Рекомбінантна експресія розчинного інтерферону

Реферат: Винахід належить до клітини-хазяїна для рекомбінантної експресії білка інтерферону ссавця, причому згадана клітина включає: (а) функціональний ендогенний trxB ген, (b) інактивований ендогенний gor ген та c) полінуклеотидну послідовність, що кодує екзогенний білок інтерферон. Винахід також належить до використання клітини-хазяїна для рекомбінантної експресії білка інтерферону та до способу для рекомбінантної експресії розчинного інтерферону в клітиніхазяїні. UA 110831 C2 (12) UA 110831 C2 UA 110831 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід загалом відноситься до області рекомбінантної експресії генів в клітинахгосподарях. Зокрема, винахід відноситься до клітини-господаря для рекомбінантної експресії білка інтерферону ссавця, причому згадана клітина включає: (a) функціональний ендогенний trxB ген і (b) інактивований ендогенний gor ген. Винахід крім того відноситься до використання таких клітин-господарів для рекомбінантної експресії білка інтерферону. Винахід також пропонує спосіб для рекомбінантної експресії розчинного інтерферону в клітині-господарі. Передумови для створення винаходу Інтерферони - це група глікопротеїнів, які секретуються клітинами ссавців у відповідь на різні подразники, наприклад, вірусну або бактеріальну інфекцію. Інтерферони володіють різними терапевтично корисними характеристиками, такими як імуностимулююча, антипроліферативна і противірусна активність. Відповідно, ці білки широко застосовуються для лікування ряду захворювань і порушень, включаючи вірусні інфекції і деякі види раку, такі як множинна мієлома, лейкемія, рак нирки і т.д. На основі їх клітинного походження і антигенності людські інтерферони ділять на три групи. У людей альфа-інтерферони продукуються лейкоцитами, бета-інтерферони продукуються фібробластами, і гамма-інтерферони продукуються Bклітинами. Спочатку інтерферони були отримані шляхом очищення білків з природних джерел, наприклад, з лейкоцитів і фібробластів крові. Поява технології рекомбінантного ДНК дала можливість продукувати інтерферони в промисловому масштабі, наприклад, шляхом рекомбінантної експресії білків інтерферонів в клітках-господарях бактерій. Escherichia coli є одним з найбільш часто використовуваних бактеріальних організмів-господарів для рекомбінантної експресії гетерологічних білків через здатність швидко рости до високих щільностей клітин, наявності величезного числа клонуючих векторів і легкості введення таких векторів в клітини для подальшої експресії. Більшість інтерферонів, які доступні сьогодні для використання в медицині людини, продуковані в системах експресії E.coli. З іншої сторони, експресія гетерологічних білків в E.coli, як відомо, пов'язана з певними обмеженнями, які створюють проблеми для продукування великих кількостей фармацевтично активних білків. Проблемою, що часто зустрічається в системах експресії E.coli, є нездатність клітини-господаря продукувати значні кількості рекомбінантних білків в розчинній і активній формі. Замість цього, більшість білка зберігається у формі тілець включень, тобто, в агрегатах денатурованих білків. Основна причина неспроможності створювати розчинні рекомбінантні білки полягає в тому, що цитоплазма E.coli є відновним середовищем, яке перешкоджає формуванню дисульфідних зв'язків. Для виділення активного білка з тілець включення потрібна повторна укладка білків з використанням відновлюваних агентів, таких як дитіотреїтол і бета-меркаптоетанол, або денатуруючих агентів, таких як гуанідин-HCl і сечовина, яка часто недостатня і пов'язана з неприйнятними втратами продукту. Для подолання цих недоліків розроблені клітини-господарі, в яких визначені гени редуктази інактивовані, щоб створити більш окислене середовище, яке робить можливим формування дисульфідних зв'язків. Ці модифіковані клітини-господарі мають мутації в генах, що кодують тіоредоксин редуктазу (trxB) і глутатіон оксидоредуктази (gor). За допомогою цих мутацій стає можливим формування дисульфідних зв'язків в цитоплазмі, і вихід розчинного продукту збільшується. Клітини-господарі, які мають дефіцит у trxB і gor генах, доступні, наприклад, під фірмовими найменуваннями Origami ™ (Novagen) або SHuffle ™ (NEB). Доведено, що клітини trxB /gor Origami ™ B (DE3) (іменовані нижче Origami (DE3); Novagen) можна успішно використовувати для експресії рекомбінантного інтерферону α2b, що описано в опублікованій заявці США № 2009/0258394. Незважаючи на ці вдосконалення, все ж існує потреба в більш ефективних системах експресії, які можуть бути використані для надійногопродукування білків інтерферонів, зокрема білків інтерферонів людини. Нові системи експресії повинні давати можливість продукувати великі кількості розчинних білків інтерферонів, в той же час мінімізуючи частку денатурованого білка. В ідеалі, системи експресії не повинні представляти труднощів у роботі і дозволяти продукувати цитокіни, такі як інтерферони, за низькою собівартості. Розкриття винаходу Даний винахід пропонує нові клітини-господарі, які, зокрема, підходять для рекомбінантної експресії білків інтерферонів ссавців. Встановлено, що вдосконалені клітини-господарі для експресії білків інтерферонів можуть бути створені шляхом інактивації ендогенного gor гена клітини-господаря з одночасним збереженням функціонального ендогенного trxB гена. Збереження функціонального ендогенного trxB гена в клітині-господаря несподівано призвело до значного збільшення виходу рекомбінантних білків інтерферонів. Можна припустити, що 1 UA 110831 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продукт trxB ген бере участь у різних регуляторних шляхах, які здійснюють вплив на вихід продукту експресії. Шляхом використання нових клітин-господарів для рекомбінантного отримання інтерферона можна отримувати великі кількості розчинних білків без значного формування тілець включення. Як показано в наведених нижче прикладах, клітини-господарі винаходу продукують значно більші кількості розчинного інтерферона ніж відповідні клітини, що мають мутації в gor і trxB генах. Таким чином, нові клітини-господарі створюють значне удосконалення відомого рівня техніки, оскільки вони спрощують отримання білків інтерферонів і в той же час знижують виробничі витрати. У першому аспекті даний винахід, таким чином, відноситься до клітини-господаря, яка підходить для рекомбінантної експресії білка інтерферону, причому ця клітина-господар включає: (a) функціональний ендогенний trxB ген і (b) інактивований ендогенний gor ген. Рекомбінантна експресія означає, що експресія бажаного білка здійснюється нуклеїновою кислотою, отриманої методом генної інженерії. Переважно, клітину-господаря, яка забезпечена експресуючим вектором, що включає полінуклеотидну послідовність, яка кодує білок інтерферон, культивують в умовах, відповідних для експресії інтерферону. Винахід крім того відноситься до використання таких клітин- господарів для рекомбінантної експресії білка інтерферону. Відповідно до винаходу, може бути використана будь-яка клітина, яка відома в даній області як підходяща в якості господаря для експресії гетерологічних білків і яка була модифікована шляхом інактивації ендогенного gor гена. Клітка може бути еукаріотичного або прокаріотичного походження. В одному варіанті здійснення клітина-господар є клітиною ссавця, наприклад, зародковою клітиною або клітинною лінією, отриманої від миші, щура, хом'яка, собаки або примату, крім людини. Клітини ссавців, які виявилися підходящими для гетерологічної експресії білків, включають як зародкові клітини (наприклад, клітини кісткового мозку мишей, гемопоетичні стовбурові клітини, мишачі лімфоцити, м'язові клітини, гепатоцити і т.д.), так і розвинені клітинні лінії (наприклад, клітини яєчника китайського хом'яка (CHO), клітини нирки мавпи (COS), клітини нирки дитинчати хом'яка (BHK), клітини нирки зеленої африканської мавпи (Vero), клітини Мадін Дарбі нирки собак (MDCK) і т.д.). У ще одному варіанті здійснення клітиною-господарем винаходу є клітина дріжджів. Наприклад, клітини дріжджів, які отримані з видів Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis і Pichia pastoris, виявилися придатними для експресії білків інтерферонів (Скоко та ін (Skoko et al.) (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38 (Pt3): 257-65). У ще одному варіанті здійснення клітина-господар винаходу також може бути отримана з клітин комах, таких як клітини комах видів Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Spodoptera frugiperda або Trichoplusia ni. У цьому винаході особливо переважне використання бактеріальних клітин-господарів, зважаючи на легкість поводження з ними і швидке зростання. Бактеріальні клітини від багатьох видів використовуються в даній галузі техніки для експресії гетерологічних білків. Зазвичай використовувані клітини-господарі включають штами Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum і Bacillus subtilis. В одному переважному варіанті здійснення бактеріальною клітиною-господарем є клітина E. coli, така як клітина, отримана з штаму BL21 E. coli. Відповідно до винаходу, клітина-господар, розглянута тут для експресії білків інтерферонів, пройшла генетичну маніпуляцію для інактивації ендогенного gor гена, тобто, гена, що кодує глутатіон оксидоредуктази, близьку для клітини-господаря. Ген, що кодує глутатіон оксидоредуктази, описаний в літературі в декількох різних організмах. Як приклад, нуклеотидна послідовність гена gor штаму K12 E.coli представлена тут як SEQ ID NO: 5. На основі нуклеотидної послідовності gor гена фахівець легко зможе інактивувати цей ген стандартними генетичними способами, такими як сайт-направлений мутагенез. Інактивація gor гена буде такою, щоб у клітині-господарі не було або по суті не було експресії біологічно активного ферменту глутатіон оксидоредуктази. Для цієї мети даного винаходу gor ген вважатиметься інактивованим, якщо генетична маніпуляція зменшувала кількість функціонального ферменту глутатіон оксидоредуктази щонайменше на 90 %, переважно на 95 % або більше в порівнянні з немодифікованою клітиною-господарем. Інактивація може бути виконана шляхом делеції частини або всієї кодуючої послідовності gor гена в клітині-господарі. Альтернативно, також можна ввести заміну одного нуклеотиду в кодуючу послідовність гена за умови, що ця заміна відбувається в триплеті, який кодує істотний залишок ферменту оксиредуктази. Також можна вставити один або кілька нуклеотидів в ділянку кодування, щоб змінити рамку зчитування gor гена. У ще одному переважному варіанті 2 UA 110831 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення винаходу gor ген інактивований шляхом вставки і ексцизії ще одного полінуклеотида, наприклад, гена, що надає стійкість до антибіотика, який може бути використаний для вибору. Способи, які можуть бути використані для інактивації генів в клітинах бактерій, ссавців і дріжджів, добре відомі фахівцеві в даній області. Наприклад, в літературі описані багато способів інактивації бактеріального гена. Крім цього, набори для сайт-направленого мутагенезу є у продажу, наприклад, набір для мутагенезу Quick-Change компанії Stratagene, набір для мутагенезу Transformer компанії Clontech, система мутагенезу GenTaylor компанії Invitrogen, набір для мутагенезу in vitro Altered Sites II компанії Promega і набір для рекомбінації Red/ET компанії Gene Bridges. Автори винаходу з'ясували, що інактивація ендогенного gor гена клітини-господаря краща для отримання великих кількостей рекомбінантно експресованих розчинних інтерферонів. Що дивно, клітини-господарі, в яких інактивовано тільки ендогенний gor ген, продукують значно більші кількості білків інтерферонів у порівнянні з відповідними клітинами, що мають генотип trxB /gor (див.Приклад 6 нижче). Тому клітини-господарі, заявлені в даному винаході, включають функціональний ендогенний trxB ген, тобто, trxB ген, який рідний для клітини-господаря і дає ферментативно активну тіоредоксин редуктазу. В результаті, клітина-господар винаходу здатна продукувати рідний функціональний фермент тіоредоксин редуктазу. Слід сказати, що штами з подвійним вимиканням (knock-out) trxB /gor життєздатні тільки у випадку, якщо вони також мають мутацію в гені, що кодує алкілгідропероксид редуктазу (ahpC*). Дивіться: Faulkner et al. (2008), PNAS, 105 (18):6735-40. Як описаний тут штам RHB-T7∆gor/trx, так і штам Origami (DE3) таким чином містили мутацію супресора ahpC*. Навпаки, штами, що містять тільки інактивуючу gor мутацію, життєздатні без мутації ahpC*, оскільки інактивація gor гена як така не має летального ефекту. Таким чином, штам RHB-T7∆gor, підготовлений в Прикладі 2, нижче, не містив ahpC* мутацію супресора. Відповідно, тут переважно потрібно, щоб клітини-господарі, які припускаються даним винаходом, включали ендогенний, не модифікований, функціональний ahpC ген, тобто, ahpC ген, який нативний для клітини-господаря, не містить мутації супресора і здатний продукувати ферментативно активну алкілгідропероксид редуктазу. Для підвищення рівня експресії експресованого білка інтерферону клітина-господар винаходу може включати РНК-полімеразу з бактеріофага, таку як T7 РНК-полімераза. T7 РНКполімераза забезпечує сильну і контрольовану експресію полінуклеотидної послідовності, яка міститься в експресуючому векторі і якій передує T7 промотор. Ген T7 РНК-полімерази може бути поміщений в клітку-господар у формі експресуючого вектора. Експресуючий вектор, який містить ген T7 РНК-полімерази, може бути ідентичний вектору або відмінний від вектора, який включає послідовність інтерферону для експресії. Бажано, однак, щоб послідовність, яка містить ген T7 РНК-полімерази, була вставлена в геном клітини-господаря, наприклад, в бактеріальну хромосому. Наприклад, ген T7 РНК-полімерази може бути вставлений в геном клітини-господаря E.coli, і полінуклеотид, що кодує білок інтерферон, такий як IFN-α2a, експресується з експресучого вектора, який дозволяє експресію в клітини E.coli. Відповідна генна касета, яка включає ген T7 РНК-полімерази, може бути введена в геном бактеріальної клітини-господаря, наприклад, шляхом гомологічної рекомбінації, як сказано в прикладах, наведених нижче. Крім цього, клітини-господарі E.coli, які включають ген T7 РНК-полімерази, також є у продажу, наприклад, від компанії New England Biolabs (Франкфурт, Німеччина), дивіться, наприклад, NEB Cat#C2566, C3016, C3010, C3013 і вектори серії SHUffle, такі як C3026, C3027, C3029 і C3030. Переважно, ген T7 РНК-полімерази використовують у поєднанні з полінуклеотидом інтерферону, який був кодон-оптимізований для експресії в прокаріотичному мікроорганізмі, такому як клітина E.coli. Клітина-господар, яка пройшла маніпуляцію, що описана вище, потім буде забезпечена полінуклеотидною послідовністю, що кодує екзогенний білок інтерферон, переважно ген людського інтерферону. Термін "екзогенний" ставиться до того факту, що клітина-господар, яка обрана для експресії інтерферону, в природі не містить полінуклеотиду, який кодує інтерферон. Полінуклеотид може бути введений в клітину-господар, наприклад, шляхом трансформації або трансфекції. Переважно, щоб полінуклеотидна послідовність, що кодує експресуючий білок інтерферон, була включена в експресуючий вектор. Вибір експресуючого вектора в основному буде залежати від характеру клітини-господаря. Наприклад, якщо клітина-господар є клітиною ссавця, такою як клітина CHO або Vero, експресуючим вектором може бути, наприклад, вірусний або невірусний експресуючий вектор, підходящий для введення кодуючого інтерферон полінуклеотиду в клітку для подальшої експресії білка інтерферону, кодованого цим полінуклеотидом. Експресуючим вектором може бути епісомальний вектор, тобто, вектор, який здатний автономно саморепліцитуватися в 3 UA 110831 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 клітині-господарі, або вектор, що інтегрується, тобто, вектор, який стабільно впроваджується в геном клітини ссавця. Експресуючий вектор ссавця зазвичай міститиме промотор, який функціонально пов'язаний з полінуклеотидом, що кодує інтерферон. Підходящі промотори включають, але без обмеження, передранній промотор цитомегаловіруса (CMV-IE), U3 промотор вірусу некрозу селезінки (SFFV) і аденовірусний основний пізній промотор (Ad MLP). В якості додаткового компонента експресуючий вектор ссавця може включати підходящий енхансер для підвищення рівня експресії. Приклади включають SV40 ранній енхансер генів (Дійкема та ін (Dijkema et al) (1985) EMBO J. 4: 761) і енхансер довгого термінального повторення (LTR) вірусу саркоми Рауса (Горман та ін (Gorman et al.) (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777). Експресуючий вектор також, за вибором, включає послідовності, які термінують транскрипцію, і послідовності поліаденілювання для поліпшення експресії білка інтерферону. Відповідні сигнали термінатора транскрипції і поліаденілювання можуть бути взяті, наприклад, з SV40 (Сембрук та ін (Sambrook et al) (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Будь-який інший елемент, який відомий в даній області як підтримуючий ефективну експресію, може бути доданий до експресуючого вектору, наприклад, посттранскрипційний регуляторний елемент гепатиту бабака (wPRE). В особливо переважному аспекті експресуючим вектором є вірусний експресуючий вектор. Вірусні вектори, підходящі для використання в даному винаході, зазвичай включають вірусний геном, в якому частина нативної послідовності видалена, щоб ввести гетерогенний полінуклеотид без руйнування інфективності вірусу. Через специфічні взаємодії між компонентами вірусу і рецепторами клітини-господаря вірусні вектори дуже підходять для ефективного перенесення генів у клітини-мішені. Відповідні вірусні вектори для полегшення переносу генів у клітину ссавця добре відомі в даній області і можуть бути отримані з різних типів вірусу, наприклад, з ретровірусу, аденовірусу і адено-асоційованого вірусу (AAV), ортоміксовірусу, параміксовірусу, паповавірусу, пікорнавірусу або альфавірусу. Огляд різних вірусних векторних систем дивіться у Нієнхуса та ін (Nienhuis et al.), Hematology, Vol. 16: Viruses and Bone Marrow, N.S. Young (ed.), 353-414 (1993). З іншого боку, якщо клітиною-господарем є бактеріальна клітина, така як клітина E.coli, експресуючий вектор буде адаптований до експресії білка в середовищі клітини прокаріотів. Велике число експресуючих векторів описано для E.coli та інших бактеріальних клітингосподарів. Приклади векторів, підходящих для експресії білка в клітинах E.coli включають, наприклад, вектори серії pBluescript, вектори серії pUC, наприклад, pUC18, pUC19, pBR322, pBR329, pQE70, pQE60, pQE-9, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK233-3, pDR540, pRIT5, pLG338, pKC30, pHSG299, pHSG399, pACYC177, pACYC184, pRSF1010, pBW22 і т.д. Бажаним вектором є той, який відноситься до групи векторів pET. Вектори pET зазвичай містять lacI ген, який несе інформацію про репресорний білок lac, T7 промотор, який специфічний для T7 РНК-полімерази, послідовність, який термінує транскрипцію, оператор lac, який може блокувати транскрипцію, полілінкер для клонування, джерело реплікації f1, ген стійкості до ампіциліну або канаміцину і джерело реплікації ColE1. Вектори pET, підходящі для використання в способах даного винаходу, включають, але без обмеження, pET-21a (+), pET24a (+), pET-28a (+), pET-29a (+), pET-30a (+), pET-41a (+), pET-44a (+), pET-21b (+), pET-24b (+), pET-26b (+), pET-28b (+), pET-29b (+), pET-30b (+), pET-42b (+), pET-44b (+). Особливо переважні вектори, які засновані на остові pET-26b (+). Інші приклади підходящих векторів описані, наприклад, у публікації "Клонуючі вектори" (Паувелс та ін (Pouwels et al.) (Eds.) Elsevier, Amsterdam New York Oxford, 1985). Експресуючий вектор для використання в бактеріальних клітинах може бути трансформований в клітину-господар будь-яким підходящим способом. Наприклад, експресуючий вектор для використання в E.coli може бути введений в клітину-господар, наприклад, шляхом електропорації або хімічними способами, такими як трансформація, опосередкована фосфатом кальцію, як сказано у Маніатіса та ін (Maniatis et al.) 1982, "Молекулярне клонування, Лабораторне керівництво", Cold Spring Harbor Laboratory. Клітини-господарі і способи винаходу підходять для рекомбінантної експресії великих кількостей розчинних білків інтерферонів. Тип інтерферону конкретно не обмежений. Зазвичай білки інтерферони, вибрані для експресії в клітинах-господарях винаходу, можуть бути людського або не людського походження. Поліпептиди інтерферонів не людського походження включають, наприклад, бичачий, кінський, свинячий та мишачий інтерферони, а також відповідні білки від собак, кішок, кроликів і овець. Інші типи не людських інтерферонів включають ті, які можна знайти у приматів, таких як шимпанзе і горили. В одному переважному варіанті здійснення білки інтерферони, вибрані для експресії в клітинах-господарях винаходу, є 4 UA 110831 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людськими інтерферонами, тобто, інтерферонами, які зустрічаються в природі у людей, включаючи алельні варіанти. Білок інтерферон може належати до будь-якого підкласу інтерферонів, який відомий в даній області. Зокрема, білок інтерферон для експресії в клітині-господарі винаходу може бути альфа-інтерфероном (IFN-α), бета-інтерфероном (IFN-β) або гамма-інтерфероном (IFN-γ). В одному особливо переважному варіанті здійснення білок інтерферон для експресії є людським IFN-α, IFN-β або IFN-γ або його біологічно активним фрагментом. Способи винаходу також можуть підходити для експресії біологічно активних варіантів або фрагментів білків IFN-α, IFN-β або IFN-γ, як сказано нижче. В одному варіанті здійснення винаходу IFN, експресуючий в клітинах-господарях винаходу, є зрілим нативним людським білком IFN-α. Однак даний винахід також охоплює експресію біологічно активних варіантів і фрагментів IFN-α, які описані в даному документі. Людський IFNα зустрічається як сімейство з щонайменше 25 високо гомологічних білків з 166 амінокислот, які кодовані різними генами. Білки IFN-α інгібують реплікацію вірусів і проліферацію клітин і модулюють певні імунні відповіді. Рекомбінантний IFN-α в даний час використовується для лікування гепатиту B і гепатиту C, а також для лікування лейкемії, злоякісної меланоми і пов'язаної зі СНІД саркомою Капоші. Переважні IFN-α для експресії відповідно до способу винаходу включають IFN-α2a, IFN-α2b і IFN-α2c. Амінокислотна послідовність зрілого нативного людського IFN-α2a відображена в SEQ ID NO: 1. У ще одному варіанті здійснення IFN, експресуючий в клітинах-господарях винаходу, є зрілим нативним людським білком IFN-β або біологічно активним варіантом або фрагментом IFN-β, як сказано нижче. Людський IFN-β є глікопротеїном, що має молекулярну масу приблизно 20кДа. Як IFN-α, він показує сильну антивірусну активність і, як відомо, інгібує проліферацію клітин. Зріла форма людського IFN-β має 166 амінокислот. Зрілий людський IFN-β показаний в SEQ ID NO: 2. Встановлено, що IFN-β зв'язується з тими ж рецепторами, що і IFN-α. У ще одному варіанті здійснення винаходу IFN, експресуючий в клітинах-господарях винаходу є зрілим нативним людським білком IFN-γ. Однак даний винахід також охоплює експресію біологічно активних варіантів і фрагментів IFN-γ, які згадані в даному документі. IFN-γ є глікопротеїном, який виконує кілька регуляторних функцій в імунній системі. Наприклад, вивільнення IFN-γ промотуює диференціацію B-клітин і стимулює продукування TNF-α. Крім того, встановлено, що IFN-γ активує епітеліальні і ендотеліальні клітини, фібробласти і макрофаги, щоб усунути внутрішньоклітинні патогени. Ефекти IFN-γ опосередковані зв'язуванням регуляторного білка з різними формами рецепторів на поверхні клітин, чутливих до IFN-γ. У зрілій формі мономерний людський IFN-γ включає 143 амінокислоти і має молекулярну масу приблизно 17кДа. Амінокислотна послідовність зрілого нативного людського IFN-γ відображена в SEQ ID NO:3. Звичайно, також можна використовувати клітини-господарі і способи винаходу для продукування варіантів інтерферонів, які в деякій мірі відрізняються від вищезазначених білків інтерферонів і, зокрема тих, які показані в SEQ ID NO: 1-3. Ці варіанти звичайно будуть біологічно активними варіантами, тобто, вони зберігають щонайменше частину біологічної активності інтерферону, що зустрічається в природі, наприклад, здатність зв'язуватися з відповідними молекулами рецепторів. Відповідні аналізи для визначення зв'язування варіанту з рецептором типу I інтерферону описані, наприклад, в патенті США № 5,766,864. Альтернативно, біологічна активність інтерферону може бути визначена шляхом вимірювання його антипроліферативних або противірусних активностей, як вказано, наприклад, в патентах США № 5,770,191 і 5,690,925. Переважно, варіантний інтерферон зберігає значну частину біологічної активності білка інтерферону, з якого він отриманий, наприклад, щонайменше приблизно 50 % активності, більш переважно 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або більше. Варіанти включають білки, які зустрічаються в природі і отримані рекомбінантно, які відрізняються від вихідної опорної амінокислотної послідовності однією або декількома замінами, делеціями або додаваннями амінокислот. Наприклад, варіант людського інтерферону α2a може мати амінокислотну послідовність, яка відрізняється в 2, 3, 4, 5, 6 або до 10, 20, 30 або більше положеннях від послідовностей нативного людського інтерферону α2a, відображеного в SEQ ID NO: 1. Переважно, щоб заміни були консервативними замінами, тобто, замінами одного або декількох амінокислотних залишків однакової полярності, які діють як функціональний еквівалент. Переважно, амінокислотний залишок, який використовується в якості заміни, вибирають з тієї ж групи амінокислот, що і замінний амінокислотний залишок. Наприклад, гідрофобний залишок може бути замінений іншим гідрофобним залишком, або полярний залишок може бути замінений іншим полярним залишком, що має такий же заряд. Функціонально гомологічні амінокислоти, які можуть бути використані для консервативної 5 UA 110831 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 заміни, включають, наприклад, неполярні амінокислоти, такі як гліцин, валін, аланін, ізолейцин, лейцин, метіонін, пролін, фенілаланін і триптофан. Приклади незаряджених полярних амінокислот включають серин, треонін, глутамін, аспарагін, тирозин і цистеїн. Приклади заряджених полярних (основних) амінокислот включають гістидин, аргінін і лізин. Приклади заряджених полярних (кислих) амінокислот включають аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту. Також розглянутими в якості варіантів інтерферону є білки, які відрізняються від вихідного інтерферону однією або декількома (наприклад, 2, 3, 4, 5, 10 або 15) додатковими амінокислотами. Ці додаткові амінокислоти можуть бути присутніми в амінокислотній послідовності вихідних білків інтерферонів (тобто, як вставка), або вони можуть бути додані до одного або обох кінців білка. В основному, вставки можуть бути в будь-якому положенні за умови, що додавання амінокислот не погіршує здатність білка проявляти щонайменше частину біологічної активності, яку виявляє білок інтерферон, який зустрічається в природі. Більш того, варіанти також включають ті білки, в яких, в порівнянні з вихідним білком, відсутні одна або декілька амінокислот. Такі делеції можуть бути зроблені щодо будь-якого положення амінокислот за умови, що вони не погіршують здатність такого варіанту проявляти щонайменше частину біологічної активності, яку виявляє білок інтерферон, який зустрічається в природі. Варіанти білків інтерферонів також включають білки зі структурними модифікаціями щодо білків, які зустрічаються в природі, такі як модифіковані амінокислоти. Відповідно до винаходу, модифікованими амінокислотами є амінокислоти, які модифіковані або природними способами, такими як процесингові або посттрансляційні модифікації, або способами хімічної модифікації. Модифікації амінокислот, які можуть зустрічатися у варіантах інтерферону, отриманих відповідно до винаходу, можуть включати фосфорилювання, глікозування, ацетилювання, ацилювання, розгалуження, АДФ-рибозилювання, зшивання, формування дисульфідного моста, формілювання, гідроксилювання, карбоксилювання, метилирування, деметилювання, амідування, кільцювання та/або формування ковалентних або не ковалентних зв'язків з фосфатидилінозитолом, похідними флавіна, ліпотейховими кислотами, жирніими кислотами або ліпідами. Такі модифікації широко описані в літературі, наприклад, у публікації "Білки: структура та молекулярні властивості", T. Creighton, 2nd edition, W. H. Freeman and Company, New York (1993). Згадувані тут варіанти інтерферону переважно представляють значну ідентичність амінокислотної послідовності в порівнянні з вихідним білком інтерфероном. Переважно, амінокислотна ідентичність становить приблизно 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % і більш переважно більше ніж 96 %, 97 %, 98 % або 99 %. Способи і комп'ютерні програми для визначення амінокислотної гомології добре відомі в даній області. Для мети даного винаходу ідентичність послідовності визначають, використовуючи алгоритм Сміта-Ватермана з пошуку гомології (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981), 2:482-489). Біологічно активні варіанти людських білків інтерферонів описані в літературі в даній області. Варіанти людського IFN-α можна знайти, наприклад, в патенті США № 5,676,942, який також містить інформацію по залишках і ділянкам білка IFN-α, які можуть бути змінені без втрати біологічної активності. Варіанти людського IFN-γ описані, наприклад, в патентах США № 5,690,925 і 6,046,034. Клітини-господарі і способи, запропоновані даним винаходом, також можуть підходити для експресії біологічно активних фрагментів непроцесованих білків інтерферонів або їх варіантів, які визначені вище. У використовуваному тут сенсі фрагментом білка інтерферону є білок, поліпептид або пептид, який відрізняється від відповідного білка інтерферону відсутністю однієї або декількох амінокислот на N- кінці і/або C-кінці, причому щонайменше частина біологічної активності молекули опорного інтерферону, наприклад, її властивості зв'язуватися з рецепторами або її противірусна або антипроліферативна активність зберігаються. Переважно, щоб біологічно активні фрагменти білків інтерферонів, які зустрічаються в природі, або фрагменти відповідних варіантів інтерферонів зберігали щонайменше приблизно 50 %, щонайменше приблизно 75 %, переважно щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 % або навіть щонайменше приблизно до 99 % біологічної активності опорного інтерферону. Біологічно активні фрагменти людських інтерферонів були описані раніше. Наприклад, фрагменти IFN-γ відомі з патенту США № 5,770,191, який розкриває фрагменти, що містять амінокислоти 95-134 зрілого непроцесованого людського IFN-γ. Ці фрагменти проявляють біологічну активність зрілого IFN-γ. У документі EP 0306870 розкриті фрагменти людського IFNγ, що має делецію амінокислот 7-11 на C-кінці. Ці фрагменти проявляють значно підвищену активність порівняно з непроцесованим людським IFN-γ. 6 UA 110831 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 При клонуванні полінуклеотидної послідовності, яка кодує один з вищезгаданих білків інтерферонів або його біологічно активний варіант або фрагмент в бактеріальний експресуючий вектор, необхідно враховувати, що може бути корисним модифікувати кодуючий інтерферон полінуклеотидної послідовності, щоб адаптувати її до прокаріотичної експресії. Способи оптимізації кодон-використання експресуючої полінуклеотидної послідовності, щоб зробити її придатною для експресії в бактеріальних клітинах-господарях, таких як клітини E.coli, добре відомі в даній області і описані, наприклад, у Мартенса та ін (Maertens et al.) (2010), Protein Science, 19:1312-1326. Коротко, полінуклеотидною послідовністю, яка кодує білок інтерферон, експресуючий в клітинах-господарях, маніпулюють шляхом адаптації кодон-використання до кодон-зміщення E.coli. Ділянки з дуже високим (> 80 %) і дуже низьким (