Живильне середовище для культивування bordetella pertussis

Живильне середовище для культивування бактерій кашлюку, яке складається з білкової основи, крохмалю, солей, дріжджового екстракту, цистеїну, проліну, адсорбенту ненасичених жирних кислот, яке відрізняється тим, що як білкову основу використовують солянокислий гідролізат Винахід відноситься до медицини, а саме до мікробіологи, зокрема середовищ для мікробіологічних досліджень Bordella pertussis, збудник кашлюку, відноситься до бактерій, культивування яких пов'язане з певними труднощами, оскільки цей мікроорганізм не росте на загальноприйнятих живильних середовищах На даний час в Україні застосовуються декілька живильних середовищ для культивування В pertussis S Cohen і М Uheeler [1], W Verwey [2], М Захарова і Н Палкіна [3], В Степашина [4] лює високу собівартість всіх наведених аналогів (включаючи прототип) Прототипом середовища, яке пропонується, є середовище М Захарової та Н Палкіної - картопляно-вугільний агар - КУА КУА є елективним середовищем для кашлюкового мікроба, до його складу входять такі інгредієнти [3] Казеїновий гідролізат - до концентрації змінного азоту у готовому середовищі до 120-15мг% КН2РО40,5г МдСІ2 0,4г Крохмзль розчинний 1,5г СзС120,01 г FeS04 0,01г CuSO40.005 г Цистин збо цистеїн L і І_Дформи 0,03г Дріжджовий пдроліззт збо екстрзкт ЮОмл Агзр 22г Вугілля зктивовзне Зг Пролін збо глютзмін 0,03г Дистильовзнз водз до 1л рН 7,0 -7,2 Ознзкзми прототипу, що збігаються з тзкими середовищз, що пропонується, є використання білкової основи, здсорбенту, розчинного крохмзлю (1,5г/л ), змінокислот (цистин, пролін збо глютзмін - по 0,03г/л) і дріжджового звтоліззтутз склзд солей Нз відміну від прототипз пропонуємо рішення, Всі ВОНИ МІСТЯТЬ білкову основу (солянокислі та сірчанокислі гідролізати казеїну [1, 2, 3] або рибне борошно [4] ) Крім того, до їх складу входять крохмаль, дріжджовий автолізат, цистеїн та неорганічні солі хлориди натрію та магнію, фосфати ВІДМІННОСТІ МІЖ ЦИМИ середовищами поляга ють у складі мікроелементів та у використанні активованого вугілля, яке виступає як адсорбент ненасичених жирних кислот, що утворюються в культурі В pertussis і гальмують її ріст Активоване вугілля використовується в середовищах М Захаровой і Н Палкіной (КУА)- [3] та Степанишиной с співавт [4] Ознаками, що збігаються з суттєвими ознаками заявленого винаходу, є використання живильної білкової основи з високим ступенем розщепленості молекули, адсорбентів, крохмалю, дріжджового автолізату, цистеша та неорганічних солей Використання харчової сировини (казеїну, рибного борошна ) та активованого вугілля обумов ВІДХОДІВ гаммаглобулінового виробництва (фракція IV) до концентрації змінного азоту 120150 мг %, а як адсорбент - глину - відходи виробництва кераміки - у концентрації 0,45-0,60 % ю (О ю ю в якому як білкова основа використовуються відходи гамаглобулінового виробництва (фракція IV) (замість харчового продукта казеїну) та ВІДХІД виробництва кераміки, глина (замість активованого вугілля) В основу винаходу поставлено задачу розробити середовище для культивування Bordetella pertussis шляхом заміни харчової сировини (казеїну) відходами гамаглобулинового виробництва та активованого вугілля — відходами виробництва кераміки, забезпечити зниження собівартості середовища при збереженні його показників ВІДОМОСТІ, ЩО підтверджують можливість здійснення винаходу В експерименті було вивчено - вплив способу обробки фракції IV на придатність одержуваної основи для культивування Bordetella pertussis, - вплив концентрації змінного азоту на ростові якості основи, - підібрано оптимальну концентрацію глини — відходу виробництва кераміки Для з'ясування питання про те, який спосіб обробки фракції IV дає можливість одержати найбільш прийнятну для культивування В pertussis 55695 білкову основу, було випробувано два методи панкреатичне переварювання та солянокислий гідроліз Одержані основи характеризувались різним складом та ступенем розщепленості і були використані для приготування живильних середовищ за тим же прописом, що і КУА, але замість гідролізату казеїну, були взяті одержані основи в кількостях, які забезпечували концентрацію змінного азоту в межзх 120-150мг% Нз одержзні середовищз здійснювзли КІЛЬКІСНИЙ висів В pertussis шт 171 зз методикою перевірки якості живильних середовищ, рекомендовзною лзборзторними реглзментзми виробництвз кзшлюкових взкцин, якз використовується згідно інструктивних рекомендзцій у лзборзторній прзктиці при ДІЗГНОСТИЦІ мікробів роду Bordetells Згідно ЦІЄЇ методики ріст ізольовзних колоній при ВИСІВІ 1000 і 500 мікробних клітин нз досліджувзному середовищі дозволяє стверджувзти, що дзне середовище придзтне для використання Відсутність росту нз протязі 3-5 діб свідчить про те, що тзке середовище непридзтне для використання Одержзні результати нзведені втзблиці 1 Тзблиця 1 Склзд одержувзних основ тз їх ростовз якість Основз Ззгзльний ззотМз, мг% Амінний ззотІЧзМ, мг% Ступінь розщепленості, % Активність росту при ІЧзМ=140 мг% Тривзлість культивувзння 24 год 48 год ПОСІВНЗ ДОЗЗ, КЛІТИН 10у Пзнкрезтичний перевзр фрзкції IV з крохмзлем Пзнкрезтичний перевзр фрзкції IV Солянокислий пдроліззт КУА (контроль) ПОСІВНЗ ДОЗЗ, КЛІТИН 5-10у 10у 5-10у слзбкий ріст дуже слзбкий ріст 787±112 353±98 44,9 росту не- росту немзє мзє 690±212 387±101 56,6 росту не- росту не29 колоній мзє мзє 945±221 809±93 85,6 5 колоній помірнз КІЛЬКІСТЬ щільно розтзшовзних коло** дуже бзгзто щільно розтзшовзних колоній Як видно із приведених дзних, нзйкрзщз ростовз зктивність виявляється у середовищз, яке приготовзне нз основі солянокислого пдроліззту Основи з меншим ступенем розщепленості дзють меншу КІЛЬКІСТЬ колоній при ПОСІВІ зрззків з мзлим стзндзртом мутносп (1000-500 клітин/мл) тз в деВплив вмісту змінного ззоту в N° п/п Вміст ЗМІННОГО ззоту, мг % * ** ** * ній * * ** ** яких випздкзх зумовлюють появу клітин з нетиповою морфологією Для з'ясувзння питзння про оптимзльну концентрзцію ззоту в розроблювзному середовищі було приготовзно зрззки з різним вмістом змінного ззоту, від 110 до 190мг% Рештз інгредієнтів були взяті в звичзйній КІЛЬКОСТІ Нз одержзних середовищзх було здійснено висів В pertussis зз тією ж методикою (тзбл 2) Тзблиця 2 середовищі нз його ростову якість Активність росту при ВИСІВІ 500 кл ЮООкл Тривзлість культивувзння, год ЮООкл 24 500 кл 48 1 2 3 110 120 130 росту немзє 5 колоній 18 колоній росту немзє росту немзє 4 140 25 колоній 18 колоній 1 0 КОЛОНІЙ 6 КОЛОНІЙ 25 колоній 100 колоній бзгзто щільно розтзшовзних КОЛОНІЙ росту немзє росту немзє 6 0 КОЛОНІЙ 80 колоній 55695 Продовження табл 2 N° п/п Активність росту при ВИСІВІ 500 кл ЮООкл Тривалість культивування, год ЮООкл Вміст ЗМІННОГО азоту, мг % 48 24 5 150 6 160 7 170 8 180 9 190 ЗО колоній 500 кл 20 колоній щільний ріст ізольованих КОЛОНІЙ 80 колоній 6 0 КОЛОНІЙ 35 колоній 63 нетипові полі- 32 нетипові полі1 0 КОЛОНІЙ 5 колоній морфні колонії морфні колонії багато нетипових багато нетипових багато нетипових багато нетипових поліморфних поліморфних поліморфних поліморфних коКОЛОНІЙ КОЛОНІЙ КОЛОНІЙ лоній --1 6 КОЛОНІЙ Як видно із приведених даних, найкращу ростову активність забезпечує вміст змінного азоту в межзх 130-150мг% Для зясувзння питзння про можливість використання в склзді розроблювзного середовищз глини ззмість зктивовзного вугілля експеримент було поставлено наступним чином було пригото 6 КОЛОНІЙ вано два зразки середовища на основі солянокислого гідролізату фракції IV Перший зразок містив активоване вугілля в тій же КІЛЬКОСТІ, ЩО І КУА0,03%, а другий - глину в діапазоні концентрацій від 0,2 до 0,8% (5 варіантів), після чого було здійснено висів В pertussis на кожен з варіантів середовища (таблиця 3) Таблиця З Вплив вмісту глини у живильному середовищі на його ростову якість Активність росту при ВИСІВІ Зразок середовища 24 год 48 год 1000 клітин Середовище КУА (контроль) Розроблюване середовище з активованим вугіллям Розроблюване середовище з глиною 0,20 г/100м Розроблюване середовище 3 ГЛИНОЮ 0,30 г/100м Розроблюване середовище 3 ГЛИНОЮ 500 клітин 1000 клітин 500 клітин ЗО колоній 20 колоній 28 колоній 50 колоній 25 колоній 15 колоній 6 0 КОЛОНІЙ ЗО колоній Росту немає Росту немає 1 0 КОЛОНІЙ 15 колоній 20 колоній 1 8 колоній 40 колоній 20 колоній 25 колоній 15 колоній 90 колоній 55 колоній 28 колоній 18 колоній 100 колоній 6 0 КОЛОНІЙ 1 6 КОЛОНІЙ 8 колоній 6 0 КОЛОНІЙ 28 колоній 0,45 г/100м Розроблюване середовище 3 ГЛИНОЮ 0,60 г/100м Розроблюване середовище 3 ГЛИНОЮ 0,80 г/100м Як видно з приведених даних, оптимальна КІЛЬКІСТЬ глини в складі розроблюваного середовища становить 0,45-0,60/100мл , менша КІЛЬКІСТЬ не забезпечує доброго росту, а більша зумовлює каламутність середовища і появу часток глини в конденсаційній воді Таким чином, проведені експерименти дають можливість прийняти такі параметри при конструюванні живильного середовища для культивування В pertussis Білкова основа солянокислий гідролізат фракції IV (відходу гамаглобулі нового виробництва) Вміст ЗМІННОГО азоту130-150мг% Вміст ГЛИНИ (відходу виробництвз керзміки) 0,45-0,6г/100мл Виготовлення живильного середовищз для В pertussis проходить у двз етзпи I Виготовлення білкової основи (солянокислого пдроліззту) II Виготовлення щільного середовищз для вирощувэння В pertussis І Виготовлення білкової основи (солянокислого пдроліззту) здійснюється зз відомою методикою [В І Іоффе, Л В Осиповз, Н Н Скляровз, Н А 55695 8 Після автоклавування одержану рідину коричневого кольору розбавили вдвоє дистильованою водою і провели освітлення активованим вугіллям Для цього до розбавленого гідролізату добавили 20г вугілля на 1л, суміш автоклавували при 100°С Юхв і відфільтрували через склотканину або полотно Одержаний гідролізат має характеристики, приведені втабл 4 Козлова Коклюш - Л Медицина, 1964 - 282 с ] Для цього 500г фракції IV витримували 4 доби в 0,2%-ному розчині СНЗСООН, з трьохразовою зміною кислоти щоденно, після чого основи промивали дистильованою водою до рН-6,0 Промиту фракцію IV помістили в скляний бутиль, переносячи 500мл дистильованої води, внесли 500мл 12н НСІ (хч) і автоклавували Згод при 127°С (1,5атм) Таблиця 4 Характеристики солянокислого гідролізату, одержуваного з фракції IV № серії 1 2 3 4 5 Загальний азот, N з, мг% 836 800 1200 620 399 Амінний азот N ам, мг% 712 720 995 598 380 II Виготовлення живильного середовища для культивування В pertussis на одержаній основі включає такі етапи - нейтралізацію гідролізату до рН 7,0-7,2, - розведення до вмісту змінного азоту 130-150 мг%, - внесення сольових інгрідієнтів - внесення глини у КІЛЬКОСТІ 0,45-0,6г/100мл, - стерилізація 20хв при 120° С Приклад № 1 150г фракції IV обробили ВІДПОВІДНО З викладеною методикою одержання солянокислого гідролізату Одержана основа мала такі показники загальний азот 1200мг% амінний азот 995 мг% ступінь розщепленості 83% КІЛЬКІСТЬ СОЛЯНОКИСЛОГО гідролізату, необхід ного для приготування 1л середовища розрахували виходячи із міркування, що концентрація змінного азоту у готовому середовищі повиннз становити 140мг% зз прзвилом змішувзння 140 d _ 1060 1200-140 10 20 1000-х ТІ Залізо Fe 2+ , мкг/мл 6,08 5,13 5,92 3,08 4,56 85,2 90,0 82,9 96,4 95,2 116,7мл пдроліззту нейтрзлізувзли внесенням сухого ІЧзОН до рН=7,2 (зз шдикзторним пзпером) Об'єм доведено до 800 мл дистильовзною водою, після чого обробляли фосфзтною сумішшю для видзлення ІОНІВ Fe 2+ В рідину, позбзвлену ІОНІВ Fe 2+ , вносили інгредієнти середовищз КУА КН 2 РО 4 0,5г МдСІ2 0,4г Крохмзль розчинний 1,5г СзСІ 2 0,01г FeSO4 0,01г CuSO4 0,005г Цистин 0,03г Дріжджовий пдроліззт ЮОмл Агзр 22г Глинз 4,5г Н2О до 1л рН7,2 Перевірку придзтності одержзного середовищз для культивувзння мікробів роду Bordetells здійснювзли шляхом вивчення ростової зктивності мікробів кзшлюку зз допомогою методз посіву серійних розведень свіжевиділених штзмів нз розроблене середовище тз нз середовище КУА (контроль) - звільнення від ІОНІВ Fe2+, 0 Ступінь розщепленос 116,7{мл) Таблиця 5 Ростова активність В pertussis на розробленому середовищі Тривалість культивування, год Штами В pertussis Середовища 24 Активність росту 48 Активність росту Доза при ВИСІВІ при ВИСІВІ №456 (свіжевидіКУА лений) розроблюване 40 колоній 32 колонії 25 колоній 28 колоній №569 (свіжевиділений) 46 колоній 22 колонії КУА 100 колоній 118 колоній щільний ріст ізольованих Доза 52 колонії Морфологія клітин 6 6 КОЛОНІЙ типова типова 75 клітин типова 6 0 КЛІТИН типова КОЛОНІЙ розроблюване ЗО колоній 20 колоній Як видно з нзведених дзних тзбл 5, розроблене середовище зз ростовими якостями не поступзється КУА Висновок середовище придзтне для культи 100 колоній вувзння В pertussis Приклзд № 2 З 200г фракції IV гамзглобулінового виробництвз одержзно солянокислий пдроліззт зз пропи 10 9 55695 сом, наведеним в прикладі № 1 Одержаний проБуло приготовано живильне середовище з дукт мав такі характеристики вмістом змінного азоту 120мг% і глини 0,6% Ступінь розщепленості 90%, Для його ростових якостей використовувались Загальний азот 800мг%, свіжевиділені штами В pertussis №596 та №538 (табл 6) Амінний азот 720мг% Таблиця 6 Ростова активність штамів В pertussis №596 та №538 на розробленому середовищі у Штами В pertussis Середовища 596 КУА розроблене 45 20 КУА 45 536 10 клітин Активність росту при ВИСІВІ у у у 5-10 клітин 10 клітин 5-10 клітин Тривалість культивування, годин 24 48 23 135 70 10 98 50 щільний ріст 23 ізольованих 75 Морфологія КЛІТИН типова типова типова КОЛОНІЙ розроблене 25 12 Як видно із приведених даних, ростові якості розробленого середовища не поступаються КУА Висновок середовище придатне для вирощування В pertussis Приклад З З 250 г фракції IV гамаглобулінового виробництва за вищенаведеним прописом було виготовлено солянокислий гідролізат з характеристиками, наведеними нижче 100 60 типова Загальний азот 836мг%, Амінний азот 712мг%, Ступінь розщепленості 85,2% На даній основі було виготовлене живильне середовище для В pertussis з вмістом змінного азоту 150мг% тз КІЛЬКІСТЮ ГЛИНИ 0,53%, яке було використано для вирощувзння штзмів №171 тз №456 (тзбл 7) свіжевиділених Тзблиця 7 Ростовз зктивність штзмів № 171 тз № 456 нз розробленому середовищі Активність росту при ВИСІВІ Штэми В perСередовищз tussis 171 456 КУА розроблене КУА розроблене 10у клітин 45 36 42 34 5-10у клітин 10у клітин 5-10у клітин Тривзлість культивувзння, годин 24 48 23 130 70 20 110 65 24 120 68 18 115 66 Як видно із приведених дзних, розроблене середовище придэтне для вирощувзння В pertussis Лггерэтурэ 1 CohenS Wheeler M //JPubl Health —1946 - 36, №4 - P-371-380 -цит по Иоффе В И , Осиповэ П В , Скляровэ Н Н , Козловэ Н А -Коклюш - М Медицинэ, 1964-282 с 2 VerweyWT//J Bsctenol -1964 - 58, № 2 Р 127 - 132 цит по Иоффе В И , Осиповэ П В , Скляровэ Н Н , Козловэ Н А - Коклюш - М Ме Морфологія КЛІТИН ТИПОВЭ ТИПОВЭ ТИПОВЭ ТИПОВЭ дицинэ, 1964-282 с 3 Зэхэровэ М С , Пэлкинэ Н А Мэтериэлы по обмену опытом М Медицинэ, 1956 - Т 2 - с 44 48 - цит по Иоффе В И с соэвт 4 Степэнишинэ В Н , Алексеевэ Л Н , Коробовэ О В Логэчевэ Л В , Шипин А П , Анисимов ГА , Волковой К И Взэимосвязь состэвэ питэтельных сред с ростовыми и биологическими свойствэми Bordetell3 pertussis //ЖМЭИ -1994 — № 6 - с 26-27 Підписано до друку 05 05 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24