Імуногенні білки streptococcus uberis

Реферат: Винахід належить до способів і засобів для ідентифікації білка бактерій роду Streptococcus, здатних викликати імунну відповідь проти щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus. В заявці також описані імуногенні композиції, здатні викликати імунну відповідь проти Streptococcus uberis, що включають щонайменше два рекомбінантні і/або виділені білки, одержані із Streptococcus uberis, і/або імуногенну частину або аналог, або похідну кожного із вказаних білків або їх обох; також описані молекули нуклеїнової кислоти, які кодують вказані білки або їх імуногенні частини, діагностичні тести на основі білків і нуклеїнових кислот. UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дійсний винахід належить до галузі медицини. Точніше дійсний винахід належить до імуногенних білків Streptococcus, а також до їх імуногенних частин, похідних і аналогів. Род Streptococcus включає широкий круг патогенних і комменсальних грампозитивних бактерій, які існують в різних господарях, у тому числі в організмах людей, коней, свиней і корів. У організмі господаря стрептококи зазвичай вражають слизисті поверхні верхніх дихальних шляхів. Проте в деяких обставинах стрептококи також можуть викликати захворювання, важкість яких варіює від підгострої до гострої і навіть хронічної. До цього часу багато комерційних вакцин проти Streptococcus засновано на бактеринах цілих клітин. Зазвичай такі бактерини дійсно надають істотний захист проти зараження гомологічними серотипами, але не захищають проти зараження гетерологічними серотипами. Вакцинація цілими клітинами Streptococcus часто приводить до імунної відповіді, яка направлена проти того ж штаму Streptococcus, але яка не направлена (істотним чином) проти інших штамів Streptococcus, не говорячи вже про інші серотипи Streptococcus. В результаті багато вакцин представляють недостатній захист проти гетерологичних штамів і серотипів, оскільки вакцинація проти одного штаму Streptococcus зазвичай недостатня для протидії інфікуванню іншим штамом Streptococcus. Крім того, вакцинація проти одного серотипа Streptococcus зазвичай недостатня для протидії інфікуванню іншим серотипом Streptococcus. Таким чином, бажано, аби імуногенні композиції були здатні викликати імунну відповідь проти щонайменше двох штамів Streptococcus, переважно проти двох серотипів Streptococcus. Одне із завдань дійсного винаходу полягає в одержанні білків Streptococcus, а також їх імуногенних частин, похідних і/або аналогів, і молекул, кодуючих їх нуклеїнові кислоти таким чином, що вони здатні індукувати імунну відповідь щонайменше двох штамів Streptococcus. Дійсний винахід передбачає спосіб ідентифікації білка Streptococcus, який здатний викликати імунну відповідь щонайменше двох штамів Streptococcus, і включає: a) ідентифікацію щонайменше частини секретованого білка, поверхнево-асоційованого білка і/або білка, який ідентичний щонайменше на 50 % послідовності бактеріального фактора вірулентності, б) вибір щонайменше одного білка, ідентифікованого на стадії a), який зберігається щонайменше в двох штамах Streptococcus, і в) визначення здатності щонайменше одного білка, вибраного на стадії б), або його імуногенної частини, похідної і/або аналога, специфічно зв'язувати антитіло і/або імунні клітини тварини, інфікованої першим штамом Streptococcus, і другим антитілом і/або імунними клітинами тварини, інфікованої другим штамом Streptococcus. Вказаний перший штам Streptococcus і вказаний другий штам Streptococcus переважно належать до одного виду Streptococcus. Переважно вказаний білок, послідовність якого щонайменше на 50 % ідентична послідовності бактеріального чинника вірулентності, володіє щонайменше на 60 %, переважніше щонайменше на 70 %, переважніше щонайменше на 75 %, найпереважніше щонайменше на 80 %, ідентичністю з послідовністю бактеріального чинника вірулентності. За даним винаходом ідентифікують щонайменше один білок Streptococcus, який здатний викликати імунну відповідь щонайменше двох штамів Streptococcus. Вказаний білок може застосовуватися для імунізації конкретної тварини і/або людини, оскільки може викликати широку імунну відповідь. Таким чином, даний винахід не вимагає одержання вакцини для кожного штаму і/або серотипа Streptococcus. Застосування імуногенного білка Streptococcus за даним винаходом, таким чином, зберігає час і гроші. Важливіше, що імуногенний білок Streptococcus за даним винаходом в принципі здатний викликати імунну відповідь проти штаму Streptococcus, який поки що невідомий, або проти штаму, відносно якого ще немає специфічної вакцини (наприклад, штаму, який недавно виник в природних умовах). Переважно білок Streptococcus за даним винаходом здатний індукувати імунну відповідь проти щонайменше двох серотипів Streptococcus. Переважний варіант здійснення дійсного винаходу, таким чином, передбачає спосіб ідентифікації білка Streptococcus, який здатний індукувати імунну відповідь проти щонайменше двох серотипів Streptococcus, що включає: а) ідентифікацію щонайменше частини секретованого білка, поверхнево-асоційованого білка і/або білка, який ідентичний щонайменше на 50 % послідовності бактеріального чинника вірулентності, б) вибір щонайменше одного білка, виявленого на стадії a), який зберігається щонайменше в двох серотипах Streptococcus, і в) визначення здатності щонайменше одного білка, вибраного на стадії б), або його імуногенної частині, похідної і/або аналога, специфічно зв'язувати антитіло і/або імунні клітини тварини, інфікованої першим серотипом Streptococcus, і антитілом і/або імунними клітинами тварини, інфікованої другим серотипом Streptococcus. 1 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Імунну відповідь проти щонайменше двох штамів Streptococcus і/або двох серотипів Streptococcus у контексті даного винаходу виражають як гуморальну і/або клітинну імунну відповідь, направлену проти Streptococcus щонайменше двох різних штамів і/або серотипів. Вказана імунна відповідь індукується, наприклад, в тварині, але не в організмі людини. Також можливо індукувати імунну відповідь щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus в організмі конкретної людини, для того, щоб попередити і/або перешкодити захворюванню, пов'язаному з Streptococcus. Гуморальна імунна відповідь призводить до вироблення антитіл, не дивлячись на те, що клітинна імунна відповідь переважно підвищує формування реактивних імунних клітин, наприклад, Т-клітин-кілерів. Звичайна обоє частини імунної відповіді індукуються введенням імуногенного білка або його імуногенної частини. Імунна відповідь проти щонайменше двох штамів/серотипів Streptococcus переважно включає вироблення антитіла. Вказана імунна відповідь переважно здатна щонайменше частково знизити число мікроорганізмів Streptococcus у організмі конкретної людини і/або тварини. Вказана імунна відповідь також переважно здатна щонайменше частково, перешкоджати розладу, що викликається Streptococcus. Штам Streptococcus ідентифікують за морфологічними, біохімічними і серологічними ознаками, відомими в даній галузі. Серотип Streptococcus є групою Streptococcus, класифікація якої ґрунтується на наявності специфічних антигенних полісахаридів. Класифікація серотипівв Streptococcus також відома в даній галузі. Спосіб за даним винаходом включає ідентифікацію щонайменше частини секретованого білка, поверхнево-асоційованого білка і/або білка, послідовність якого ідентична щонайменше на 50 % послідовності бактеріального фактора вірулентності. Вказаний білок ідентифікують різними способами. У одному з варіантів здійснення дійсного винаходу застосовують геномний підхід. Ген, що кодує секретуємий білок, і/або поверхнево-асоційований білок, ідентифікують, наприклад, за пошуком мотиву вказаного секретованого білка і/або поверхнево-асоційованого білка. Вказаний мотив переважно включає сайт приєднання ліпіду, сайт розщеплювання сигнальної пептидази і/або сайт приєднання сортази. Безумовно можна виявити інші мотиви, відомі в даній галузі. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу, таким чином, передбачають спосіб за даним винаходом, в якому вказаний секретований білок і/або поверхнево-асоційований білок виявляють шляхом ідентифікації щонайменше частини послідовності генома гена Streptococcus, що включає мотив секретованого і/або поверхневоасоційованого білка. Додатково або в іншому варіанті ген, що кодує секретуємий білок і/або поверхнево-асоційований білок, ідентифікують одним або декількома методами, відомими в даній галузі. Наприклад, якщо ген бактерій виду роду Streptococcus, що кодує секретуємий білок і/або поверхнево-асоційований білок, відомий, можна виявити іншу геномну послідовність Streptococcus за наявністю гена з високим відсотком ідентичності послідовності. У одному з варіантів здійснення дійсного винаходу вказаний метод скринінгу включає спосіб, в якому вказана інша послідовність генома Streptococcus піддається скринінгу для виявлення здатності гібридизуватися з нуклеотидною послідовністю, що кодує секретований і/або поверхнево-асоційований білок Streptococcus. Даний винахід, таким чином, передбачає спосіб за даним винаходом, в якому вказаний білок, що має щонайменше 50 % ідентичність з бактеріальним чинником вірулентності, ідентифікують щонайменше у частини послідовності генома гена Streptococcus, який здібний до гібридизації з якою-небудь з нуклеотидних послідовностей, перерахованих на фіг. 4, при 65 °C у буфері, що містить 0,5 M натрій фосфат, 1 мM EDTA і 7 % натрій додецилсульфат при pH 7,2, причому молекули нуклеїнової кислоти залишаються гібридизованими після двократного промивання буфером, що містить 40 мM натрій фосфат (pH 7,2), 1 мM EDTA і 5 % натрій додецилсульфат протягом 30 хв при 65 °C, і промивають двічі буфером, що містить 40 мM натрій фосфат (pH 7,2), 1 мM EDTA і 1 % натрій додецилсульфат протягом 30 хв при 65 °C. Переважно вказаний білок, що володіє щонайменше 50 % ідентичністю до послідовності бактеріального чинника вірулентності, ідентичний щонайменше на 60 %, переважніше щонайменше на 70 %, переважніше щонайменше, на 75 %, найпереважніше щонайменше на 80 % послідовності бактеріального чинника вірулентності. В даній галузі також передбачають різні способи визначення, чи має послідовність білка Streptococcus ідентичність, щонайменше рівну 50 %, по відношенню до послідовності бактеріального чинника вірулентності. Наприклад, амінокислотну послідовність білка Streptococcus порівнюють з амінокислотною послідовністю бактеріального чинника вірулентності. Також можливе застосування геномного підходу. Ген, що кодує білок Streptococcus, послідовність якого щонайменше на 50 % ідентична послідовності бактеріального чинника вірулентності, виявляють, наприклад, скринінгом послідовності генома Streptococcus за нуклеотидною послідовністю, яка володіє щонайменше 50 % ідентичністю послідовності 2 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бактеріального гена, що кодує чинник вірулентності. У одному з варіантів здійснення дійсного винаходу, таким чином, передбачають спосіб за даним винаходом, в якому білок, який володіє щонайменше 50 % ідентичністю послідовності бактеріального чинника вірулентності, ідентифікують шляхом ідентифікації щонайменше частини послідовності генома гена Streptococcus, яка володіє щонайменше 50 % ідентичністю послідовності гена бактеріального чинника вірулентності. Проте в даній галузі відомі багато інших способів визначення, чи володіє білок Streptococcus щонайменше 50 % ідентичністю послідовності до послідовності бактеріального чинника вірулентності. Якщо ідентифікований щонайменше один ген Streptococcus, що кодує секретуємий білок, поверхнево-асоційований білок і/або білок, який ідентичний щонайменше на 50 % послідовності бактеріального чинника вірулентності, переважно визначити, чи може щонайменше один з вказаних генів зберігатися щонайменше в двох штамах Streptococcus. Ген першого штаму Streptococcus зберігається щонайменше в двох штамах Streptococcus, якщо геном другого штаму Streptococcus включається в послідовність нуклеїнової кислоти, яка щонайменше приблизно на 60 % ідентична вказаному гену вказаного першого штаму Streptococcus. Переважно, вказана послідовність нуклеїнової кислоти щонайменше на 70 %, переважніше щонайменше, на 75 %, переважніше щонайменше, на 80 % переважніше щонайменше, на 90 %, найпереважніше щонайменше на 95 % ідентична послідовності вказаного гена. Поняття "ідентичність послідовностей" належить до процентної ідентичності між двома послідовностями нуклеїнової кислоти або послідовностями амінокислот. Дві послідовності нуклеїнової кислоти володіють ідентичністю щонайменше на 60 % по відношенню одна до одної після вирівнювання і входження генів, при необхідності, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей. Способи і комп'ютерні програми для вирівнювання відомі в даній галузі. Одній з комп'ютерних програм, яка може бути застосована або адаптована для цілей визначення, чи потрапляє послідовність-кандидат під дане визначення, є програма "Align 2", розроблена фірмою Genentech, Inc., яка додається до документації для користувача Відомства по охороні авторських прав США, Вашингтон, округ Колумбія 20559, 10 грудня 1991 року. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу, якщо ген за даним винаходом зберігається щонайменше в двох штамах Streptococcus, білок, що кодується вказаним геном, є хорошим кандидатом для оцінки, чи є вказаний білок або його імуногенна частина, похідна і/або аналог, здатним викликати імунну відповідь більш ніж одного штаму Streptococcus. Вказаний перший штам Streptococcus і вказаний другий штам Streptococcus переважно є одним і тим же видом Streptococcus. Переважно визначають, чи зберігається вказаний ген щонайменше в двох серотипах Streptococcus, для того, щоб ідентифікувати хороший білок-кандидат (кодований вказаним геном), який тестують за здатністю викликати імунну відповідь більш ніж одного серотипа Streptococcus. Спосіб за даним винаходом, який також включає вибір гена, який зберігається щонайменше в двох штамах і/або серотипах Streptococcus, таким чином, є переважним. Якщо ідентифікують ген, який зберігається щонайменше в двох штамах/серотипах Streptococcus, переважно одержують білок, що кодується вказаним геном. Додатково, або в іншому варіанті, одержують імуногенну частину, похідну і/або аналог вказаного білка. У данній галузі відомі різні методи одержання білка, що кодується геном, або його імуногенної частини, похідної і/або аналога. Вказаний ген, наприклад, експресують у відповідній системі експресії. Прикладами, які не обмежують даний винахід, є еукаріотичні клітини-господарі, наприклад, дріжджі і прокаріотичні клітини-господарі, наприклад Escherichia coli. Переважно ген за даним винаходом, що кодує секретований білок, асоційований поверхневий білок і/або білок, який щонайменше на 50 % ідентичний послідовності бактеріального чинника вірулентності, і який зберігається щонайменше в двох штамах Streptococcus, білок, що кодується вказаним геном, експресується в прокаріотичній системі експресії. Прокаріотична система експресії є переважною, оскільки білок (прокаріотичний) бактерії Streptococcus в принципі краще експресується в прокаріотичній системі експресії. Крім того, прокаріотичну систему експресії зазвичай легко створити і використовувати. Спосіб за даним винаходом включає з'ясування, чи є щонайменше один білок за даним винаходом або його імуногенна частина, похідна і/або аналог, здатними специфічно зв'язувати антитіло і/або імунні клітини тварини, інфікованої першим штамом Streptococcus, і антитілом і/або імунними клітинами тварини, інфікованої другим штамом Streptococcus. Переважно визначають, чи може щонайменше один білок за даним винаходом або його імуногенна частина, похідна і/або аналог, володіти здатністю специфічно зв'язувати антитіло і/або імунні клітини тварини, інфікованої першим серотипом Streptococcus, і антитіло і/або імунні клітини тварини, інфікованої другим серотипом Streptococcus. В даній галузі відомо багато способів для 3 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виконання вказаного тесту. Переважно використовують сироватку щонайменше двох тварин, інфікованих щонайменше двома різними штамами Streptococcus. У іншому варіанті використовують сироватку лише одної тварини, інфікованої щонайменше двома різними штамами Streptococcus. У одному з варіантів здійснення дійсного винаходу одну тварину, але не людину, інфікують щонайменше першим штамом і/або серотипом Streptococcus, і другу тварину, але не людину, інфікують щонайменше другим штамом і/або серотипом Streptococcus. Вказані штами і/або серотипи Streptococcus, наприклад, вводять внутрішньовенно вказаній тварині. Потім за одним з варіантів здійснення дійсного винаходу відбирають сироватку від вказаних тварин, що мають Streptococcus-специфічні антитіла і/або імунні клітини. Вказану сироватку необов'язково переробляють перед застосуванням. Наприклад, антитіла і/або імунні клітини, є щонайменше частково сконцентрованими і/або виділеними. Білок за даним винаходом і/або його імуногенна частина, похідна і/або аналог, переважно виділяють і/або одержують рекомбінантно і потім інкубують з вказаною сироваткою - або з (частково) виділеним антитілом і/або імунними клітинами - похідними від вказаних тварин. Можливе застосування сироватки, антитіла і/або імунних клітин, одержаних від першої тварини, разом з сироваткою, антитілом і/або імунними клітинами, одержаними від другої тварини. У іншому варіанті, сироватку, антитіло і/або імунні клітини, одержані від першої тварини, вводять спочатку, потім додатково вводять сироватку, антитіла і/або імунні клітини від другої тварини. У ще одному з варіантів здійснення дійсного винаходу сироватку, антитіла і/або імунні клітини від першої тварини вводять в одній окремій групі, що включає щонайменше один білок і/або імуногенну частину, похідну і/або аналог за даним винаходом, а також сироватку, антитіла і/або імунні клітини другої тварини вводять в іншій групі, що включає щонайменше один білок і/або імуногенну частину, похідну і/або аналог за даним винаходом. Після інкубації вказану сироватку, антитіла і/або імунні клітини промивають і зв'язані антитіла і/або імунні клітини візуалізують, використовуючи який-небудь відомий в даній галузі спосіб. Зв'язані антитіла, наприклад, інкубовані з другим антитілом, здатні специфічно зв'язувати вказані зв'язані антитіла, причому друге антитіло кон'юговане з пероксидазой хріну. Після відмивання другого незв'язаного антитіла вводять перекис водню. Руйнування перекису водню пероксидазой хріну пов'язане з окисленням хромогенної сполуки таким чином, що реакція стає видимою. Якщо білок за даним винаходом і/або його імуногенна частина, похідна і/або аналог виявилися специфічно зв'язаними антитілом і/або імунними клітинами, що індукуються першим штамом Streptococcus, і антитілом і/або імунними клітинами, що індукуються другим штамом Streptococcus, це означає, що вказаний білок, імуногенна частина, похідна і/або аналог здатні індукувати імунну відповідь проти щонайменше двох штамів Streptococcus. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу використовують антитіло і/або імунні клітини, похідні сироватки в період одужання тварини, яка було інфікована Streptococcus. Сироватку в період одужання одержують від тварини, яка ефективно одужує, позбавляючись від інфекції. Таким чином, сироватка в період одужання тварини, яка була інфікована бактерією Streptococcus, включає антитіла і/або імунні клітини, які здатні захистити вказану тварину від зараження тим же штамом Streptococcus. Таким чином, інкубація з середою одужання переважна для визначення, чи здатний білок і/або його імуногенна частина, похідна і/або аналог за даним винаходом викликати захисну імунну відповідь. У одному з варіантів здійснення дійсного винаходу передбачається спосіб ідентифікації білка Streptococcus, який здатний викликати імунну відповідь щонайменше двох штамів Streptococcus, що включає: - одержання виділених і/або рекомбінантних білків Streptococcus, - інкубація вказаних білків з антитілом і/або імунними клітинами тварини, інфікованої першим штамом і/або серотипом Streptococcus, і з антитілом і/або імунними клітинами тварини, інфікованої другим штамом і/або серотипом Streptococcus, і - визначення, чи здатний білок зв'язувати антитіло і/або імунні клітини тварини, інфікованої першим штамом і/або серотипом Streptococcus, і антитіло і/або імунні клітини тварини, інфікованої другим штамом і/або серотипом Streptococcus. Білки Streptococcus одержують різними способами. Переважно секретовані білки, поверхнево-асоційовані білки і/або білки, які ідентичні щонайменше на 50 % послідовності бактеріального фактора вірулентності, виділені з культури Streptococcus. У одному з варіантів здійснення дійсного винаходу поверхнево-асоційовані білки виділяють з Streptococcus, використовуючи, наприклад, лізоцим. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу білки Streptococcus одержують рекомбінантно, використовуючи щонайменше одну послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше один з вказаних білків. Вище було вказано, що переважно використовують 4 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 секретовані білки, поверхнево-асоційовані білки і/або білки, які ідентичні щонайменше на 50 % послідовності бактеріального чинника вірулентності. Переважніше, вказаний ген зберігають щонайменше в двох штамах і/або серотипах Streptococcus. У іншому варіанті або додатково білок Streptococcus або його імуногенну частину, похідну і/або аналог, одержують, використовуючи інший метод, відомий в даній галузі. Наприклад, імуногенний білок або пептид Streptococcus одержують, використовуючи звичайний метод синтезу, наприклад, твердофазний синтез. У іншому прикладі білок Streptococcus виділений з Streptococcus або одержаний рекомбінантно, після чого його модифікують для того, щоб одержати імуногенну частину, похідну і/або аналог. В одному з переважних варіантів здійснення дійсного винаходу білки Streptococcus розділяють на поліакриламідному гелі і послідовно інкубують з антитілом і/або імунними клітинами тварини, інфікованої першим штамом і/або серотипом Streptococcus, і з антитілом і/або імунними клітинами тварини, інфікованої другим штамом і/або серотипом Streptococcus. Переважно застосовують двомірний поліакриламідний гель. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу ідентифікують білок Streptococcus, який здатний викликати антитіла, які індукують опсонофагоцитоз. Опсонофагоцитоз є природним процесом, в якому мікроорганізм опсонизується опсонінами, після чого вказаний мікроорганізм фагоцитується фагоцитними клітинами і знищується. Багато мікроорганізмів потребують опсонізації опсонінами для підвищення їх фагоцитозу. Опсонізація - це процес, в результаті якого мікроорганізм стає чутливішим для поглинання в результаті фагоцитозу. У вказаному процесі опсонізовані антитіла і/або білки зв'язані з вказаним мікроорганізмом, тим самим, полегшуючи поглинання вказаного мікроорганізму в результаті вказаного фагоцитозу. Таким чином, білок Streptococcus згідно даного винаходу або його імуногенна частина, похідна і/або аналог, що індукують антитіла, здатні викликати опсонофагоцитоз, є переважним, оскільки введення такого білка, і/або його імуногенної частини, похідноїі/або аналога тварині призводить до наявності опсонофагоцитоз-індукуючих антитіл у даній тварині, здатній фагоцитувати Streptococcus. Білок Streptococcus за даним винаходом, або його імуногенна частина, похідна і/або аналог здатні викликати імунну відповідь проти щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus. Для того, щоб викликати ще ширшу імунну відповідь, переважно виявити щонайменше два різні білки Streptococcus, і/або імуногенну частину, похідну і/або аналог щонайменше одного з вказаних білків. Переважніше щонайменше виявлення трьох різних білків Streptococcus, і/або імуногенній частини, похідної і/або аналога щонайменше одного з вказаних білків, і так далі. Підвищене число виявлених білків Streptococcus, і/або його імуногенних частин, похідних і/або аналогів за даним винаходом індукує ширшу імунну відповідь. У іншому переважному варіанті здійснення дійсного винаходу виявляють щонайменше один білок Streptococcus і/або імуногенну частину, похідну і/або аналог за даним винаходом, які здатні викликати імунну відповідь щонайменше трьох штамів Streptococcus. Вказаний білок і/або імуногенна частина, похідна і/або аналог особливо придатні для індукування широкої імунної відповіді у конкретної людини і/або тварини. Переважніше виявляють щонайменше один ідентифікований білок, і/або імуногенну частину, похідну, і/або аналог за даним винаходом з Streptococcus, який здатний індукувати імунну відповідь щонайменше трьох серотипів Streptococcus. Імуногенну частину білка визначають як ту частину білка, яка здатна викликати імунну відповідь у конкретної людини і/або тварини. Переважно вказана імуногенна частина здатна викликати того ж типа імунну відповідь, хоча необов'язково в тій же кількості, що і вказаний білок. Імуногенна частина білка переважно включає один або декілька епітопів вказаного білка. Епітоп білка визначають як частину вказаного білка, що складається щонайменше приблизно з 5 амінокислот в довжину, здатну індукувати специфічне антитіло і/або імунні клітини, здатні специфічно зв'язувати вказаний епітоп. Існує два різні типи епітопів: лінійні епітопи і конформаційні епітопи. Лінійний епітоп представляє послідовність розташованих підряд амінокислот. Конформаційний епітоп сформований декількома послідовностями розташованих підряд амінокислот, які складаються певним чином і разом формують епітоп правильно складеного білка. Імуногенна частина за даним винаходом здатна включати епітопи або одного, або обох вказаних типів. Імуногенна частина білка представляє щонайменше 5 амінокислотних залишків. Переважно вказана імуногенна частина представляє щонайменше 10, переважніше щонайменше 15, переважніше щонайменше 25, і найпереважніше щонайменше 30 послідовно розташованих амінокислот. Вказана імуногенна частина переважно представляє саме більше приблизно 500 амінокислотних залишків, переважніше саме більше 250 амінокислотних залишків, залежно від 5 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 типа білка, з якого вказана імуногенна частина походить. Похідну білка визначають як молекулу, яка володіє тими ж імуногенними властивостями, необов'язково вираженими кількісно. Фахівець в даній галузі здатний змінити білок таким чином, що імуногенні властивості вказаної молекули будуть в істотній мірі того ж типа, але необов'язково виражені кількісно, в порівнянні з вказаним білком. Похідну білка, наприклад, одержують за рахунок мутації щонайменше одного амінокислотного залишку вказаного білка і/або заміщення одного амінокислотного залишку на інший амінокислотний залишок. Переважно здійснюють консервативні амінокислотні заміщення, наприклад, заміщення амінокислоти, що включає кислий бічний ланцюжок, іншою амінокислотою, що включає кислий бічний ланцюжок, заміщення об'ємної амінокислоти іншою об'ємною амінокислотою, заміщення амінокислоти, що включає лужний бічний ланцюжок, іншою амінокислотою, що включає лужний бічний ланцюжок, і так далі. Фахівець в даній галузі може одержувати аналоги білка. Так, наприклад, це можливо шляхом скринінгу бібліотеки пептидів або зміною пептидних програм. Аналог за даним винаходом має в значній мірі ті ж імуногенні властивості вказаного білка, але не обов'язково виражені кількісно. Аналог білка за даним винаходом, наприклад, представляє гібридний білок і/або химерний білок. Для здатності індукувати імунну відповідь, імуногенній частині, похідному і/або аналогу за дійсним винаходом переважно надаються властивості для забезпечення вироблення антитіла і/або імунних клітин. Вказані властивості, відомі в даній галузі, наприклад, включають відповідні фланкируючі послідовності і/або сайти протеолітичного розщеплювання. У іншому варіанті, або додатково, білок, імуногенна частина, похідна і/або аналог за даним винаходом, переважно забезпечуються імуногенним носієм. Якщо білок або імуногенну частину, похідну і/або аналог за дійсним винаходом вводять людині або тварині, він зазвичай піддається ризику руйнування, викликаному рядом різних чинників, наприклад, протеолізом, порушенням складчастості, екстремальними величинами рН, детергентами і високими концентраціями солей. Для продовження періоду цілісності білка, або його імуногенної частини, похідної і/або аналога, його стійкість до руйнування переважно підвищують, наприклад, синтезом пептиду із C-кінцевим карбоксамідом, і/або ацетилюванням N кінця пептиду для підтримки вихідних властивостей заряду молекули. У одному з варіантів здійснення дійсного винаходу стійкість до руйнування додатково підвищують шляхом мутації білка або імуногенної частини, похідної і/або аналога за дійсним винаходом таким чином, що локальний процес порушення складання вказаного білка або його імуногенної частини, похідної і/або аналога, чутливих до автолізу щонайменше частково пригнічений. Стратегії стабілізуючих мутацій відомі і описані, наприклад Matthews (1991), Alber (1991), Vriend, Eijsink (1993) і Fersht, Serrano (1993). Секретований білок виражають як білок, який природним чином виробляється в клітині і/або організмі і щонайменше частково секретується з вказаних клітин і/або організму в зовнішнє середовище. Таким чином, при культивуванні Streptococcus секретований білок щонайменше частково, міститься щонайменше в частині культурального середовища щонайменше в деяких тимчасових точках. Білок, що секретується, необов'язково повинен вироблятися і/або секретуватися постійно. Секретований білок може, наприклад, вироблятися і/або секретуватися під час певної фази життєвого циклу бактерії. Крім того, вироблення і секреція білка, що секретується, не обов'язково відбувається в один і той же час. Наприклад, деякі секретовані білки спочатку акумулюються усередині клітини і секретуються пізніше. Асоційований з поверхнею білок визначають як білок, який в нормі формує частину поверхні клітини, або який приєднаний до поверхні клітини. Якщо вказаний білок, що асоціюється з поверхнею клітини, приєднаний до поверхні клітини, приєднання є або безпосереднім, або непрямим. Непряме приєднання, наприклад, включає наявність щонайменше одного лінкера. Поняття "виділений білок" належить до білка, який щонайменше частково виділений з природного середовища, і/або до білка, який не містить щонайменше частини послідовності, що є у природної форми. Поняття "рекомбінантний білок" належить до білка, який виробляється виділеною і/або штучною системою експресії, переважно використовуючи послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує вказаний білок. Вказана послідовність нуклеїнової кислоти переважно оперативно пов'язана щонайменше з однією регуляторною послідовністю, наприклад, промотором, енхансером і/або теминатором. Переважно вказана регуляторна послідовність є індукованою, тому можливий контроль тривалості експресії вказаного білка. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу вказана послідовність нуклеїнової кислоти включає екзогенну послідовність нуклеїнової кислоти. Екзогенна послідовність нуклеїнової кислоти є послідовністю нуклеїнової 6 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислоти, яка міститься в сайті генома організму, в якому вказана послідовність нуклеїнової кислоти в природному варіанті відсутня. Після ідентифікації способом за даним винаходом здатності білка Streptococcus індукувати імунну відповідь проти щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus, переважно здійснюють його вироблення. Вироблений білок, наприклад, придатний для вироблення імуногенної композиції і/або індукування імунної відповіді проти щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus в організмі тварини. Згідно з вказаним вище, різні способи вироблення білка відомі в даній галузі, наприклад, вироблення із застосуванням рекомбінації. Даний винахід, таким чином, передбачає спосіб одержання щонайменше одного білка, виявленого за способом даного винаходу. Білок Streptococcus, який здатний індукувати імунну відповідь проти щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus, одержуваний за способом за даним винаходом, також описаний в дійсному винаході. Білок Streptococcus і/або імуногенна частина, похідна і/або аналог за даним винаходом особливо застосовні для приготування імуногенної композиції. Вказана імуногенна композиція здатна індукувати широку гуморальну і/або клітинну імунну відповідь проти щонайменше, двох штамів Streptococcus. Переважно білок Streptococcus і/або його імуногенна частина, похідна і/або аналог, здатні викликати імунну відповідь проти щонайменше двох серотипів Streptococcus, використовують для приготування імуногенної композиції таким чином, що досягається широка імунна відповідь проти щонайменше, двох серотипів Streptococcus. Застосування білка, який може бути одержаний за способом даного винаходу, або його імуногенної частини, похідної і/або аналога для приготування імуногенної композиції, здатної індукувати імунну відповідь щонайменше проти двох штамів і/або серотипів Streptococcus, таким чином також передбачає імуногенну композицію, здатну індукувати імунну відповідь проти щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus, включаючи щонайменше один виділений і/або рекомбінантний білок, що одержується способом за даним винаходом, або його імуногенну частину, похідну і/або аналог. Для того, щоб забезпечити ширший захист щонайменше два або декілька білків і/або імуногенні частини, похідні і/або аналоги за даним винаходом переважно використовують для приготування імуногенної композиції. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу комбінацію щонайменше одного білка і щонайменше однієї імуногенної частини, похідної і/або аналога за даним винаходом, використовують для приготування імуногенної композиції. Окрім ширшого захисту, застосування щонайменше двох білків і/або імуногенних частин, похідних і/або аналогів за даним винаходом знижує зміну "вислизнувших" виділених мутантів бактерій Streptococcus. "Вислизнулі" мутанти бактерій зазвичай виникають за стресових умов зовнішнього середовища, наприклад, у присутності антибіотика і/або у присутності антитіла проти епітопа вказаного організму. Завдяки природній варіабельності в популяції організму деякі організми уникають інгібіруючого ефекту вказаного стресу зовнішнього середовища, наприклад, антибіотика і/або антитіла, і здібні до розмноження. Зміна розвитку "вислизнувшого" мутанта для декількох різних епітопів одночасно менше, ніж зміна розвитку "вислизнувшого" мутанта лише для одного епітопа. Таким чином, імуногенна композиція за даним винаходом переважно включає щонайменше два виділених і/або рекомбінантних білка, і/або щонайменше одну їх імуногенну частину, похідну і/або аналог, одержувані за способом даного винаходу. Для того, щоб ще краще уникнути формування "вислизнувших" мутантів, білок за даним винаходом переважно представляє істотно важливий білок. Це білок, який переважно істотно важливий для метаболізму, виживання і/або розмноження бактерій Streptococcus. Таким чином, можливий "вислизнувший" мутант із зміненим істотно важливим білком менш життєздатний або нежиттєздатний. Таблиці 5 і 6 включають перелік переважних білків Streptococcus uberis, які ідентифіковані за способом даного винаходу. Ці білки, або щонайменше одна їх імуногенна частина, похідна і/або аналог, застосовні для приготування імуногенної композиції за дійсним винаходом. Застосування за даним винаходом білка, який вибраний із таблиці 5 і/або таблиці 6, таким чином також передбачається, разом з імуногенною композицією за дійсним винаходом, що включає щонайменше один виділений і/або рекомбінантний білок, представлений в таблиці 5 і/або таблиці 6, або його імуногенну частину, похідну і/або аналог. Аби забезпечити ще ширший захист, вказана імуногенна композиція переважно включає щонайменше два білки, представлені в таблиці 5 і/або таблиці 6, і/або їх імуногенні частини, похідні і/або аналоги. Найбільш переважно вказана імуногенна композиція включає щонайменше три білки, представлені в таблиці 5 і/або таблиці 6, і/або їх імуногенні частини, похідні і/або аналоги. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу щонайменше один, щонайменше два 7 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або щонайменше три білки, представлені в таблиці 5 і/або таблиці 6, вибрані з групи, що включає P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100, P105, білок поверхневого виключення, тригерний чинник (ropA) і нуклеозиддифосфаткіназу. Ці білки або розпізнаються антитілом, наявним в сироватці тварин, інфікованих S. uberis, вказуючи на те, що ці білки експресуються in vivo і є імуногенними в організмах корів, або володіють перехресною реактивною здатністю між щонайменше двома штамами S. uberis, представленими в таблиці 5. Нумерація описаних вище білків, наприклад, в таблиці 5, належить до білків, представлених, наприклад, в таблиці 1, 2 і 3, які показують, але ними не обмежуються, приклади звичайних поверхневих білків S. uberis. Крім того, фіг. 4 показує, але ними не обмежується, приклади послідовностей нуклеїнових кислот і амінокислот цих вибраних передбачуваних поверхневих білків/чинників вірулентності бактерій вигляду S. uberis. Білки, які високо консервативні, експресуються in vivo і високо імуногенні, наприклад білки, які розпізнаються сироватками в період одужання від корів, інфікованих різними штамами згідно з прикладом 11, є особливо застосовними в імуногенних композиціях за даним винаходом. У ще переважнішому варіанті здійснення дійсного винаходу, таким чином, вибір білків з таблиці 5 і/або таблиці 6 включає білок, вибраний з групи, що включає P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93 і P105. Найпереважніше вибір білків з таблиці 5 і/або таблиці 6 представляє білок, вибраний з групи, що складається з P15, P16, P54, P28, P63 і P105. У прикладі 11 показано, що подальший відбір розпізнається всіма застосовуємими онвалесцентними сироватками, що свідчить, що ці антигени експресуються всіма штамами S. uberis, які викликають відповідну інфекцію, що ці антигени експресуються під час інфікування організму господаря і що ці антигени у високій мірі іммуногенні. У ще одному з варіантів здійснення дійсного винаходу передбачають імуногенну композицію, здатну індукувати імунну відповідь щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus, що включають щонайменше одну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше один білок, що одержується за способом даного винаходу, або імуногенну частину, похідну і/або аналог вказаного білка. При введенні вказаної імуногенної композиції тварині вказана молекула нуклеїнової кислоти експресується в організмі тварини, приводячи до експресії щонайменше один білок і/або імуногенну частину, похідний і/або аналог за даним винаходом. Вироблення і, необов'язково, позаклітинна екскреція вказаного білка і/або імуногенної частини, похідної і/або аналога приводить до імунної відповіді. У одному з варіантів здійснення дійсного винаходу білок за дійсним винаходом і/або його імуногенна частина, похідна і/або аналог одержують шляхом рекомбінації. Даний винахід передбачає спосіб вироблення імуногенної композиції, здатної індукувати імунну відповідь щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus, причому вказаний спосіб включає введення клітин або іншої системи експресії щонайменше з одним рекомбінантним вектором, причому вказаний щонайменше один вектор включає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше один білок, що одержується способом за даним винаходом, і/або щонайменше один білок, вибраний з таблиці 5 і/або таблиці 6, і/або імуногенну частину, похідну і/або аналог вказаного білка. Відповідні вектори експресії відомі в даній галузі. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу експресується щонайменше одна послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує один білок за даним винаходом або його імуногенну частину. В іншому варіанті здійснення дійсного винаходу використовують щонайменше одну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше два білки і/або імуногенні частини. Також можливе використання щонайменше двох молекул нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодує один або декілька білків і/або імуногенних частин за дійсним винаходом і таке інше. Наприклад, можна використовувати одну молекулу, що кодує (щонайменше) один білок, і одну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує (щонайменше) одну імуногенну частину. Таким чином, можливі варіації числа молекул нуклеїнової кислоти і числа білків і/або імуногенних частин, що кодуються вказаними молекулами нуклеїнової кислоти. Послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом інсертована, наприклад, в геном клітини гомологічною рекомбінацією. Також можливо інсертувати послідовність нуклеїнової кислоти випадковим чином, наприклад, електропорацією. В іншому варіанті або додатково, вказана послідовність нуклеїнової кислоти поміщається у вектор, наприклад, плазмідний вектор або фаговий вектор, який стабільний у вибраній системі експресії, що представляє мікроорганізм і/або клітину. Вказана послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом переважно транскрибується і транслюється під контролем регуляторної послідовності, наприклад промотора, енхансера і/або термінатора. Переважно вказаний промотор, енхансер і/або термінатор застосовний для використання у вибраній системі експресії. Більш переважно вказана регуляторна послідовність індукуєма для того, щоб допустити контрольовану експресію. 8 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Промотори і термінатори, застосовні для різних мікроорганізмів, описані в кн.: Biseibutsugaku Kisokoza (Basic Microbiology), 1990, т. 8, Genetic Technology, Kyoritsu Shuppan. Наприклад, допустимими плазмідними векторами для Escherichia, точніше, для Escherichia coli, є плазміди серії pBR і pUC, а також допустимі промотори, наприклад, промотор lac (ß-галактозідази), оперон trp (триптофановий оперон) і промотор tac (гібридний промотор lac-trp) і промотори, похідні від λ-faag PL або PR. До переважних термінаторів відносяться trpA- або похідний від фага rrnB рибосомальний термінатор. Плазмідні вектори, застосовні для рекомбінантного вироблення Streptococcus, включають, наприклад pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett. 26, 1985, с. 239), pGK1 (Appl. Environ. Microbiol. 50, 1985, с. 94). Даний винахід також передбачає молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше два білки Streptococcus, які можуть бути одержані способом за даним винаходом, і/або вибрані з таблиці 5 і/або таблиці 6, і/або імуногенну частину щонайменше одного з вказаних білків, під контролем функціонально зв'язаної регуляторної послідовністі, наприклад, промотора. Виділені клітини-господарі, що включають послідовність нуклеїнової кислоти, які кодують щонайменше два білки, що одержуються способом за даним винаходом і/або вибрані з таблиці 5 і/або таблиці 6, і/або їх імуногенну частину, також передбачені в даному винаході. Вказані клітини-господарі переважно представляють прокаріотичні клітини-господарі. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу молекулу нуклеїнової кислоти за даним винаходом використовують для індукування імунної відповіді проти Streptococcus. Індукцію переважно здійснюють з рекомбінантним носієм, що включає нуклеїнову кислоту, що кодує щонайменше один білок, що одержується способом за даним винаходом, і/або вибраний з таблиці 5 і/або таблиці 6, і/або імуногенну частину вказаного щонайменше одного білка, або рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти за даним винаходом. Вказаний рекомбінантний носій, таким чином, також передбачений в даному винаході. Найпереважніше також передбачений рекомбінантний носій, що включає нуклеїнову кислоту, що кодує щонайменше один білок, вибраний з таблиці 5 і/або таблиці 6. В одному особливо переважному варіанті здійснення дійсного винаходу вказаний рекомбінантний носій включає нуклеїнову кислоту, що кодує щонайменше два білки, які вибрані з таблиці 5 і/або таблиці 6. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу допускається вироблення вказаного рекомбінантного носія, щонайменше одного білка за даним винаходом, після чого щонайменше один рекомбінантний білок і сам носій використовують для індукування імунної відповіді проти щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus. У іншому варіанті здійснення дійсного винаходу передбачений неживий рекомбінантний носій за даним винаходом. У ще одному з варіантів здійснення дійсного винаходу також передбачається живий рекомбінантний носій за даним винаходом. У іншому варіанті здійснення дійсного винаходу вказаний живий носій є аттенуірованим носієм. Живий носій за даним винаходом переважно здатний інфікувати людину і/або тварину, після чого індукується імунна відповідь проти щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus. Рекомбінантний носій за даним винаходом переважно представляє види Streptococcus. При цьому імунна відповідь, направлена проти Streptococcus, індукується і білком (білками), і/або імуногенною частиною (частинами), похідним (похідними), і/або аналогом (аналогами), кодованими вказаним носієм, і самим вказаним рекомбінантним носієм. Продукти експресії капсулярного гена Streptococcus часто є високо імуногенними і серотип-специфічними. Таким чином, наявність продуктів експресії капсулярного гена перешкоджає індукування імунної відповіді, направленої проти різних штамів і/або серотипів Streptococcus. У одному з варіантів здійснення дійсного винаходу, таким чином, якщо рекомбінантний носій за даним винаходом включає Streptococcus, вказаний Streptococcus втрачає щонайменше частину продукту експресії капсулярного гена. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу вказана бактерія Streptococcus належить до некапсулярних стрептококів. Згідно з описаним вище, імунізація щонайменше двома білками і/або імуногенними частинами, похідними і/або аналогами, похідними щонайменше від двох різних штамів і/або серотипів Streptococcus, передбачає широкий захист і мінімізацію зміни формування "вислизнувших" мутантів. Переважний варіант застосування даного винаходу, таким чином, передбачає рекомбінантний носій за даним винаходом, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше один білок і/або його імуногенну частину, похідну від першого штаму і/або серотипа Streptococcus, і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше один білок і/або його імуногенну частину, похідну від другого штаму і/або серотипа Streptococcus. Вказаний рекомбінантний носій переважно включає живий рекомбінантний носій. Рекомбінантний носій, наприклад, виробляється у відповідних клітинах-господарях. Таким 9 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чином, клітини-господарі, що включають рекомбінантний носій за даним винаходом, також передбачені. Рекомбінантний носій за даним винаходом застосовний для вироблення імуногенної композиції, здатної індукувати імунну відповідь щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus. Таким чином, в даному винаході також передбачена імуногенна композиція, здатна індукувати імунну відповідь Streptococcus, причому також передбачена вказана композиція, що включає рекомбінантний носій за дійсним винаходом. Після введення імуногенної композиції за даним винаходом людині і/або тварині, індукується імунна відповідь проти Streptococcus. Вказана імунна відповідь переважно здатна щонайменше частково, протидіяти захворюванню, пов'язаному з бактеріями роду Streptococcus. Таким чином, в даному винаході також передбачена імуногенна композиція за даним винаходом для застосування як лікарський засіб, а також застосування імуногенної композиції за даним винаходом для приготування лікарського засобу проти захворювання, пов'язаного з бактеріями роду Streptococcus. Імуногенна композиція за дійсним винаходом також застосовна для вироблення вакцини. Вказана вакцина переважно здатна щонайменше частково забезпечувати захист від захворювання, пов'язаного з бактерією роду Streptococcus. Переважно, вказана вакцина здатна забезпечити захист від інфекції Streptococcus. Даний винахід, таким чином, передбачає застосування імуногенної композиції за даним винаходом для приготування вакцини. Білок, імуногенну частину, похідну, аналог і/або рекомбінантний носій за даним винаходом переважно вводять конкретній людині і/або тварині разом з відповідним носієм. Вказаний носій переважно полегшує сприйняття вказаною конкретною людиною і/або твариною вказаного білка, імуногенної частини, похідної, аналога і/або рекомбінантного носія за даним винаходом і переважно підвищує імуногенний ефект. Відповідний носій за даним винаходом, наприклад, включає відповідний ад'ювант, здатний підвищувати імунізуючий ефект імуногенної композиції за даним винаходом. Багато відповідних ад'ювантів на основі масла і води відомі фахівцям в даній галузі. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу вказаним ад'ювантом є Diluvac Forte і/або Specol. У іншому варіанті здійснення дійсного винаходу вказаний відповідний носій представляє розчин, наприклад, фізіологічний розчин для розведення білків або його імуногенних частин, похідних і/або аналогів. Таким чином, даний винахід також описує імуногенну композицію за даним винаходом, що включає щонайменше один білок, імуногенну частину, похідну, аналог і/або рекомбінантний носій за даним винаходом і відповідний носій. Імуногенна композиція за даним винаходом здатна викликати імунну відповідь Streptococcus у конкретної людини і/або тварини і, тим самим, вона знижує і/або знищує ряд бактерій Streptococcus у вказаної конкретної людини і/або тварини. Даний винахід, таким чином, передбачає спосіб зниження і/або знищення ряду бактерій Streptococcus у людини і/або тварини, що включає одержання вказаним індивідуумом і/або твариною імуногенної композиції за дійсним винаходом. Імуногенна композиція за даним винаходом переважно здатна щонайменше частково перешкоджати розвитку захворювання і/або попереджати захворювання, пов'язане з бактеріями роду Streptococcus. Якщо захворювання, пов'язане з бактеріями роду Streptococcus, вже виникло, імуногенна композиція за даним винаходом переважно здатна щонайменше частково, протидіяти вказаному захворюванню. Фармацевтична композиція, що представляє імуногенну композицію за даним винаходом і, переважно, відповідний носій, наприклад, ад'юванти Diluvac Forte і/або Specol, таким чином, також передбачені в дійсному винаході. В іншому варіанті здійснення дійсного винаходу передбачають спосіб виміру імунітету конкретної людини і/або тварини проти Streptococcus, який включає визначення щонайменше в одному зразку вказаного індивідуума і/або тварини, наявність антитіла і/або імунних клітин, направлених проти білка, що одержується способом за даним винаходом, і/або вибраного з таблиці 5 і/або таблиці 6, або його імуногенної частини. Діагностичний набір, що включає щонайменше один білок, що одержується способом за даним винаходом, і/або вибраний з таблиці 5 і/або таблиці 6, або його імуногенну частину, і засоби виявлення зв'язування антитіла і/або зв'язування імунних клітин з вказаним білком або його імуногенною частиною, також представлені в даному винаході. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу вказаний діагностичний набір включає щонайменше два білки, вибраних з таблиці 5 і/або таблиці 6. Детальний опис винаходу Спосіб за даним винаходом є переважним варіантом здійснення дійсного винаходу, застосованим для ідентифікації білка Streptococcus uberis, здатного викликати імунну відповідь щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus uberis. Вказаний білок Streptococcus 10 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 uberis переважно використовують для приготування імуногенної композиції, здатної викликати імунну відповідь щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus uberis. Імуногенна композиція за дійсним винаходом, яка здатна викликати імунну відповідь щонайменше двох штамів і/або серотипів Streptococcus uberis, що включає щонайменше один, переважно щонайменше два, виділених і/або рекомбінантних білка, одержуваних способом за даним винаходом, або щонайменше одну його імуногенну частину, похідну і/або аналог, таким чином, також передбачені в даному винаході, а також передбачені їх застосування для приготування лікарського засобу проти маститу, що викликається Streptococcus uberis. Даний винахід також передбачає виділену або рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше два білки Streptococcus uberis, одержуваних способом за дійсним винаходом, і/або вибраних з таблиці 5 і/або таблиці 6. Також передбачені рекомбінантні носії, клітини-господарі і імуногенні композиції, що включають вказану нуклеїнову кислоту, а також їх застосування. Бактерія Streptococcus uberis асоційована з маститом у корів. Мастит у корів представляє інфекцію молочної залози, зазвичай викликану бактеріями. Запальна відповідь після інфікування призводить до зниження продуктивності і якості молока і викликає значні щорічні економічні втрати при виробництві молока. Економічна втрата в Нідерландах складає приблизно 100 євро на корову в рік. Серед видів бактерій більшість видів, що зазвичай асоціюються з маститом, є різними видами роду Streptococcus, включаючи Streptococcus uberis (нетипуємий вид), Streptococcus agalactiae (група B за класифікацією Ленсфілда), Streptococcus dysgalactiae (група C за класифікацією Ленсфілда), Streptococcus zooepidemicus і стрептококи груп D, G, L і N за класифікацією Ленсфілда. Деякі з цих видів є заразливими (наприклад S. agalactiae), хоча інші представляють патогени, поширені в довкіллі (наприклад S. dysgalactiae і S. uberis). Мастит, що виникає в результаті зараження S. uberis, зазвичай протікає безсимптомно, відрізняючись зовні нормальним молоком з підвищеною кількістю соматичних клітин із-за припливу лейкоцитів. Мастит може бути різним зв важкостю, виходячи з клінічних проявів, викликаних інфекцією. Помірна форма маститу може декілька підвищити температуру тіла і/або підвищити температуру вимені. У важчих випадках мастит, що викликається S. uberis, може також протікати в гострій клінічній формі з очевидними ознаками захворювання, наприклад, згустками в молоці або із зміною кольору молока, набряканням або ущільненням молочної залози. Деякі випадки клінічного захворювання можуть бути важкими, і може спостерігатися гіпертермія. Огляд клінічних проявів маститу, викликаного S. uberis, див. в роботах Bramley (1991) і Schalm і ін. (1971). Традиційні способи знищення бактеріальних інфекцій, наприклад, пальпація соска і лікування антибіотиками, ефективні для знищення багатьох типів контагіозних маститів, але бактерії, в нормі присутні в довкіллі і зазвичай пов'язані зі всіма молочними виробництвами, часто стійкі до таких способів. Отже, вказані способи не ефективні в разі маститу, викликаного патогенами зовнішнього середовища, наприклад Streptococcus uberis і Escherichia coli, які в даний час відповідальні за більш ніж 95 % випадків маститу. З цих двох видів S. uberis є найбільш важливим патогеном, що поступає з довкілля, що слідує з досліджень, проведених у Великобританії (Hillerton і ін., 1993), в Новій Зеландії (McDougall, 1998), в США (Hogan і ін., 1989) і в Нідерландах (Animal Health Service, 2000). Також встановлено, що S. uberis, якщо інфекція походить із зовнішнього середовища, може безпосередньо поширитися від інфікованої корови іншій чутливій тварині (Neave і ін., 1969, Oliver і ін., 1999, Zadoks і ін., 2001). Відомо декілька штамів S. uberis, які відрізняються за вірулентністю і антигенністю. Неспроможність сучасних способів, що стосуються знищення збудника маститу S. uberis, привела до пошуку інших засобів боротьби з інфекцією, наприклад, ефективніших вакцин. До теперішнього часу було одержане і досліджене на коровах декілька типів вакцин. Повторна імунізація молочної худоби убитими цілими бактеріями призводить до зниження числа бактерій, що містяться в молоці після експериментального зараження тим же штамом (Leigh, 1999; Leigh, 2000). Проте убита вакцина не попереджає ні інфікування, ні запальної відповіді в молочній залозі, і не впливає на захворюваність маститом, що викликається S. uberis, у полі (Leigh, 1999). Таким чином, був зроблений висновок, що імунізація убитими бактеріями не вирішує проблеми маститу, викликаного S. uberis. Імунізація живими бактеріями S. uberis викликає частковий захист проти експериментального зараження тим же (або гомологічним) штамом (Finch і ін., 1997). Захист досягався при відсутності опсонізуючої активності і без великого зосередження нейтрофілів. Проте виявляється, що вакцина не захищає від інших штамів S. uberis. Відносно невелика користь від застосування вакцин з таких цілих клітин показує, що важко захистити тварин проти S. uberis, використовуючи звичайні 11 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вакцини з цілих бактерій. Пізніше була одержана субодинична вакцина, заснована на одному білку S. uberis (Fontaine і ін. 2002). Публікація вказаної субодиничної вакцини до теперішнього часу не привела до подальшого розвитку, в результаті було зроблено висновок, що зміни у виявленні цілого білка, який може захистити тварину від декількох типів S. uberis, незначні, і субодиничні вакцини цього типа зазвичай не відповідають вирішенню проблеми боротьби з маститом, що викликається S. uberis. Таким чином, мастит, викликаний S. uberis, ефективно не попереджається або не виліковується вакцинацією цілими живими або убитими бактеріями або субодиничною вакциною, що включає один білок. Не дивлячись на описані вище невдачі вакцинації проти маститу, що викликається S. uberis, у даному винаході описують успішне попередження і/або послаблення прояву захворювань маститу, викликаних різними штамами S. uberis, за рахунок застосування антигенної композиції, здатної індукувати імунну відповідь S. uberis за даним винаходом. Даний винахід передбачає спосіб ідентифікації білка Streptococcus uberis, здатного індукувати імунну відповідь проти щонайменше двох штамів і/або типів Streptococcus uberis, що включає: a) ідентифікацію щонайменше частини секретованого білка, що асоціюється з поверхнею білка і/або білка, послідовність якого щонайменше на 50 % ідентична послідовності бактеріального чинника вірулентності; б) вибір щонайменше одного білка, виявленого на стадії a), який зберігається щонайменше в двох штамах і/або типах Streptococcus uberis; і в) визначення, чи може щонайменше один білок, вибраний на стадії б), або його імуногенна частина, похідна і/або аналог, специфічно зв'язуватися з антигеном, і/або імунними клітинами тварини, інфікованої першим штамом і/або типом Streptococcus uberis, і антитілом і/або імунними клітинами тварини, інфікованої другим штамом і/або типом Streptococcus uberis. Переважно, вказаний білок, послідовність якого щонайменше на 50 %, щонайменше на 60 %, переважніше щонайменше на 70 %, переважніше щонайменше на 75 %, найпереважніше щонайменше на 80 % ідентична послідовності бактеріального чинника вірулентності. Даний винахід, крім того, представляє комбінацію щонайменше двох виділених або рекомбінантних поверхневих білків S. uberis або їх імуногенних частин в антигенній композиції, яка істотно підвищує імунну відповідь проти штамів S. uberis. Хоча вакцини з цілих бактеріальних клітин, що включають багато бактеріальних імуногенних білків, не викликають широкого захисту проти різних штамів S. uberis, два або декілька білків або їх імуногенні частини в імуногенній композиції за даним винаходом володіють необхідним ефектом підвищення імунної відповіді проти S. uberis. У дійсному винаході встановлено, що вибір щонайменше двох імуногенних білків або їх імуногенної частини бактерії S. uberis, і переважно щонайменше двох штамів або типів бактерій S. uberis, і комбінування вказаних щонайменше двох імуногенних білків або їх імуногенної частини в імуногенній композиції підвищує імунітет проти різних штамів S. uberis, оскільки імунна відповідь бажана проти широкого круга бактерій S. uberis. Для індукування імунної відповіді у людини або тварини переважно імуногенна частина білка поступає вказаній людині або тварині. У даному винаході поняття "імуногенний сайт" використовують взаємозамінно з поняттям "імуногенна частина". Поняття "імуногенний сайт (імуногенна частина)" означає частину білка, здатну індукувати імунну відповідь у суб'єкта. Переважно вказана імуногенна частина білка включає один або декілька епітопів і відповідно індукує імунну відповідь. Імуногенна частина включає щонайменше 5 aмінoкислот, переважно щонайменше 10-15, і найпереважніше 25 або декількох послідовно розташованих амінокислот. Таким чином, даний винахід в іншому варіанті свого застосування передбачає білок або його імуногенну частину, що включає щонайменше відрізок з 30 послідовно розташованих амінокислот білкової молекули, яка кодується нуклеїновою кислотою за даним винаходом. Конформаційний епітоп зазвичай формується декількома відрізками послідовно розташованих амінокислот, які складаються і разом формують епітоп, коли білок приймає властиву йому тривимірну структуру. Даний винахід також описує застосування конформаційних епітопів як імуногенні частини. Похідну білка означає білок, що володіє тим же типом імуногенних властивостей, але не обов'язково в тій же кількості. Фахівець в даній галузі здатний змінити білок таким чином, що імуногенні властивості вказаної молекули будуть в істотній мірі того ж типа, але не обов'язково в тій же кількості. Похідна білка може бути одержана багатьма способами, наприклад, шляхом консервативного заміщення амінокислот, наприклад, заміщенням одній aмінoкислоти у білку на 12 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іншу амінокислоту. При традиційному замісному картуванні переважно здійснюють, наприклад, заміщення амінокислот, що включають кислий бічний ланцюжок, на іншу амінокислоту, що включає кислий бічний ланцюжок, об'ємну амінокислоту на іншу об'ємну амінокислоту, амінокислоту, що включає основний бічний ланцюжок, на амінокислоти, що включають основний бічний ланцюжок, амінокислоти, що включають незаряджений полярний бічний ланцюжок на амінокислоти, що включають незаряджені полярні бічні ланцюжки, і амінокислоти, що включають неполярний бічний ланцюжок на амінокислоти, що включають неполярний бічний ланцюжок. Фахівець в даній галузі здатний виробляти аналогічні білкові сполуки. Наприклад, шляхом скринінгу пептидної бібліотеки або за програмою зміни пептидів. При використанні в якості імуногену пептид синтезують з покращуваними властивостями, аби підвищити високу вірогідність успішного вироблення антитіла. До них відноситься C-кінцева вільна карбоксильна група, якщо пептид представляє C-кінцеву послідовність нативного білка, і вільна N-кінцева aмінoгрупа, якщо пептид представляє реальну N-кінцеву послідовність нативного білка. Такий аналог володіє в достатній мірі тими ж імуногенними властивостями вказаного білка, але не обов'язково в тій же кількості. Білок або пептид являє собою об'єкт для руйнування рядом різноманітних засобів, наприклад, протеолізом, порушенням складчастості, граничними величинами pH, детергентами і високими концентраціями солей. Для продовження терміну збереження рекомбінантного білка або пептиду, вказаний білок або пептид роблять стабільнішим для протистояння руйнуванню, наприклад, шляхом синтезу вказаного пептиду із C-кінцевим карбоксамидом і/або ацетилювання N-кінця для підтримки властивостей нативного заряду. Цього також можна досягти за рахунок мутацій, використовуючи стратегію стабілізуючих мутацій для придушення процесів місцевого розгортання, які зазвичай роблять білок чутливим до автолізу. Вказана стратегія стабілізуючої мутації заснована на зазвичай прийнятих принципах структури білка і стабільності, згідно з описом, наприклад Matthews (1991), Alber (1989), Vriend і Eijsink (1993), Fersht і Serrano (1993). В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу імуногенна композиція за даним винаходом включає композицію, що містить щонайменше два рекомбінантних або виділених поверхневих білка, або їх похідні, або аналоги, і/або імуногенні частини, причому введення композиції людині або тварині, переважно корові, наводить до розвитку гуморальної і/або клітинної імунної відповіді відносно вказаних поверхневих білків або їх імуногенних частин. Імуногенна відповідь включає формування гуморальної і/або клітинної імунної відповіді, направленої проти вказаного білка або його імуногенної частини у людини або тварини, переважно корови. Гуморальна імунна відповідь приводить до вироблення антитіла у людини або тварини, оскільки клітинна імунна відповідь переважно підвищує формування реактивних імунних клітин. В цілому обоє складові імунної відповіді індукуються введенням імуногенного білка або його частини. Переважна імунна відповідь проти S. uberis полягає у виробленні антитіл. Переважно вказана імунна відповідь попереджає і/або знижує прояв маститу, і/або знижує число бактерій S. uberis у вимені. Даний винахід описує способи відбору і вироблення білків і епітопів для індукування вказаної відповіді у вигляді антитіл. Іншою переважною імунною відповіддю проти S. uberis є клітинна імунна відповідь. Даний винахід також описує способи відбору епітопів Т-клітин поверхневих білків і вироблення епітопів Т-клітин, що викликають підвищену Т-клітинну реактивність, наприклад, шляхом з'єднання складених заздалегідь вибраних епітопів Т-клітин за типом ланцюжка намиста (string-of bead fashion), наприклад, згідно з описом Van der Burg і ін. (WO 97/41440). В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу вказана імуногенна композиція здатна знижувати тривалість і/або важкість інфекції і/або підвищувати стійкість тварин до інфікування бактерією S. uberis. Даний винахід описує імунну відповідь, направлену проти зовнішньої поверхні S. uberis, що є переважним. Таким чином, дійсний винахід описує імуногенну композицію або її імуногенну частину, яка здатна індукувати імунну відповідь на антигени, переважно розташовані на поверхні клітин або біля поверхні клітин S. uberis. До поверхневих білків за даним винаходом відносяться білки, які в природному стані переважно знаходяться біля або на поверхні бактерій S. uberis, і/або білкі, які в природному стані переважно виробляються і/або екстрагуються бактеріями S. uberis позаклітинно. Вказані поверхневі білки переважно мають гомологічні білки в інших штамах S. uberis. Таким чином, імунна відповідь індукується імуногенними білками або їх частинами, похідними від одного штаму S. uberis, і він також ефективний проти інших штамів S. uberis. Таким чином, даний винахід описує імуногенну композицію, здатну індукувати імунну відповідь S. uberis, причому вказана композиція включає щонайменше два рекомбінантних і/або виділених поверхневих білка, похідних від Streptococcus uberis, і/або імуногенні частини одного 13 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або обох вказаних білків. Поняття "рекомбінантний білок" належить до білка, що одержується методами рекомбінації ДНК, тобто, що виробляється клітинами, трансформованими конструкцією нуклеїнової кислоти, що кодує необхідний білок. Вказана конструкція нуклеїнової кислоти є прикладом конструкції рекомбінантної ДНК з регуляторною послідовністю, наприклад, промоторною послідовністю, і/або термінуючою послідовністю, і/або енхансерною послідовністю, яка контролює експресуючу послідовність. Поняття "виділений білок" належить до білка, виділеного і очищеного з цілого організму, у складі якого молекула виявлена в природі; і/або білку, що не містить, повністю або частково, речовин, які в нормі супроводять білок в природі. Вказана імуногенна композиція включає або щонайменше два білки, або їх імуногенні частини, похідні від тієї ж бактерії S. uberis, або вона включає щонайменше один білок або його імуногенну частину від одного типа бактерій S. uberis і щонайменше один білок або його імуногенну частину від бактерії S. uberis іншого типа. Даний винахід також описує комбінацію щонайменше 3, або 4, або більшої кількості білків або їх імуногенних частин, з яких один, або два або більш похідні від інших типів S. uberis. Переважно імуногенна композиція або її імуногенна частина за даним винаходом включає білки щонайменше двох різних організмів S. uberis, оскільки одержувана широка імунна відповідь забезпечує перехресний захист, тобто направлений проти різних типів S. uberis. Крім того, застосування імуногенних білків або їх імуногенних частин щонайменше двох типів штамів S. uberis, знижує зміни в розвитку "вислизнулих" мутантів бактерій S. uberis. Висмикування бактерій мутантів зазвичай відбувається в стресових умовах зовнішнього середовища, наприклад, у присутності антибіотика, або у присутності антитіла проти епітопа вказаного організму. За рахунок природних варіацій, наприклад, викликаних низькою частотою мутації в популяції бактерій, у деяких бактерій вказаної популяції реплікація пригнічується більше вказаними антитілами, чим у інших, які "вислизнули" від інгібіруючої дії присутнього вказаного антитіла, і зберігають можливість розмножуватися, тим самим, займаючи переважаюче положення в новій популяції. Зміна розвитку "вислизнувшого" мутанта по декількох різних епітопах одночасно менше, ніж зміна розвитку "вислизнувшого" мутанта лише для одного епітопа. Імуногенна композиція і/або її імуногенна частина переважно індукує імунну відповідь проти щонайменше двох білків, переважно викликаючи широкий захист проти інфекції і зниження клінічних ознак маститу. Таким чином, справжнє застосування передбачає імуногенну композицію, здатну індукувати імунну відповідь Streptococcus uberis, що включає щонайменше два рекомбінантних і/або виділених поверхневих білка, похідних щонайменше від одного штаму Streptococcus uberis, і/або імуногенну частину, або аналог, або похідну одного або обох вказаних білків. Білки, важливі для метаболізму, або виживання, або розмноження бактерії, зазвичай відомі як значимі для бактерії білки. Послідовність і функція вказаних значимих білків зазвичай переважно зберігається біля різних типів S. uberis. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу вказані імуногенні білки є значимими білками S. uberis. Таким чином, імунна відповідь направлена проти істотно важливого білка або його імуногенної частини, тим самим, формуючи захист проти гомологічної бактерії S. uberis, але, також забезпечуючи перехресний захист проти різних типів S. uberis, оскільки вказаний збережений білок або значимий білок також присутній на поверхні інших типів S. uberis. Таким чином, застосування значимих поверхневих білків бактерії S. uberis як імуногенний білок за даним винаходом підвищує ефективність захисту імунної відповіді проти інфекції різними типами бактерій S. uberis і знижує здатність вказаних організмів уникнути імунної відповіді. Капсулярні антигени S. uberis зазвичай є хорошими імуногенними епітопами, оскільки капсулярні антигени легко виявляються сироваткою видужуючих корів (які перенесли мастит, викликаний S. uberis). Вказані імуногенні властивості здатні підвищувати імунну відповідь проти родинних імуногенних епітопів S. uberis. Таким чином, в іншому варіанті здійснення дійсного винаходу імуногенна композиція включає щонайменше один капсулярний антиген додатково до імуногенних білків, оскільки вказаний капсулярний антиген підвищує імунну відповідь проти вказаної імуногенної композиції. У дійсній заявці на патент в табл. 5 й табл. 6 представлені переважні рекомбінантні та або виділені поверхневі білки, похідні від S. uberis та обрані за властивою їм здатністю індукувати імунну відповідь проти різних штамів S. uberis. Таким чином, застосування дійсного винаходу передбачає імуногенну композицію в дійсному винаході, і/або імуногенну частину, або аналог, або похідну одного або двох вказаних білків, в якої щонайменше два білки, вибрані з табл. 5 і/або табл. 6. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу вибір роблять з табл. 5 і/або табл. 6, й 14 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комбінацію одержують з двох або декількох білків, наприклад, білка № 63 і/або його імуногенної частині зі штаму S. uberis O140J, разом з білком № 15 або 22, і/або двома, і/або їх імуногенною частиною зі штаму S. uberis 41-241. Такий вибір передбачає білки або їх імуногенні частини з двох різних штамів S. uberis, тим самим, забезпечуючи широкий захист для декількох штамів S. uberis. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу вибір білків з табл. 5 і/або табл. 6 включає білок, обраний з групи, що включає P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100 і P105. Згідно зазначеному раніше, ці білки або розпізнаються антитілами, наявними в сироватці тварин, інфікованих S. uberis, показуючи, що ці білки експресуються in vivo та імуногени в організмах корів, або перехресно взаємодіють щонайменше між двома штамами S. uberis, наведеними в табл. 5. Білки, яки виявлені в прикладі 11, особливо застосуються для індукування імунної відповіді. У ще кращому варіанті здійснення дійсного винаходу, таким чином, вибір білків з табл. 5 і/або табл. 6 включає білок, вибраний з групи, що складається з P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93, й P105. Відповідно зазначеному вище, подальша селекція білків представляється всіма штамами S. uberis, які збуджують відповідну інфекцію у прикладі 11, експресованими під час інфікування організму хазяїна, та у високій мірі імуногенними. Приведена вище нумерація білків, представлених, наприклад в табл. 5, належить до білків, представлених, наприклад, в табл. 1, 2 і 3, які показують необмежені приклади розповсюджених поверхневих білків S. uberis. Крім того, фіг. 4 показує необмежені приклади послідовностей нуклеїнових кислот та амінокислот, яки обрані з передбачуваних поверхневих білків/чинників вірулентності S. uberis. Невелику кількість бактерій в молоці або на/у вимені корів часто виявляють в польових умовах і вони не шкідливі для тварини. Мастит може розвинутися, якщо число бактерій, наприклад, бактерій S. uberis, зростає в молоці або у вимені. Імунна відповідь, яка індукована білками або їх імуногенними частинами в дійсному винаході, найбільш ефективна в придушенні щонайменше частковому, бактеріального зростання бактерій Streptococcus uberis у вимені. Зниження кількості бактерій S. uberis в середовищі, що безпосередньо оточує тварину, також сприяє попередженню маститу. Дійсний винахід описує, як попередити та/або понизити прояви маститу, спричиненого S uberis, шляхом імунізації корів, тим самим, зберігаючи число бактерій S. uberis низьким. Вказаний низький рівень бактерій S. uberis далі зберігається низьким при застосуванні гігієнічного режиму при доїнні, згідно якому слідує, наприклад, мити вим'я, соски і всю апаратуру, яка контактує з вим'ям та/або сосками. Рекомбинантні та/або виділені поверхневі білки, похідні від бактерії S. uberis, що одержуються у дійсному винаходу, в одному з варіантів його здійснення одержують за допомогою системи вироблення, використовуючи прокариотичні клітини або еукариотичні клітини. Прикладами клітин з добре сформованими системами господаря / вектора для вироблення рекомбинантного білка є, наприклад, бактерії: Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus і Lactobacillus, дріжджі: Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Hansenula, Pichia і Candida, та гриби: Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium і Trichoderma. Для одержання рекомбинантного досліджуваного білка ген, що кодує вказаний білок або його частину, або інтегрований в геном, наприклад, шляхом гомологічної рекомбінації або випадково, або вказаний ген поміщений в плазмидний вектор або у фаговий вектор, який стабільно підтримується і експресується у вибраних мікроорганізмах або клітинах. Для експресії вибраної конструкції ДНК в мікроорганізмі або клітинах ген транскрибирують і транслюють під контролем промотора і терминатора. Найкраще зазначений промотор і термінатор застосовуються для вибраних мікроорганізмів. Промотори і терминатори, яки застосовуються для різних мікроорганізмів, описані в "Biseibutsugaku Kisokoza (Basic Microbiology)", 1990, т. 8, Genetic Technology, Kyoritsu Shuppan (1990)", а кращі для дріжджів описані в Adv. Biochem. Eng. 43, 1990, сс. 75-102 і в Yeast 8, 1992, сс. 423-488. Наприклад, плазмідними векторами для Escherichia, конкретніше для Escherichia coli, які застосовуються є плазміди серій pBR та pUC, та промоторами, яки застосовуються є промотор lac (ß-галактозидаза), оперон trp (триптофановий оперон) й промотор tac (гібридний промотор lac-trp) й промотори, похідні від λ faag PL або PR. Кращі термінатори представляють trpA- або похідний від фага rrnB рибосомальний термінатор. До плазмидних векторів, застосовних для рекомбинантної виробки в бактеріях Streptococcus, відносяться, наприклад, pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett. 26, 1985, с. 239) і pGK1 (Appl. Environ. Microbiol. 50, 1985, с. 94). Плазмідні вектори, які застосовуються для рекомбинантної виробки в Lactobacillus, включають, наприклад, вектори, описані для Streptococcus, наприклад, pAM β1 (J. Bacteriol. 137, 1979, с. 614). Плазмідні вектори, яки 15 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосовуються для рекомбинантної виробки в Saccharomyces, переважно Saccharomyces cerevisiae, включають, наприклад, вектори, серій YRp, YEp, YCp і YIp. Вектор інтеграції (EP 5327456), сконструйований за допомогою застосування гомологічної рекомбінації рибосомальної ДНК з копією в хромосомі, застосується для інсерції копії та для стабільного генного контролю. Плазмідні вектори, які застосовуються для рекомбінантної виробки в Kluyveromyces, переважно Kluyveromyces lactis, включають, наприклад, серії плазмід розміром 2 мкм, похідних від Saccharomyces cerevisiae, серії плазмід pKD1 (J. Bacteriol. 145, 1981, сс. 382390) та pGK11-похідну плазміду, що бере участь у дії по знищенню, плазміду серій KARS з геномом аутоіммунної реплікації Kluyveromyces та інтегруючим вектором (EP 537456). Плазмідні вектори, які застосовуються для рекомбінантної виробки в Pichia, включають, наприклад, систему вектора хазяїна, розроблену в Pichia pastoris, використовуючи ген, який бере участь в автономній реплікації в Pichia (Mol. Cell. Biol. 5, 1985, с. 3376). Плазмідні вектори, які застосовуються для рекомбінантної виробки в Candida включають, наприклад, систему вектора хазяїна, сформованого в Candida maltosa, Candida albicans і Candida tropicalis. (Agri. Biol. Chem. 51, 1987, с. 1587. Плазмідні вектори, яки застосовуються для одержання шляхом рекомбінації в Aspergillus, включають, наприклад, вектор, сконструйований шляхом інтеграції гена в плазміду або хромосому та промотора для позаклітинної протеази або амілази (Trends in Biotechnology 7, 1989, сс. 283-287). Плазмідні вектори, яки застосовуються для рекомбінантної виробки в Trichoderma, включають, наприклад, систему вектора хазяїна, сформованого в Trichoderma reesei, і промотор позаклітинної целюлази, який застосовується для конструювання цього вектора (Biotechnology 7, 1989, сс. 596-603). Переважно зазначена система вироблення передбачає конструкцію нуклеїнової кислоти, переважно з конструкцією ДНК, що кодує білок, представлений в табл. 5 і/або табл. 6, або його імуногенну частину. У другому варіанті здійснення дійсного винаходу зазначена система вироблення передбачає конструкцію ДНК, що кодує два, або три, або чотири, або навіть більшу кількість білків, представлених в табл. 5 і/або табл. 6, або їх імуногенних частин. У ще одному з варіантів здійснення дійсного винаходу передбачена вказана система вироблення щонайменше з двома конструкціями ДНК, кожна з яких кодує щонайменше один білок, представлений в табл. 5 і/або табл. 6, або його імуногенну частину. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу зазначений білок, представлений в табл. 5 і/або табл. 6, вибраний з групи, що складається з P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100 та P105. У ще більш кращому варіанті здійснення дійсного винаходу зазначений білок, представлений в табл. 5 і/або табл. 6, вибраний з групи, що включає P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93 і P105. Найбільш переважно вказаний білок, представлений в табл. 5 і табл. 6, вибраний з групи, яка включає P15, P16, P54, P28, P63 і P105. У більш кращому варіанті здійснення дійсного винаходу вказана конструкція нуклеїнової кислоти кодує гібридний білок, що включає імуногенні епітопи, похідні більш ніж від одного білка S. uberis. Переважніше, зазначений гібридний білок включає епітопи, похідні від білків, похідних від більш ніж одного штаму S. uberis. У іншому варіанті здійснення дійсного винаходу вказана конструкція нуклеїнової кислоти кодує епітопи, які модифікують для підвищення гуморальної і клітинної імунної відповіді. Таким чином, дійсна заявка передбачає спосіб одержання імуногенної композиції, що включає щонайменше два білки S. uberis, які здатні викликати імунну відповідь проти Streptococcus uberis, зазначений спосіб, що включає одержання клітин з рекомбінантним вектором, причому зазначений вектор включає нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше два білки, представлених в табл. 5 і/або табл. 6, та імуногенну частину, або аналог, або похідну одного або обох із зазначених білків. Для рекомбінантного одержання білка, що кодується нуклеїновою кислотою, вказану нуклеїнову кислоту переважно поміщають під контроль індукованої регуляторної послідовності, здатної підвищити експресію вказаного білка, що переважно приводить до підвищеного рівня білка. Переважне накопичення зазначеного рекомбінантного білка або його імуногенної частини відбувається або в цитоплазмі, наприклад, у випадках, в яких рекомбінантний білок, що виробляється, збирають з клітин, або білок екскретується, наприклад, якщо збирають з культуральної рідини. Таким чином, рекомбінантну конструкцію, що кодує вказаний імуногенний білок, одержують з точними регуляторними послідовностями та функціонально зв'язаним промотором для внутрішньоклітинного або позаклітинного накопичення. Таким чином, дійсній винахід передбачає рекомбінантну молекулу, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше два білки, представлених в табл. 5 і/або табл 6, та/ або імуногенну частину, або аналог, або похідну одного або обох зазначених 16 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білків під контролем функціонально зв'язаного промотора. У кращому варіанті здійснення дійсного винаходу вказаний білок, з числа представлених в табл. 5 і табл. 6, вибраний з групи, що складається з P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100 і P105. Найбільш переважний білок, з числа представлених в табл. 5 і/або табл. 6 та вибраний з групи, що складається з P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93 і P105. У дійсному винаході також передбачається живий рекомбінантний носій, що включає послідовність нуклеїнової кислоти за дійсним винаходом або рекомбінантну молекулу ДНК за дійсномим винаходом. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу носій є першим штамом S. uberis й рекомбінантна нуклеїнова кислота кодує імуногенні епітопи іншого штаму S. uberis Таким чином, дійсний винахід передбачає живий рекомбінантний носій, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує один або декілька білків, представлених в табл. 5 і/або табл 6, та/ або імуногенну частину, або аналог, або похідну одного або обох вказаних білків під контролем функціонально зв'язаного промотора. Безперечно, вказаний живий рекомбінантний носій в неживій формі також є імуногенним. Таким чином, дійсній винахід також описує неживий рекомбінантний носій. У дійсному винаході також передбачаються виділені клітини-господарі, що включають послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує один або декілька білків, представлених в табл. 5 і/або табл. 6, і/або імуногенну частину, або аналог, або похідну одного або обох вказаних білків під контролем функціонально зв'язаного промотора. Виділені клітини-господарі, наприклад, включають бактеріальні клітини, наприклад: Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Lactobacillus, або клітини дріжджів, наприклад: Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Hansenula, Pichia, Candida, або клітини грибів, наприклад: Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium і Trichoderma. За допомогою зазначених вище виділених клітин-господарів, що включають рекомбіинантну молекулу, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує один або декілька білків, представлених в табл. 5 і/або табл. 6, і/або імуногенну частину, або аналог, або похідну одного або обох вказаних білків під контролем функціонально зв'язаного промотора, дійсний винахід описує для фахівців спосіб одержання рекомбінантної білкової молекули. Із-за відмінностей між різними штамами S. uberis, білки і пептиди від різних штамів можуть показувати невелику вариабельність амінокислотної послідовності та як і раніше мають ту ж функцію. Таким чином, білкова молекула, одержана від одного штаму S. uberis, по послідовності ідентична функціонально ідентичній білковій молекулі іншого штаму S. uberis. Поняття "Ідентичність послідовності" належить до процентної ідентичності двох амінокислотних послідовностей або нуклеотидних послідовностей після вирівнювання двох послідовностей та впровадження гепов, при необхідності, для досягнення максимальної процентної ідентичності. Способи і комп'ютерні програми для вирівнювання відомі фахівцям в даній галузі. Однією з комп'ютерних програм, яка може використовуватися або може бути адаптована для визначення, чи потрапляє послідовність-кандидат в дане визначення, є програма "Align 2", що розроблена фірмою Genentech, Inc., яка в Агентстві охорони авторських прав США (United States Copyright Office, Washington, D.C. 20559) одержала дату пріоритету 10 грудня 1991 р. Дві амінокислотні послідовності мають високу ступень "ідентичності послідовностей" одна до одної, якщо послідовності проявляють щонайменше приблизно на 80 %, переважно щонайменше приблизно на 90 %, і найпереважніше щонайменше приблизно на 95 % ідентичність молекул після вирівнювання. Таким чином, дійсний винахід описує виділену і рекомбінантну білкову молекулу, яка має щонайменше на 80 % ідентичну послідовність до білка, що кодується нуклеїновою кислотою за дійсним винаходом. У переважному варіанті дійсного винаходу описують виділену і рекомбінантну білкову молекулу, яка має щонайменше на 95 % ідентичну послідовність до білкової молекули, яка кодується нуклеїновою кислотою за дійсним винаходом. Для індукування імунної відповіді у тварини проти білка або імуногенної частини за дійсним винаходом, зазначену тварину забезпечують білком і/або імуногенною частиною, яка включає щонайменше один імуногенний сайт. Імуногенна частина або сайт білка сформовані одним або декількома епітопами й, таким чином, здатні індукувати імунну відповідь. Імуногенний сайт включає переважно щонайменше 5 амінокислот, переважніше щонайменше 10-15, і найпереважніше 25 або більш послідовно розташованих амінокислот. Дійсний винахід в іншому переважному варіанті його здійснення передбачає білок або його імуногенну частину, які включають щонайменше відрізок з 25 послідовно розташованих амінокислот білкової молекули, яка кодується нуклеїновою кислотою за дійсним винаходом. Переважно вказаний відрізок, що складається щонайменше з 25 послідовно розташованих амінокислот, включає імуногенний сайт. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти в переважному варіанті здійснення дійсного 17 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу кодує щонайменше один білок або гібридний білок, який кодує щонайменше два білки або їх імуногенні частини. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу вказаний гібридний білок включає імуногенні частини білків щонайменше двох штамів S. uberis. Таким чином, дійсний винахід описує нуклеїнову кислоту, що кодує білкову молекулу за дійсним винаходом. Експресія вказаної нуклеїнової кислоти в клітинах-господарях передбачає імуногенний білок за дійсним винаходом. Зазначений імуногенний білок переважно включений в імуногенну композицію за дійсним винаходом. Таким чином, дійсний винахід передбачає імуногенну композицію, здатну індукувати імунну відповідь проти Streptococcus uberis, причому вказана композиція включає виділену і/або рекомбінантну білкову молекулу за дійсним винаходом. Зазначений рекомбінантний білок за дійсним винаходом виробляється клітинамигосподарями. Для вироблення використовують клітини-господарі бактеріальних видів, наприклад, E. coli, і/або дріжджів, або грибів, або еукаріотичних клітин. Імуногенна композиція, що включає виділений або рекомбінантний білок, і/або клітини, що експонують вказаний білок, здатна індукувати імунну відповідь проти Streptococcus uberis після введення тварині, переважно корові. Переважно вказані клітини, що включають нуклеїнову кислоту за дійсним винаходом під контролем відповідної регуляторної послідовності, експресують вказаний білок на поверхні. Такі клітини називаються клітинами-носіями. Зазначені клітини-носії переважно включені в імуногенну композицію за дійсним винаходом. Переважно, зазначені клітини, що несуть вказаний імуногенний білок, є живим рекомбінантним носієм, але, в іншому варіанті здійснення дійсного винаходу, вказані клітини-носії здатні індукувати імунну відповідь, після того, як клітини вбивають, наприклад, обробкою формаліном. Таким чином, дійсний винахід передбачає імуногенну композицію, здатну індукувати імунну відповідь проти Streptococcus uberis, причому вказана композиція включає живий або убитий рекомбінантний носій за дійсним винаходом. Оскільки причиною маститу у корів є бактерія Streptococcus uberis, в переважному варіанті здійснення дійсного винаходу зазначеним живим або убитим рекомбінантним носієм є вид Streptococcus. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу вказані клітини-господарі належать до клітин бактерій видів роду стрептококів. Білкова молекула потім переважно міститься у складі інших стрептококових білків, які підвищують індуковану імунну відповідь. Крім того, імуногенність може бути підвищена за рахунок надекспресії рекомбінантних білків на поверхні клітин-господарів, переважно клітин стрептококів. Крім того, застосування різних штамів стрептококових клітин-господарів підвищує імуногенність імуногенних білків або їх частин. Таким чином, дійсний винахід також передбачає імуногенну композицію за дійсним винаходом, в якій зазначені клітини-господарі належать до бактерій видів стрептококів. Декілька видів стрептококів також можуть застосовуватися як клітини-господарі, наприклад, S. suis, або S. agalactiae, або S. dysgalactiae. Із-за відмінностей між різними видами стрептококів, а також враховуючи, що деякі білки, які природним чином присутні на бактеріях Streptococcus uberis, можуть сприяти індукуванню імунної відповіді проти Streptococcus uberis, в переважному варіанті здійснення дійсного винаходу, аттеннуіровану бактерію Streptococcus uberis використовують як живий рекомбінантний носій в імуногенній композиції за дійсним винаходом. Переважно вказані бактерії S. uberis експресують білки іншого штаму S. uberis, тим самим виявляючи різні вакцини, оскільки сироватка тварини, яка вакцинована вказаною вакциною, відмінна від сироватки тварини, інфікованої польовою інфекцією, оскільки виявляє антитіла проти білків обох штамів. В іншому варіанті здійснення дійсного винаходу вказана бактерія S. uberis як клітини-господаря або як живий або убитий носій заміщена на бактерію S. suis, або види Staphylococcus, або E. coli, або живі, або убиті. Введення імуногенного білка за дійсним винаходом або його частини, або введення нуклеїнової кислоти, що кодує зазначений білок за дійсним винаходом, індукує імунну відповідь. Зазначена нуклеїнова кислота при введенні корові експресується в клітинах зазначеної корови і розпізнається її імунною системою. Нуклеїнова кислота, тим самим, бере участь як імуногенна композиція, наприклад, ДНК вакцини проти маститу. Таким чином, дійсній винахід передбачає імуногенну композицію, здатну індукувати імунну відповідь проти Streptococcus uberis, причому вказана композиція включає нуклеїнову кислоту за дійсним винаходом. Оскільки імуногенна композиція за дійсним винаходом індукує імунну відповідь у тварини, переважно у корови, білок знижує прояви захворювання, пов'язаного з маститом, і покращує стан здоров'я зазначених корів, тим самим, роблячи їх стійкішими до інших (вторинних) інфекцій. Таким чином, дійсний винахід передбачає імуногенну композицію для застосування, як лікарський засіб. Переважно, імуногенну композицію за дійсним винаходом використовують для одержання 18 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лікарського засобу проти маститу,що викликається Streptococcus uberis, який знижує специфічний прояв хвороби, пов'язаної з маститом, викликаним Streptococcus uberis. Таким чином, дійсний винахід передбачає застосування імуногенної композиції для приготування лікарського засобу проти маститу, що викликається Streptococcus uberis. Імуногенну композицію за дійсним винаходом також використовують для одержання або переробки вакцини проти маститу. Вакцина зазвичай оберігає тварин або людей від зараження. Переважно імуногенна композиція за дійсним винаходом здатна попередити мастит. Таким чином, дійсний винахід описує в переважному варіанті здійснення імуногенної композиції для приготування вакцини. У іншому варіанті здійснення дійсного винаходу імуногенну композицію переважно використовують для зниження кількості і/або знищення бактерій S. uberis в молоці і/або у вимені корови. Процес доїння на молочних фермах представляє серйозну загрозу переносу бактерій S. uberis від хворої корови до здорової. Зниження кількості бактерій S. uberis, таким чином, найбільш важливо для придушення поширення інфекції з одного соска вимені до іншого соска, і/або від тварини до тварини. Для введення суб'єкту імуногенної композиції за дійсним винаходом змішування білків або їх імуногенних частин, або клітин-господарів з відповідним носієм полегшує одержання суб'єктом імуногенної композиції і підвищує імуногенний ефект композиції. До відповідних носіїв за дійсним винаходом, наприклад, відноситься відповідний ад'ювант для підвищення імунізуючого ефекту зазначеної імуногенної композиції. Багато відповідних ад'ювантів, заснованих і на маслі, і на воді, відомо фахівцям в даній галузі, наприклад, адъювант Diluvacforte® або адъювант Specol®. В одному з варіантів здійснення дійсного винаходу відповідний носій включає, наприклад, фізіологічний розчин для розведення бактерій, або білків, або їх імуногенних частин. Таким чином, дійсний винахід описує фармацевтичну композицію, що включає імуногенну композицію за дійсним винаходом і відповідний носій. В організмі тварини, переважно корови, імунізованої імуногенною композицією за дійсним винаходом, виробляються антитіла, направлені проти S. uberis. Наявність і рівень вказаних антитіл є показниками імунітету після імунізації імуногенною композицією або вакциною за дійсним винаходом. Зазначені антитіла переважно не направлені проти епітопів, які є у польових штамів S. uberis дикого типа. Аби відрізнити вакциновану тварину від тварини, яка інфікована штамом польового типа, імунітет зазначеної вакцинованої тварини в одному з варіантів здійснення дійсного винаходу переважно визначають за виміром антитіл, направлених проти зазначеної імуногенної композиції. Антисироватку вказаної вакцинованої корови також досліджують на наявність антитіл проти антигенів S. uberis, які відсутні в імуногенній композиції. Виявлення антитіл проти антигена S. uberis, відсутнього в імуногенній композиції або вакцині за дійсним винаходом, є показником того, що інфекція належить до дикого типа. Таким чином, дійсний винахід описує спосіб вимірювання імунітету тварини проти S. uberis, причому вказаний спосіб включає визначення щонайменше в одному зразку від зазначеної тварини наявності антитіла, направленого проти білка, вибраного з представлених в табл. 5 і/або табл. 6 білків або їх імуногенних частин. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу зазначений білок вибраний з табл. 5 і табл. 6 з групи, що складається з P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100 і P105. Ще більш переважно, зазначений білок вибраний з табл. 5 і/або табл. 6, з групи, що складається з P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93 й P105. Більш переважно зазначений білок вибраний з білків, представлених в табл. 5 і/або табл. 6, з групи, що складається з P15, P16, P54, P28, P63 і P105. Для виявлення антитіла, яке зв'язується з імуногенною композицією за дійсним винаходом, застосовується діагностичний набір, який включає щонайменше один із білків, представлених в табл. 5 і/або табл. 6, або його імуногенну частину. Зв'язування антитіла з зазначеним білком або його імуногенною частиною виявляють за допомогою, наприклад, виявлення імунофлуоресцентного антитіла, або виявлення зв'язаного фермент - антитіла, або інших засобів виявлення антитіла, пов'язаного з зазначеним білком або його імуногенною частиною. У переважному варіанті здійснення дійсного винаходу зазначений щонайменше один білок із представлених в табл. 5 і/або табл. 6, вибраний з групи, яка включає P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100 й P105.. Ще більш переважно зазначений щонайменше один з білків, представлених в табл. 5 і/або табл. 6, вибраний з групи, яка включає P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93 й P105. Більш переважно зазначений щонайменше один із білків, представлених в табл. 5 і/або табл. 6, вибраний з групи, яка включає P15, P16, P54, P28, P63 і P105. Таким чином, дійсний винахід описує діагностичний набір, що включає щонайменше один білок, вибраний з представлених в табл. 5 і/або табл. 6, або його імуногенну частину та засоби 19 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виявлення антитіла, що зв'язується з вказаним білком або його імуногенною частиною. Таким діагностичним набором, наприклад, є тест ELISA, або який-небудь інший тест, застосовний для скринінгу сироваток. Переважно зазначений тестовий набір застосується для скринінгу великої кількості сироваток. В іншому варіанті здійснення дійсного винаходу нуклеїнову кислоту за дійсним винаходом використовують для виявлення тварин, заражених штамами дикого типа S. uberis в популяції тварин, вакцинованих імуногенною композицією або вакциною за дійсним винаходом. Цього виявлення, наприклад, можна досягти методом ПЦР. Дійсний винахід описує, що корисні імуногенні білки за дійсним винаходом є білковими молекулами і/або білками, доступними для антитіла на поверхні бактерії і загальними для ряду штамів S. uberis. Як приклад поверхневі білки ідентифікують з послідовностей генома штамів 41-241 і O140J шляхом вибору генів, що містять одну або декілька послідовностей, що звичайно виявляються у поверхневих білків грампозитивних бактерій, наприклад, мотив LPXTG сортази, потрібний для закріплення білка клітинною стінкою, або мотив приєднання ліпіду, необхідного для ліпопротеїнів, або сигнальна послідовність, або трансмембранна область, що попереджує поверхневу локалізацію кодованого білка. Дійсний винахід описує наявність вибраних білків у штамів S. uberis, що підтверджується зондуванням хромосомальной ДНК ряду штамів S. uberis з продуктами ПЦР, одержаними з генів, наприклад, відібраних вище. Дійсний винахід також пояснюється прикладами, що наводяться нижче. Ці приклади не обмежують рамок, що охоплюють дійсного винаходу, а лише пояснюють дійсний винахід. Багато інших варіантів його здійснення можуть бути виконані в рамках охоплення даного винаходу. Підписи до фігур Фіг. 1. Аналіз FACS, виконаний на інтактних штамах S. uberis. Штами S. uberis 41-241 (A) і O140J (Б) інкубують з сироваткою імунізованих мишей (темні стовпці) або з відповідною сироваткою до імунізації (світлі стовпці). Зв'язані антитіла виявляють за допомогою FITC-конъюгированних вторинних антитіл. Дані виражають у вигляді середньої флуоресценції, пов'язаної з бактеріальними клітинами. Флуоресценцію ≥ 10 (в 2 рази вище початкової) оцінюють як позитивну. Номери сироватки відповідають номерам генів/білків, зазначених в табл. 1-4. Фіг. 2. Пофарбовані кумасси діамантовим синім 2D протеомние зразки. Лизати штамів 41241 (A) і O140J (Б) S. uberis на експоненціальній стадії зростання були зондовані сироваткою, одержаною від корів після експериментального зараження штамом O140J. Обведені кружком білки ідентифікують як імуногенні білки. Властивості ідентифікованих білків по аналізу в гелі при розщеплюванні трипсином і за даними мас-спектрометрії MALDI-TOF показані в табл. 6. Фіг. 3. Зараження корів штамом O140J або штамом 41-421 S. uberis. 3 A. Корів 6716 і 6717 заражають через молочну протоку штамом O140 J S. uberis. Корів 6720 і 6721 заражають через молочну протоку штамом S. uberis 41-421. Слід зазначити, що корова 6720 заражена 5000 КОЕ S. uberis і корова 6721 заражена 500 КОЕ S. uberis. SSC означає підрахунок соматичних клітин в молоці. BO означає дослідження бактерій та означає число бактерій як колонієутворюючих одиниць (КОЕ), виділених з молока. RV означає праву передню чверть, LA означає ліву задню чверть. 3 Б. Клінічні ознаки, бактеріальні та цитологічні наслідки зараження корів 6718 та 6719 штамом O140J S. uberis. 3 В. Клінічні ознаки, бактеріальні та цитологічні наслідки зараження корів 6722 та 6723 штамом 41-241 S. uberis. Фіг. 4. Послідовності нуклеїнових кислот та амінокислот білків S. uberis, представлених в табл. 5. Приклади Приклад 1. Відбір загальних поверхневих антигенів Аналіз послідовності ДНК. Послідовність ДНК штаму 41-241 S. uberis визначають з 2 х охватом. Дані по секвенированию збирають для одержання 572 дотичних послідовностей, що містять 1815 ORF. В Центрі Sanger штам O140J S. uberis (Hill, 1988) був секвенирован. Дані про послідовність, яки доступні на сайті Sanger, були зібрані в квітні 2002 р. для одержання 61 контига, що містить 1938 ORF. Вибір загальних поверхневих антигенів. Успішними вакцинними антигенами є білки, яки доступні для антитіла на бактеріальній поверхні і загальні для ряду штамів S. uberis. Поверхневі білки ідентифікують з послідовностей геномів штамів 41-241 і O140J шляхом вибору генів, що містять одну або декілька послідовностей, які формують мотив підпису (див. M&M), що зазвичай 20 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виявляється в поверхневих білках грампозитивних бактерій. Серед всіх досліджених ORF, 17 ORF містять LPXTG мотив сортази (табл. 1), необхідний для заякіривання білка на клітинній стінці. Чотири білки з сімнадцяти зазначених білків (P12, P23, P24 і P25) були виявлені виключно до штаму 41-241. Тридцять одна відкрита рамка зчитування (ORF) містить мотив приєднання ліпіду, необхідний для липопротеїнів (табл. 2). Всі ці білки виявлені у штаму O140J, а також у штаму 41-241. Крім того, вибирають 87 ORF, які містять сигнальну послідовність або трансмембранну область, прогнозуючи поверхневу локалізацію кодованого білка (табли. 3). Ці білки виявляють у штаму O140J, а також у штаму 41-241. Приклад 2. Поширення вибраних генів серед різних клінічних і субклінічних ізолятів S. uberis Для дослідження наявності вибраних генів серед різних штамів S. uberis, проводять експерименти по точкової гібридизації, в якіх хромосомальную ДНК значного числа клінічних штамів S. uberis зондують ПЦР- продуктами, одержаними від 99 вибраних генів. Одержані дані (табл. 4) показують, що більшість вибраних генів гибридизируется з більшістю штамів S. uberis, отже, більшість вибраних генів звичайно є в різних штамів S. uberis. Навпаки, 4 із 99 досліджених генів гибридизуется лише з обмеженим числом штамів. Всі ці гени є в штамі 41-241 і кодують білки LPXTG, що мають мотив сортази, потрібний для заякіривання білка на клітинній стінці. Приклад 3. Імуногенність вибраних поверхневих білків Для оцінки ролі білків як білків-кандидатів для вакцини, білки, що кодуються 115 вибраними генами, клонують і експресують в E. coli з полігистидиновими мітками. Продукти 106 з цих генів успішно клонують і експресують в E. coli. Потім сироватку, одержану від заражених S. uberis корів та від кроликів, імунізованих клітинами S. uberis, убитими формаліном або ультразвуком, досліджують на наявність антитіл, направлених проти експресованих білків, методом вестернблотінга. Результати (табл. 5) показують, що 19 з експресованих білків виявлені антитілами, наявними в сироватці тварин, заражених S. uberis, отже, ці білки експресуються in vivo і є імуногенними для корів. Крім того, 30 експресованих білків були розпізнані антитілами, що містяться в сироватці від кроликів, імунізованих клітинами S. uberis, убитих формаліном або ультразвуком. Дванадцять з числа експресованих білків розпізнаються і сироваткою, одержаною від корів, заражених S. uberis, і сироваткою від кроликів, імунізованих клітинами S. uberis, убитими формаліном або ультразвуком. Ці дані показують, що більшість білків є антигенними. Таблиця 5 також показує, що деякі білки розпізнаються антисироватками, що індукуються після експериментального зараження штамами 41-241 і O140J. Проте, інші білки реагують позитивно виключно з сироваткою, одержаною після зараження штамів O140J, або з сироваткою, одержаною після зараження штамом 41-241. Це приблизно вказує на відмінності між двома штамами, або в експресії білка in vivo, або в доступності цих білків для імунної системи. Приклад 4. Очищення вибраних білків Для подальшої оцінки ролі білків як вакцини-кандидатів очищають всі 36 білків, розпізнаних або сироваткою від заражених корів, і/або сироваткою від імунізованих кроликів. Крім того, очищають 4 білки, які містять мотив сортази, але які не реагують з обома сироватками. Тридцять один з 40 вибраних рекомбінантних білків успішно зверхекспресують в розчинній формі і вони можуть бути очищені в нативних умовах, хоча 5 білків експресуються у вигляді нерозчинних тілець включень. Ці білки очищають, використовуючи умови для денатурування, та після очищення заново згортають. Для 4 білків не удалося одержати достатньої для імунізації кількості. Все 36 очищених білків потім використовують для імунізації мишей. З результатів вестерн-блотінга виходить, що жоден з білків не взаємодіє з сироваткою, одержаною від мишей до імунізації. Навпаки, білки, що міцно взаємодіють з імунною сироваткою, одержаною від мишей (табл. 5), показують, що білки у високій мірі імуногенні у мишей. Специфічність індукованого антитіла підтверджують імуноблотінгом проти лизатов (або супернатантов протопластов) клітин S. uberis. Результати показують, що більшість індукованих антитіл специфічно реагують з білком S. uberis очікуваної молекулярної маси, чітко вказуючи, що ці білки представляють (поверхневі) антигени, які здатні індукувати імунну відповідь у мишей. Приклад 5. Функціональні властивості індукованих антитіл Сироватку мишей використовують в аналізі методом FACS для вивчення скріплення антитіла з цілими інкапсульованими клітинами S. uberis (вирощеними в середовищі ToddHewitt). На фіг. 1 показано, що жодна з сироваток, одержаних від мишей до імунізації, не здатна зв'язуватися з цілими клітинами S. uberis. Навпаки, лише вісім з імунних сироваток (сироваток, 21 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що індукуються проти білків P11, P15, P17, P20, P25, P26, P27, P63) сильно зв'язуються з цілими бактеріальними клітинами, хоча дві сироватки (націлені проти білків P 17, P18) показують слабке пов'язання з цілими бактеріальними клітинами. З вказаних результатів з очевидністю витікає, що білки, розпізнані цими сироватками, експресуються в умовах, використовуваних для зростання бактеріальних клітин S. uberis, та застосовні для пов'язання з антитілами. Крім того, фіг. 1 чітко показує, що експресія і/або поверхнева доступність білків різні у двох різних штамів. Експресія і/або поверхнева доступність зберігаються в трьох білках (P17, P19 й P20). Навпаки, P11 та P63 виявляють виключно при використанні штаму O140J, хоча P15, P18, P25 та P26 виявляють виключно при використанні штаму 41-241. Білок P27 доступний на поверхні й штаму 41-241, й O140J, але слабо розпізнається антисироваткою штаму 41-241. В сукупності приведені дані з очевидністю свідчать про те, що 10 з вибраних антигенів експресуються на поверхні бактерій, зростаючих in vitro, і можуть застосовуватися для скріплення антитіла на інтактних інкапсульованих клітинах. Троє з цих білків зберігають в двох досліджуваних штамах. Приклад 6. Серологічний протеомний підхід Серологічний протеомний аналіз використовують, як інший підхід до ідентифікації вакцинкандидатів S. uberis. Білки штамів S. uberis, вирощених в бульйоні TH, розділяють 2D гель-електрофорезом і зондують антитілами, що містяться в сироватках тварин, заражених S. uberis. Ряд високо імуногенних білків S. uberis був ідентифікований (дані не представлені). Три плями успішно спарюють з білками, присутніми в гелі 2D, пофарбованому барвником діамантовим синім кумаси (фіг. 2). Продукти розщеплювання цих білків трипсином аналізують методом Q-TOF та одержувані фінгерпринти пептидної маси порівнюють з in silico виробленими фінгерпринтами пептидної маси всіх білків, розрахованих з аналізу послідовності генома штамів 41-241 та O140J. Крім того, два великих триптических пептиду, вибраних з кожного фінгерпринта, використовують для тандемної MS. Одержувану амінокислотну послідовність пептидів потім порівнюють з послідовностями, розрахованими по послідовностях геномів S. uberis. Всі три білки можуть бути успішно спарені за допомогою цієї процедури. Властивості ідентифікованих білків перераховані в табл. 6. Одну з цих вакцин-кандидатів також ідентифікують, використовуючи геномний підхід (P63). Це підкреслює важливість цього білка як вакцинукандидата. Приклад 7. Аналіз методом ELISA культуральних супернатантов з мишачою імунною сироваткою P93 та P105 чітко встановлюють в супернатантах культур обох штамів, свідчачи про те, що ці білки секретируються бактеріями. Приклад 8. Аналіз FACS із застосуванням клітин S. uberis, вирощених на молочній сироватці, для імітації умов in vivo Аналіз, представлений в прикладі 5, проводять для дослідження антитіла до клітин S. uberis, вирощеним на середовищі, що імітує молоко. Приклад 9. Консервація антигенів серед різних штамів S. uberis Досліджують аналізом FACS збереження вибраних білків та доступність до антитіл серед різних ізолятів S. uberis. Ці дослідження позволяють вибрати вакцини-кандидати, направлені на різні штами S. uberis. Приклад 10. Вакцинація та зараження худоби Експериментальне інфікування невакцинованих тварин Вірулентність штамів S. uberis O140J і 41-241 визначають після експериментального інфікування. Вим'я розділяють на чотири частини, які звичайно називають квадратами. Кожен квадрат включає клітини, що секретують молоко, молочні протоки, порожнини для молока і сосок. У цьому експерименті кожен квадрат окремо инокулируют в порожнину для молока через молочну протоку і сосок. Шість з восьми квадратів инокулированих штамом O140J, стають успішно інфікованими (фіг. 3, табл. 7). Чисти культури S. uberis O140J виділяють з молока, одержаного з таких квадратів, і визначають підвищені рівні кількості соматичних клітин (КСК). У двох чвертях після зараження не можуть виявити інфекцію (двох різних корів, корови №№ 6717 і 6719, фіг. 3A і 3Б). Обидві чверті, що залишилися, є негативними за бактеріологічними параметрами впродовж експерименту. В одній з двох чвертей спостерігають невелике підвищення КСК. Навпаки, у всіх восьми чвертях, заражених штамом 41-241, встановлюють інфекцію (фіг. 3A і 3В; табл. 7). Чотири з цих восьми чвертей (корови 6721 та 6723) заражають дозою 5 × 102 КОЕ штаму 41-241, а інші чотири чверті заражають дозою 5 × 103 КОЕ (корови 6720 та 6722). Більш важки ефекти спостерігають після інокуляції підвищеною дозою: температура тіла корів підвищена істотніше і спостерігають важчі клінічні симптоми 22 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 захворювання (згустки в молоці та ущільнення вимені) (табл. 7, фіг. 3A і 3В). Проте клінічні симптоми маститу також виникають при використанні штаму 41-241 при дозі зараження 5 × 102 КОЕ. Схожі дані були раніше одержані для штаму O140J (Hill, 1988). В порівнянні зі штамом 41-241 клінічні ознаки маститу, викликаного штамом O140J (доза зараження 5 × 102 КОЕ, досліджують протягом 16 діб), представляються важчими (фіг. 3Б і 3В). Три з чотирьох чвертей стають ефективно інфікованими штамом O140J і все три показують клінічні ознаки маститу протягом щонайменше 16 діб зараження. Дві з цих чвертей залишаються бактеріологічно позитивними протягом 16 діб після зараження (фіг. 3Б), та в одній чверті виявляють підвищений рівень КСК протягом 35 діб (дані не представлені). Всі чотири чверті, заражені штамом 41-241, показують клінічні ознаки маститу протягом 10-13 діб після зараження, але стають негативними за клінічних ознак після 13 діб (фіг. 3В). Дві з цих чвертей (корова 6723) залишаються бактеріологічно позитивними під час експерименту (16 діб), що свідчить про наявність S. uberis в молочній залозі (фіг. 3В). Гістологічне дослідження матеріалу вимені, зібраного через 3-5 діб після зараження звичайно відповідає клінічним спостереженням. Обидві корови, інфіковані штамом 41-241, та одна корова, інфікована штамом O140J, хворіють на мастит у формі від помірної до важкої по всій залозі з багато осередковим усередині альвеолярним накопиченням поліморфно-ядерних гранулоцитів, фокальним руйнуванням епітеліального шару в альвеолах та помірною інтерстиціальною інфільтрацією мононуклеарних клітин (дані не представлені). Друга корова, інфікована штамом O140J, хвора на помірний багато осередковий катаральний мастит. В сукупності ці дані показують, що обидва штами, O140J та 41-241, патогенні для корів. Імунізація молочних корів Підвищується вміст поліклональних антитіл проти білків S. uberis у корів. Корів імунізують за різними схемами імунізації, використовуючи підшкірне зараження, й внутрішньом'язове, та в молочну залозу. Імуногенну композицію переробляють з розчинником, наприклад, фосфатно-сольовим буфером та адъювантом, наприклад, адъювантом вода-в-маслі або адъювантом без масла. Після імунізації зразок крові відбирають та сироватку досліджують на антитіла проти S. uberis. Експериментальне інфікування вакцинованих тварин Вакцинованих і невакцинованих корів заражають 500 КОЕ штаму S. uberis O140J. Кожну чверть вимені окремо заражають через молочну протоку кожного соска. Після зараження корови, яки вакциновані імуногенною композицією по дійсному винаходу, показують слабкі клінічні ознаки маститу, меншу зміну молока, знижені рівні КСК, скорочений період клінічної стадії маститу, меншу лихоманку. Клінічні оцінки і гістологічне підтвердження при аналізі вимені чітко показують, що імунізація за дійсним винаходом ефективна проти маститу, викликаного S. uberis. Приклад 11. Реактивність антигенів з сироваткою реконвалесцентов Здатність вибраних білків (P15, P16, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P68, P75, P93 та P105) індукувати антитіла видужуючих досліджують методом вестерн-блотінга, використовуючи польову сироватку, одержану від 14 корів, які видужали від інфекції S uberis, що була раніше. Шість з 12 вибраних антигенів (P15, P16, P54, P28, P63, P105) розпізнають всі 14 використовуваних сироваток реконвалесцентов. Ці дані показують, що вказані антигени експресуються всіма штамами S. uberis, які викликають відповідні інфекції, що ці антигени експресуються під час інфікування в організмі господаря, і що ці антигени у високій мірі імуногенні. П'ять антигенів (P 68, P27, P20, P93 та P22) розпізнають сироватки реконвалесцентов 8, 9, 10, 11 або 12, відповідно. З одним з антигенів не можна виявити реакції з якою-небудь сироваткою реконвалесцентов (P75). Приклад 12. Збереження антигенів в різних штамах S. uberis Щоб показати застосовність антигенів для вироблення захисту проти різних штамів S. uberis, визначають збереження та експресію 12 вибраних антигенів (P15, P16, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P68, P75, P93 та P105) серед колекції раніше виділених польових штамів (35 штамів). Експресію антигенів показують скринінгом методом вестерн-блотінга з мишачою імунною сироваткою проти очищених антигенів. П'ять з 12 антигенів (P15, P16, P28, P75 та P105) експресуються в більш ніж 97 % досліджених штамів, два з антигенів (P27, P63) експресуються в 94 % штамів і чотири антигені (P20, P22, P54, P93) експресуються в 81-92 % штамів. Ці дані з очевидністю показують, що експресія більшості антигенів високо консервативна серед різних штамів S. uberis. Матеріали та методи Бактеріальні штами та умови зростання 23 UA 103885 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Один штам S. uberis 41-241 був виділений в 1998 р. на комерційній молочній фермі, на якій був спалах маститу, викликаного S. uberis (Hill, 1988). Штам 41-241 показує, що методом RAPD (random amplified polymorphic DNA - випадково амплифицированной поліморфною ДНК) переважно виявляють фінгерпринтинг типа В у певному стаді під час спалаху інфекції (Zadoks та ін., 2003). Штам виділяють у корів, інфікованих S. uberis протягом щонайменше двох місяців. Початок інфікування протікає безсимптомно і потім супроводжується різким проявом різних клінічних симптомів. Штами S. uberis O140J та EF20 були люб'язно надані доктором J. Leigh, Інститут ветеринарії, Комптон, Англія. Інші штами S. uberis та S. para uberis, виділені при клінічному прояві симптомів маститу на різних молочних фермах, були люб'язно надані доктором D. Mevius, фірма CIDC, Lelystad, Нідерланди, докторами O. Sampimon, фірма Animal Health Service, Deventer, Нідерланди, або Dierenartsen Praktijk, Diessen, Нідерланди. Всі інші види стрептококів одержані із лабораторної колекції ASG, Lelystad, Нідерланди. Штами стрептококів вирощують в бульйоні Todd-Hewitt (код CM189, фірма Oxoid) та поміщають на кров'яний агар Columbia (код CM331, фірма Oxoid), що містить 6 % об. крові (коня) та 0,1 % мас. аєскулина якщо не вказано інакше. Штами E. coli вирощують в бульйоні Luria (18) і поміщають на агар Luria, що містить 1,5 % мас. агару. При необхідності вносять 50 мкг/мл канаміцину. Приготування сироватки. Молоко одержують з молочних ферм, про які відомо, що у них раніше було зараження S. uberis (Waiboerhoeve, Lelystad, Нідерланди). Молоко центрифугують протягом 30 хв при 12800 g та видаляють масло. Потім додають 40 мкл/мл реннина (Lactoferm, Brouwland, Belgium) і молоко інкубують протягом 2 ч при 37 °C з регулярним перемішуванням. Коагульоване молоко видаляють фільтрацією і супернатант, що залишився, центрифугують протягом 30 хв при 12800 g. Освітлений супернатант стерилізують фільтрацією через фільтр Sartobran P з розміром пір 0,2 мкм (фірма Sartonus, Goettingen, Німеччина). Антисироватка кролика. Поліклональні антитіла, направлені проти убитих формаліном цілих клітин S. uberis, а також проти оброблених ультразвуком клітин S. uberis, підвищуються у 9 кроликів. Кроликів імунізують підшкірно, використовуючи 2-4 × 10 убитих клітин в адъюванте вода-в-маслі. Инокулирования повторюють через дві, три та чотири тижні. Через 6 тижнів кроликів убивають і збирають сироватку. Для приготування антигенів штами S. uberis вирощують протягом 16 ч в бульйоні ToddHewitt. Культури розводять в 10 разів в 1 л попередньо підігрітого бульйону Todd-Hewitt та клітини вирощують до оптичної щільності 0,5 (600 нм). Культури центрифугують протягом 15 хв при 10000 g та осадки розчиняють в 100 мл ФСБ (136,89 мM NaCl, 2,68 мM KCl, 8,1 мM Na2HPO4, 2,79 мM KH2PO4 pH 7,2). Потім оптичну щільність (600 нм) доводять до 1,0 за допомогою ФСБ. Для приготування фіксованих формаліном клітин, порції цих клітин об'ємом 10 мл центрифугують протягом 20 хв при 10000 g та осадок ресуспендируют в 2,5 мл ФСБ. До цієї суспензії додають 250 мкл 3 % формаліну і підтримують протягом 16 ч при кімнатній температурі. Суспензію перевіряють на відсутність живих бактерій шляхом висіву на агарове середовище Columbia. Для видалення формаліну клітини двічі промивають ФСБ. Для приготування оброблених ультразвуком клітин порції по 10 мл клітин центрифугують протягом 20 хв при 10000 g, осадок ресуспендируют в 250 мкл ФСБ. Клітини обробляють ультразвуком протягом 15 мін, використовуючи ультразвуковий генератор з наконечником при 100 % виході, 50 % навантаженню. Після обробки ультразвуком клітини розводять в 10 разів у ФСБ. Обидва антигени змішують 1:1 з Specol для одержання емульсій вода-в маслі. Послідовності геномів. ДНК генома виділяють з штаму S. uberis 41-241 по опису Sambrook та ін. (1989). ДНК нарізають і використають для створення плазмидної бібліотеки. Випадкові клони секвенируют, використовуючи метод хімії красителей -термінаторів (dye-terminator chemistry), та аналізують на аналізаторі ABI PRISM 3700 ДНК (фірма Applied Biosystems, Warrington, Великобританія). Дані по секвенированию збирають для одержання 572 безперервних послідовностей. Первісний набір відкритих рамок зчитування (open reading frames-ORF) ідентифікують за допомогою програмного забезпечення GLIMMER та GENEMARK. Трансмембранні спіралі і субклітинні локалізації в генах прогнозують за допомогою комп'ютерної програми TMHMM, яку можна одержати на сайті www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM. Для пошуку в кожній ORF сигнальних пептидів використовують програму SIGNALP (Nielsen і ін., 1999). Інші прогнози по сигнальних пептидах одержують, використовуючи програму PSORT, доступну на сайті http://psort.nibb.ac.jp, і програму GCG-SPS, доступну на сайті http://www.biology.wustl.edu /gcg/spscan.html. Ліпопротєїни виявляють, використовуючи програму GCG-Findpatterns з наступними виразами: PS00013: ~(D, E,R, K)6(L, I,V, M,F, W,S, T,A, G) 2(L, I,V, M,F, Y,S, T,A, G,C, Q)(A, G,S) C; g-lpp: