Імуногенні композиції bordetella bronchiseptica

Реферат: Винахід належить до імуногенної композиції, що містить Bordetella bronchiseptica та виділений антиген пертактину р68. Також вакцина може додатково містити антигени вірусу собачого парагрипу (CPIV), собачого аденовірусу серотипу 2 (CAV-2), собачого респіраторного коронавірусу собак (CRCoV) та Mycoplazma cynis. Винахід також належить до застосування заявленої композиції для лікування та запобіганні виникненню респіраторних інфекцій у собак. UA 110505 C2 (12) UA 110505 C2 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявлений винахід має відношення до імунології, зокрема до імуногенних та вакцинних композицій. Точніше кажучи, заявлений винахід має відношення до композицій, що містять препарат Bordetella bronchiseptica у комбінації з пертактином для лікування або запобігання хвороби(хвороб) дихання у собак. Bordetella bronchiseptica є грам-негативними бактеріями, що оселяються у дихальних шляхах собак та викликають трахеобронхіт або так званий “вольєрний кашель” (Hawkins, E.C., Veterinary Internal Medicine (1995), pp. 767-811). Бактерії Bordetella bronchiseptica роблять собак більш сприйнятливими до впливу інших респіраторних агентів та часто існують одночасно з ними. На сьогоднішній день існують декілька вакцин для лікування трахеобронхіту, викликаного Bordetella bronchiseptica, в тому числі вакцини Nobivac®, Bronchi-Shield®, Bronchicine® CAe, TM TM Vanguard® B, Univac 2, Recombitek® KC2, Naramune -2 та Kennel-Jec 2. Однак, більшість існуючих комерційних вакцин вимагають обтяжливого інтраназального введення, а також додавання допоміжних речовин, що може привести до шкідливих побічних проявів, як-то печія та роздратованість (Viera Scheibner et al., Nexus Dec 2000 (Vol 8, No1)). Вакцини для інтраназального застосування також є непопулярними у практикуючих ветеринарних лікарів через особистий ризик введення вакцин примхливим тваринам. Також досліджені субодиничні вакцини, як-то вакцини, що пов'язані з застосуванням білка p68 Bordetella bronchiseptica (пертактину), але вони досі ще не включені до складу жодної промислової собачої вакцини, можливо, через недостатню імуногенність, побічні реакції та/або стійкість препарату. Bordetella bronchiseptica є значним фактором розвитку інфекційної респіраторної хвороби собак (CIRDC) та дуже заразним захворюванням, що звичайно трапляється у собак, розміщених у скупчених умовах, як-то притулки для тварин або тренувальні вольєри. Вважається, що патогенез CIRDC є багатофакторним та виникає за участю кількох вірусів та бактерій. Інфекційні агенти, що спричинюють CIRDC на додачу до Bordetella bronchiseptica (Bemis et al., Lab. Anim. Sci., 29:48-52, 1977) охоплюють також респіраторний коронавірус собак (CRCoV) (Erles et al., Virology, 310(2):216-223, 2003), вірус собачого грипу (CIV) (Crawford et al., Science, 310(5747):482-485, 2005), вірус собачого парагрипу (CPIV) (Binn et al., Exp. Biol. Med., 126:140145, 1967), мікоплазму Mycoplasma cynos (Chalker et al., Microbiology, 150:3491-3497, 2004) та собачий аденовірус серотипу 2 (CAV-2) (Ditchfield et al., Can. Vet. J., 3:238-247, 1962). На сьогоднішній день досі ще не з'явилося жодної всеосяжної комбінованої вакцини проти всіх або більшості з вищезазначених патогенів. Відповідно, залишається потреба у імуногенній композиції, яку можна безпечно парентерально вводити собакам та яка буде надавати довготривалий імунозахист проти бактерій Bordetella bronchiseptica без шкідливих побічних проявів або перешкод з боку інших антигенів у комбінаційній вакцині або без ризику її застосування практикуючими ветеринарними лікарями. Заявлений винахід задовольняє цієї та іншим пов'язаним з нею потребам. У одному втіленні, заявлений винахід стосується імуногенної композиції, що містить, серед іншого, Bordetella bronchiseptica та виділений пертактиновий антиген. У іншому втіленні, вказаний пертактиновий антиген є рекомбінантним білком. У іншому втіленні, вказаний пертактиновий антиген походить від Bordetella bronchiseptica. У іншому втіленні, вказаний пертактиновий антиген є білком p68. У іншому втіленні, вказана композиція додатково містить виділений антиген Bsp22 . У іншому втіленні, компонент Bordetella bronchiseptica є бактерином або бактеріальним екстрактом. У іншому втіленні, вказана композиція не посилена ад’ювантом. У іншому втіленні, вказана композиція додатково містить ад’ювант. У іншому втіленні, вказаний пертактиновий антиген є присутнім у кількості біля 1-30 мкг. Більш переважно, вказаний пертактин є присутнім у кількості біля 5-20 мкг, ще переважніше біля 7-15 мкг та ще переважніше біля 5 мкг, 10 мкг, 15 мкг або 20 мкг. Переважним чином вказаний пертактиновий антиген отримують шляхом розчинення пертактинових тілець включення у сечовині та їх вибіркового очищення шляхом колоночної хроматографії. Вказані пертактинові антигени є розчинними та переважно істотно вільними від агрегатів. Інше втілення передбачає імуногенні композиції, що містять численні рекомбінантні пертактинові антигени p68, де вказані композиції є істотно вільними від агрегатів p68. Більш докладно, ці вказані численні рекомбінантні пертактинові антигени p68 отримують шляхом розчинення пертактинових тілець включення у сечовині та їх вибіркового очищення шляхом колоночної хроматографії. Винахід також передбачає способи отримання пертактинових антигенів p68 шляхом розчинення пертактинових тілець включення у сечовині та їх вибіркового очищення шляхом колоночної хроматографії. У іншому втіленні, вказана композиція є отриманою для парентерального введення таким 1 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чином, що вона ще додатково містить розчинник або наповнювач для парентерального введення собаці. У іншому втіленні, вказана композиція додатково містить антиген собачого респіраторного патогену, вибраний з групи, що охоплює вірус собачого парагрипу (CPIV), собачий аденовірус-2 (CAV-2), респіраторний коронавірус собак (CRCoV) та вірус собачого грипу (CIV). У більш специфічному втіленні, вказана композиція містить принаймні два, три або чотири антигени собачих респіраторних патогенів. У іншому втіленні, описані тут імуногенні композиції не містять антигени, що не пов'язані з диханням. Отже, у одному втіленні винаходу передбачено композицію, як тут описано, за умовах, що вона не містить не пов'язаний з диханням антиген. Нереспіраторні антигени не викликають хвороб дихання у суб’єкта. Необмежені приклади таких антигенів охоплюють вірус сказу, парвовірус собак, собачий кишковий коронавірус, види Leptospira та Borrelia burgdorferi. У іншому втіленні, вказаний антиген походить від респіраторного коронавірусу собак (CRCoV). У іншому втіленні, вказаний антиген походить від вірусу собачого грипу (CIV). У іншому втіленні, вказаний антиген походить від вірусу собачого парагрипу (CPIV). У іншому втіленні, вказаний антиген походить від собачого аденовірусу -2 (CAV-2). У іншому втіленні, вказаний антиген походить від вірусу собачого парагрипу (CPIV) та собачого аденовірусу -2 (CAV-2). У іншому втіленні, вказана композиція містить антигени, що походять з вірусу собачого парагрипу (CPIV), собачого аденовірусу -2 (CAV-2), респіраторного собачого коронавірусу (CRCoV) та вірусу собачого грипу (CIV). У іншому втіленні, композиція викликає імунну відповідь до Bordetella bronchiseptica та ще принаймні до одного збудника, вибраного з: вірусу собачого парагрипу (CPIV), собачого аденовірусу-2 (CAV-2), респіраторного собачого коронавірусу (CRCoV) та вірусу собачого грипу (CIV). У іншому втіленні винаходу передбачено імуногенну композицію, що містить респіраторний собачий коронавірус (CRCoV), препарат Bordetella bronchiseptica та вірус собачого грипу (CIV). Більш докладно, вказана композиція містить виділений пертактиновий антиген. Інше втілення заявленого винаходу передбачає спосіб або застосування імуногенної композиції будь-якого з вищезгаданих втілень для лікування собак або запобігання їх зараження собачим респіраторним патогеном. У іншому втіленні, вказана композиція запобігає зараженню вказаного собаки вказаним собачим респіраторним патогеном на період, що дорівнює шість місяців або більше. У іншому втіленні, вказана композиція запобігає зараженню вказаного собаки вказаним собачим респіраторним патогеном на період, що дорівнює біля одного року. У іншому втіленні, собачим респіраторним патогеном є Bordetella bronchiseptica. У іншому втіленні, собачий респіраторний патоген додатково містить принаймні один, два, три або чотири з наступного: вірус собачого парагрипу (CPIV), собачий аденовірус -2 (CAV-2), респіраторний коронавірус собак (CRCoV) та вірус собачого грипу (CIV). Інше втілення заявленого винаходу передбачає спосіб або застосування імуногенної композиції будь-якого з вищезгаданих втілень для лікування або запобігання інфекційної респіраторної хвороби собак (CIRDC), де композиція лікує або запобігає інфекції багатьох собачих респіраторних патогенів. Інше втілення передбачає застосування або спосіб парентерального введення імуногенетичної композиції, як тут описано. Інше втілення передбачає виробництво лікарського засобу, що містить імуногенну композицію для лікування або запобігання інфекції, викликаної у собаки собачим респіраторним патогеном. Ці та інші втілення, риси та переваги винаходу стануть очевидними з наведеного нижче детального опису відкриття та доданої Формули Винаходу. Зрозуміло, що кожне з зазначених вище втілень та наступні варіанти втілення можуть бути об'єднані в одному втіленні. У даній заявці застосовані нижченаведені визначення, що замінюють будь-які суперечливі визначення у складі кожної окремої роботи, включеної сюди шляхом посилання. Невизначені слова мають значення, що зазвичай застосовують фахівці у цій галузі. Крім того, якщо іншого не передбачено в контексті, то терміни, застосовані у однині також повинні охоплювати множину та навпаки. Вираз “біля” або “приблизно при застосуванні у зв'язку з вимірною числовою змінною має відношення до зазначеного значення змінної та до всіх значень змінних, що знаходяться в межах експериментальної похибки вказаного значення (наприклад, у межах 95% довірчого інтервалу для середнього значення) або у межах 10 відсотків вказаного значення, в залежності від того, що більше. Якщо вираз “біля” застосовують по відношенню до інтервалів часу у тижнях, то “біля 3 тижнів” охоплює 17-25 днів та “біля 2-4 тижнів” охоплює 10-40 днів. 2 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 “Ад’ювант”, як тут застосовано, має відношення до будь-якої речовини, яка може бути неспецифічним стимулятором імунної відповіді. Додатковий опис ад’ювантів див. нижче. Термін “тварина”, як тут застосовано, охоплює будь-яку тварину, сприйнятливу до інфекції, викликаної Bordetella bronchiseptica та/або інфекційного респіраторного захворювання собак, в тому числі приручених та диких ссавців. Переважно, застосований тут термін має відношення до собаки або людини. “Антитіло”, як тут застосовано, є будь-яким поліпептидом, що містить сайт зв’язування антигену незалежно від джерела походження, способу отримання або інших характеристик. Цей термін має відношення до імуноглобулінової молекули або її фрагменту, що специфічно зв’язується з антигеном в результаті імунної відповіді на цей антиген. Імуноглобуліни є сироватковими білками, що складаються з “легкого” та “важкого” поліпептидних ланцюгів, що мають “сталі” та “змінні” ділянки та діляться на класи (наприклад, IgA, IgD, IgE, IgG, та IgM) в залежності від складу сталих ділянок. Під антитілом, яке є “специфічним” для вказаного антигену мається на увазі, що змінні ділянки антитіла впізнають та зв’язують виключно специфічний антиген. Цей термін охоплює, але без обмеження: поліклональні антитіла, моноклональні антитіла, моноспецифічні та поліспецифічні антитіла, гуманізовані антитіла, тетрамерні та тетравалентні антитіла, мультиспецифічні антитіла, одноланцюгові антитіла, домен-специфічні антитіла, однодоменні антитіла, антитіла з видаленим доменом, злиті (гібридні) білки, злиті білки ScFc, одноланцюгові антитіла, химерні антитіла, синтетичні антитіла, рекомбінантні антитіла, гібридні, мутовані та CDR-щеплені антитіла. Антитіла можуть бути інтактними імуноглобулінами, що походять з природних або з рекомбінантних джерел або можуть являти собою імунореактивні частки інтактних імуноглобулінів. “Антитіло” може бути перетворено на антиген-зв’язуючий білок, що охоплює, але без обмеження, фрагменти антитіла, які, в свою чергу, охоплюють, але без обмеження: фрагменти Fab, F(ab')2, Fab', Fv, одноланцюговий фрагмент Fv (ScFv), фрагмент Fd , фрагмент dAb, діатіла, пептид CDR3, обмежений пептид FR3-CDR3-FR4, нанотіла, бівалентні нанотіла, імунофармацевтичні засоби на основі модульного білка малого розміру (SMIP), мінітіла та будь – які з вищезазначених фрагментів та їх отримані хімічним або генетичним чином модифіковані копії, а також інші фрагменти антитіл, що зберігають антиген-зв’язувальну функцію. Звичайно, подібні фрагменти будуть містити антиген-зв’язуючий домен. Як буде зрозуміло фахівцям, будь-яка з таких молекул може бути створена штучним шляхом (наприклад, за допомогою ембріональних клітинних ліній) з метою зниження імуногенності, підвищення спорідненості, змінення специфічності або з іншою метою. “Антиген” або “імуноген”, як тут застосовано, має відношення до молекули, що містить один або декілька епітопів (лінійних, конформаційних або лінійних та конформаційних), що при дії на суб’єкт будуть викликати специфічну для цього антигену імунну відповідь. Епітоп є специфічною ділянкою антигену, що зв’язується з Т- клітинним рецептором або зі специфічним антитілом та звичайно містить біля 3-20 амінокислотних залишків. Термін “антиген” має відношення до субодиничних антигенів - антигенів, які є самостійними та відокремленими від цілого організму, з яким вони є природно пов’язаними, а також до вбитих, ослаблених або інактивованих бактерій, вірусів, грибів, паразитів або інших мікробів. Термін “антиген” також має відношення до антитіл, як-то до анті-ідіотипічних антитіл або їх фрагментів та до синтетичних пептидних мімотопів, що можуть імітувати антиген або антигенну детермінанту (епітоп). Також термін “антиген” має відношення до олігонуклеотиду або полінуклеотиду, що експресує антиген або антигенну детермінанту in vivo, як-то у застосуваннях ДНК-імунізації. “Антигенність”, як тут застосовано, має відношення до здатності білка або поліпептиду бути імуноспецифічно зв’язаним антитілом, що виникає проти вказаного білка або поліпептиду. Термін “Bordetella bronchiseptica” або “B. bronchiseptica” має відношення до: живої послабленої бактерії Bordetella bronchiseptica, екстракту вбитих цілих клітин (бактерину) Bordetella bronchiseptica або до клітинного бактеріального екстракту Bordetella bronchiseptica. Під “буфером” мається на увазі хімічна система, що запобігає зміненню у концентрації іншої хімічної речовини. У якості буферів діють протонні донорні та акцепторні системи, що запобігають виникненню помітних змін концентрації іонів водню (pH). Іншим прикладом буфера є розчин, що містить суміш слабкої кислоти та його солі (сполучену основу) або слабку основу та її сіль (сполучену кислоту). “Собака”, як тут застосовано, охоплює тварин, яких звичайно називають собаками та інших членів родини Canidae. Термін “клітинна лінія” або “клітина - хазяїн”, як тут застосовано, має відношення до прокаріотичних або еукаріотичних клітин, прийнятних для реплікації або до зберігання вірусу. Термін “культура”, як тут застосовано, означає популяцію клітин або мікроорганізмів, що 3 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зростають при відсутності інших видів або типів. “Доза” має відношення до вакцини або імуногенної композиції, яку отримує суб’єкт. “Перша доза” або “підсилена початкова доза” має відношення до дози такої композиції, яку отримує суб’єкт у нульову добу. “Друга доза” або “третя доза” або “щорічна доза” має відношення до кількості такої композиції, яку вводять після першої дози, що може бути, але не обов'язково є такою ж саме вакциною або іммуногенною композицією, як і перша доза. “Епітоп” є специфічною ділянкою антигену, що зв’язується з Т-клітинним рецептором або зі специфічним антитілом та звичайно складається з приблизно 3-20 амінокислотних залишків. “Наповнювач”, як тут застосовано, має відношення до нереактивного компонента-носія вакцини або імуногенної композиції, який не є антигеном. Бажаними наповнювачами є відомі у цій галузі наповнювачі для застосування у складі парентеральної ін’єкції. “Фрагмент” має відношення до усіченої частини білка або гена. “Функціональний фрагмент” та “біологічно активний фрагмент” має відношення до фрагменту, що зберігає біологічні властивості повнорозмірного білка або гена. “Тотожність” або “відсоток тотожності” має відношення до відсотка нуклеотидів або амінокислотних залишків кандидатної послідовності, які є ідентичними або подібними до залишків послідовності (послідовностей), яку порівнюють після вирівнювання послідовностей та введення, якщо це потрібно, пробілів для досягнення максимальної відсоткової тотожності послідовності, враховуючи будь-які консервативні заміщення як частину тотожності послідовності. “Гомологи” або “гомологи видів” містять гени, знайдені у двох або більше різних видів, що мають суттєву полінуклеотидну тотожність послідовності та однакові або подібні біологічні функції та/або властивості. Переважним чином, полінуклеотидні послідовності, що представлені видовими гомологами будуть гібридизуватися у помірно жорстких умовах, як описано тут у прикладі та мають однакові або подібні біологічні функції та/або властивості. У іншому аспекті, полінуклеотиди являють собою види гомологів, що мають більш, ніж біля 60% тотожності послідовності, більш, ніж біля 70% тотожності послідовності, більш, ніж біля 80% тотожності послідовності, більш, ніж біля 90% тотожності послідовності, більш, ніж біля 95% тотожності послідовності, більш, ніж біля 96% тотожності послідовності, більш, ніж біля 97% тотожності послідовності, більш, ніж біля 98% тотожності послідовності або більш, ніж біля 99% тотожності послідовності. “Ідентичність” або “відсоток ідентичності” має відношення до відсотка нуклеотидів або амінокислот у кандидатній послідовності, які є ідентичними залишкам у порівняльній послідовності після вирівнювання обох послідовностей та введення , якщо це потрібно, пробілів для досягнення максимальної відсоткової тотожності послідовності, враховуючи будь-які консервативні заміщення як частину тотожності послідовності. “Імунна відповідь” у суб’єкта, як тут застосовано, має відношення до розвитку гуморальної імунної відповіді, клітинної імунної відповіді або гуморальної та клітинної імунної відповіді на антиген. “Гуморальна імунна відповідь” має відношення до такої відповіді, що принаймні частково опосередкована антитілом. “Клітинна імунна відповідь” є відповіддю, опосередкованою T-лімфоцитами або іншими білими клітинами крові або цими клітинами разом та полягає у продукуванні цитокінів, хемокінів та подібних молекул активованими T-клітинами, білими клітинами крові або усіма цими клітинами разом. Імунні відповіді можна визначити з застосуванням відомих у цій галузі стандартних способів імуноаналізу та аналізу нейтралізації. “Імуногенність”, як тут застосовано, має відношення до здатності білка або поліпептиду викликати імунну відповідь, специфічно спрямовану проти антигену. “Імуногенна композиція” є препаратом, що містить імуноген, в тому числі, наприклад, білок, пептид, цілі клітини, інактивований, субодиничний або ослаблений вірус або полісахарид або їх комбінацію, який вводять для стимулювання гуморальних та клітинних імунних систем реципієнта до одного або декількох наявних у імуногенній композиції антигенів. “Імунізація” є процесом введення імуногенної композиції та стимулювання у хазяїна імунної або імуногенної відповіді на антиген. Бажаними хазяями є ссавці, як-то собаки. Переважним чином, імуногенна композиція є вакциною. “Імунологічно захисна кількість”, як тут застосовано, є кількістю антигену, що буде ефективною для викликання імуногенної відповіді у реципієнта, яка є адекватною для запобігання або полегшення ознак або симптомів захворювання, в тому числі несприятливих наслідків для здоров'я або їх ускладнень. Викликаними можуть бути або гуморальний або клітинно-опосередкований імунітет або обидва типи імунітету. Імуногенна відповідь тварини на композицію може бути обчислена, наприклад, небезпосереднім чином шляхом вимірювання титрів антитіл, застосуванням аналізів проліферації лімфоцитів або безпосередньо шляхом 4 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 моніторингу ознак та симптомів після інфікування штамом дикого типу. Захисний імунітет, наданий композицією або вакциною може бути обчислений шляхом вимірювання, наприклад, вимірюванням скорочення виділення реципієнтом організмів інфікування, спостеріганням зменшення клінічних ознак як-то смертності, захворюваності, температури та шляхом перевірки загального фізичного стану, здоров'я та продуктивності суб’єкта. Імунна відповідь також може охоплювати, без обмеження, викликання клітинного та/або гуморального імунітету. Терапевтично ефективна кількість композиції або вакцини може змінюватися у залежності від певного застосованого організму або стану тварини, що підлягає лікуванню або вакцинації та може бути визначена ветеринаром. “Інтраназальне” введення, як тут застосовано, має відношення до введення речовини, як-то вакцини або іншій композиції у тіло суб’єкта через ніс та полягає у транспортуванні речовини переважно крізь слизову оболонку носа. Термін “виділений” має відношення до речовини що або існує у істотно чистій формі, наприклад, має більш, ніж біля 95% чистоти; або є очищеною або деяким чином збагаченою зі стану свого природного середовища. Під “виділеним пертактином” мається на увазі те, що білок пертактину є вилученим зі свого природного середовища, як-то з організму тваринихазяїна/собаки у середовище для зростання або є очищеним з препарату цілих клітин Bordetella bronchiseptica та потім він може бути доданий назад до композиції, що містить екстракт Bordetella bronchiseptica (тобто бути збагаченим пертактиновими ізолятами). Термін “виділений” охоплює імуногени, що знаходяться у розчині з іншими агентами/розчинниками/наповнювачами/ад’ювантами/білками. “Лікарський засіб” має відношення до будь-якого агенту, корисного для запобігання, лікування або покращення медичного стану або для запобігання певного фізіологічного стану або явища. “Моноклональне антитіло”, як тут застосовано, має відношення до антитіл, отриманих від одиничної лінії клітин гібридоми, всі з яких спрямовані до одного епітопу певного антигену. Антиген, що взаємодіє з моноклональним антитілом може бути наданий у вигляді виділеного білка патогену або цілого патогену. “Гібридома” є клональною клітинною лінією, що складається з гібридних клітин, отриманих шляхом злиття клітин міеломи та специфічних клітин, що виробляють антитіла. Головним чином, моноклональні антитіла є мишачого походження, однак вони також мають відношення до клональних популяцій антитіл, отриманих до певного епітопу у складі антигену за допомогою фаг-дисплейної технології або еквівалентного способу або отриманих до гібридів клітин не-мишачого походження. “Оральне” або “пероральне” введення, як тут застосовано, має відношення до введення речовини, як-то вакцини або іншої композиції у тіло суб’єкта через рот та полягає у ковтанні або у транспортуванні речовини через слизову оболонку порожнини рота (наприклад, шляхом сублінгвального або букального (щічного) всмоктування) або у застосуванні обох цих шляхів. Внутрішньотрахеальне введення також вважається оральним або пероральним введенням. “Ороназальне” введення, як тут застосовано, має відношення до введення речовини, як-то композиції або вакцини у тіло суб’єкта через рот та ніс, як це відбувається, наприклад, шляхом введення у ніс однієї або декількох крапель. Ороназальне введення охоплює транспортні процеси, пов’язані з оральним та інтраназальним введенням. “Парентеральне введення”, як тут застосовано, має відношення до введення речовини, якто композиції або вакцини у тіло суб’єкта шляхом, що виключає застосування травного тракту. Парентеральне введення охоплює підшкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоартеріальне та внутрішньовенне введення. Для цілей даного опису, парентеральне введення виключає шляхи введення, що перш за все охоплюють транспортування речовини через слизову оболонку у порожнини рота, носа, трахеї та легені. Термін “патоген” або “патогенний мікроорганізм”, як тут застосовано, має відношення до мікроорганізму, наприклад, вірусу CPIV, CAV-2, CRCoV, CIV, мікоплазми Mycoplasma cynos або бактерії Bordetella bronchiseptica, що здатен викликати або спонукати виникнення захворювання, слабкість або ненормальний стан своїх тварин-хазяїв, переважно дихальне захворювання, як-то CIRDC. “Пертактин”, як тут застосовано, є білком зовнішньої мембрани Bordetella. Переважним чином, пертактин походить з B. bronchiseptica та ще переважніше він є білком “p68” та кодується геном prnA. Пертактин може бути виділеним з Bordetella bronchiseptica у нативній формі або його можна отримати рекомбінантним шляхом. Послідовності та приклади пертактину надані у патенті США U.S. Patent No. 7,736,658, зміст якого включений сюди шляхом посилання. Застосований тут пертактиновий антиген охоплює ліпідовані форми білка. “Фармацевтично прийнятний” має відношення до речовин, які, в рамках медичної точки зору, 5 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 є прийнятними для застосування в контакті з тканинами пацієнтів без пов'язаних з цими речовинами надмірної токсичності, подразнення, алергічної реакції тощо, а також є прийнятними з точки зору розумного ставлення користі до ризику та ефективними для їх призначеного застосування. “Поліклональне антитіло”, як тут застосовано, має відношення до змішаної популяції антитіл, отриманої проти окремого патогену або антигену. Головним чином, популяція містить багато груп антитіл, де кожна група є спрямованою до окремого епітопу патогену або антигену. Для отримання поліклональних антитіл, цілий патоген або виділений антиген вводять хазяїну шляхом щеплення (інокуляції) або інфікуванням, що спонукає хазяїна виробляти антитіла проти цього патогену або антигену. Термін “полінуклеотид”, як тут застосовано, має відношення до органічної полімерної молекули, що складається з ковалентно пов'язаних в ланцюг нуклеотидних мономерів. ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота) та РНК (рибонуклеїнова кислота) є прикладами полінуклеотидів з різною біологічною функцією. Термін “поліпептид”, як тут застосовано, має відношення до органічної полімерної молекули, що складається з двох або більше амінокислот, пов'язаних в ланцюг. “Запобігання інфекції”, як тут застосовано, означає запобігання або інгібування реплікації збудника (бактерії або вірусу), що викликає визначене захворювання для інгібування переносу бактерії або вірусу, запобігання укорінення бактерії або вірусу у тілі хазяїна або для зменшення симптомів захворювання, викликаного інфекцією. Лікування вважається терапевтичним, якщо є зниження бактеріального або вірусного навантаження. “Захист”, “захисний”, “захисний імунітет” тощо, як тут застосовано, має відношення до вакцини або іншої композиції та означає, що ця вакцина або композиція запобігає виникненню або зменшує симптоми захворювання, викликані організмом, антиген (антигени) якого були застосовані у отриманій вакцині або композиції. Терміни “захист” та “захисний” тощо також означають, що вакцина або композиція може бути застосована для “лікування” захворювання або одного або більше симптомів захворювання, що вже існує у суб’єкті. “Респіраторне” введення, як тут застосовано, має відношення до введення речовини, як-то композиції або вакцини у тіло суб’єкта шляхом інгаляції розпиленої (атомізованої) речовини. При такому введенні, основний механізм транспорту полягає у поглинанні розпиленої речовини через слизову оболонку трахей, бронхів та легень, отже відрізняється від інтраназального або перорального введення . Терміни “специфічне зв’язування”, “специфічно зв’язується” тощо стосуються визначення двох або більше молекул, що утворюють комплекс, який піддається вимірюванню у фізіологічних або аналітичних умовах та є селективним. Вважають, що антитіло або інший інгібітор “специфічно зв’язується” з білком, якщо, при відповідно підібраних умовах таке зв’язування істотно не пригнічується, тоді як в той же час має місце інгібування неспецифічного зв'язування. Специфічне зв’язування відрізняється високою спорідненістю та є селективним для сполуки або білка. Неспецифічне зв’язування завжди має низьку спорідненість. Зв’язування -7 антитіл IgG, наприклад, звичайно характеризується спорідненістю принаймні біля 10 M або -8 -9 вище, як-то принаймні біля 10 M або вище, або принаймні біля 10 M або вище або принаймні -10 -11 -12 біля 10 або вище або принаймні біля 10 M або вище, або принаймні біля 10 M або вище. Цей термін також можна застосувати, наприклад, коли антиген-зв'язуючий домен є специфічним для певного епітопу, що не переноситься у складі численних антигенів. У такому разі, антитіло, що несе антиген-зв’язувальний домен звичайно не буде зв’язувати інші антигени. “Специфічний імуногенний фрагмент”, як тут застосовано, має відношення до частини послідовності, що розпізнається антитілом або специфічними для цієї послідовності Tклітинами. “Суб’єкт”, як тут застосовано, має відношення до будь-якої тварини, що має імунну систему, що охоплює ссавців, як-то собак. “Істотно ідентичний”, як тут застосовано, має відношення до ступеня ідентичності послідовності, що дорівнює принаймні біля 90%, принаймні біля 95%, принаймні біля 96%, принаймні біля 97%, принаймні біля 98% або принаймні біля 99%. “Субодинична вакцина” та “субодинична композиція”, як тут застосовано, має відношення до типу вакцини або композиції, що охоплює один або декілька антигенів, але не обов’язково всі антигени у вакцині або композиції, що походять від антигенів інтересуючого патогену, як-то вірус, бактерія, паразит або гриб або гомологічні цим антигенам. Така композиція або вакцина є істотно вільною від інтактних клітин патогену або патогенних частин чи лізатів таких клітин або частин. Отже, субодинична вакцина або субодинична композиція може бути отримана з принаймні частково очищених або істотно очищених від патогену імуногенних поліпептидів або 6 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 їх аналогів. Способи отримання антигену або антигенів у субодиничній вакцині або субодиничній композиції полягають у застосуванні стандартних технологій очищення та виробництва продукту рекомбінантним шляхом або шляхом хімічного синтезу. Отже. “субодинична вакцина” або “субодинична композиція” має відношення до вакцини або композиції, що складається з визначеного антигенного компонента або компонентів вірусу, бактерії або іншого імуногену. Переважно, субодиничний компонент заявленого винаходу отриманий рекомбінантним чином та більш переважно він є пертактином (p68). “TCID50” (ЦПД 50) має відношення до “інвективної дози для культури тканин” та визначається, як розведення вірусу, потрібне для інфікування 50% вибраної партії інокульованих клітинних культур. Для обчислення TCID 50 можуть бути застосовані різні способи, в тому числі спосіб Спірмена-Карбера, застосований у даному описі. Опис цього способу див. у B.W. Mahy & H.O. Kangro, Virology Methods Manual 25-46 (1996). "Терапевтичний агент", як тут застосовано, має відношення до будь-якої молекули, сполуки, вірусу або лікарського засобу, переважно до ослабленого або вбитого вірусу або субодиниці або сполуки, що допомагає у лікуванні вірусної, бактеріальної, паразитарної або грибкової інфекції, захворювання або викликаного цим стану. “Терапевтично ефективна кількість”, як тут застосовано, має відношення до кількості антигену або вакцини або композиції, що буде викликати імунну відповідь у суб’єкта (де суб’єктом є, наприклад, собака), що отримав антиген або вакцину або композицію, яка буде адекватною для запобігання або послаблення ознак або симптомів захворювання, в тому числі негативних дій на здоров'я або їх ускладнень, викликання інфекції з патогеном, як-то вірус, бактерія, паразит або грибок. Викликаний імунітет може бути гуморальним або клітиннноопосередкованим або разом гуморальним та клітинно-опосередкованим. Імуногенна відповідь тварини на композицію може бути обчислена, наприклад, небезпосереднім чином шляхом вимірювання титрів антитіл, аналізом проліферації лімфоцитів або безпосередньо шляхом моніторингу ознак та симптомів після інфікування штамом дикого типу. Захисний імунітет, наданий композицією або вакциною можна обчислити шляхом вимірювання, наприклад, вимірюванням зменшення розповсюдження інфікування організмів, зменшення клінічних ознак як-то смертності, захворюваності, температури та шляхом перевірки загального фізичного стану, здоров'я та продуктивності суб’єкта. Терапевтично ефективна кількість вакцини або композиції може змінюватися в залежності від окремого застосованого імуногену або стану суб’єкта та може бути визначена фахівцем у цей галузі. “Лікувати” або “лікування”, як тут застосовано, має відношення до реверсії, полегшення, пригнічення розвитку або попередження розладу, стану або захворювання, до якого цей термін застосовано або до запобігання виникнення одного або декількох симптомів такого розладу, стану або захворювання. “Лікування”, як тут застосовано, має відношення до акту “лікування”, як безпосередньо визначено вище. “Вакцина” або “вакцинна композиція,” як тут застосовано, має відношення до імуногенної композиції, вибраної з вірусу або бактерії, яка є або живою модифікованою, ослабленою або вбитою або до субодиничної вакцини, або до будь-якої комбінації вищезазначеного. Введення вакцини суб’єкту веде до появи імунної відповіді. Вакцину можна ввести безпосередньо суб’єкту за допомогою будь-якого відомого шляху введення, в тому числі парентерально, перорально тощо. Під цим терміном слід розуміти композицію, що запобігає або зменшує інфекцію або що запобігає або зменшує одну чи більше її ознак або симптомів. Звичайно захисних дій вакцинної композиції проти патогену досягають шляхом викликання у суб’єкті імунної відповіді. Взагалі кажучи, зникнення або зниження випадків зараження, полегшення ознак або симптомів або прискорене усунення мікроорганізму з інфікованого суб'єкту свідчить про наявність захисних дій композиції вакцини. Вакцинні композиції заявленого винаходу забезпечують захисний ефект проти інфекцій, викликаних патогенами респіраторного захворювання собак. “Ветеринарно прийнятний”, як тут застосовано, має відношення до речовин, які, в рамках медичної точки зору, є прийнятними для застосування в контакті з тканинами суб’єктів ветеринарії без пов'язаних з цими речовинами надмірної токсичності, подразнення, алергічної реакції тощо, а також є прийнятними з точки зору розумного ставлення користі до ризику та ефективними для їх призначеного застосування. “Ветеринарно прийнятний носій”, як тут застосовано, має відношення до транспортного середовища, що не впливає на ефективність біологічної активності активного інгредієнта та не є токсичним для ветеринарного суб'єкта, якому його вводять. Основою заявленого винаходу є неочікуване відкриття того, що включення виділеного пертактинового антигену у композицію з препаратом Bordetella bronchiseptica веде до істотно 7 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 покращеної ефективності та безпеки, тобто при парентеральному введенні собакам перед бактеріальним інфікуванням ця композиція запобігає початку захворювання на трахеобронхіт та не веде до шкідливих побічних проявів. Заявлений винахід також передбачає імуногенні композиції та вакцини, що містять один або декілька вірусів та бактерій або субодиниць, прийнятних для введення собакам для лікування CIRDC. Описаний тут респіраторний коронавірус собак (CRCoV) можна охарактеризувати, як коронавірус, присутній у дихальних шляхах собаки з інфекційним респіраторним захворюванням. Філогенетично CRCoV є найбільш близько спорідненим до коронавірусу корів (BCoV), штаму OC43 коронавірусу людини (HCoV) та вірусу гемаглютинуючого енцефаломієліту (HEV). Кишковий собачий коронавірус (CCoV) має лише віддалену спорідненість з CRCoV. Характерним прикладом прийнятного для застосування у заявленому винаході вірусу CRCoV є його штам, визначений, як штам 4182 CRCoV (Erles et al., Virus Res., 124:78-87, 2007). Антигени вірусу грипу, що охоплюються цим винаходом можуть належати до будь-якого визначеного штаму вірусу грипу будь-яких птахів або ссавців, в тому числі, але без обмеження, до вірусу грипу, що має підтип гемаглютинину H3 та підтип нейрамінідази N8 або підтип H3N8, частіше позначений, як вірус H3N8. Грип може бути пташиним захворюванням або бути грипом ссавців, в тому числі, але без обмеження, свинячим, кінським або собачим. У одному втіленні застосовано антиген собачого грипу, у одному втіленні застосовано антиген кінського грипу. У одному втіленні застосовано штам, що має підтипні глікобілки, позначені, як H3 або N8. У одному втіленні застосовано штам, що має обидва підтипних глікобілка H3 та N8. Антигени грипу, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути отримані від собак, коней, свиней, а також від свійських та диких птахів. Тварини, вибрані для відбору зразків повинні проявляти гострі та / або підгострі клінічні синдроми, включаючи важкі респіраторні симптоми та лихоманку. Тварини також можуть проявляти ознаки анорексії та летаргії. Способи виділення вірусу добре відомі фахівцям у цей галузі та охоплюють, серед іншого: інокуляцію клітинних культур клітин ссавців та птахів, інокуляцію (щеплення) ембріонів зразками назального чи глоткового слизу, отриманими з клінічних препаратів, відбір мазків з носових ходів або горла або відбір тканевих зразків, як-то селезінки, легенів, мигдалин, печінки та рідини промивання (лаважу) легенів. Цитопатичну дію вірусу можна спостерігати у культурі клітин. Алантоїсну рідину або клітинні лізати також можна перевірити на їх здатність до аглютинації еритроцитів людини, курки, індика чи морської свинки, яка є можливим свідоцтвом наявності вірусу грипу. Характерним прикладом штаму вірусу грипу, прийнятного для застосування у заявленому винаході є штам, визначений, як A/canine/Iowa/9A1/B5/08/D12, що зберігається, як PTA-7694 у Американській колекції типових культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 з 29 червня 2006р відповідно до Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Характерним штамом CIV антигену є штам вірусу CIV промислової вакцини Vanguard® CIV (Pfizer, Inc). Цей винахід також охоплює вакцини, що містять штам, визначений, як штам кінського вірусу грипу A/Equine/2/Miami/1/63. Цей штам також зберігається у ATCC під інвентарним номером VR 317 відповідно до Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури . Додаткові приклади вірусів грипу для застосування у заявленому винаході охоплюють A/canine/Iowa/13628/2005, A/Equine/Kentucky/1998, A/Equine/Kentucky/15/ 2002, A/Equine/Ohio/1/2003, A/Equine/Kentucky/1/1994, A/Equine/Massachusetts/213/2003, A/Equine/Wisconsin/2003, A/Equine/NewYork/1999 та A/Equine/Newmarket/A2/1993. Інші бажані штами та/або ізоляти вірусу CIV охоплюють описані у патенті США U.S. Patent Nos. 7,959,929 (особливо штами та гемаглютинінові послідовності, що були визначені, як Jacksonville/2005, Miami/2005, FL/242/03 та Florida/43/04), 7,384,642, 7,572,620 та 7,468,187, склад яких, у тому числі всіх послідовностей, особливо гемаглютинінових послідовностей та штамів включений сюди в якості посилання таким чином, начебто б вони були викладені тут повністю. Додатково, прийнятним для застосування у заявленому винаході штамом CIV є ізолят Colorado CIV, описаний у Barrell et al., J. Vet. Intern. Med., 24 (6), 1524-1527 (2010), що має інвентарний номер ADW41784. Вірус парагрипу собак (CPIV), що має відношення до заявленого винаходу можна охарактеризувати як один з вірусів, що є, як відомо, збудником, пов'язаним з вольєрним кашлем. Характерним штамом антигену CPIV є штам ослабленого вірусу CPI у промисловій вакцині Vanguard® Plus 5 (Pfizer). Іншим характерним штамом антигену CPIV є штам ослабленого вірусу CPI, що має назву “NL-CPI-5” (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA). 8 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Собачий аденовірус другого типу (CAV-2), що має відношення до заявленого винаходу можна охарактеризувати як один з вірусів, що є, як відомо, збудником, пов'язаним з вольєрним кашлем. Характерним штамом антигену CAV-2 є штам ослабленого вірусу CAV-2 у промисловій вакцині Vanguard® Plus 5 (Pfizer). Характерним штамом антигену CAV-2 є також штам ослабленого вірусу CAV-2, відомий, як штам “Манхеттен” (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA). Mycoplasma cynos (M. cynos), що має відношення до заявленого винаходу, описана у Chalker et al., Microbiology, 150:3491-3497, 2004 та є єдиним видом мікоплазми, який звичайно пов’язують з респіраторним захворюванням. Імуногенні композиції проти M. cynos описано у патенті США US 2007/0098739, який є включеним сюди шляхом посилання. Компонент Bordetella bronchiseptica, що має відношення до заявленого винаходу можна охарактеризувати у якості бактеріального агента-збудника, пов'язаного з вольєрним кашлем. Імуногенні композиції та вакцини, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути одним або декількома з наступного: живими ослабленими Bordetella bronchiseptica, бактерином Bordetella bronchiseptica або бактеріальним екстрактом. Крім того, композиція також переважно включає виділений субодиничний антиген Bordetella bronchiseptica. У одному втіленні, Bordetella bronchiseptica отримують у вигляді гомогенату, отриманого з цілих клітин під дією ультразвуку та очищеного шляхом колоночної хроматографії, як передбачено у заявці Patent Application No. FR2571618, що була подана 12 жовтня 1984 р. Іншим характерним прикладом Bordetella bronchiseptica є бактеріальний екстракт Bronchicine™ CAe (Pfizer), отриманий з антигенного матеріалу, екстрагованого з клітин Bordetella bronchiseptica. Іншим прикладом Bordetella bronchiseptica є штам B-C2 живих ослаблених бактерій Bordetella bronchiseptica, присутній у вакцині Nobivac® та/або штам живих ослаблених TM бактерій Bordetella bronchiseptica з вакцин Intra-Trac®, Bronchi-Shield®, Naramune , TM Recombitek®, Univac, та/або Kennel-Jec . Крім того, у комбінації з компонентом Bordetella bronchiseptica переважно також представлена (тобто доповнює його) субодиниця, характерним прикладом якої є виділений пертактиновий антиген, переважно антиген p68 Bordetella bronchiseptica, особливо рекомбінантний антиген p68 Bordetella bronchiseptica, що впізнається p68-специфічним моноклональним антитілом Bord 2-7 (що описано у патенті США US 7,736,658, який включений сюди шляхом посилання) та, у одному бажаному втіленні, має амінокислотну послідовність, яка наведена у патенті США US 7,736,658 або має тотожність до неї. Пертактиновий антиген рекомбінантного білка p68 переважно отримують у розчинній формі зі збереженням та відновленням протягом процесингу його структури, подібної до нативної. Відповідно, одним аспектом винаходу передбачено рекомбінантний білок p68, який є істотно вільним (вільним менш, ніж на біля 80%, 90%, 95% або навіть 99%) від агрегатів. У іншому втіленні, рекомбінантний білок p68 розчинюють у переважно біля 0.1 M, 0.5 M, 1 M, 2 M, 3 M, або 6 M розчині сечовини. Після цього, антиген p68 може бути очищений, наприклад, шляхом колоночної хроматографії. Один такий процес солюбілізації описано у Surinder et al., J. Bioscience and Bioengineering, v. 99(4), pgs 303-310 (2005). Застосовані тут пертактинові антигени також охоплюють ліпідовані форми. Приклади отримання ліпідованих білків наведені у науковій статті від Erdile et al., Infection and Immunity, (1993) v.61(1), p. 81-90, що включена сюди шляхом посилання. Описані тут способи можуть бути застосовані для отримання посттрансляційно модифікованих пертактинових білків, які містять приєднану ліпідну функціональну групу. Крім того, у іншому втіленні, імуногенна композиція містить Bordetella bronchiseptica та виділений антиген Bsp22. У іншому втіленні, імуногенна композиція містить Bordetella bronchiseptica, виділений пертактиновий антиген та виділений антиген Bsp22. Антиген Bsp22 можна отримати, як наведено у Medhekar et al., Molecular Microbiology (2009) 71(2), 492-504. Переважним чином, виділений антиген Bsp22 є присутнім разом з (тобто на додачу до) екстрактом Bordetella bronchiseptica та виділеним пертактиновим антигеном, специфічно зміненим рекомбінантним білком p68. “Bsp22” також охоплює ліпідовані форми антигену. Приклади отримання ліпідованих білків наведені у Erdile et al., Infection and Immunity, (1993) v.61(1), p. 81-90, включеній сюди шляхом посилання. Описані тут способи можна застосувати для отримання посттрансляційно модифікованих білків Bsp22, що містять приєднану ліпідну функціональну групу. Віруси, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути розмножені у клітинах, клітинних лініях та у клітинах-хазяях. Вказані клітини, клітинні лінії або клітини-хазяї можуть бути наприклад, але без обмеження, клітинами ссавців та іншими клітинами, в тому числі клітинами комах та рослин. Клітини, клітинні лінії та клітини-хазяї, у яких можна розмножувати 9 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 віруси, що охоплюються заявленим винаходом є добре відомі та доступні фахівцям у цій галузі. Бактерії, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути культивовані та розмножені з застосуванням різних відомих пересічним фахівцям культуральних середовищ, в тому числі, середовищ для культивування у вигляді бульйону (рідке) та на основі агару (тверде; напівтверде). Деякі бактерії також можуть бути культивовані та розмножені у клітинах ссавців або у інших клітинах. Віруси та бактерії, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути ослаблені або інактивовані перед застосуванням у імуногенній композиції або вакцині. Способи ослаблення та інактивації добре відомі фахівцям у цей галузі. Способи ослаблення охоплюють, але без обмеження, серійний пасаж у клітинній культурі відповідної клітинної лінії (віруси та деякі бактерії), серійний пасаж у бульйонній культурі (бактерії), ультрафіолетове опромінення (віруси та бактерії) та хімічний мутагенез (віруси та бактерії). Способи вірусної або бактеріальної інактивації охоплюють, але без обмеження, обробку формаліном, бетапропіолактоном (BPL), бінарним етиленіміном (BEI) або інші відомі фахівцям способи. Інактивацію формаліном можна здійснити шляхом змішування суспензії, що містить мікроорганізм з 37% формальдегідом до кінцевої 0.5% концентрації формальдегіду. Суміш мікроорганізм-формальдегід перемішують шляхом постійного збовтування протягом приблизно 24 год. при кімнатній температурі, після чого інактивовану суміш мікроорганізму перевіряють на залишкові живі організми шляхом аналізу зростання у прийнятній клітинній лінії або у бульйонному середовищі. Для деяких антигенів, інактивацію за допомогою BEI можна здійснити шляхом перемішування суспензії, що містить мікроорганізм заявленого винаходу з 0.1M BEI (2-бромоетиламін у 0.175Н NaOH) до кінцевої 1 мМ концентрації BEI. Для інших антигенів кінцева концентрація BEI дорівнює 2 мM. Прийнятна для застосування концентрація BEI відома фахівцям у цій галузі. Суміш вірусу з BEI суміш перемішують шляхом постійного збовтування протягом приблизно 48 год. при кімнатній температурі, після чого додають 1.0 M тіосульфат натрію до кінцевої концентрації 0.1 мM. Перемішування триває ще додаткові дві години, після чого суміш, що містить інактивований мікроорганізм перевіряють на залишковий живий вірус шляхом аналізу зростання у відповідній клітинній лінії або бульйонному середовищі. Імуногенні композиції та вакцини, що належать до заявленого винаходу можуть містити один або декілька ветеринарно прийнятних носіїв. "Ветеринарно прийнятний носій", як тут застосовано, охоплює будь-які та всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, ад'юванти, стабілізуючі агенти, розріджувачі, консерванти, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, агенти затримки адсорбції тощо. Розчинники можуть охоплювати воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин тощо. Серед інших ізотонічних агентів, відомих фахівцям, до цих речовин також належать хлорид натрію, декстроза, маніт, сорбіт та лактоза. Серед інших стабілізаторів, відомих фахівцям, до цих речовин також належить альбумін. Серед інших консервантів, відомих досвідченим фахівцям, до цих речовин також належить мертіолат. Ад’ювант може перетворюватися в ході обміну речовин, це стосується ад’ювантів, що складаються з компонентів, здатних перетворюватися в ході обміну речовин інтересуючих видів, як-то ад’ювантів на основі рослинних олій. Такий здатний до перетворення під час метаболізму ад’ювант може бути олією, що має подібні властивості. Здатними до перетворення під час метаболізму речовинами є олії та жири, що звичайно зустрічаються у рослинах та тваринах та звичайно складаються головним чином з суміші тригліцеридів, також відомих, як тригліцериди або нейтральні жири. Ці неполярні, нерозчинні у воді речовини є складними триефірами жирних кислот гліцерину. Три-ацил-гліцеріни розрізняються в залежності від їх особливих властивостей та від розташування притаманних їм трьох залишків жирних кислот або бічних ланцюгів. Ад’ювант може також бути нездатним до перетворення під час метаболізму, як-то ад’юванти, що складаються з компонентів, що не перетворюються під час метаболізму організмом тваринного суб’єкту, якому вводять вказану емульсію. Не здатні до метаболізації, але прийнятні для застосування у композиції заявленого винаходу олії охоплюють алкани, алкени, алкіни та їх відповідні кислоти та спирти, їх прості та складні ефіри та суміші. Переважним чином, окремі олійні сполуки є легкими вуглеводневими сполуками, тобто такі компоненти мають 6-30 карбонових атомів. Подібні олії можна отримати синтетично або отримати з нафтопродуктів шляхом очищення. Бажані для застосування у описаних тут композиціях олії, що не перетворюються в ході метаболізму, наприклад, охоплюють мінеральні оливи, рідкий парафін та циклопарафіни. Термін "мінеральна олива" має відношення до нездатної до перетворення під час метаболізму ад’ювантної олії, яка є сумішшю рідких 10 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вуглеводів, отриманих з петролатума (парафіну, що одержують із залишкової сировини) шляхом дистиляції. Цей термін є синонімічним до термінів "зріджений парафін", "рідкий петролатум" та "біла мінеральна олива", а також призначений охоплювати поняття "легка мінеральна олива", тобто олива, яка аналогічним чином була отримана з петролатума шляхом дистиляції, але має трохи меншу густину, ніж біла мінеральна олива. Miнеральну оливу можна отримати з різних комерційних джерел, наприклад, J.T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). Легка мінеральна олива є у продажу під торгівельною маркою DRAKEOL®. Ад’юванти охоплюють, але без обмеження, ад’ювантну систему Emulsigen® (MVP Laboratories; Ralston, NE), ад’ювантну систему RIBI (Ribi Inc.; Hamilton, MT), галун, гель гідроксиду алюмінію, емульсії типу “олія у воді” та “вода у олії”, як-то, наприклад, повний та неповний ад'юванти Фрейнда, блок-сополімер (CytRx; Atlanta, GA), SAF-M (Chiron; Emeryville, ® CA), ад’ювант AMPHIGEN , сапонін, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc.; Cambridge, MA), GPI0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc.; Birmingham, AL) або інші сапонінові фракції, монофосфорил-ліпід A, ліпід-аміновий ад’ювант авридин, термолабільний ентеротоксин з E. coli (рекомбінантний або іншого походження), холерний токсин, мурамілдипептид, блок-сополімер / поверхнево-активну речовину (SP-oil) сквален / плюронік, сульфо-ліпо-бета-циклодекстрин (SLCD), ліпосоми, що містять імуномодулятор (наприклад, CpG або полі I:C), мурамілдипептид (MDP), ад’ювант ІSCOMATRIX® (Quil A / фосфатидилхолін), CpG / DEAE-декстран / мінеральна олива (TXO), CpG, тритерпеноїди (наприклад, Quil А або інший очищений або частково очищений сапоніновий препарат), стероли (наприклад, холестерин), імуномодуляторні агенти (наприклад, диметил діоктадеціл бромід амонію-DDA), полімери (наприклад, поліакрилова кислота, як-то CARBOPOL®) та Th2-стимулятори (наприклад, гліколіпіди, як-то Bay R1005®) та їх комбінації, а також багато інших відомих фахівцям ад’ювантів. Необмежені приклади різних прийнятних для застосування комбінацій охоплюють комбінацію тритерпеноїду зі стеролом (наприклад, Quil A/ холестерин, також відому, як QAC), комбінацію тритерпеноїду зі стеролом, імуномодуляторним агентом та полімером (наприклад, Quil A / холестерин / DDA /CARBOPOL®, також відому, як QCDC) та комбінацію тритерпеноїду зі стеролом, імуномодуляторним агентом, полімером та Th2-стимулятором (наприклад, Quil A / холестерин /DDA / CARBOPOL® та Bay R1005®, також відому, як QCDCR). Кількості та концентрації ад’ювантів та домішок, корисних у контексті заявленого винаходу можуть бути легко визначені досвідченим фахівцем. У одному втіленні, заявлений винахід розглядає імуногенні композиції та вакцини, що містять біля 20-2000 мкг ад’юванту. У іншому втіленні, ад’ювант включено у кількості біля 100-1500 мкг або біля 250-1000 мкг або біля 350-750 мкг. У іншому втіленні, ад’ювант включено у кількості біля 500 мкг / 2 мл дози імуногенної композиції або вакцини. Імуногенні композиції та вакцини також можуть містити антибіотики, що охоплюють, але без обмеження, антибіотики, що належать до аміноглікозидів, карбапенемів, цефалоспоринів, глікопептидів, макролідів, пеніцилінів, поліпептидів, хінолонів, сульфаніламідів та тетрациклінів. У одному втіленні, заявлений винахід розглядає імуногенні композиції та вакцини, що містять біля 1-60 мкг/мл антибіотика. У іншому втіленні, імуногенні композиції та вакцини містять біля 555 мкг/мл антибіотика або біля 10-50 мкг/мл антибіотика або біля 15-45 мкг/мл антибіотика або біля 20-40 мкг/мл антибіотика або біля 25-35 мкг/мл антибіотика. У іншому втіленні, імуногенні композиції та вакцини містять менш, ніж біля 30 мкг/мл антибіотика. Імуногенні композиції та вакцини, що охоплюються заявленим винаходом можуть містити одну або декілька полінуклеотидних молекул, що кодують вірус або бактерію або вірусний або бактеріальний білок. Також у імуногенній композиції або вакцині можуть бути застосовані молекули ДНК або РНК. Молекули ДНК або РНК можуть бути введені у відсутності інших агентів або їх можна ввести разом з агентом, що сприяє клітинному поглинанню (наприклад, з ліпосомами або катіонними ліпідами). Загальна концентрація полінуклеотиду у імуногенній композиції або вакцині буде звичайно знаходитися у межах біля 0.1-5.0 мг/мл. У іншому втіленні, загальна концентрація полінуклеотиду у імуногенній композиції або вакцині буде звичайно знаходитися у межах біля 1 мкг/мл-4.0 мг/мл або біля 10 мкг/мл та біля 3.0 мг/мл або біля 100 мкг/мл та біля 2.0 мг/мл. Вакцини та процедури вакцинації, де застосовані нуклеїнові кислоти (ДНК або мРНК) добре описані у науковій літературі, наприклад, у патентах США U. S. Pat. No. 5,703,055, U.S. Pat. No. 5,580,859 та U.S. Pat. No. 5,589,466, всі з яких включені сюди шляхом посилання. На додачу до описаних вище вірусів або бактерій, імуногенні композиції та вакцини, що охоплюються заявленим винаходом можуть також містити інші додаткові антигени. Антигени можуть існувати у вигляді інактивованого цілого або часткового препарату мікроорганізму або у вигляді антигенних молекул, отриманих за допомогою способів генетичної інженерії або 11 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60хімічного синтезу. Інші прийнятні для застосування відповідно до заявленого винаходу антигени охоплюють, але без обмеження, антигени, що походять від патогенних вірусів, як-то вірус собачої чуми, вірус герпесу собак, вірус собачого грипу, вірус сказу, патогенних бактерій, як-то Bordetella bronchiseptica, Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp., Borrelia spp., Streptococcus spp., в тому числі Streptococcus equi subspecies zooepidemicus, Ehrlichia spp., Mycoplasma spp., в тому числі Mycoplasma cynos та Microsporum canis. Антигени також можуть бути отримані від патогенних грибів, як-то Candida, від протозоа, як-то Cryptosporidium parvum, Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Eimeria spp., Babesia spp., Giardia spp., Leishmania spp. або від гельмінтів, як-то Taenia, Cuterebra, Echinococcus, та Paragonimus spp. Імуногенні композиції та вакцини, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути введені тваринам для викликання ефективної імунної відповіді проти CIRDC. Відповідно, заявлений винахід передбачає способи стимулювання ефективної імунної відповіді шляхом введення тварині терапевтично ефективної кількості описаної тут імуногенної композиції або вакцини. Описані тут імуногенні композиції та вакцини можуть бути введені тваринам для вакцинації тваринного суб’єкту проти CIRDC. Імуногенні композиції та вакцини можуть бути введені тваринам для запобігання або лікування CIRDC у тварин. Відповідно, тут описані способи вакцинації тварин проти CIRDC та запобігання або лікування CIRDC, що полягають у введенні тваринам терапевтично ефективної кількості описаної тут імуногенної композиції або вакцини. Імуногенні композиції та вакцини, що охоплюються заявленим винаходом можуть бути отримані у різних формах у залежності від шляху введення. Наприклад, імуногенні композиції та вакцини можуть бути отримані у вигляді стерильних водних розчинів або дисперсних систем, прийнятних для ін'єкційного застосування або у ліофілізованому стані з застосуванням способів сублімаційного сушіння. Ліофілізовані імуногенні композиції та вакцини звичайно зберігають при біля 4°C та потім вони можуть бути відновлені у стабілізуючому розчині, наприклад, у сольовому розчині або HEPES, з ад’ювантом або без нього. Імуногенні композиції та вакцини також можна отримати у формі суспензій або емульсій. Імуногенні композиції та вакцини заявленого винаходу містять терапевтично ефективну кількість одного або декількох вищеописаних мікроорганізмів. Очищені віруси та/або бактерії можна застосувати безпосередньо у імуногенній композиції або вакцині або вони можуть бути додатково ослаблені або інактивовані. Звичайно, імуногенна композиція або вакцина містить 212 311 біля 1×10 1×10 вірусних або бактеріальних частинок або біля 1×10 1×10 частинок або біля 410 59 68 1×10 1×10 частинок або біля 1×10 1×10 частинок або біля 1×10 1×10 частинок. Точна кількість мікроорганізмів у імуногенній композиції або вакцині, що буде ефективною для надання захисного ефекту може бути визначена досвідченим фахівцем. Імуногенні композиції та вакцини звичайно містять ветеринарно прийнятний носій об’ємом біля 0.5-5 мл. У іншому втіленні, об’єм носія дорівнює біля 1-4 мл або біля 2-3 мл. У іншому втіленні, об’єм носія дорівнює біля 1 мл або біля 2 мл або біля 5 мл. Ветеринарно прийнятні носії, прийнятні для застосування у імуногенній композиції та вакцині можуть бути будь-якими з вищеописаних. Фахівець у цій галузі може легко визначити, чи потребує вказаний вірус або бактерія ослаблення або інактивації перед введенням. У іншому втіленні заявленого винаходу, вірус або бактерія може бути введена тварині безпосередньо без додаткового ослаблення. Кількість терапевтично ефективного мікроорганізму може відрізнятися в залежності від окремого застосованого мікроорганізму, стану тварини та/або ступеню інфекції та може бути визначена досвідченим фахівцем. У відповідності зі способами заявленого винаходу, тваринам може бути введена одинична доза або, альтернативно, можуть мати місце дві або більше інокуляції з інтервалами біля 2-10 тижнів. Також може бути потрібним застосування режимів бустингу та режим дозування може бути відрегульований для забезпечення оптимальної імунізації. Фахівець у цій галузі зможе легко визначити оптимальний режим введення. Імуногенні композиції та вакцини можуть бути введені безпосередньо у кровоток, у м'яз, внутрішній орган або під шкіру. Прийняті засоби для парентерального введення охоплюють внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньом'язове та підшкірне введення. Прийнятні пристрої для парентерального введення охоплюють голки (в тому числі, мікроголки) ін'єктори та безолкові ін'єктори. Препарати для парентерального введення звичайно є водними розчинами, що можуть містити наповнювачі, як-то солі, вуглеводи, білки та буферні агенти (переважно з pH біля 3-9 12 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або біля 4-8 або біля 5-7.5 або біля 6-7.5 або біля 7-7.5), але, у деяких випадках, вони можуть бути більш зручніше отримані у вигляді стерильного безводного розчину або у сухому стані для застосування у поєднанні з прийнятним засобом доставки, як-то зі стерильною, апірогенною водою або сольовим розчином. Отримання препаратів для парентерального введення у стерильних умовах, наприклад, шляхом ліофілізації може бути легко здійснено за допомогою добре відомих фахівцям стандартних фармацевтичних технічних прийомів. Розчинність матеріалів, застосованих для отримання розчинів для парентерального введення можна збільшити шляхом застосування відомих досвідченому фахівцю відповідних способів отримання, як-то шляхом включення агентів, що збільшують розчинність, в тому числі буферів, солей, поверхнево-активних речовин, ліпосом, циклодекстринів тощо. Композиції для парентерального введення можуть бути отримані для негайного або модифікованого вивільнення. Препарати з модифікованим вивільненням охоплюють препарати з затриманим, сталим, імпульсним, контрольованим, цільовим та програмованим вивільненням. Отже, імуногенні композиції та вакцини можуть бути отримані у твердому, напівтвердому або тиксотропному рідкому стані для введення у вигляді імплантованого депо для забезпечення модифікованого вивільнення імуногенних композицій та вакцин. Інші засоби введення імуногенної композиції або вакцини охоплюють доставку за допомогою мікроголки або шляхом безголкової (наприклад, Powderject™, Bioject™ тощо) ін’єкції. У випадках застосування підшкірної або внутрім’язової ін’єкції бажаним є застосування ізотонічного препарату. Головним чином, ізотонічні домішки можуть охоплювати хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт та лактозу. В окремих випадках застосовують ізотонічні розчини, як-то забуферений фосфатом фізіологічний розчин. Додатково, препарати можуть містити стабілізатори, як-то желатин та альбумін. У деяких втіленнях до препарату також додають судинозвужувальний засіб. Фармацевтичні препарати відповідно до заявленого винаходу звичайно надають в стерильному та апірогенному стані. Однак, фахівцям добре відомо, що препарати фармацевтично прийнятних носіїв є фармацевтичними носіями, затвердженими постановами, прийнятими Департаментом сільського господарства США або еквівалентним урядовим агентством інших країн, як-то як Канада чи Мексика, або будь-якої з європейських країн для будь-якої вакцини для собак, поліпептидних (антигенних) субодиничних імуногенних композиції та вакцин, рекомбінантних вірусних векторних вакцин та ДНК-вакцин. Отже, фармацевтично прийнятний носій для промислового виробництва імуногенних композиції або вакцин є носієм, який вже є затвердженим або буде затверджений відповідною державною установою у Сполучених Штатах Америки або у іншій державі. Також імуногенні композиції та вакцини можуть бути додатково змішані з фармацевтично прийнятним ад’ювантом. У деяких препаратах імуногенних композицій та вакцин, імуногенні композиції або вакцини поєднують з іншими собачими імуногенними композиціями або вакцинами для отримання полівалентного продукту, що може захистити собаку проти широкого спектру захворювань, викликаних іншими собачими патогенами. Природу та ступінь викликаних у тварин імунних відповідей можна оцінити за допомогою багатьох способів. Наприклад, можна зібрати сироватку з інокульованих тварин та дослідити її на присутність або відсутність антитіл, специфічних до імуногенів. Виявлення відповіді цитотоксичних T-лімфоцитів (CTL) у лімфоїдних тканинах, що свідчить про індукцію клітинної імунної відповіді, можна отримати шляхом аналізів, наприклад, проліферації T-клітин. Відповідні способи добре описані у науковій літературі. Оскільки може бути бажаним введення иммуногенної композиції або вакцини у комбінації з додатковими композиціями або сполуками, наприклад, для лікування певного захворювання або стану, це знаходиться в межах обсягу даного винаходу, куди іммуногенні композиції або вакцини можуть бути легко включені або можуть знаходитися у вигляді набору, прийнятного для введення або спільного введення композицій. Отже, набори, що охоплюються заявленим винаходом можуть містити одну або декілька окремих фармацевтичних композиції, де принаймні одна з них є імуногенною композицією або вакциною відповідно до заявленого винаходу та засоби для окремого зберігання вказаних композицій, як-то контейнер, розділена пляшка або розділений пакет з фольги. Прикладом такого набору є шприц та голка тощо. Набір заявленого винаходу є особливо прийнятним для введення різних форм дозування, наприклад, для перорального або парентерального введення окремих композицій з різними інтервалами дозування або для порівняльного титрування окремих композицій між собою. Для сприяння введенню композиції, що охоплюється заявленим винаходом, набір звичайно містить керівництво по введенню. Інший набір, що охоплюється заявленим винаходом може містити один або декілька агентів, 13 UA 110505 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 корисних для визначення інфікованих тварин. Набір може містити агенти для аналізу зразка на наявність цілих мікроорганізмів, поліпептидів, епітопів або полінуклеотидних послідовностей. Наявність вірусу, бактерії, поліпептидів або полінуклеотидних послідовностей може бути визначена за допомогою антитіл, ПЛР, гібридизації та інших способів визначення, відомих фахівцям. Інший набір, що охоплюються заявленим винаходом може передбачати реагенти для визначення антитіл проти певних епітопів. Такі реагенти є корисними для аналізу зразка на присутність антитіл та добре відомі та доступні фахівцям в даній галузі. Наявність антитіл може бути визначена за допомогою стандартних способів визначення, що також відомі фахівцям в даній галузі. У певних втіленнях, набори можуть містити ще набір надрукованих інструкцій або етикетку, яка вказує на те, що набір є корисним для визначення інфікованих тварин. Антитіла можуть бути моноклональними, поліклональними або рекомбінантними. Антитіла можуть бути отримані проти імуногену або його частини. У якості імуногену, наприклад, може бути виділено та застосовано синтетичний пептид або пептид, отриманий рекомбінантним шляхом за допомогою технологій клонування на основі амінокислотної послідовності імуногену або продукту природного гену та/або його частин. Імуногени можна застосувати для продукування антитіл за допомогою добре відомої фахівцям стандартної технології отримання антитіл. Фрагменти антитіл, що охоплюють Fab, F(ab') 2, та Fv також можна отримати з антитіл за допомогою відомих фахівцям способів. При виробництві антитіл, за допомогою стандартних відомих в цій галузі імунологічних способів можна здійснити перевірку на бажане антитіло. Найбільш бажаними прийнятними типами імуноаналізу є добре відомі фахівцям способи ІФА та Вестерн-блот аналізу, у яких можна застосовувати як поліклональні, так і моноклональні антитіла. Антитіло може бути зв’язано з твердим підтримуючим субстратом, кон'юговано з функціональною групою, яку можна визначити або бути водночас зв’язаним та кон'югованим, як це добре відомо у цій галузі. Прикріплення антитіл до твердого підтримуючого субстрату також добре відомо у цій галузі. Прийнятні для застосування у заявленому винаході функціональні групи, що піддаються визначенню охоплюють, але без обмеження, флуоресцентний, металічний, ферментативний та радіоактивний маркери, як-то біотин, золото, феритин, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу, 14 пероксидазу, уреазу, флуоресцеїн, родамін, тритій, C, та йодування. Заявлений винахід ілюстровано нижче наступними прикладами, що не мають обмежувального характеру. Приклади. Приклад 1: Імуногенність бактеріального екстракту Bordetella bronchiseptica, субодинична вакцина. У дослідженнях приймали участь 32 собаки-гончака приблизно восьмитижневого віку з низьким рівнем Bordetella bronchiseptica (титри реакції мікроаглютинації антитіл (MAT) дорівнювали 39.5°C). У деяких собак у обох групах лікування під час вакцинації були відмічені випадки свербіння. Тільки у двох собак з групи T2 дослідники спостерігали маленькі за розміром набряки у місці ін’єкції (2x2x1 см), що були помітні протягом 3-6 год. після обстеження після першої вакцинації. Результати спостереження свідчать про безпечність та добру сприйнятливість собаками досліджуваної вакцини. У всіх контролів, вакцинованих сольовим розчином був відмічений розвиток кашлю, що вказує на адекватне інфікування. Значення тривалості кашлю для контрольної групи, виміряне способом найменших квадратів (LS) дорівнювало 20.3. На відміну від цього, застосування вакцини значно зменшило тривалість кашлю у групі вакцинатів до значення у 5.2 (LS) з pвеличиною