоединенная углеводная цепь присоединена по любому из указанных аминокислотных положений 13 Молекула ДНК, содержащая последовательность, кодирующую аналог эритропоэтина человека, который представляет собой 30 32 87 88 90 Asn Thr Val Asn Thr ЕРО. 14 Молекула ДНК, содержащая последовательность, кодирующую аналог эритропоэтина человека, включающий удлинение из одной или нескольких аминокислот с карбокси-конца эритропоэтина, где удлинение содержит, по меньшей мере, один сайт гликозилирования 15 Молекула ДНК, содержащая последовательность, кодирующую аналог эритропоэтина человека, включающий делецию одного или нескольких сайтов гликозилирования эритропоэтина человека и вставку соответствующего количества не встречающихся в природе сайтов гликозилирования, посредством чего присоединяется углеводная цепь 16 Молекула ДНК, содержащая последовательность, кодирующую аналог эритропоэтина человека, содержащий дополнительный сайт Огликозилирования в аминокислотном положении 123, где дополнительная О-связанная углеводная цепь присоединена в указанном аминокислотном положении 17 Эукариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК таким образом, что клеткахозяин экспрессирует аналог эритропоэтина человека, где молекула ДНК содержит последовательность, кодирующую аналог эритропоэтина человека, имеющего, по крайней мере, один дополнительный сайт N-гликозилирования в остатке аспарагиновой кислоты в любом из аминокислотных положений 30, 51, 57, 88, 89, 136 и 138, и где, по крайней мере, одна дополнительная Nприсоединенная углеводная цепь присоединена по любому из указанных аминокислотных положений 18 Эукариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК таким образом, что клеткахозяин экспрессирует аналог эритропоэтина человека, где молекула ДНК содержит последовательность, кодирующую аналог эритропоэтина человека, который представляет собой Атт Tlir32 VeF Asna Thr96 ЕЮ. 19 Эукариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК таким образом, что клеткахозяин экспрессирует аналог эритропоэтина человека, где молекула ДНК содержит последовательность, кодирующую аналог эритропоэтина человека, включающий удлинение из одной или нескольких аминокислот с карбокси-конца эритропоэтина, где удлинение содержит, по меньшей мере, один сайт гликозилирования 20 Эукариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК таким образом, что клеткахозяин экспрессирует аналог эритропоэтина человека, где молекула ДНК содержит последовательность, кодирующую аналог эритропоэтина человека, включающий делецию одного или нескольких сайтов гликозилирования эритропоэтина человека и вставку соответствующего количества не встречающихся в природе сайтов гликозилирования, посредством чего присоединяется углеводная цепь 21 Эукариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК таким образом, что клеткахозяин экспрессирует аналог эритропоэтина человека, где молекула ДНК содержит последовательность, кодирующую аналог эритропоэтина человека, содержащий дополнительный сайт Огликозилирования в аминокислотном положении 123, и где дополнительная О-связанная углеводная цепь присоединена в указанном аминокислотном положении 22 Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество аналога эритропоэтина совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем, адъювантом или носителем, где аналог эритропоэтина человека имеет, по крайней мере, один дополнительный сайт N-гликозилирования в остатке аспарагиновой кислоты в любом из аминокислотных положений 30, 51, 57, 88, 89, 136 и 138, и где, по крайней мере, одна дополнительная N-присоединенная углеводная цепь присоединена по любому из указанных аминокислотных положений 23 Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество аналога эритропоэтина совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем, адъювантом или носителем, где аналог эритропоэтина человека представляет собой Asn30 Thr32 Val87 Asn88 ThrM ЕРО. 24 Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество аналога эритропоэтина, совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем, адъювантом или носителем, где аналог эритропоэтина человека включает удлинение из одной или нескольких аминокислот с карбокси-конца эритропоэтина, где удлинение содержит, по меньшей мере, один сайт гликозилирования 25 Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество аналога эритропоэтина совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем, адъювантом или носителем, где аналог эритропоэтина человека включает делецию одного или нескольких сайтов гликозилирования эритропоэтина человека и вставку соответствующего количества не встречающихся в природе сайтов гликозилирования, посредством чего присоединяется углеводная цепь 26 Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество аналога эритропоэтина, совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем, адъювантом или но 49793 сителем, где аналог эритропоэтина человека содержит дополнительный сайт О-гликозилирования в аминокислотном положении 123, и где дополни тельная О-связанная углеводная цепь присоединена в указанном аминокислотном положении Настоящее изобретение относится к аналогам эритропоэтина, имеющим, по крайней мере, один дополнительный сайт для гликозилирования или включающим перегруппировку, по крайней мере одного сайта для гликозилирования Изобретение также относится к последовательностям ДНК, кодирующим указанные аналоги эритропоэтина, и рекомбинантным плазмидам и клеткам хозяевам для экспрессии аналога Эритропоэтин (ЕРО) является гликопротеиновым гормоном, вовлеченным в созревание эритроидных клеток-предшественников в эритроцитах Он является необходимым при регулировании уровней эритроцитов в кровообращении Эритропоэтин естественного происхождения образуется легкими в процессе фетальной жизни и почкой взрослых индивидуумов, и циркулирует в крови, и стимулирует образование эритроцитов в костном мозге Анемия является почти без сомнения следствием почечной недостаточности, обусловленной пониженным образованием эритропоэтина из почки Рекомбинантный Эритропоэтин, полученный с помощью генной инженерии, включающей экспрессию протеинового продукта из клетки хозяина, превращенной геном, кодирующим Эритропоэтин, как было найдено, является эффективным, если используется при лечении анемии, возникшей при хронической почечной недостаточности ция, отнесенная к гликозилированию, может драматически влиять на физические свойства протеинов и может оказывать важное влияние на стабильность протеина, секрецию и субклеточную локализацию Нужное гликозилирование может являться существенным для биологической активности Фактически, некоторые гены из организмов эукариотов, если они экспрессированы в бактерию (например, Е coli), которая благоприятствует клеточным процессам гликозилирования протеинов, дают протеины, которые выделяются почти или совсем неактивными в силу их недостаточного гликозилирования Гликозилирование происходит в специфических положениях вдоль полипептидного скелета и бывает обычно двух типов 0-связанные олигосахариды присоединяются к сериновым или треониновым остаткам, в то время как N-связанные олигосахариды присоединяются к аспарагиновым остаткам, если они являются частью последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, за исключением пролина Структуры N-связан-ных и 0-связанных олигосахаридов и остатков Сахаров, найденные в каждом типе, являются различными Один тип сахара, который обычно находят на обоих структурах является Nацетилнейраминовой кислотой (далее употребляется как сиаловая кислота) В моче человека обычно присутствуют низкие уровни эритропоэтина, тогда как у пациентов, страдающих гипопластической анемией, обнаружены повышенные уровни мочевого эритропоэтина Для очистки мочевого эритропоэтина человека Miyake etal J Biol Chem ,252, 5558 /1977/ использовали, в качестве исходного материала, мочу от пациентов с гипопластичной анемией До сих пор, однако, мочевой Эритропоэтин, как было показано, является терапевтически полезным Идентификацию, клонирование и экспрессию генов, кодирующих эритропоэтин, описывают в патенте США № 4703008 Lin Описание способа очистки рекомбинантного эритропоэтина из клеточной среды содержится в патенте США №4667016 Экспрессия и выделение биологически активного рекомбинантного эритропоэтина из клеток хозяина млекопитающего, содержащих ген эритропоэтина или рекомбинантные плазмиды, впервые сделала доступными количества эритропоэтина, пригодные для терапевтических применений Кроме того, знание генной последовательности и доступность больших количеств очищенного протеина привело к лучшему пониманию характера действия этого протеина Сиаловая кислота является обычно терминальным остатком обоих N-связанных и 0связанных олигосахаридов, и, в силу ее отрицательного заряда, может сообщать кислотные свойства гликопротеину Оба эритропоэтина и мочевой эритропоэтин человека, и рекомбинантный эритропоэтин (экспрессированный в клетки млекопитающего), имеющие аминокислотную последовательность 1165 эритропоэтина человека содержат три Nсвязанных и одну 0-связанную олигосахаридные цепи, которые вместе составляют около 40% общего молекулярного веса гликопротеина N-связанное гликозилирование протекает в аспарагиновых остатках, расположенных в положениях 24, 38 и 83, в то время как 0-связанное гликозилирование протекает в сериновом остатке расположенном в положении 126 (Lai et al JBiolChem 261, 3116/1986/, Broudy et al Arch Biochem Biophys 265, 329/1988/) Олигосахаридные цепи, как показано, являются модифицированными терминальными остатками сиаловой кислоты Ферментативная обработка гликозилированного эритропоэтина с удалением всех остатков сиаловой кислоты приводит к потере активности in vivo, но не влияет на активность in vitro (Lowy et al , Nature, 185, 103 /I960/, Goldwasser et al , J Biol Chem 249, 4202/1974/) Это поведение объясня Многие поверхностные протеины клеток и секреторные протеины, полученные с помощью клеток эукариотов, модифицируют одной или более олигосахаридными группами Эта модифика 49793 ется быстрым выведением асиало-эритропоэтина из кровообращения при взаимодействии с почечным асиалогликопротеином, связывающим протеин (Morrell et al J Biol Chem 243, 155/1968/, Bnggs et al Am JPhysiol 227, 1385/1974/, Ashwell et al Methods Enzymol 50, 287 /1978/) Таким образом, эритропоэтин обладает биологической активностью in vivo только, если он сиалилирован для того, чтобы избежать его связывания почечным связывающим протеином Роль других компонентов в олигосахаридных цепях эритропоэтина является недостаточно определенной Было показано, что частично дегликозилированный эритропоэтин имеет сильно пониженную активность in vivo, по сравнению с гликозилированной формой, но не сохраняет активность in vitro (Dordal et al Endocrinology 116, 2293/1985/ Lin) В другом исследовании, однако, удаление N-связанных или 0-связанных олигосахаридных цепей поодиночке или совместно с помощью мутагенеза аспарагинового или серинового остатков, которые являются сайтами гликозилирования, резко снижает активность in vitro измененного эритропоэтина, который получают в клетках млекопитающего (Dube et al JBiolChem 263,17516/1988/) Гликопротеины, такие как эритропоэтин, могут быть разделены в различных заряженных формах, используя технику, такую как изоэлектрическое фокусирование (IEF) Несколько исследовательских групп сообщали о IEF изучении неочищенных и частично очищенных эритропоэтиновых препаратов (Lukowsky et al_ J Biochem 50, 909 119121 \ Sheltton et al Biochem Med 12,45 /1975/, Fuhr etal Biochem Biophys Res Comm 98, 930/1981/) Самое большее, три или четыре фракции, имеющие эритропоэтиновую активность были определены с помощью IEF в этих исследованиях и ни одна из них не была охарактеризована в отношении содержания карбогидрата Кроме того, не было проведено корреляции между изоэлектрическими точками фракций и их биологической активностью В процессе очистки мочевого эритропоэтина из мочи человека, обсуждавшемся Miyake et al , сообщалось о двух эритропоэтиновых фракциях, полученных при хроматографировании на гидроксиаппатите, обозначенных как II и IIIA, которые имели подобную специфическую активность Последующий карбогидратный анализ фракций II и IIIA показал, что фракция II имеет большее среднее содержание сиаливой кислоты, чем фракция IIIA (Dordal etal) Целью настоящего изобретения является обеспечение разделенных и выделенных изоформ эритропоэтина, имеющих определенное содержание сиаливой кислоты и биологическую активность Фармацевтические композиции, содержащие такие молекулы, будут обладать терапевтически полезным действием Объект изобретения относится к аналогам эритропоэтина человека, содержащим аминокислотную последовательность, которая включает, по крайней мере, один дополнительный сайт для гликозилирования Добавленные сайты для глико 8 зилирования могут давать большее число карбогидратных цепей и более высокое содержание сиаловой кислоты, чем эритропоэтин человека Аналоги эритропоэтина, включающие аминокислотные последовательности, которые включают перегруппировку, по крайне мере, одного сайта для гликозилирования, также охватываются настоящим изобретением Аналоги, включающие дополнительно одну или более аминокислот с карбокси терминальным концом эритропоэтина, где обеспечивается дополнительно, по крайней мере, один сайт гликозилирования, также включаются в настоящее изобретение Изобретение далее включает последовательности ДНК, кодирующие такие аналоги эритропоэтина и рекомбинантные плазмиды и клетки хозяев для экспрессии аналога Фиг 1 показывает аналитический изоэлектрический фокусирующий гель разделенных рекомбинантных изоформ эритропоэтина Полосы геля 1-11 показывают изоформы в области от менее кислой (более высокая величина р1) в полосе 1 до более кислой (более низкая величина р1) в полосе 11 Очищенный рекомбинантный эритропоэтин, содержащий смесь изоформ 9-14, также показан в дальних левых и правых полосах геля Фиг 2 показывает взаимосвязь между количеством сиаливой кислоты на изоформу эритропоэтина и специфической активностью in vivo каждой изоформы, выраженной в единицах на мг полипептида эритропоэтина На фиг 2А концентрацию каждой изоформы эритропоэтина определяли с помощью анализа на протеин по Брэдфорду, на фиг 2В концентрацию определяли по поглощению при 280нм, на фиг 2С концентрацию определяли с помощью анализа RIA Фиг 3 показывает аналитический изоэлектрический фокусирующий гель определенных смесей рекомбинантных изоформ эритропоэтина, приготовленных с помощью анионообменной хроматографии в различных условиях Полосы геля 1-6 представляют, соответственно, изоформы эритропоэтина, элюированные в высококонцентрированный солевой промывной раствор после промывания колонки с Q-сефарозой быстрым потоком ("fast flow") 150ммоль/л уксусной кислоты, рН 4 7, 250ммоль/л уксусной кислоты, рН 4 7, 300ммоль/л уксусной кислоты, рН 4 7 или 300ммоль/л уксусной кислоты (небуферной) Очищенный рекомбинантный эритропоэтин, содержащий смесь изоформ, полученный с использованием процедуры, описанной в Примере 2, Lai et al , за исключением того, что хроматографию с DEAE-агарозой заменяют хроматографией с Qсефарозой, показывают также в левой дальней полосе геля Фиг 4 показывает разделение изоформ эритропоэтина с 8 по 12, достигнутое путем воздействия на кондиционированную среду клеток на колонке с Q-сефарозой, градиентом уменьшения рН и увеличения ионной силы Аликвоты равномерно распределенных фракций от фракции 2 до фракции 40 подвергали аналитическому изоэлектрическому фокусированию 49793 Очищенный рекомбинантный эритропоэтин, содержащий смесь изоформ, полученный с использованием процедур, описанных в Примере 2 Lai et al , за исключением того, что хроматографию с DEAE-агарозой заменяют хроматографией с Qсефарозой, также показывают в дальней левой полосе геля Фиг 5 показывает аминокислотную последовательность эритропоэтина человека Квадраты указывают на аспарагиновые остатки, к которым присоединяются N-связанные карбогид ратные цепи, и звездочки указывают на сериновый остаток, модифицированный 0-связанной карбогидратной цепью Фиг 6А, 6В и 6С показывают серии стадий клонирования, использованных в генерировании плазмид для конструирования и анализа аналогов эритропоэтина человека Эти аналоги имеют измененные аминокислоты как показано на фиг 5, которые обеспечивают дополнительные сайты гликозилирования Фиг 7 показывает Western blot анализ супернатантов клеток COS эритропоэтина, с последовательностью, подобной эритропоэтину человека и указанных аналогов эритропоэтина Аналоги [Asn9, Ser11] ЕРО, [Asn69] ЕРО, [Asn125, Ser127] ЕРО 124 125 и [Pro , Thr ] ЕРО конструируют, как описано в Примере 6 Дополнительные аналоги [Pro125, Thr127] ЕРО и [Asn 126 , Ser 128 ] ЕРО, которые не содержат дополнительных карбогид ратных цепей, показывают для сравнения Фиг 8 показывает Western blot анализ супернатантов клеток COS эритропоэтина с последовательностью, подобной эритропоэтину человека и указанных аналогов эритропоэтина после обработки N-гликаназой Аналоги [Thr125] ЕРО и [Pro 24, 125 Thr ] ЕРО были сконструированы, как описано в Примере 6 Аналоги [Val12fe] ЕРО, [Pro124] ЕРО, [Pro125] ЕРО, [Thr127] ЕРО, [Pro125, Ser 127 ] ЕРО и 125 127 [Thr , Ser ] ЕРО показывают для сравнения Фиг 9 показывает изоэлектрический фокусирующий гель пулов 2, 3 и 4, полученных с помощью хроматографии с Q-сефарозой и С4 обращенной фазой среды клеток, которая поддерживала рост СНО клеток, трансфекцированных эритропоэтиновой сДНК, содержащей [Thr125] мутацию Очищенный рекомбинантный эритропоэтин, содержащий смесь изоформ, которые были получены с использованием процедур, описанных в Примере 2 Lai et al , за исключением того, что хроматографию с DEAE-агарозой заменяют хроматографией с О-сефарозой,также показывают в левой и правой полосах геля Фиг 10 показывает Western blot анализ супернатантов COS клетки рекомбинантного эритропоэтина человека (rHuEPO) и выбранных аналогов Конструкцию аналогов описывают в Примере 6 Аналоги N9, N14, N18, N19, N21, N24 и N39 имеют, по крайней мере, одну дополнительную карбогидратную цепь, как это свидетельствует из меньшей подвижности геля Фиг 11 показывает Western blot анализ супернатантов COS клетки рекомбинантного эритропоэтина человека и ЕРО N14 аналога в процессе усваивания N-гликаназы Были выбраны точки при 10 0, 4, 12 и 45 минутах и после усваивания в течение ночи Фиг 12 показывает изоэлектрический фокусирующий гель препаратов изоформы ЕРО N14 аналога Низкий пул изоформы содержит ЕРО N14 аналог, включающий главным образом 6-12 сиаловых кислот на молекулу, средний пул изоформы содержит ЕРО N14 аналог, содержащий главным образом 10-15 сиаловых кислот на молекулу , и высокий пул изоформы содержит ЕРО N 14 аналог, имеющий главным образом 12-17 сиаливых кислот на молекулу Фиг 13 показывает фармакокинетические данные рекомбинантного эритропоэтина человека, выделенной изоформы 14 и ЕРО N 14 аналога (изоформы 15-17) после внутривенной инъекции крысам Фиг 14 показывает данные анализа по холодной замене 1125 меченного рекомбинантного эритропоэтина человека, связанного с эритропоэтиновым рецептором, в присутствии изменяющихся количеств немеченного гНиЕРО, выделенной изоформы 14 или ЕРО N14 аналога Фиг 15 показывает гематокритное исследование мыши, сравнивающее активность высокого пула изоформы ЕРО N14 (0 036 и 0 0712мкг), выделенной изоформы 14 (0 036 и 0 0712мкг), низкого пула изоформы ЕРО 177 (0 0712мкг) и гНиЕРО (0 071м кг) Объект изобретения включает изоформы эритропоэтина Специфические изоформы эритропоэтина, полученные в соответствии с настоящим изобретением, и их свойства, могут меняться в зависимости от источника исходного материала Например, изоформы мочевого эритропоэтина человека отличаются от изоформ рекомбинантного эритропоэтина В предпочтительном варианте, изобретение относится к изоформе эритропоэтина, имеющей специфическое число (те фиксированное число больше 0) сиаловых кислот на молекулу эритропоэтина, указанное число выбрано из группы, состоящей из 1-14 Преимущественно, указанное число составляет 9, 10, 11, 12, 13 или 14 В другом варианте, указанное число больше 14, преимущественно 16-23 Термин "изоформа эритропоэтина," как он использован здесь, относится к препаратам эритропоэтина, имеющим одну изоэлектрическую точку (р1) и имеющим одинаковую аминокислотную последовательность Термин "эритропоэтин", как он использован здесь, включает эритропоэтин естественного происхождения, мочевой эритропоэтин человека, а также полипептиды ненатурального происхождения, имеющие аминокислотную последовательность и гликозилирование, достаточно точно воспроизводящее то, которое свойственно эритропоэтину естественного происхождения, что позволяет им обладать биологическими свойствами in vivo, вызывающими в клетках костного мозга повышенное продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов Было найдено, что дискретные изоформы рекомбинантного эритропоэтина, имеющие аминокислотную последовательность мочевого эритропоэтина человека, соответствуют молекулам 11 эритропоэтина, имеющим 1-14 сиаливых кислот, и каждая изоформа, присутствующая в очищенном рекомбинантном эритропоэтине, обладает активностью in vivo, которую связывают с числом сиаловых кислот, которым обладает изоформа В предпочтительном варианте, эритропоэтин представляет продукт экспрессии экзогенной ДНК последовательности, которая трансфекцирована в нечеловеческую клетку хозяина эукариота, таким образом, в предпочтительном варианте эритропоэтин представляет "рекомбинантный эритропоэтин" Рекомбинантный эритропоэтин получают, преимущественно, согласно процедуре, описанной в патенте США 4703008 Рекомбинантный эритропоэтин может быть очищен согласно обычной процедуре, описанной в Примере 2 патента США 4667016 Lai et al или, напротив, согласно процедуре, описанной в Примере 2 Lai et al , где хроматографию с DEAE-агарозой заменяют хроматографией с Q-сефарозой Эритропоэтин, очищенный согласно Примеру 2 Lai et al , содержит преимущественно шесть изоформ, при анализе с помощью IEF Кроме того, по крайней мере одна дополнительная изоформа большей кислотности обнаружена с использованием процедуры хроматографирования, описанной в Примере 4 (Эта более кислая форма, мигрирующая при более 14 сиаловых кислотах на IEF геле может содержать отрицательные заряды несиаловой кислоты, что проявляется в сопротивлении усваиванию солидазы некоторым зарядом) Эти изоформы отличаются друг от друга содержанием сиаливой кислоты Как показано в Примерах, это демонстрируется выделением 10 из этих изоформ с помощью препаративной IEF и определением содержания сиаливой кислоты в пяти из них Анализом изоформ на содержание сиаливой кислоты найдено, что пять изоформ содержали либо 9, 10, 11, 12, либо 13 остатков сиаловой кислоты Существует взаимосвязь между относительной специфической активностью in vivo эритропоэтина и числом остатков сиаливой кислоты на молекулу эритропоэтина изоформ от 5 до 11 (каждая изоформа обозначена здесь числом сиаливых кислот на молекулу эритропоэтина) Изоформы с 11 по 14 имеют приблизительно одинаковую относительную специфическую активность in vivo Изоформы 5-14 подвергали анализу на активность in vivo с помощью эксгипоксинового полицитемического биоанализа на мышах и количество каждой присутствующей изоформы определяли с помощью анализа на протеин по Брэдфорду, по поглощению при 280 нм или с помощью радиоиммунного анализа (RIA) для эритропоэтина RIA определения (Ergie etal Immunobiology 172, 213/1986/), выраженные в единицах/мл делят на 212,770 единиц/мг эритропоэтинового полипептида среднюю специфическую активность очищенного эритропоэтина, определенную с помощью RIA, получая концентрации протеина выделенных изоформ или смесей изоформ, выраженные в мг полипептида эритропоэтина/мл Как показано в Примерах, относительные специфические активности in vivo увеличиваются ступенчато от изо 49793 12 формы 5 до изоформы 11 (смотри Таблицу 2) Специфические активности in vivo, на которые ссылаются здесь, являются показателями относительных специфических активностей in vivo и не являются показателями абсолютных специфических активностей in vivo Для целей этой заявки, специфические активности используют только для сравнения относительных активностей изоформ, которые подвергали анализу, используя один и тот же анализ, используя те же условия, включающие тот же внутренний стандарт, тот же тип животных, имеющих тот же анализ данных, использованных для расчета специфической активности, тот же анализ для определения содержания протеина Не имеется в виду, что любая величина специфической активности in vivo, приведенная для любой изоформы, представляет характеристическую или абсолютную величину для такой изоформы Это изобретение также включает композиции, содержащие две или более изоформы эритропоэтина В одном варианте композиции включают смесь изоформ, имеющих больше, чем предварительно определенное число сиаливых кислот на молекулу эритропоэтина, например, больше чем 11 сиалевых кислот на молекулу эритропоэтина, или больше чем 12 сиаловых кислот на молекулу, например, смесь изоформ 12, 13 и 14 В другом варианте, композиции содержат смеси изоформ, имеющих предварительно определенное число сиалевых кислот на молекулу эритропоэтина, например, меньше 12, но больше 8 сиаловых кислот на молекулу, как, например, смесь изоформ 9, 10 и 11 Изобретение также включает композиции изоформ эритропоэтина, где относительные количества изоформ являются одинаковыми или разными Например, смесь изоформ 9, 10 и И может иметь изоформы присутствующие в различных отношениях, таких как 1 1 1 , 2 3 1 или 20 20 1 Преимущественно, композиции включают смеси менее чем четырех изоформ, например, смесь изоформ 11, 12 и 13, или смесь 12 и 14, или смесь 7 и 13 Для того, чтобы получить смеси изоформ эритропоэтина, это изобретение также включает способы выделения выбранных изоформ эритропоэтина Эти способы включают выделение индивидуальных изоформ с помощью такой техники, как препаративное изоэлектрическое фокусирование или приготовление смесей изоформ, имеющих предварительно определенное число сиаливых кислот на молекулу (например, больше 11), с помощью такой техники, как ионообменная хроматография или хроматофокусирование Все эти приемы имеют в качестве основы разделение протеинов в соответствии с зарядом В общем, ионообменнная хроматография и хроматофокусирование включают применение либо неочищенного эритропоэтина человека (клетка кондиционированной среды), или вещества, очищенного на колонке со смолой в условиях, которые позволяют связывать некоторые или все изоформы эритропоэтина со смолой Для неочищенных препаратов эритропоэтина предпочтительно применять протеин с колонки при рН около 13 49793 14 7, в то время как для очищенных препаратов протеин может быть применен с колонки с рН 7 и ниже, до рН 4 После промывания колонки буфером с рН около 4, те изоформы эритропоэтина, которые остаются связанными с ионообменной колонкой, элюируют с помощью повышения рН и концентрации соли в буфере, или с помощью применения градиента повышения рН и увеличения ионной силы при рН около 4 Для хроматофокусирования, изоформы элюируют из колонки с помощью градиента повышения рН или путем промывания колонки раствором с повышенной концентрацией соли В предпочтительном варианте, индивидуальные изоформы выделяют, используя ионообменную хроматографию Как например, изоформу 14 выделяют, используя ионообменную хроматографию как описано в Примере 8 Изобретение также включает некоторые аналоги эритропоэтина человека Фраза "аналог эритропоэтина человека", как она использована здесь, относится к эритропоэтину с одним или более изменениями в аминокислотной последовательности эритропоэтина человека, которая приводит в результате к увеличению числа сайтов для присоединения сиаловой кислоты Аналоги генерируют сайт-направленным мутагенезом, включающим присоединения, делеции или замещения аминокислотных остатков, которые увеличивают или изменяют сайты, которые являются пригодными для гликозилирования Такие аналоги могут иметь большее число карбогидратных цепей, чем эритропоэтин человека щие дополнительные сайты для гликозилирования Аналоги, имеющие повышенные уровни присоединенного карбогидрата у сайта гликозилирования, также включаются изобретением Такие аналоги обычно включают замещение одной или более аминокислот, которые находятся в непосредственной близости к N-связанному или 0связанному сайту В результате этих изменений аминокислоты, большее количество полипептидов эритропоэтина будет содержать карбогидратную модификацию Сайты гликозилирования могут быть естественного происхождения или генерированы с помощью мутации Например, аналог N 13 не генерирует дополнительную карбогидратную цепь даже через сайт гликозилирования, введенный в положение 88 Однако, аналоги N 14 и N 18, которые содержат сериновые и валиновые остатки, соответственно, замещенные в положение 87, имели дополнительную карбогидратную цепь в положении 88 Изобретение также включает аналоги, которые содержат одну или более аминокислот, простирающихся от карбоксиконцевои области эритропоэтина и где карбоксиконцевое расширение обеспечивает, по крайней мере, один дополнительный карбогидратный сайт В одном из вариантов, аналог конструировали слиянием карбоксиконцевых 28 аминокислот хронического гонадотропина человека (HCG) с аргининовым остатком в положении 166 эритропоэтина человека HCG карбоксиконцевои фрагмент содержал четыре сайта для 0-гликозилирования (Kessler et al J Biol Chem 254, 7907/1979/) Аналоги эритропоэтина согласно настоящему изобретению включают аминокислотную последовательность, которая включает, по крайней мере, один дополнительный сайт для гликозилирования Аналоги, имеющие уровни сиаловой кислоты большие чем те, которые найдены в эритропоэтине человека, генерируют добавлением сайтов гликозилирования, которые не нарушают вторичную или третичную конформацию, требуемую для биологической активности Преимущественно, аналог эритропоэтина человека имеет 1, 2 или 3 дополнительных сайта для N-гликозилирования или 0-гликозилирования, которые приводят в результате к добавлению 1, 2 или 3 дополнительных N-связанных или 0-связанных карбогидратных цепей Например, лейцин в положении 69 заменяют аспарагином с получением последовательности Asn-Leu-Ser, которая служит в качестве четвертого сайта для N-гликозилирования Такое изменение может вообще обеспечивать вплоть до четырех дополнительных сиаловых кислот на молекулу Примерами изменений, которые генерируют дополнительные сайты 0-гликозилирования, являются аланин в положении 125 к треонину и аланины в положениях 124 и 125 к пролину и треонину, соответственно Могут быть сконструированы аналоги,которые имеют одну или более дополнительных N-связанных и 0-связанных цепей, например, аналоги N01 и N02, описанные в Таблице 5 Как будет понятно специалистам в этой области, объект изобретения включает многие другие аналоги эритропоэтина человека, имею Таблицы 3, 4 и 5 представляют аналоги эритропоэтина, которые имеют дополнительные сайты для N-связанных и/или 0-связанных карбогидратных цепей Аналоги имеют последовательность Asn-X-Ser/Thr замещенную в различных положениях в полипептидной цепи эритропоэтина человека для создания Nсвязанных сайтов или имеют введенные сериновые или треониновые остатки для создания 0связанных сайтов Таблица 6 представляет те аналоги, которые добавляют, по крайней мере, одну дополнительную N-связанную или одну дополнительную 0связанную карбогидратную цепь, или добавляют одновременно дополнительные N-связанные и 0связанные цепи, как следует из данных миграции гликопро-теинов на SDS гелях (Пример 7) Как можно заметить из таблиц 3-6, аналоги, имеющие один или более дополнительных сайтов для присоединения карбогидрата, необязательно приводят к молекулам эритропоэтина, имеющим дополнительные карбогид ратные цепи Например, замещение треониновых остатков в положениях 123 и 125 приводит в результате к добавлению 0связанной карбогидратной цепи, в то время как замещение серина или треонина в другие положения не приводит к аналогам с дополнительными 0-связанными цепями (смотри Таблицу 4) Однако, замещение аспарагиновых остатков в положениях 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 и 138 в аминокислотной последовательности эритропоэтина человека приводит к добавлению N-связанной цепи в этих 15 сайтах Слияние HCG полипептидного фрагмента с аспарагиновым остатком в положении 166 эритропоэтина человека приводит к слиянию молекулы эритропоэтин-HCG, имеющей, по крайней мере, две дополнительные 0-связанные карбогидратные цепи Аналоги эритропоэтина согласно настоящему изобретению также включают эритропоэтин, имеющий аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку, по крайней мере, одного сайта для гликозилирования Перегруппировка сайта гликозилирования, как использовано здесь, относится к делеции одного или более сайтов гликозилирования в эритропоэтине человека и присоединению одного или более сайтов гликозилирования неестественного происхождения Аналоги R1, R2 и R3 представляют, например, такие перегруппировки и были сконструированы путем делеции N-связанных сайтов в положениях 24, 38 или 83, соответственно, и добавлением N-связанного сайта в положение 88 Однако, другие многочисленные типы перегруппировок карбогидратного сайта являются возможными и полученные аналоги могут иметь, а могут и не иметь большее число сайтов гликозилирования, по сравнению с эритропоэтином человека Аналоги R1, R2 и R3 анализировали in vivo на биологическую активность и результаты показаны в Таблице 7 Введение N-связанной цепи в Asn 88 восстанавливало биологическую активность в эритропоэтине, в котором уничтожен один из трех N-связанных сайтов естественного происхождения Эти результаты указывают на то, что положения карбогидратных цепей в эритропоэтине могут быть изменены с тем, чтобы генерировать полезные аналоги без значительного влияния на биологическую активность Настоящее изобретение включает также ДНК последовательности, кодирующие аналоги эритропоэтина, имеющие дополнительные сайты для N-связанных и/или 0-связанных цепей, аналоги, включающие перегруппировку, по крайней мере, одного добавленного сайта для карбогидратной цепи, и аналоги, имеющие одну или более аминокислот, простирающихся от карбоксиконцевой области эритропоэтина Процедуры, использованные для введения изменений в ДНК последовательность эритропоэтина человека с целью создания и изменения добавленных сайтов для карбогидратов, раскрыты в Примере 6 Эти аналоги эритропоэтина могут быть продуктом экспрессии экзогенной ДНК последовательности, т е продуцированной через рекомбинантную ДНК технологию, или могут быть синтезированными продуктами Экзогенная ДНК последовательность включает ДНК, ДНК геном или химически полученную ДНК, кодирующую аналог эритропоэтина Рекомбинантные ДНК плазмиды и клетки хозяева эукариота, полезные для экспрессии указанных аналогов, также охватываются изобретением Векторы экспрессии включают любой вектор, который способен экспрессировать клонированные ДНК последовательности в клетку хозяина эукариота, в частно 49793 16 сти, эти векторы используют для экспрессии в клетки COS и СНО Примеры таких векторов включают плазмиды рТС и pDEC дельта, описанные в Примере 6 заявки Культивирование COS и СНО клеток хозяина, экспрессирующих аналоги эритропоэтина, проводили, используя процедуры, известные специалистам в этой области Выделенные изоформы и смеси изоформ, полученные из аналогов эритропоэтина, получают, используя способы, описанные выше для приготовления изоформ эритропоэтина человека Эти способы могут включать изоэлектрическое фокусирование, ионообменную хроматографию и хроматофокусирование Предпочтительно, используют ионообменную хроматографию для приготовления индивидуальных изоформ и смесей изоформ, полученных из аналогов эритропоэтина Увеличение числа карбогидратных цепей в эритропоэтине, и, соответственно, числа сиаловых кислот в молекуле эритропоэтина может придавать предпочтительные свойства, такие как повышение растворимости, большее сопротивление протеолизу, понижение иммуногенности, повышение времени полураспада сыворотки и повышения биологической активности Кондиционированная среда из СНО клеток, экспрессирующих аналоги эритропоэтина была анализирована на биологическую активность in vivo и результаты показаны в Таблице 6 Некоторые испытанные аналоги имели активность, которая в три или больше раз превышала активность эритропоэтина человека В частности, аналоги, имеющие дополнительную N-связанную карбогидратную цепь, либо в положении 30, либо в положении 88 проявляли в 2 или 3 раза большую активность, чем у эритропоэтина человека, в то же время аналоги, имеющие дополнительные 0связанные цепи в результате слияния эритропоэтина человека с HCG полипептидным фрагментом имели, по крайней мере, в два раза большую активность Два аналога эритропоэтина, имеющие дополнительные карбогидратные цепи, были очищены, и смеси изоформ, имеющие различное содержание сиаливых кислот были выделены (Пример 8) Аналоги Thr125 и Ser87 Asn 8 8 Thr (ЕРО N14) были разделены натри отдельные фракции изоформ, и была для каждой фракции определена биологическая активность in vivo Результаты, представленные в Таблице 8, демонстрируют, что фракции ЕРО N14 изоформы, имеющие более высокое содержание сиаловои кислоты обладали большей активностью in vivo Пул изоформ с высоким содержанием сиаливой кислоты аналога ЕРО N14 и рекомбинантного эритропоэтина человека (изоформы 9-14) были изучены по данным анализов по рецепторному связыванию, фармакокинетическим экспериментам и экспериментам с повышением гематокрита мыши Результаты этих анализов указывают на то, что существует прямая связь между содержанием сиаловои кислоты, периодом полураспада клиренса и способностью к повышению гематокрита мышей, подвергнутых обработке Таким об 17 разом, как показано на фиг 13, 14 и 15, ЕРО N14 пул изоформы с высоким содержанием сиаловой кислоты имел значительно более продолжительный период полураспада in vivo и способствовал большему повышению гематокрита, чем это было в случае выделенной изоформы 14 или рекомбинантного эритропоэтина человека, даже несмотря на то, что пул изоформы N 14 с высоким содержанием сиаловой кислоты не связан так сильно с рецептором Другой объект изобретения относится к клеткам хозяевам млекопитающего (например, Chinese Hamster Ovary, СНО), которые предпочтительно синтезируют изоформы эритропоэтина человека или аналоги эритропоэтина, имеющие большее чем определенное число сиаловых кислот на молекулу , например, больше, чем 10 сиаловых кислот на молекулу Молекулы эритропоэтина содержат Nсвязанные и 0-связанные олигосахаридные структуры, которые могут ограничивать содержание сиаловой кислоты в молекуле Например, четырехусиковые (четырехразветвленные) Nсвязанные олигосахариды наиболее вероятно обеспечивают четыре возможных сайта для присоединения сиаловой кислоты, в то время как двух и трехусиковые олигосахаридные цепи, которые могут заменять четырехусиковую форму в аспарагин-связанных сайтах, обычно имеют не более двух или трех присоединенных сиаловых кислот 0-связанные олигосахариды обычно обеспечивают два сайта для присоединения сиаловой кислоты Таким образом, молекулы эритропоэтина могут аккомодировать полностью 14 остатков сиаловой кислоты при условии, что все три Nсвязанных олигосахарида являются четырехусиковыми Культуры клеток млекопитающего отсевают от тех клеток, которые предпочтительно присоединяют четырехусиковые цепи к рекомбинантному эритропоэтину, тем самым минимизируя число сайтов для присоединения сиаловой кислоты N-связанные олигосахариды мочевого эритропоэтина содержат сиаловую кислоту в обоих положениях в альфа 2,3 и альфа 2,6 связях с галактозой (Takeuchi et al J Biol Chem 263, 3657 /1988) Обычно, сиаловую кислоту в альфа 2,6 связи присоединяют к галактозе на маннозное альфа 1,6 ответвление и сиаловую кислоту в альфа 2,6 связи присоединяют к галактозе на маннозное альфа 1,3 ответвление Ферменты, которые присоединяют эти сиаловые кислоты (бета-галактозид альфа 2,3 сиалилтрансфераза и бета-галактоз ид альфа 2,6 сиалилтрансфераза) являются наиболее эффективными при присоединении сиаловой кислоты к маннозе альфа 1,6 и маннозе альфа 1,3 ответвлениям соответственно Неполные Chinease Hamster Ovary (СНО) клетки дигидрофолат редуктазы (DHFR) обычно используют клетку хозяина для продуцирования рекомбинантных гликопротеинов, включая рекомбинантный эритропоэтин Эти клетки не экспрессируют фермент бета-галактоз ид альфа 2,6 силилтрансферазы и поэтому не добавляют сиаловую кислоту в альфа 2,6 связь с N 49793 18 связанными олигосахаридами гликопротеинов, полученных в этих клетках (Mutsaers et al EurJBiochem 156, 651 /1986/, Takeuchi et al J Chromatogr 400, 207 /1987/) Следовательно, рекомбинантный эритропоэтин, полученный в СНО клетках, испытывает недостаток сиаловой кислоты в 2,6 связи с галактозой (Sasaki et al /1987/, Takeuchi etal /1987/) В другом варианте объекта изобретения эритропоэтин человека или аналог эритропоэтина получают в СНО клетках, которые трансфекцируют геном функциональной бета-галактоз ид альфа 2,6 силилтрансферазой с встраиванием сиаловой кислоты в альфа 2,6 связь с галактозой Полученные изоформы будут содержать сиаловую кислоту, имеющую обе связи альфа 2,3 и альфа 2,6 с галактозой (Смотри Lee et al J Biol Chem 264, 13848 /1989/, для раскрытия техники создания модифицированных СНО клеток или других клеток хозяина млекопитающего) Изобретение также включает фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество определенной изоформы или смеси изоформ вместе с соответствующим разбавителем, адъювантом и/или носителем, полезные в эритропоэтиновой терапии Фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество аналога эритропоэтина вместе с соответствующим разбавителем, адъювантом и/или носителем, также включает настоящее изобретение Термин "терапевтически эффективное количество", как он использован здесь, относится к такому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного условия и режима введения Введение изоформ эритропоэтина человека или аналогов эритропоэтина осуществляется, предпочтительно, парентеральными путями Выбор специфического пути введения будет зависеть от состояния, которое подвергается лечению Введение изоформ эритропоэтина человека или аналогов эритропоэтина осуществляют, предпочтительно, частями композиции, содержащей соответствующий носитель, такой как сывороточный альбумин человека, соответствующий разбавитель, такой как буферный солевой раствор, и/или соответствующий адъювант Требуемые дозы будут находиться в количествах, достаточных для повышения гематокрита пациента, и будут меняться в зависимости от тяжести состояния, которое подвергается лечению, использованного способа введения и им подобных Следующие примеры предназначены для более полной иллюстрации изобретения, но не ограничивают его объема Стандартный эритропоэтин, использованный в биоопытах in vivo, примененный в примерах, является стандартным рекомбинантным эритропоэтином, который был стандартизован по отношению к стандартному частично очищенному мочевому эритропоэтину Таким образом, измеренными являлись только относительные специфические активности in vivo Специфические активности in vivo выражают также в "единицах/мл", "единицах/мг" и "единицах/А28о" а не в "Ill/ml", "IU/mg" и IU/A280, потому 19 49793 что примененный стандартный эритропоэтин не был непосредственно скоррелирован с любым существующим международным стандартом Пример 1 Выделение изоформ рекомбинантного эритропоэтина Рекомбинантный эритропоэтин получают как описано Lin (патент США 4703008) Рекомбинантный эритропоэтин, использованный в качестве исходного материала для первого и третьего посевов изоформ, очищают согласно процедуре, описанной в Примере 2, Lai et al Исходный материал для второго и пятого посева изоформы очищают согласно Lai et al , используя хроматографию, модифицированную Q-сефарозой Эти препараты содержат смесь изоформ рекомбинантного эритропоэтина, имеющую ту же аминокислотную последовательность, как у мочевого эритропоэтина, и содержат преимущественно изоформы с 9 по 14 Исходный материал для препарата четвертой изоформы представляет материал, который элюируют в процессе промывания анионообменной колонки, как в Примере 2 Lai et al , раствором 5ммоль/л уксусной кислоты/ 1 ммоль/л глицина/ бмоль/л мочевины Эта фракция содержит изоформы с меньшим или равным 9 количеством сиаловых кислот и далее ее очищали с помощью гель фильтрационной хроматографии, как описано в Примере 2 Lai et al , до использования в препаративной изоэлектрической фокусирующей процедуре Препарат шести изоформ использовали в качестве исходного материала для очищенного препарата рекомбинантного эритропоэтина, содержащего от 4 до 13 сиаловых остатков Этот материал очищали, как представлено в Примере 2 Lai et al , за исключением модификации ионообменной колонки (элюирование рекомбинантного эритропоэтина раствором хлористого натрия с градиентом при рН 8 4 и пропускание смеси уксусная кислота/мочевина для промывания), которая приводит к удерживанию большей части изоформ, присутствующих в исходном материале Шесть различных препаратов индивидуальных изоформ получают с помощью препаративного изоэлектрического фокусирования в ложе гранулированного геля (Ultrodex, LKB), особенно как в LKB описании 198 Используют фармалит (Pharmacia) 2 5-5 амфолиты (Pharmacia) и ложе геля, содержащее 5моль/л мочевины В первом препарате в гель вводят 20мг рекомбинантного эритропоэтина в 6 8мл смеси 20моль/л цитрата натрия/100 ммоль/л хлористого натрия, Рн 7 0, фокусируют при 8вт приблизительно 16 часов После изоэлектрического фокусирования, полосы изоформы в геле визуализируют с помощью контактной печати на бумагу ложа геля Получают печать и затем проявляют погружением в 3 заменяющихся (приблизительно каждые 10 минут, температура комнатная) проявляющих раствора (40% метанола/ 10% уксусной кислоты/10% ТСА/ 3 5% сульфосалициловой кислоты), которые подвергают одной замене (приблизительно 10 минут) 40% метанола/ 10% уксусной кислоты (30-60 градусов Цельсия), окрашивают в течение 15 минут при 60 градусах 20 Цельсия в 0125 % Кумасиновом голубом (Coomassie Blue) R-250/ 40% метаноле/ 10% уксусной кислоте и затем обесцвечивают в 7 5% метаноле/10% уксусной кислоте, для того, чтобы визуализировать разделенные изоформы Область ложа гранулированного геля, содержащую изоформы (около 50% смолы) удаляют, добавляют воду (около 16мл), и суспензию выливают в поднос (15 х 50мм) и выпаривают до чистого веса около 40г Этот препарат фокусируют второй раз и контактную печать ложа геля осуществляют, как было проведено ранее Часть геля, содержащую каждую из шести различающихся изоформ, удаляют из ложа геля Для того чтобы элюировать изоформы из геля, к каждой изоформе добавляют раствор, содержащий 10ммоль/л трис-НС1, Рн 7 0/5ммоль/л Chaps, с тем чтобы получить суспензию Суспензии помещают в маленькие колонки и промывают буфером Tns-Chaps Проходящие потоки собирают и отдельно добавляют в маленькие колонки (колонка открытой конфигурации), содержащие в качестве обращенной фазы смолу Vydac C4, равновесно распределенную в 20% этанола/ 10ммоль/л трис-НС1, Рн 7 0 Колонки постадийно проявляют 20% этанолом/ 10ммоль/л трис-НС1, Рн 7 0, 35% этанолом/ 10ммоль/л трис-НС1, Рн 7 0 и 65% этанолом/ 10ммоль/л трис-НС1, Рн 7 0 Фракцию элюированную 65% этанолом/ 10ммоль/л трис разбавляют 1 1 10ммоль/л трисНС1, Рн 7 0 и подвергают концентрирова-нию, и затем заменяют буфер на 10ммоль/л трис-НС1, Рн 7 0, используя Centncon-10 (Amicon) микроконцентратор Аналитическое изоэлектрическое фокусирование этого препарата проводят, в основном, как описано в LKB техническом описании 250, используя Servalyte 3-5 амфолины (Serva) в полиакриламидном геле, содержащем 5моль/л мочевины Во втором препарате приблизительно 26мг рекомбинантного эритропоэтина в 6 5мл деионизированной воды добавляют к гелю и фокусируют при 2 5 ватт в течение 35 минут и при Юватт в течение приблизительно 17 часов Полосы фокусированного протеина, которые видны в ложе геля, удаляют в виде 11 различных пулов Каждый пул вымывают 7 5мл деионизованной воды, и 20мл каждого из супернатантов полученных пулов подвергают аналитическому изоэлектрическому фокусированию как описано выше К каждому из пулов добавляют 5мл 1 5моль/л трис-НС1, Рн 8 8, и каждую из суспензий помещают в маленькие колонки и позволяют жидкой фазе протекать через колонку Смолу промывают приблизительно тремя объемами 0 5ммоль/л трис-НС1, Рн 7, и промывной раствор объединяют с прошедшим через колонку раствором Элюанты концентрируют и заменяют буфер на 20ммоль/л цитрата натрия/ 100ммоль/л хлористого натрия, Рн 7 0, используя доступные ультрафильтрационные устройства Amicon, содержащие смолу с определенным молекулярным весом 10000 дальтон Концентрированные растворы (приблизительно 0 5мл) затем пропускают через определенный фильтр 0 22 микрон из ацетата целлюлозы На основании аналитического изоэлектрического фокусирования 21 49793 находят пять пулов с преобладающим содержанием единственной изоформы 10, 11, 12, 13 и 14 В третьем препарате приблизительно 30мг рекомбинантного эритропоэтина в 21 8мл дистиллированной воды добавляют к гелю и фокусируют при 2ватт в течение 25 минут, при Юватт в течение 20 часов и при 15ватт в течение 15 минут Полосы протеина, соответствующие индивидуальным изоформам, визуально наблюдают и удаляют из ложа геля К изоформам, выделенным из геля, добавляют дистиллированную воду для получения суспензии, и полученные супернатанты анализируют с помощью аналитического изоэлектрического фокусирования К каждой суспензии добавляют равный объем 1 моль/л трис-НС1, Рн 7 2, суспензии помещают в отдельные маленькие колонки, и жидкой фазе позволяют протекать через колонку с элюированием изоформ Каждый поток, прошедший через колонку, концентрируют и заменяют буфер на 20ммоль/л цитрат натрия/ 100ммоль/л хлористого натрия, Рн 7 0, используя доступное ультрафильтрационное устройство Amicon со смолой определенного молекулярного веса 10000 Аналитический изоэлектрический фокусирующий гель обнаруживает, что получены пулы, содержащие преобладающие единичные изоформы 9, 10, 11,12, 13 и 14 Четвертый препарат изоформы использовали в качестве исходного материала изоформ 3-9, содержащих эритропоэтин (полученный как описано выше) Предварительное препаративное изоэлектрическое фокусирование проводят, в основном, как описано для препаратов 1-3 выше, амфолиты (Pharmalyte 2,5-5/ предварительно фракционировали в Rotofor /Bio-Rad, Richmond, С А) с жидкофазной изоэлектрической фокусирующей ячейкой с получением участка амфолита, более пригодного для самых низких изоэлектрических точек исходного материала Предварительное фракционирование проводили путем смешения 6 7мл Pharmalyte 2 5-5 с 15г мочевины и добавления очищенной воды с доведением до объема 50мл Эту смесь фракционировали в Rotofor при ЮОватт, 1 градусе Цельсия, в течение пяти с половиной часов, используя 0 1 моль/л фосфорную кислоту и 0 1 моль/л гидроокись натрия в качестве анолита и католита соответственно Фракции амфолита, имеющие измеренные величины Рн между 4 5 и приблизительно 6, использовали в изоэлектрическом фокусировании с плоским ложем (flat-bed) Амфолиты удаляли из изоформ, используя Centneluter (Amicon, Danvers, MA) и определенного молекулярного веса 10000 Centncon (Amicon), используя следующие параметры 0 18 трис буфер Рн 8,8, 100 вольт, 25-30мА в течение 3 часов Обменивали буфер в изоформах на 01ммоль/л хлористого натрия путем гельфильтрации, используя Сефадекс G-25 (Pharmacia) Аналитическое изоэлектрическое фокусирование пяти полученных пулов показывало содержание в них изоформ 4, 5, 6, 7 и 8 Изоформа 4 выходит в виде нескольких полос, указывая на то, что она может подвергаться деструкции в некоторой степени Пятый препарат изоформы модифицировали 22 добавлением стадии предварительного фокусирования к процедуре изоэлектрического фокусирования В этой модификации протеин не добавляли к смеси амфолит/мочевина/гель до электрофореза, но добавляли к изоэлектрическому фокусирующему аппарату вслед за генерированием градиента Рн в ложе геля После предварительного фокусирования в течение 75 минут (1500 вольт-час) отрезок ложа геля в 2,25-4,25см от катода удаляли, смешивали с раствором эритропоэтина и вновь возвращали в ложе геля Вслед за изоэлектрическим фокусированием изоформы 10, 11, 12, 13 и 14 элюировали из ложа геля и отделяли от амфолитов путем ультрафильтрации, используя устройство Centncon-10 (Amicon) Модификация предварительного фокусирования была проведена для того, чтобы получить характеристики ультрафиолетового поглощения препаратов изоформ, более похожие на характеристики исходного рекомбинантного эритропоэтина Это улучшение спектральных характеристик можно видеть для отношения поглощения при 280 и 260нм для выделенных изоформ Среднее отношение поглощения при 280нм к поглощению при 260нм (А280/А260) для изоформ из препаратов 2 и 3 (не подвергнутых предварительному фокусированию) составляет 1 36±0 11, в то время как среднее А280/А260 отношение для препаратов 5 и 6 (предварительно фокусированных) составляет 1 68±0 20 Если изоформу #14 исключают из расчета, средние отношения А280/А260 составляют 1 39±0 11 и 1 74±0 09 для препаратов 2 и 3, 5 и 6 соответственно (Изоформа 14 может иметь наиболее нетипичный спектр, потому что она присутствует в самых малых количествах, и таким образом, в большей степени подвергается интерференции следами загрязнения компонентами амфолита, или потому что она находится наиболее близко к электроду в процессе процедуры изоэлектрического фокусирования плоского ложа) Среднее отношение А280/А260 для рекомбинантного эритропоэтина, полученного согласно Примеру 2 Lai et al (модифицированного как описано ранее с использованием Q-сефарозы в качестве анионообменной смолы) составляет 1 91 ±0 04 Как описано выше, исходным материалом для препарата, содержащего изоформы #6, был препарат рекомбинантного эритропоэтина, содержащий изоформы 4-13 Амфолиты предварительно фокусировали в аппарате Rotofor как для четвертого препарата Фракции амфолита, имеющие измеренные величины Рн между 3 7 и 4 8 использовали для изоэлектрического фокусирования в плоском ложе Плоское ложе предварительно фокусировали как в опыте #5, и изоформы 9, 10, 11, 12 и 13 получали после ультрафильтрации (centncon-10) для удаления амфолитов, использованных в качестве носителя Пример 2 Содержание силевой кислоты изоформ рекомбинантного эритропоэтина В изоформах, выделенных как описано в Примере 1, и эритропоэтине, очищенном согласно процедурам, описанным Lai et al, (смесь изоформ 23 49793 с 9 по 14), заменяли буфер на 0 10-0 15моль/л хлористого натрия и анализировали на содержание сиаливой кислоты с помощью модификации процедуры Jourdian et al (J Biol Chem 246, 430 /1971/) Остатки сиаловой кислоты вырезали из гикопротеинов гидролизом 0 35моль/л серной кислотой при 80 градусах Цельсия в течение 30 минут, и растворы нейтрализовали гидроокисью натрия до анализа Для того чтобы установить количество присутствующего протеина эритропоэтина, проводили анализ протеина по Брэдфорду (Bradford Anal Biochem , 72, 248 /1976/), используя рекомбинантный эритропоэтин, имеющий аминокислотную последовательность эритропоэтина человека, в качестве стандарта, используя реагенты и процедуру микро-способа, примененную Bio-Rad Результаты, выраженные в молях сиаловых кислот на моль эритропоэтина, показаны в Таблице 1 Изоформы обозначают согласно числу сиаловых кислот на молекулу, и области от наименее кислой (изоформа 9) до более кислой (изоформа 13) Изоформы 9-13 показаны в полосах геля 6-10 Рисунка 1 Количества изоформы 14 оказались недостаточными для точного измерения содержания сиаливой кислоты Содержание кислоты в этой изоформе выводят из ее миграций на IEF гелях относительно других изоформ Содержание сиаловой кислоты в изоформах 5-8 (препарат #4) не было измерено, но аналогично выведено из их миграций на IEF гелях Таблица 1 Изоформа эритропоэтина Изоформа 13 Изоформа 12 Изоформа 11 Изоформа 10 Изоформа 9 Смесь изоформ /9-14/ Моли сиаловой кислоты/ моль эритропоэтина 12 9±0 5 11 8±0 2 11 0±0 2 9 8±0 3 8 9±0 6 113+0 2 Пример 3 Активность изоформ рекомбинантного эритропоэтина Изоформы, выделенные как описано в Примере 1, анализируют по поглощению при 280нм, с помощью анализа на протеин по Брэдфорду и с помощью RIA для определения присутствующего количества рекомбинантного эритропоэтина Эксгипоксический полицитемический биоанализ на мышах (Cotes et al Nature 191, 1065 /1961/) используют для определения относительной биологической активности in vivo Расчет количества присутствующего эритропоэтинового протеина с использованием радиоиммунного анализадля полученного эритропоэтина давал результаты, 24 имеющие более высокую специфическую активность in vivo для определенных изоформ из-за кажущегося уменьшения иммунореакционной способности изоформ, содержащих большие количества сиаловых кислот, приводящего к недооценке концентрации эритропоэтина и, таким образом, к переоценке относительной специфической активности in vivo для более отрицательных изоформ Определения биоанализа на мышах, выраженные в единицах/мл делят на соответствующие концентрации протеина с получением специфической активности in vivo, выраженной в единицах/мг эритропоэтинового полипептида Эти специфические активности показаны в Таблице 2 В Таблице 2 "п" представляет число независимых препаратов изоформ, которое вносит вклад в специфическую активность В большинстве случаев были выполнены несколько анализов in vivo на каждом препарате изоформы Вклад тех же данных in vivo в расчеты специфической активности для всех трех колонок, единицы/мг эритропоэтинового полипептида определяют по поглощению при 280нм, по данным радиоиммунного анализа или по результатам анализов на протеин по Брэдфорду Очищенный рекомбинантный эритропоэтин, содержащий изоформы 9-14, использовали в качестве стандарта в анализе на протеин по Брэдфорду Величина "п" может быть меньше для расчета, проведенного с использованием анализа на протеин по Брэдфорду, так как некоторые препараты не были пригодны для выполнения анализов по Брэдфорду Эритропоэтин, очищенный согласно процедурам описанным Lai et al и содержащий смесь изоформ с 9 по 14, используют в качестве стандарта для анализов RIA и in vivo Относительные специфические активности, выраженные в виде единиц/мг эритропоэтинового полипептида, могут быть превращены в единицы/А280 путем умножения на 0 807мг эритропоэтинового полипептида/А280 Фактор превращения получают умножением коэффициента экстинкции эритропоэтина (1 З45мг/А28о) на содержание протеина в эритропоэтиновом гликопротеине (около 60 весовых %, Davis et al Biochemistry 26, 2633 /1987/) с получением мг эритропоэтинового полипептида/А28о (те 1 345мг эритропоэтина/А28о х 0 60мг полипептида/мг эритропоэтина = 0 807мг эритропоэтина/А28о) Кроме того, специфические активности, выраженные в единицах/мг эритропоэтинового полипептида, могут быть умножены на фактор 0 60мг полипептида/мг эритропоэтинового гликопротеина с получением специфических активностей, выраженных в единицах/мг эритропоэтинового гликопротеина 25 49793 26 Таблица 2 Изоформа 14 13 12 11 10 9 8 7 5 Ед/мг полипептид (анализ по БредфорДУ) 289,400+3 100 307,600+30,600 275,200+55,600 282,700+41,100 188,000+1,900 Ед/мг полипептид (по поглощению при 280нм) 2 4 4 3 1 65,200+3,800 46,200+5,800 16,600+1,700 1 1 1 205,800+37,700 258,700+59,500 258,400+41,700 255,800+67,300 170,300+34,500 96,600+46,700 70,600+4,100 50,300+6,300 18,300+1,900 Данные Таблицы 2 представлены также графически на фиг 2А, 2В и 2С Эти данные показывают, что относительная активность in vivo эритропоэтина увеличивается как функция содержания сиаливой кислоты вплоть до изоформы #11 Изоформы 11-14 имели, по существу, одинаковые относительные биоактивности in vivo (Это является наиболее очевидным, если концентрацию изоформы 14 выражают, используя величину анализа по Брэдфорду Величина по Брэдфорду может быть более точной для изоформы 14 из-за низких уровней, которые создают трудности В Определении С ПОМОЩЬЮ ПОГЛОЩеНИЯ При А280, И наиболее очевидно уменьшают реакционную способность по данным RIA очень отрицательных форм, что обсуждалось ранее) Большая относительная специфическая активность in vivo изоформ эритропоэтина, имеющего большее количество сиаловой кислоты, наиболее вероятно обусловлена более продолжительным временем полураспада этих изоформ в процессе кровообращения Изоформы 9 и 13 метили радиоактивным иодом (12 I), и определяли скорость их выведения на крысах Период полураспада в процессе кровообращения был значительно больше для изоформы 13, по сравнению с изоформой 9 Пример 4 Отбор смеси изоформ рекомбинантного эритропоэтина с помощью хроматографии с Q-сефарозой Кондицинированную клетками среду при получении рекомбинантного эритропоэтина, согласно процедурам, описанным Lin, концентрируют и подвергают диафильтрованию относительно раствора 10ммоль/л Трис, рН 7 2 Концентрацию протеина определяют по данным анализа на микропротеин по Брэдфорду, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин 19 6 мл раствора, содержащего 40мг общего протеина, готовят с 20мкмоль/л сульфата меди, фильтруют через фильтр, вырезающий 0 45 микрон и загружают в колонку в виде слоя объемом 4мл (1 05см в высоту х 2 2см диаметром), колонку, заполненную Q-сефарозой быстрого потока (Fast Flow) (Pharmacia), которую уравновешивают 10ммоль/л Трис, рН 6 8 до 7 0 при 4 градусах С После пропускания образца через колонку, ее промывают раствором, равным двум объемам колонки, того же самого буфера Скорость потока в колонке 2 5 5 4 3 2 1 1 1 Ед/мг полипептид (по данным радиоиммунного анализа) 366,700+55,900 2 337,200+40,200 5 287,700+42,600 5 251,400+62,700 4 171,900+31,600 3 113,600+39,600 2 61,000+3,500 1 42,800+5,400 1 15,500+1,600 1 около 1 мл/мин Шесть отдельных колонок загружают, используя эту процедуру для отбора определенных смесей изоформ эритропоэтина Колонки промывают раствором буфера, равным 6-9 объемам колонки, с низким Рн, состоящим из Колонка 1 150мл уксусной кислоты, 1ммоль/л глицина, 20мкмоль/л сульфата меди, бмоль/л мочевины, доведенным до Рн 4 7 гидроокисью натрия, Колонка 2 200ммоль/л уксусной кислоты, 1ммоль/л глицина, 20мкмоль/л сульфата меди, бмоль/л мочевины, доведенным до Рн 4 7 гидроокисью натрия, Колонка 3 250ммоль/л уксусной кислоты, 1ммоль/л глицина, 20мкмоль/л сульфата меди, бмоль/л мочевины, доведенным до Рн 4 7 гидроокисью натрия, Колонка 4 300ммоль/л уксусной кислоты, 1ммоль/л глицина, 20мкмоль/л сульфата меди, бмоль/л мочевины, доведенного до Рн 4 7 гидроокисью натрия, Колонка 5 150ммоль/л уксусной кислоты, 1мкмоль/л глицина, 20мкмоль/л сульфата меди, бмоль/л мочевины, Колонка 6 300ммоль/л уксусной кислоты, 1ммоль/л глицина, 20мкмоль/л сульфата меди, бмоль/л мочевины Рн колонок повышают приблизительно до 7 промыванием каждой из них раствором, равным 811 объемам колонки, 10ммоль/л Трис-НС1, 55ммоль/л хлористого натрия, 20мкмоль/л сульфата меди, Рн 7 Определенные смеси изоформ эритропоэтина элюируют из колонок промыванием раствором 10 ммоль/л Трис-НС1, 140 ммоль/л хлористого натрия, 20 мкмоль/л сульфата натрия, Рн7 0 Пулы изоформ, элюированные из каждой колонки, концентрируют и растворитель заменяют на воду, используя Amicon Centncon-10 микроконцентратор Результаты аналитического изоэлектрического фокусирования этих концентрированных пулов показаны на фиг 3 Полосы геля 1-6 представляют определенные смеси изоформы эритропоэтина, элюированные из колонок 1-6 соответственно "Смесь изоформ", показанная, в дальней правой полосе геля фиг 3 представляет клеточную среду, которую пропускают через ко 27 28 49793 приблизительно 4) Общий объем градиента составлял приблизительно около 40 объемов колонки, и фракции объемом приблизительно равным объему одной колонки, каждую собирали в сосуды, содержащие буфер Трис с объемом, достаточным для доведения рН до 6-8 5, для того чтобы избежать выдерживания фракций в течение продолжительного времени при низком рН Аликвоты фракций подвергали аналитическому изоэлектрическому фокусированию с управлением разделения Фиг 4 показывает разделение изоформ 8-11, которое может быть достигнуто этой процедурой Изоформы 12-14, которые остаются связанными с колонкой по окончании градиента, элюируют промыванием буфером, состоящим из 10ммоль/л Трис НС1, 140ммоль/л хлористого натрия, 20мкмоль/л сульфата меди (Рн 7 0) Изоформы (выделенные в процессе градиента или элюирования раствором хлористого натрия) освобождали от примесных протеинов с помощью хроматографии с обращенной фазой с последующей гель фильтрационной хроматографией, как описано в Примере 2 Lai et al лонку с Q-сефарозой как описано выше, колонку промывают раствором 5ммоль/л уксусной кислоты, 1ммоль/л глицина, 20мкмоль/л сульфата меди, бмоль/л мочевины и смесь изоформ эритропоэтина элюируют из колонки, используя процедуры, описанные выше Эту элюированную смесь изоформ далее очищают, согласно процедурам, описанным Lai et al до аналитического изоэлектрического фокусирования Пример 5 Фракционирование изоформ рекомбинантного эритропоэтина с использованием низкого градиента рН на Q-сефарозе В другой процедуре, изоформы эритропоэтина разделяют, используя градиент понижения рН и увеличения ионной силы раствора Среду, содержащую концентрированный диализованный эритропоэтин, загружали в колонку с Q-сефарозой при отношении приблизительно 40мг общего количества протеина/мл геля Затем колонку промывали раствором, равным приблизительно двум объемам колонки, 10ммоль/л Трис НС1, рН 7 0, и затем раствором, приблизительно равным 10 объемам колонки, 2 ммоль/л уксусной кислоты/ 1 ммоль/л глицина/ 20мкмоль/л сульфата меди/ бмоль/л мочевины (рН приблизительно 4 8) для удаления загрязняющих протеинов и изоформ эритропоэтина, содержащих меньше чем приблизительно 7 остатков сиаловой кислоты Изоформы, содержащие от приблизительно 8 до приблизительно 12 сиаловых кислот, элюировали из колонки, используя градиент, начиная с 2 ммоль/л уксусной кислоты в 6 моль/л мочевины/1 ммоль/л глицина/ 20 мкмоль/л сульфата меди до 40 ммоль/л уксусной кислоты/ 6 моль/л мочевины/ 1 ммоль/л глицина/ 20 мкмоль/л сульфата меди (рН Пример 6 Конструирование аналогов эритропоэтина человека Положения существующих присоединенных карбогидратных сайтов в пределах аминокислотной последовательности эритропоэтина человека показаны на фиг 5 (SEQ Ю N0 26) Процедуры для генерирования дополнительных сайтов гликозилирования для эритропоэтина суммированы на Фиг 6А-С и описаны ниже Следующие олигонуклеотидные затравки получали для использования в мутагенезе in vitro (ЛЗП«, Set») ЕРО: 5 ' CGCCCACCAuu£CTCi££TGTGACAGCCGA 3* (SEQ ID HO! I) [АзпЭ, 5 e r l l ) ЕРО: 5* ArCTGTACM£CGAi££CTGGAGAGGr 31 {5EQ ID. HO; 2) t*3n69) ЕРО: 5*ffiKCCTOGCCUUCCIGTCGGAAS3 ' (SEQ I D . NO: 3J 20 £ А З П s n * 2 4 ] Е Р 5 , S e О 5 * 2 ( S E Q * 2 D , i 2 A r I [ 1 5 ; l 6 I D ЕРО: 7 ] S C g H . r O ) O : C o : Е N ^ C K О A ' G C H u T G M I & T C G e C C G K & a S G f i C T I C G S C a 3 n G C * T ( C C S A E I Q C 3 D , H O ; 4 ) ' } 5 ї 6 X 5 : 5 Р C ' X G G C C T l K » G G u a i G G G i 2 £ f t G A T G A C C & G G I G 3 * ) 5 ' ГСОЙА1ЧЮедССТСАОС!ГОСТС 3 і {SEQ I D . NO: ?) , T h r l 2 5 ] ЕРО: 5 f CCrCCAOATCCGuCCICAGCTGC З ' (SEQ I D . NO: 81 Подчеркнутые кодоны показывают несовместимые участки, где аминокислоты, указанные в скобках, заменяют аминокислотами дикого типа [Asn4, Ser6] ЕРО конструируют для добавления сайта N-гликозилирования у Asn 4 [Asn9, Ser11] ЕРО конструируют- для добавления сайта Nгликозилирования у Asn 9 [Asn69] ЕРО конструируют для добавления сайта гликозилирования у Asn 69 [Asn , Ser ] ЕРО конструируют для добавления сайта N-гликозилирования у Asn 125 [Thr125] ЕРО й [Pro 124 , Thr 125 ] ЕРО конструировали для добавления сайта 0-гликозилирования у Thr 125 Следующие олигонуклеотидные затравки были получены для использования в мутагенезе in vitro 29 ЗО 49793 [Asn69, ОДП] ЕРО: і 5 GGSCCTGGCCA^TGAC&GAAGCTGTC 3 і (SEQ It). КО: Э) 10 , Ииг71] ЕРО: S ' CAGGGCCT£3ICCaa£CrThrauThra' CAG^ACG N16 N14 plus Ser°'Asn ot> Thr au Ala ID ' AGG^GCG N17 Asn88Ser90 TGG^AAT CCC^TCC N18 Val°'Asnot>Thrau CCG^GTG TGG^AAT CCC^ACC N19 CCG->TCG Ser°'AsnooGlyoaThrau TGG^AAT GAG^GGG CCC^ACC N20 GAG->AAC Asn oa lle a 4-hr ai CCC-*ATC CTG->ACG N21 N20 plus Ser°'Asnaullea4-hrai CCG^TCG N22 Asn''Thr I I D GGA^AAC CAG^ACG N23 Asn"°Val m GCC^AAC CCT^GTT N24 AsnmSer^Thr'" CCT^AAT CCA^TCA GAT^ACT N25 Asn" 4 GCG^AAT N26 Ser'^Asn" 4 CCA^TCA GCG^AAC N27 Asn" D Ser"' GCC^AAC GCT^TCT N28 Asn" D Thr"' GCC^AAC GCT^ACG N29 LeumSer^Asn"DThr"' N28 plus CCT^CTT CCA^TCA N30 N28 plus Thr'^GIy'^Leu^Asn^Thr'" TCC^ACC CGC^GGG GAT^CTC N31 Asn'^Ser'^ TCA^AAT GCT^TCT N32 Asn" D Thr^Val" y TCA^AAT GCT^ACT CCA^GTA N33 N32 plus Leu'^'Ser'^Asn'^Thr'^Val'^ CCT^CTT CCA^TCA N34 N32 plus Thr'^'Gly'^Ser'^Asn'^Thr'^Val'^ 35 49793 N35 Ser" y Asn" u N36 N37 Asn'^ Asn'^Thr'^ N38 N39 Asn la0 Asn'^Thr'^ N40 Asnla'Thrlaa N41 Asn'~Thrl4U N42 N43 Asn144 Ser ^Thrl4yValIDU N44 Glyl4i>Thrl4y N45 N46 N47 N48 AsnIDD Asn'^SerIDD Asn^WVarAsrTThr^ AsnDaThr"Ser°'AsrTThrau l4 36 CCT^ACG GAT^GGG GCC^TCC CCA^AGC CTC^AAC ACA^AAC ACT^AAT GAC^ACC GCT^AAT GAC^AAC TTC^ACC ACT^AAT CGC^ACC TTC^AAC AAA^ACA GTC^AAC TTC^TCC CTC^ACC CGG^4GTG TTC^GGC CTC^ACC CTG^AAT ACA^AAT N4 and N18 N11 and N14 Таблица 4 Аналоги эритропоэтина, содержащие сайты для О-связанных карбогидратных цепей № аналога Аминокислотное замещение Изменение послед 01 SerD ATC^AGC 02 Ser' TGT^TCC 03 Ser° GAC^AGC 04 Ser" GTC^TCT 05 Ser10 GAG^TCG 06 Ser" GAG^TCG 07 Ser^y TGT^AGC 08 Ser^y TGT^TCT 09 Ser^u GCT^TCT 010 Ser~ TGC^TCA 011 Ser^' GAG^TCG 012 Ser4y TAT^TCT 013 SerDI GTA^TCA 014 SerD^ GTC^TCC 015 SerD/ CTG^TCG 016 SerDi> GCC^TCC 017 Ser' u CTG^TCG 018 Ser'a GCT^TCT 019 Ser'4 GTC^TC5P 020 Ser'D CTG^TCG 021 Ser' y GCC^TCC 022 Ser01 TTG^TCG 023 Ser00 CAG^TCG 024 Ser0' CCG^TCG 025 Sery^ CTG^TCG 026 Seryi> GCC^TCC 027 Seryy GTC^TCC 028 Ser lu ^ CTT^TCT 37 49793 029 030 031 032 033 034 035 036 037 038 Ser lu ^ Ser IUD Ser l u y Ser'" Ser 1 " Ser" 4 Ser 1 " Ser IDy Ser I D I Pro^Ser"' 039 040 041 042 043 044 045 046 047 048 049 050 051 ThrD^ ThrD4 ThrDD Thr00 Thryu Thry^ Thr l u u Thr l l u Thr I I D Thr 1 " Thr" 4 Thr 1 " Thr'^Ser 1 " 052 Thr'^Ser 1 " 053 054 055 056 057 058 059 Thr" D Thr" Thr" u Thr" 1 Thr" D Thr l4U Pro" 4 Thr'" 060 Pro^Thr^Thr1" 061 Pro^Thr^Thr^Thr"1 062 38 HCG C-termmal extension CGC^AGT CTC^AGC CTT^TCT GCT^TCT CTG^TCG GCC^TCC GCT^TCT TCG^GAG TGC^TCC GCC^CCC GCT^TCT GAA^ACA TGG^ACG CAG^ACG TGG^ACG CCC^ACC CAG^ACG AGT^ACT CGG^ACG CAG^ACG GAT^ACT GCG^ACG GCC^ACC GCC^ACC GCT^TCT GCC^ACA TCA^ACA TCA^ACC GCT^ACT CTC^ACC CGA^ACA GAC^ACC AAA->ACA GCG^CCG GCC^ACC 059 plus TCA->ACC 060 plus CGA^ACA Таблица 5 Аналоги эритропоэтина, содержащие сайты для N- и О-связанных карбогидратных цепей № Аналога Аминокислотное замещение Изменение послед-сти N01 N14 и 062 Ser°'Asnot>Thrau N02 Asn^Thr^Var'Asn^Thr^ N47 и 062 Плазмиды, обозначенные pDEC-X (где Х представляет аналоговое число) конструировали встраиванием эритропоэтиновой сДНК в pDECдельта, которая является производной плазмиды pDSanbcpa2 Вектор экспрессии pDSanbcpa2 в общем описан в Заявке РСТ №WO 9Q/14363 рОЕСдельта был получен из pDSanbcpa2 следующими стадиями (1) Hmdlll сайт рО5альфа2 был подвергнут делеции путем усваивания рО5альфа2 ДНК фрагментом Hmdlll, обработкой Hindill "липких концов " ДНК полимеразой (фрагмент Klenow) Е coli dNTPs и повторным лигировани-ем дефосфорелированного вектора Полученная плазмида бьша рОЗафльфа2дельтаН (2) рОЗальфа2дельтаН был усвоен Sail и синтетический олигонуклеотид, содержащий SV40 сплайс сигнал с Sail линкером, присоединенным к 3 концу сплайс сигнала был лигирован в него Синтетический олигонуклеотид имел следующую последовательность (SEQ Ю N0 18) 39 49793 40 S' T G G A C G W A C G A G T A T GA G P A T C A G A T A i C A A A T A C G ? A TT G A ' 25 C T T G C i T T M T C GA C G T G G T CA T A T T T T mA T C G C C S T C G G T G G S A C AG CG T CCGG AGT C TTCT TG C f TC G A M T C C T A T G T T G C T A T C A G CG A G 30 At I T A T C G T T A A Cc T C A A G T G C A C 3' fGG T C T T C C A & G rC G A C A C G T G C Полученная плазмида бьша сплайс рОЭальфа2дельтаН (3) сплайс рОЭальфа2дельтаН бьша усвоена Sail и дефосфорелирована обработкой "липких концов" Т4 ДНК полимеразой и dNTPs сДНК фрагмент BamHI-Bglll эритропоэтина человека с 820 парами оснований, который был дефосфорелирован таким же способом и лигирован с плазмидой Полученная плазмида бьша pDEC-1 (4) pDEC был усвоен Kpnl и Pvull и дефосфорелирован обработкой "липких концов" нуклеазой фасоли маш Плазмида бьша повторно лигирована с делецией отрезанного фрагмента Kpnl-Pvull с получением плазмиды рОЕСдельта pDEC-X плазмиды были получены из риьидельта путем полного усваивания BstEII, вслед за частичным усваиванием Bgill Векторный фрагмент недостающих кодирующих последовательностей эритропоэтина был выделен и лигирован с фрагментами BstEII-Bgill с 810 парами оснований, содержащими желаемую плазмиду Детали конструирования некоторых аналогов, содержащих многочисленные аминокислотные замены описывают ниже Конструирование pDEC(N47) и pDEC(N48) pDEC(N47), который содержит asn30 thr32 va187 asn88 и thr90 мутации, был сконструирован из pDEC(N18) и pDEC(N4) pDEC(N18) был усвоен Hindi' и ВдШ, и выделяли фрагмент с 445 парами оснований pDEC(N4) был усвоен BstEII и Hmdll, и был выделен фрагмент с 377 парами оснований Эти два фрагмента были лигированы в рОЕСдельта, вырезанный BstEII и Вд1 II как описано выше, давая pDEC(N47) pDEC(N48), который содержит asn69 thr71 ser87 asn88 и thr90 мутации был сконструирован из pDEC(N14) и pDEC(NII) pDEC(N14) был усвоен Hmdll и ВдШ, был выделен фрагмент с 445 парами оснований pDEC(NII) -был усвоен BstEII и Hmdll, и был выделен фрагмент с 377 парами оснований Эти два фрагмента лигировали в рОЕСдельта, вырезанную BstEII и ВдШ как описано выше, давая pDEC(N48) Конструирование рРЕС(062) (HCGслияние эритропоэтина) pDEC(062) был собран из рЕС1 и 107 пар оснований Stul-Bg1ll синтетического ДНК линкера, содержащего карбокси концевые области 28 аминокислот из хронического гонадотропина человека (ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-pro-ser-leu-pro-serpro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser-asp-thr-pro-ile-leu-progln) (SEQ ID NO 25) (Pierce et al Ann Rev Biochem 50,465/1981/) Последовательность линкера была следующей 5' CCTGTAGGACASGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTC3' GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGTCGGAAG20 25 5»CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATGA ISEQ ID. NO: 19) 3'GTTCAGGIAGGGCIGAGGGCCCCGGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGTGTTACTCTAG (SEQ It). HO: 20) pECI был усвоен Stul и Bgill и был выделен ДНК фрагмент с 610 парами оснований Синтетический линкер был фосфорелирован АТР и полинуклеотид киназой и лигирован pECI фрагментом в рОЕСдельта, предварительно усвоенную BstEII и частично усвоенную Вд1 II как описано выше Конструирование pDEC(NOI) pDEC(NOI) был собран из pDEC(062) (HCGЕРО) и pDEC(N14) (Ser87Asn88Thr90) pDEC177 был усвоен Stul и Bgill, и фрагмент ДНК с 610 парами оснований, содержащий мутации Ser87Asn88Thr90 был выделен чистым геном pDEC(062) был усвоен Stul и Bgill, и был выделен фрагмент с 107 парами оснований Эти два фрагмента ДНК были лигированы в рОЕСдельта, предварительно усвоенную BstEII и частично усвоенную ВдШ, как описано выше Конструирование pDEC(N02) pDEC(N02) был собран из pDEC(062) (HCGЕРО) и pDEC(N47) (Asn30Thr32Val87Asn88Thr90) pDEC(N47) был усвоен Stul и ВдШ, и фрагмент ДНК с 610 парами оснований, содержащий мутации Asn Thr Val Asn Thr был выделен с помощью GeneClean pDEC(062) был усвоен Stul и Bgill, и был выделен фрагмент с 107 парами оснований Эти два фрагмента ДНК лигировали в рОЕСдельта, предварительно усвоенную BstEII и частично усвоенную Bgill, как описано выше Конструирование pDEC(N16) (Ser 87 Asn^Thr 90 Ala 162 ) pDEC(N16) был собран из pDEC(N14) (Ser 87 Asn 8 4hr 90 ) и pDEC258 (Ala162) pDEC258 был сконструирован с использованием процедур для мутагенеза in vitro описанных выше, и заменой ом о*, от QQ Ом 41 AGG кодона на GCG в положении 162 pDEC(N14) был усвоен Stul и Bgill и фрагмент ДНК с 610 парами содержащий мутации основании, Ser Asn Thr был выделен с помощью GeneClean pDEC258 был усвоен Stul и Bglll, был выделен фрагмент с 210 парами оснований Эти два фрагмента ДНК были лигированы в рОЕСдельта, предварительно усвоенную BstEII и частично усвоенную Вд1 II как описано выше Конструирование pDEC(RI) (R2) и (R3) Для удаления сайтов гликозилирования из pDEC(N14), m13-EPO(N14), содержащий ser87 asn88 и thr90 мутации, подвергали мутагенезу in vitro как описано выше, используя следующие затравки 5'GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3' GLN24 (SEQID NO 21) 5'CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3' GLN38 (SEQ ID NO 22) 5'СТОПСОТССАОТСТТСССАОЗ1 GLN83 (SEQ ID NO 23) Полученные плазмиды были обозначены pDEC(RI) (gin24 ser87 asn 88 thr 90 ), pDEC(R2) (gin38 ser87 asn 88 thr90) и pDEC(R3) (gln fe ser87 asn 88 thr90) m13EC-1 также был подвергнут мутагенезу in vitro с вышеуказанными олигонуклеотидными затравками, давая рЕСЮ (gin24) и рЕС8 (gin38) pEC9 (gin83) был сконструирован с использованием затравки 5'ССТОТТООТССДОТСТТСССАОСЗ1 GLN83 (SEQ ID NO 24) сДНК клоны эритропоэтина человека и аналоги соответствующие [Asn4 Ser6] ЕРО, [Asn9, Ser11] ЕРО, [Asn69] ЕРО, [Asn ] ЕРО, [Asn125, Ser127] ЕРО, [Asn f63 , S e r H ЕРО, [Thr125] ЕРО и MA MR [Pro ,Thr ] ЕРО и сДНК клоны аналогов, описанных в Таблицах 3, 4 и 5, были перенесены в клетки COS-1 (АТСС №CRL-1650) путем электропорации Клетки COS-1 собирали из полуслитых чашек, промывали средой (Dulbecco модифицированной, по существу, средой, содержащей 5% фетальной сыворотки теленка и 1% І_-глутамина/пенициллина/стрептомицина (Irvine Scientific) и повторно суспендировали 4 х 10 6 клеток/мл Один мл клеток переносили в кювету для электропорации (Bio-Rad) и подвергали электропорации с Bio-Rad Gene Pulser при 25мкф и 1600вт в присутствии 100-200 мкг носителя ДНК и 2-20мкг плазмиды ДНК, кодирующей аналог эритропоэтина Электропорированные клетки помещали с 2-Ю6 клеток в 60мм чашки с культурой ткани в 5 мл среды Два-четыре часа спустя после высевания среду заменяли 5мл свежей среды Кондиционированную среду собирали через 3-5 суток после электропорации Пример 7 Характеристика аналогов эритропоэтина А Определение присоединения карбогидрата Объем супернатанта, содержащий 5-20 единиц из клеток COS трансфекцированных сДНК аналогом эритропоэтина, как описано в Примере 6, были подвергнуты иммунозащите в течение ночи при комнатной температуре политональным антителом антиэритропоэтина кролика 20-80мкл 49793 42 1 1 Протеин-А-сефароза в солевом фосфатном буфере (PBS) добавляли для иммуноосаждения и позволяли инкубироваться в течение одного часа при комнатной температуре Образцы центрифугировали, промывали PBS и, где указано, шарики обрабатывали N-гликоназой для удаления Nсвязанных карбогидратных цепей Образцы анализировали с помощью электрофореза на 15% SDS-полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозу и подвергали Western анализу как описано (Burnette et al , Anal Biochem 112, 195203 /1981/, Elliott et al Gene, 79, 167-180 /1989/), используя смесь моноклональных антител антиэритропоэтина мышей Одно из таких антител 9G8A описано у Elliott et al /1989/, Blood 74, Supp I, A 1228 Анализ супернатантов COS клетки трансфекцированных [Asn69] ЕРО и [Asn 125 , Ser127] ЕРО сДНК свидетельствует об увеличенном размере протеина, по сравнению с последовательностью эритропоэтина человека Этот увеличенный размер указывает на присутствие N-связанной карбогидратной цепи (фиг 7) Обработка супернатантов их COS клеток трансфекцированных [Thr125] ЕРО и [Pro124, Thr125] ЕРО сДНК N-гликоназой свидетельствует об увеличении размера протеина, по сравнению с последовательностью эритропоэтина человека Этот увеличенный размер указывает на наличие дополнительной 0-связанной карбогидратной цепи (фиг 8) Western blot анализ других выбранных аналогов показан на фиг 10 Для определения числа N-связанных карбогидратных цепей присоединенных к ЕРО, было проведено частичное усваивание N-гликаназы Аналоги или rHuEPO были экспрессированы в СНО клетки и была собрана кондиционированная свободной сывороткой среда Трубки содержали 40 единиц ЕРО (объем доводили до 15 мкл водой) К каждой трубке добавляли Юмкл 0 5% SDS и каждый образец кипятили в течение 3 минут Затем добавляли следующие компоненты 10 8мкл 0 5моль/л фосфата натрия, рН 8 6, 5мкл 7 5% нонидет Р40м и 1 5мкл 250единиц/мл N-гликаназы /Genzyme/ Образцы инкубировали в течение указанных промежутков времени при 37 градусах С Реакцию останавливали добавлением SDS-PAGE образца буфера (смотри выше) и затем подвергали SDS-PAGE western анализу (10% акриламид), используя политональное антитело анти-ЕРО и антикроликовый Vectastam kit (Vector laboratories) с 4-хлорнафтолом в качестве субстрата Анализ N-связанных цепей с использованием этого метода показан на Фиг И для эритропоэтина человека и аналога N14 В Анализы активности аналога эритропоэтина RIA были выполнены согласно Ergie et al El A были выполнены с CLINIGEN El A kit (R и D систем), используя процедуры, предложенные производителем Биологическую активность in vivo аналогов эритропоэтина определяли на супернатантах из кондиционированной СНО клетками среды, как описано ниже, используя эксгипоксический полицитемический биоанализ на мышах (Cotes et al)c Активность эритропоэтина in vitro определяли 49793 43 с помощью анализа эритроид образующей колонии, как описано Iscove et al Cell Physiol 83, 309320 /1974/ с модификацией Мононуклеированные клетки из клеток костного мозга человека были частично очищены на ficol-paque cussion и промыты в среде Iscove до высевания, для удаления адгезированных клеток Культура среды содержала 0 9% метилцеллюлозы и не включала никакого бычьего сывороточного альбумина Эритроидные колонии были обнаружены через 8-10 суток культивирования Аналоги эритропоэтина, трансфекцированные и экспрессированные в COS клетки как описано в Примере 6, были анализированы в неочищенных супернатантах COS клетки, используя RIA, EI А и анализ на образующие эритроидные колонии Очищенная последовательность эритропоэтина 44 человека имела активность in vitro, которая была сравнима с RIA активностью, определенной с помощью вышеупомянутых анализов Аналоги 69 125 124 125 [Asn ] ЕРО, [Ehr ] ЕРО и [Pro , Thr ] ЕРО обнаруживали активность in vitro, которая была сравнима с RIA активностью и свидетельствовала о наличии дополнительных карбогидратных цепей (как определено в части A) [Ihr125] ЕРО и аналоги N4, N11, N14, N16, N18, N47, N48, 062, N01 и N02 анализировали далее путем трансфекции сДНК клона, кодирующего аналог эритропоэтина в СНО клетках, и путем анализа СНО клеток супернатантов RIA и ЕІА и биологическим анализом in vivo Результаты показаны в Таблице 6 Активности in vivo аналогов Rl, R2 и R3, экспрессированных в супернатанты СНО клетки, показаны в Таблице 7 Таблица 6 Аналоги эритропоэтина, содержащие дополнительные карбогидратные цепи Thrl25 3 гго124 І Й Ж 125 • 3 HCG C - t e n o i a a l e x t e n s i o n 3 Активeность связанные цепи in vivo l& O.S n.t. 1.1 n.t. n.t. n.t. n.t. seduced* n.t. a.t. 0.25-0.7 a.t. s.t. n.t. l.e normal X.O n.t, n.t. reduced* n.t. n.t. n.t. s.t. n.t. n.t. 1.8 n.t. ft.t. n.t. a.t. n.t. 9.C25-0.2S nozraal 1.8 X and 2* n.t. 1 and 2* 0.1 X and 2* n.t. at least 39 1.0-1.3 HCG e x t e n s i o n 4 at least 33 1*5 HCG e x t e n s i o n 4 to S at least 39 0.8 N-связанные Последовательность цепи 3* Азп-*»ТЬс'2 з t o 4** Aan51xhr53 4 Лэп57тпх59 4 Лзп*' 4 AenSSiij3r71 4 8*х'°Алй'°Т&зг*-* 4 Val~ • Аэя'"UIJJSO 5ег87дад88ці;с96 4® , з t o 4" Ser* *Asn^ ^ G l Y ^ ' T i n ^ 4 Звгв^лапвет^ЭОИиЭг Aaa8Su e 90ihr« ^ 4 4 Ser8?Asn88ihr5CAlaie2 4 АЯП^36уйХ^38 3 (0 4 jksn^38Thx3>40 3 £ф 4 Авп*'Тпг''3-5вг^'АЭй88тох^0 4 t^ 5 Авп30щі;32уаі8/дав()8ці]-90 ТЫ12Э ^ ^^ j o . Обозначения к Таблице 6 a) Число дополнительных N-связанных цепей, установленное на основании подвижности аналогов полипептидов в SDS гелях, как описано в Примере 7А b) Отношение активности аналога in vivo к ко 3 личеству аналога эритропо-этина Измерения активности были проведены на супернатантах аналогов СНО клетки, используя полицитемический биоанализ на мышах Количество аналогов в супернатантах СНО клетки определяли с помощью анализов RIA и EI А как описано в тексте 45 49793 c) Подтверждение числа дополнительных карбогидратных цепей было проведено с помощью изучения миграции гликопротеина в SDS-гелях после частичного переваривания N-гликаназы, как описано выше в Примере 7А 126 d) 0-связанная цепь у Ser присутствует в 70% молекул эритропоэтина человека e) Аналоги, имеющие пониженное 0гликозилирование содержат карбогид-ратную цепь в Ser126 меньше чем в 70% молекул 1 ?Я f) Thr ЕРО имел две 0»связанные цепи на 46 более чем 60% молекул 125 Thr ЕРО имел две 0-связанные цепи на около 40% молекул Pro 24125 Thr ЕРО имел две 0-связанные цепи на более чем 80% молекул д) Эти аналоги имели, по крайней мере, три 0связанные цепи и могли иметь четыре или пять ОДИН HCG, как известно, имел четыре 0-связанных цепей N Т не испытывали Таблица 7 Активности эритропоэтина человека и аналогов, содержащих перегруппировки карбогидратного сайта N-связанные ЕРО последовательность Активности in vivo цепи RIA или EIA Человеческий 3 0 69 Gin" 2 016 Gin" 2 016 Gin 00 2 0 23 3 0 69 Gln' 4 Ser°'AsrTThr au (Rl) 3 0 41 GlnaoSer°'AsnooThrau (R2) 3 0 50 Gln M Ser°'Asn 00 Thr au (R3) 3-4 1 48 Ser°'Asnot>Thrau Отношение активности in vivo по данным RIA или EIA определяли, как описано в приложении к Таблице 6 С Получение смесей изоформ, приготовлен15 9 ных из аналогов эритропоэтина [Thr ] ЕРО (ЕРО 050) 125 Аналог [Thr ] ЕРО был сконструирован, как описано в разделе А Примера 6 сДНК фрагмент эритропоэтина с 810 парами оснований, несущий мутацию [Thr 125 ] выделяли путем разрыва плазмиды рЕС, содержащей мутацию [Thr1 5 ], вызванную BstEII и Вд1 II и лигирования фрагмента рОЕСдельта (производное рОЗальфа2) (описанной в Примере 6) Плазмиду рОЕСдельта, содержащую [Thr125] эритропоэтиновой сДНК трансфекцировали в DHFR-CHO клетки 770мл среды, кондиционированной СНО клетками концентрировали, используя вырезанную мембрану с молекулярным весом 10000 дальтон и диафильтрацией по отношению к 10ммоль/л Трис-НСІ, рН 8 6, до конечного объема 34мл 17мл аликвоты концентрата загружали в колонку с Q-сефарозой быстрого потока (ложе объемом 5мл) уравновешенную тем же буфером и элюировали с линейным градиентом 0250ммоль/л хлористого натрия в 10ммоль/л ТрисНСІ, рН8 6 Аликвоты фракций с колонки, либо необработанные, либо переваренные N-гликаназой, анализировали с помощью SDS-PAGE или EIF и пулы (обозначенные 2, 3 и 4) были получены из фракций изоформы и/или карбогидратной композиции Каждый пул загружали в колонку Vydac C4 /214ТВР 2030, 1см диаметра, 1 8-2 5мл объемом ложа, 0 34мл/мин/ и промывали раствором, равным двум объемам колонки 20% этанола в 10ммоль/л Трис-НсІ, рН 7 О Колонки элюировали с линейными градиентами 20-94% этанола 10ммоль/л Трис-НСІ, рН 7 0 Пулы получали, разбавляли в 10ммоль/л Трис-НСІ, рН 7 0 и загружали в колонки с Q-сефарозой быстрого потока Вслед за промыванием в 10ммоль/л Трис-НСІ, рН 7 0, образцы элюировали 20ммоль/л цитрата натрия, 250 ммоль/л хлористого натрия, рН 7 0 Очищенные пулы [Thr125] анализировали с помощью IEF, они показаны на фиг 9 Эти пулы были также анализированы на биологическую активность in vivo как описано выше (Cotes et al), и результаты показаны в Таблице 8 Ser87Asn88Thr90 ЕРО (ЕРО N14) Препарат 1 Аналог ЕРО N14 очищали, используя трехстадийную процедуру, состоящую из ионообменной хроматографии, хроматографии с обращенной фазой и гель фильтрационной хроматографии В процессе ионообменной стадии, стадии полученных пул ов давал и смесь изоформ, содержащую более высокие уровни сиаловых кислот Два дополнительных пула были получены в процессе хроматографии с обращенной фазой, содержащие аналог с агрегатом или без агрегата Детали очистки представлены ниже 1 Кондицированную СНО клетками среду, экспрессирующую аналог ЕРО N14, собирали и концентрировали приблизительно в 2 5 раза, используя мембрану YM10 (Amicon) с перемешанной клеткой, и проводя диафильтра-цию по отношению к 10ммоль/л Трис рН 8 5 2 Концентрированную среду загружали в приблизительно 12 А28о/мл смолы с Q-сефарозой FF (Pharmacia) колонку, уравновешенную 10ммоль/л Трис рН 8 5 при скорости потока 0 2см/мин 3 Вслед за загрузкой колонку промывали раствором, равным трем объемам колонки (CV) 10ммоль/л Трис рН 8 5 и элюировали с градиен 47 49793 том 0-0 5моль/л хлористого натрия/ 10ммоль/л Трис рН 8 5 в 50 CV Собирали 1 CV фракции 4 Образец каждой фракции был пропущен на IEF геле рН 3-5 На основании распределения изоформы на IEF, получали фракцию пула, содержащего больше изоформ 11-18 Добавляли к пулу EDTA до конечной концентрации 1ммоль/л 5 Пул изоформы загружали в приблизительно 5 А28о/мл смолы колонку С4 с обращенной фазой (Vydac), уравновешенную в 20% этанол/ 10ммоль/л Трис-HCI рН 7 0 при скорости потока 2 5см/мин Колонку промывали 1 CV 20% этанол/ 10ммоль/л Трис рН 7 0 и элюировали с градиентом 20-94% этанол/ 10ммоль/л Трис рН 7 0 в 30 CV при скорости потока 1 см/мин Собирали 0 2 CV фракции 6 Образец каждой фракции анализировали путем невосстанавливающей 12% SDS-PAGE Два раздельных пула были получены на основании присутствия агрегата наблюдавшегося на SDS гелях Пул #1 содержал аналог ЕРО, но не агрегат Пул #2 содержал оба варианта и аналог ЕРО, и агрегат 7 Пул #1 подвергали концентрированию приблизительно в 65-раз, а пул #2 приблизительно в 250 раз, используя Centncon 10 (Fvicon) В каждом пуле был заменен буфер на 20ммоль/л цитрат натрия/100ммоль/л хлористого натрия рН 7 О 8 Каждый пул был очищен индивидуально на колонке BioSil SEC-250 (Dio Rad) для гель проникающей хроматографии, уравновешенной 20ммоль/л цитрата натрия/ 100ммоль/л хлористого натрия рН 7 О Пулы были загружены при менее 6 А280/мл смолы при скорости потока 2 26см/мин Для каждого опыта были выбраны пики, соответствующие мономерным аналогам 9 Было измерено поглощение каждого пула и части каждого пула, которые были сконцентрированы для анализа с помощью SDS-PAGE и IEF гелей Пул #1 имел распределение изоформ 15-17 и был использован для фармакокинетических исследований и исследований по рецепторному связыванию Препарат 2 Аналог ЕРО N14 был очищен с использованием трехстадийной процедуры, состоящей из ионообменной хроматографии, гель проникающей жидкостной хроматографии с обращенной фазой и хроматографии с гидроксилаппатитом В процессе стадии ионного обмена, аналог разделяли на три пула, содержащих различные смеси изоформ Детали очистки представлены ниже 1 Супернатант из СНО клеток, экспрессирующих ЕРО N14 был собран и подвергнут приблизительно 10-кратному концентрированию, с использованием Filtron Mim-Ultrasette устройства с 48 тангенциальным потоком и подвергнут диафильтрации по отношению к 10 ммоль/л Трис рН 8 5 2 Концентрированную среду загружали при приблизительно 10 А28о/мл смолы в колонку с Qсефарозой FF (Pharmacia), уравновешенную в 10ммоль/л Трис рН 8 5 при скорости потока 0 2см/мин 3 Вслед за загрузкой колонку промывали раствором, равным трем объемам колонки (CV), 10ммоль/л Трис рН 8 5 и элюировали 50 объемами CV Собирали фракцию равную одному объему колонки CV 4 Образец каждой фракции был подвергнут анализу на IEF геле рН 3-5 Пулы трех раздельных фракций были приготовлены на основании распределения изоформы как определено с помощью IEF Были получены пул низкой изоформы (изоформа 4-12), пул средней изоформы (изоформа 515), и пул высокой изоформы (изоформа 6-18) 5 Пул каждой изоформы был очищен индивидуально на колонке Vydac C4 для гель проникающей жидкостной хроматографии с обращенной фазой Колонка была проявлена градиентом от 0 1% TFA/вода до 0 1% TFA/75% ацетонитрила при скорости 1% увеличения акрилонитрила в минуту 6 Был собран пик аналога из каждого пула и разбавлен 4 объемами 80ммоль/л Трис НС1/ 20ммоль/л основания Трис, затем концентрирован, и буфер заменен на 10ммоль/л Трис рН 7 2, используя растворитель, резистентный Centncon 3'S 7 Каждый образец был разбавлен до 2 А28о/мл в 10ммоль/л Трис рН 7 2, и был добавлен равный объем 4моль/л гидрохлорида гуанидина /GuHCI/, 10 ммоль/л CHAPS, Юммоль/л Трис рН 7 2 для конечной концентрации образца 1 А28о/мл Каждый образец был загружен в миниколон-ку с гидроксиаппатитом, уравновешенную 2 моль/л GuHCI, 5ммоль/л CHAPS, 10 ммоль/л Трис рН 7 2 Колонка была промыта уравновешивающим буфером, и были собраны фракции, равные одному объему колонки CV, прошедшие через колонку 8 Было измерено поглощение фракций, и были получены пулы, и буфер заменен на 10ммоль/л Трис рН 7 2, используя Centncon 10 Было измерено поглощение каждого пула Полученные пулы были анализированы с помощью SDS-PAGE и IEF гелей IEF гели показаны на Фиг 12 RIA и анализ на активность in vivo были проведены как описано в Примере 7А Активность in vivo полученных пулов изоформы представлена в Таблице 8 Пул изоформы с высоким содержанием сиаливой кислоты был использован в опытах для определения увеличения гематокрита мышей Таблица 8 Активности изоформ из аналогов эритропоэтина ЕРО последовательность Пул изоформы Активность in vivo ед/мг пептида* Thr125 Изоформы 8-12 Изоформы 9-15 Изоформы 13-15 147,000° 215,000° 111,000° 49 Ser87Asn88Thr90 49793 Изоформы 7-12 Изоформы 10-14 Изоформы 12-17 миллиграммы эритропоэтинового пептида были рассчитаны из данных поглощения A28oSer87Asn88Thr90 ЕРО пулов изоформы, используя коэффициенты экстинкции равные 0 93 для 1мг/мл раствора b стандартные отклонения для Thr125 ЕРО пулов изоформы не сообщаются, так как анализы по активности были проведены либо один раз, либо дважды Пример 8 Биологические свойства аналога ЕРО N14 Активности пулов изоформы аналога ЕРО N14 рекомбинантного эритропоэтина человека (rHuEPO), и выделенной rHuEPO изоформы 14, были сравнены по данным фармакокинетических анализов, полученных из ультрафиолетовых спектров, анализов по рецепторному связыванию и по изучению гематокрита Пулы изоформы ЕРО N14 были приготовлены, как описано в Примере 7С rHUEPO был приготовлен согласно Lai et al rHuEEPO изоформа 14 была очищена следующим образом rHuEPO, СОСТОЯЩИЙ ИЗ смеси изоформ 10, 11, 12, 13, 14 и 15 был загружен в колонку с Qсефарозой быстрого потока (размером = 2 2см диам х 3 4см высоты), уравновешенную 10 ммоль/л Трис рН 7 2 Загруженная колонка была приведена в равновесие 2ммоль/л уксусной кислоты/ 6 моль/л мочевины ("А" буфер), затем был осуществлен многофазный градиент, предназначенный для оптимизации очистки изоформ 13 и 14 Градиент был 0% - 7 3% 800ммоль/л уксусной кислоты/ бмоль/л мочевины ("В" буфер) в 750 мл, 7 3% - 11 4% "В" буфера в 750мл, 11 4% - 26 8% "В" буфера в 1250мл, 26 8% - 62 4% "В" буфера в 1250 мл, затем 62 4% - 100% "В" буфера в 700мл Были собраны фракции 12 5мл нейтрализованы гидроокисью аммония, затем анализированы с помощью изоэлектрического фокусирования в полиакрила-мидных гелях Эти фракции, содержащие чистую изоформу 14, были соединены вместе, концентрированы с помощью Amicon перемешиваемой кюветы, оборудованной мембраной YM-10, и затем буфер заменен на воду А IV 50 132,000± 17,000 233,000±39,000 272,000± 14,000 Фармакокинетические исследования Были проведены два раздельных исследования для сравнения фармакокинетических параметров аналога ЕРО N14 (изоформы 15-17) и выделенной изоформы 14rHuEPO В каждом опыте 1мк Сі либо 1251 выделенной изоформы 14, либо аналога І-ЕРО N14, или Iрекомбинантного эритропоэтина человека (Amersham) была проведена внутривенная инъекция в каротидную канюлю самцам крыс SpraqueDawley весом между 310-378г Через различные интервалы времени после введения была собрана кровь и приготовлена сыворотка центрифугированием Концентрация 1251-ЕРО (либо рекомбинантного эритропоэтина человека, выделенной изоформы 14, либо аналога ЕРО N14) в 0 1 мл каждого образца сыворотки были затем определены вслед за инкубированием в течение ночи при 4 градусах С в 90% этаноле В каждом образце сыворотки, осажденном в этанол1251-ЕРО рассчитывали гамма счетчиком, и полученные фармакокинетические кривые показаны на фиг 13 Были определены фармакокинетические параметры для каждой крысы с использованием PCNONLIN 4 0 нелинейного регрессионного анализа (Statistical Consultants, 1992), и результаты для каждой группы были усреднены Результаты фармакокинетических исследований для аналога ЕРО N14 и выделенной изоформы 14 суммированы в Таблице 9 Как видно из Таблицы 9, существует значительное различие в выделенной сыворотке аналога ЕРО N14 по сравнению с рассчитанной для рекомбинантного эритропоэтина человека Рекомбинантный эритропоэтин человека затухает наиболее быстро в случае бета времени полураспада 3 10 часа, по сравнению с 3 97 часа для выделенной изоформы 14 и 4 36 часа для аналога ЕРО N14 Группа рекомбинантного эритропоэтина человека также имеет наиболее быстрое выделение - 1 78 часа, по сравнению с 2 40 часа для выделенной изоформы 14 и 3 03 часа для аналога ЕРО N14 Таблица 9 Сумма фармакокинетических параметров гНиЕРО, изоформы 14 rHuEPO и ЕРО N14 (изоформы 15-17) после внутривенного введения Период полураспада (часы) Константа AUC Период поскорости Выделение Препарат (час/мл)0-со \Ю(мл/кг) лураспада элиминиро- (мл/кг-час) альфа бета (часы) Ч вания (час) гНиЕРО знач 0 332 310 308901 44 9 0 400 614 1 78 *п=6 SD 0 155 0 54 69187 83 0 069 1 36 0 27 Изоф 14 знач 0 388 3 97 483329 36 5 0 288 3 80 2 40 п=4 SD 0 066 0 40 53638 22 0 020 012 015 ЕРО N14 Знач 0 422 4 36 692231 37 4 0 230 2 67 3 03 п=4 SD 0 165 0 36 40355 19 0 021 017 0 27 В Анализы по рецепторному связыванию Взаимодействие аналога ЕРО N14 (изоформы 15-17) с эритропоэтиновым рецептором было изучено с помощью анализа холодного замещения с 51 49793 использованием эритролеикемииных ОСІМІ клеток человека (Papayannopou-lou et al Blood 64 (supp 1), 116a /1984/) Повышение концентраций немеченного ЕРО N14 было осуществлено инкубированием клетками ОСІМІ вместе с постоянной 125 концентрацией 1-гНиЕРО для определения количества ЕРО N14, необходимого для сравнения с 125 I rHuEPO для связывания с рецептором Для сравнения, увеличение концентраций немеченного rHuEPO сравнивалось с постоянной концентра125 цией 1-гНиЕРО Немеченный ЕРО N14 был разбавлен буфером и добавлен в количестве 0 ОЗнг, 0 1 нг, ОЗнг, 1 Онг, 3 %нг, ЮОнг и ЗООнг (на массу пептида) 125 О 5нг 1-рекомбинанты ЕРО человека было добавлено ко всем анализируемым трубкам с последующим добавлением приблизительно 0 5x106 ОСІМІ клеток Анализируемые трубки были затем инкубированы при 37 градусах С в водяной бане на качалке в течение 2 часов Вслед за инкубированием, растворы центрифугировали через масляный раствор дибутилфтала-та/дифталата с выделением несвязанного 1251-гНиЕРО из 1 2 5 1 rHuEPO, связанного с клетками ОСІМІ Были выделены шарики клеток, и было определено количество 1251-гНиЕРО, связанного с клетками, с помощью гамма счетчика Расчеты, связанные с клетками, были проведены, и была определена концентрация немеченного протеина, требуемая для 50% конкуренции по связыванию 12 І-rHuEPO в отсутствие конкурирующего агента, с помощью анализа линейной регрессии Результаты трех опытов указывают на то, что средняя величина 2 67+0 73нг немеченного ЕРО 125 N14 пептида была необходима для снижения IrHuEPO связывания с ОСІМІ клетками на 50% В тех же трех опытах, немеченный rHuEPO, требуе125 мый для конкуренции по связыванию 0 5нг IrHuEPO, составлял 0 51+015нг На основании этих результатов 5 25 кратный избыток ЕРО N14 был необходим для конкурирования связывания 125 1-гНиЕРО с ЕРО рецептором по сравнению с немеченным r-HuEPO (p меньше 0 01) Были проведены дополнительные эксперименты для прямого сравнения между аналогом ЕРО N14, выделенной изоформой 14 и рекомбинантным эритропоэтином по связыванию эритропоэтинового рецептора Результаты этого эксперимента указывают на то, что аналог ЕРО N14 обладает более низким сродством к рецептору, чем выделенная изоформа 14 Был необходим приблизительно двухкратный избыток аналога ЕРО N14 для конкуренции по связыванию 1 2 5 1rHuEPO с рецептором, по сравнению с немеченной изоформой 14 (фиг 14) С Изучение гематокрита Были проведены исследования in vivo для сравнения способности высоких и низких пулов изоформы ЕРО N14 (из препарата 2, описанного в 52 Примере 7С), выделенной изоформы 14 и рекомбинантного ЕРО человека к увеличению гематокрита у обработанных мышей Распределение изоформы в высоких и низких пулах изоформы ЕРО N14, использованное в этих исследованиях, показано на фиг 12 Были проведены внутрибрюшинные инъекции три раза в неделю в течение полных шести недель CD1 мышам (весом около ЗОг) одним и больше препаратом, приготовленным в 0 25% сывороточном альбумине мышей, или с placebo (PBS с 0 25% сывороточного альбумина мышей) Дозы эритропоэ-тиновых препаратов расчитывали на массу пептида, так что мыши весом 30 г получали 0 71мкг пептида/доза для ЕРО N14 высокого пула, или ЕРО N14 низкого пула, или изоформы 14, или стандарта r-HuEPO Дополнительная группа доз 0 Збмкг пептид/доза была включена для ЕРО N14 высокого пула и изоформы 14 Гематокриты всех мышей были определены у базовой линии, и спустя две недели путем ретроорбитального кровотечения В заключение эксперимента, была собрана сыворотка от всех животных и подвергнута анализу на антитела по отношению к продукту, инъекция которого была осуществлена Данные от животных, оцененные как отрицательные для нейтрализации антител, были использованы для последующих анализов Как показано на фиг 15, животные, обработанные ЕРО N14 пулом высокой изоформы достигают самой высокой группы среднего гематокрита по сравнению с другими препаратами Изоформа 14, рекомбинантный ЕРО человека, и ЕРО N14 низкий пул изоформы увеличивают гематокрит до меньшей величины Для того чтобы сравнить различные препараты эритропоэтина в количественной форме, были расчитаны средняя начальная скорость повышения гематокрита (0-11 суток), площадь под кривой (0-39 суток), и общее увеличение гематокрита (Таблица 10) По любому из этих критериев, ЕРО N14 высокий пул изоформы обнаруживал большую активность по массе пептида, чем любой другой испытанный препарат Оба препарата ЕРО N 14 высокий пул изоформы, и изоформа 14 были более активны, чем рекомбинантный ЕРО человека Низкий пул ЕРО N14 имел самую низкую активность при использовании для сравнения любых анализов В то время как изобретение было описано в его предпочтительных вариантах, оно не ограничивается раскрытыми вариантами, а, напротив, включает различные модификации и эквиваленты, включенные в объем изобретения, и прилагаемую формулу изобретения, объем, который находится в соответствии с более широкой интерпретацией, таким образом, что включает все такие модификации и эквиваленты 53 49793 54 Таблица 10 Влияние ЕРО N14 (пулов высоких и низких изоформ), изоформы 14 и гНиЕРО на гематокрит мыши Увеличение скорости Общее увеличение геПлощадь Препарат Доза (мкг) гематокрита1 (точматокрита3 (ге2 под кривой ки/день) м а т и т ки) Высокий пул N14 0 071 1 46 619 25 4 Изоформы 14 0 071 1 19 546 22 6 Высокий пул N14 0 036 0 98 428 191 Изоформы 14 0 036 0 76 284 107 r-HuEPO 0 071 1 0 424 175 Низкий пул N14 0 071 05 212 93 1 Начальная скорость повышения гематокрита была рассчитана из количества суток 0-11 с помощью линейной регрессии Площадь под кривой была рассчитана из количества суток 0-39 с помощью трапезоидного суммирования 3 Общее увеличение гематокрита было рассчитано как группа среднего гематокрита на 39 суток минус группа среднего гематокрита у базовой линии muar я з і и л и т ш ВРИІРСІЙ&ТИНЛ * 300000 * а » * о X E OO O 0 S 0 • О и и,шуе етандартік* 100ОТ9S 0 0 а • ё Фиг 1 asmui /?Ч|-МИГЁ:ЫЯ ИЗ ДЯШК ягао/ i n « uЭД/WT"Odhdisn =>д(зочш:*нля из я * шх пп»о ж мигас 4 Є В 10 12 14 16 ЧИСЛО ЙЗІЖІРЧ Фиг2С СЧ *ч W й ФигЗ Фиг 4 о? Д 56 49793 55 •» *І 10 К D MGVHEaAWLWUlSLLSUlGLPVlSAPFRlXDSIlVLmYLLEAKEAENir NS 30 D40 50 N S D P SO т О 90 103 П О 120 Т« П О N S N по J4f> 150 160 U - СаРт дія N рлй?эанлр вання * = СаРт дзя О-га^тезилирпв^яия ФигбС Фиг 7 57 58 49793 C SКЛЕТКИ O ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ЭРИГРОПОЭ'Ш IVal126l Е О Р fro 1 2 4 1 Е О Р [Pro125] ЕРО [ТІіг125|ЕРО !Pn>12iThr125}EPO Фиг.З IK&SP АНАЛОГА X і NO изоаорма N14 N40 КЗ? N39 N21 N13 Nt9 N17 № №4 Ю №£ І І ! І І 1 15 І*1 13' 12 • 11 10' Фиг.Ю Фмг.9 1 | * 1 І І 59 4 9 7 9 3 ЕРО М14 ЗРИТРОІОЗТИЬ ЧЙЛОЕНЖ ВРЕМЯ УСВАИВАНИЯ 4 ' I 12 I « С » І I 6 0 0 І 4 ! 12 | 45 ОІН | ( Фиг 12 ФйГ 11 rHuEPO .14 — ЕРО N14 О n«4 ГНиЄРО • Й ОО М З І Р 20G0D 10000 1000 Фиг 14 100 Ч С П С Е 4 ШШ1Ш АЫ ОЛ Фиг 13 l z t6 20 Z4 2& ДЕНЬ МССЛЩШНИЯ Фиг 15 --*? • рво 32 3 40 S ЕРО N14