Спосіб надання рослині резистентності до паразитичних нематод

1. Способ сообщения растению резистентности к паразитическим нематодам, отличающийся тем, что растение модифицируют и трансформируют с тем, чтобы оно экспрессировало рекомбинантную ДНК, кодирующую ингибитор протеиназы, и отбирают указанное трансформированное растение, которое экспрессирует указанный ингибитор протеиназы, такой, что указанное трансформированное растение проявляет резистентность к нематодам. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ингибитор протеиназы относится к семейству BowmanBirk. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что ингибитор протеиназы представляет собой ингибитор трипсина коровьего гороха (CpTi). C2 (54) СПОСІБ НАДАННЯ РОСЛИНІ РЕЗИСТЕНТНОСТІ ДО ПАРАЗИТИЧНИХ НЕМАТОД 39856 glycines является главным патогеном сои культурной, возделываемой в США с экономическим эффектом, достигающим примерно US $500-1000M в год. Heterodera shachti (свекловичная нематодa является главным врагом фермеров, возделывающи х сахарную свеклу в европейских странах и в некоторых регионах США, a Heterodera avenae (злаковая нематода) поражает почти все ценные зерновые культуры, произрастающее по большей части на почвах аридной зоны, например, в некоторых регионах Австралии. Картофельные нематоды Globodera rostochiensis и G. pallida распространены на многих площадях, о тведенных под возделывание картофеля. Причиняемые этими вредителями убытки сельскому хозяйству Великобритании как непосредственным разрушающим воздействием, так и опосредованным влиянием на урожай составляют £10-50М в год. Яванская галловая нематода (Meloidogyne spp) обитает в тропических и субтропических почвах, но имеется несколько видов патогенов, принадлежащих к этому классу нематод, которые распространены во вcем мире. Таких видов достаточно много, однако, за ущерб, наносимый культурным растениям, ответственны лишь пять видов нематод; причем убыток, наносимый сельскому хозяйству паразитом вида M. incognita, составляет примерно 66% от всех экономических потерь, вызываемых этими патогенами. Для широкого ряда культурных растений в главных географических регионах тропиков, общие потери в урожаях культурных растений составляют 11-25%. В настоящее время для борьбы с вредителями используются сельскохозяйственные меры борьбы с вредителями, химическая борьба, а также борьба с вредителями путем замены поражаемых растений резистентными; причем часто эти меры используются в сочетании друг с др угом. Однако проблема разработки усовершенствованного способа борьбы с нематодами, в настоящее время особенно актуальна, поскольку большинство имеющихся нематоцидов, в основном, неприемлемы для широкого использования. Например, карбамат (алдикарб) и продукты его распада являются высоко токсичными для млекопитающих, загрязняют грунтовые воды в США и, вероятно, в други х регионах, где широко используется этот пестицид. Сельскохозяйственные меры борьбы с вредителями несут в себе скрытые потери, что неприемлемо для фермеров, специализирующихся на выращивании определенных культур, либо высокорентабельных культур. Резистентные сорта также являются не всегда приемлемыми, и часто наиболее восприимчивые к поражениям патогенами сорта превосходят по своей урожайности резистентные сорта, а поэтому использование резистентных сортов опять же несет в себе скрытые потери, даже если растения не поражаются нематодами. Неадекватность вышеуказанных способов борьбы с вредителями вынуждает исследователей продолжать поиск более эффективных средств борьбы с нематодами. Галовые нематоды с обычной плотностью заселения вызывают замедление роста растений, с корневой системой, занимающей небольшой объем почвы, делая их чахлыми и низкорослыми. Пораженные растения обнаруживают симптомы ми неральной недостаточности в листьях и легко увядают. Потери в урожаях зависят от тяжести поражения, т.е. степени его превышения пределов толерантности, и могут составлять для некоторых видов свыше 50%. Галловая яванская нематода, помимо основных симптомов, описанных для галловых нематод, вызывает часто значительное галлообразование, сопровождающееся увеличением восприимчивости растения к вторичным патогенам. Некоторые нематоды являются переносчиками небольшого ряда растительных вирусов (например, вирусы NЕРО, переносимые Xiphinema, Longidorus, и некоторые вирусы ТОАРА, переносимые Trichodorus). Например, Xiphinema spp. переносит вирус GFLV на виноград. Кроме того, нематоды вместе с грибками, переносятся определенными насекомыми-переносчиками и вызывают некоторые серьезные болезни растений, такие, как вертициллез сосны и нематодоз кокосовой пальмы. В некоторых районах Австралии нематода переносит Corynebasterium на семенную шапку плевела, в результате чего он становится в высокой степени токсичным для пасущихся овец. Такое ассоциирование с бактериями и грибками, в частности, с Fusarium spp. сообщает Meloidogyne sрр. особый экономический статут. Благоприятное клубнеобразование бобовых культур Rhizoboum spp может также подавляться соевой и гороховой нематодами. Совершенно очевидно, что получение культурных растений, резистентних к нематодам, является важной задачей для исследователей. В отношении нематод резистентность определяется успехом или неудачей в репродуцировании на данном виде растений-хозяев. За доминантный, частично доминантный и рецессивный механизмы наследования ответственны от 1 до 3 растительных гена. Предлагаемой в некоторых случаях гипотезе “genborgen” которая исходит обычно из доминантного R-гена резистентности, противоречит наличие рецессивного V-гена вирулентности в нематоде. Два примера резистентности, вводимой селекционерами, заключаются в следующем. Что касается вида Globodera, то эту популяцию картофельных нематод, распространенных в Европе, можно разделить на 5 форм G. Rostochensis (Ro1-5) и три формы G. pallida (Ра1-3). Эти типы патогенов определяются как формы одного вида, которые отличаются своей репродуктивной1.способностью на растениях-хозяевах, которые, как известно, экспрессируют гены резистентности. Hl-ген, несущий резистентность к Globodeza rostochiensis Ro1 и Ro4? является достаточно качественным и находит широкое коммерческое использование. В Великобритании, cv. Marris Piper экспрессирует H1 и является высококачественным резистентным сортом. К сожалению, широкое использование в Англии этого сорта коррелирует с возрастающим преобладанием по всей стране G. pallida, к которой этот сорт является полностью восприимчивым. Что касается Меlоіdogine sрр., то этот вид имеет морфологически аналогичные формы с различной способностью размножаться на хозяйских растениях. Для дифференциации 4 видов M. Incognita использовали стандартные растения та 2 39856 бака (сv NС95) и хлопчатника (сv Deltaphne), а два вида М. arenaria дифференцировали с использованием арахиса (cv Florrunner). Один единственный доминантный ген в табаке cv NС95 сообщал резистентность к видам 1 и 3 М. incognita, но возделывание этого сорта в США повышало превалирование других галловы х нематод, в частности М. arenaria. Большинство источников резистентности были эффективными лишь для одного какоголибо вида галловых нематод, за одним лишь исключением, а именно: ген LMi от Lycopersicum peruvanium сообщал резистентность ко многим видам нематод, кроме М. hapla. Другим ограничением генов резистентности, идентифицированных в томатах, бобах, и сладком картофеле, является их температурная зависимость, которая делает их неэффективными в тех местах, где температура почвы превышает 28°С. В соответствии с выше указанным, необходимость получения более резистентних к нематодам коммерчески ценных культур становится более очевидной. Новая резистентность, сообщаемая растению, должна быть более продолжительной, поскольку нематоды не имеют большого потомcтва за сезон культивирования, и важные изменения патогенов происходят в результате селекции существующи х до этого на полях форм, а не в результате мутации после внедрения сорта. Этот последний процесс не так легко осуществляется для нематод. Например, в противоположность широко распространенной устойчивости к инсектицидам у тлей и други х насекомых, полевой устойчивости к немотоцидам не наблюдается. Было обнаружено, что ингибиторы протеиназы, включая ингибиторы трипсина, являются сильными противонематодными агентами, а поэтому обработка нематод и/или очагов их обитания ингибиторами протеиназы может служить защитой растений от поражения нематодами; например, растения, трансформированные геном или другой ДНК, кодирующей ингибитор трипсина, являются резистентними к нематодам. В первом своем варианте настоящее изобретение относится к способу борьбы с паразитами растений - нематодами, который заключается в обработке нематод или мест их обитания ингибитором протеиназы. Для того чтобы нематоды могли поглощать ингибитор, он должен соответствовать данной протеиназе. Во втором своем варианте настоящее изобретение относится к использованию ингибитора протеиназы в качестве средства против растительных нематод. Для генерирования ингибитора протеиназы в местах обитания наматод, предпочтительно использовать технику рекомбинантных ДНК. Подходящим способом достижения вышеуказанной цели является генетическая трансформация растения, при этом предпочтительно, чтобы растение, которое является восприимчивым к поражению нематодами, само экспрессировало ингибитор протеиназы. В третьем своем варианте настоящее изобретение относится к способу сообщения растению резистентности к нематодам, который заключается в модифицировании или трансформации растения в целях сообщения этому растению спо собности экспрессировать ингибитор протеиназы. При этом следует отметить, что сообщаемая растению резистентность не обязательно должна быть полной, однако она должна быть достаточной для получения нужного агрономического или экономического эффекта. Борьба с нематодами может быть ограничена борьбой с самками нематод, как будет показано ниже. Подробное описание жизненного цикла и патогенности картофельных нематод приводится в специальной литературе (Agrios G.N. (1988) Plant Pathology, 3rd Ed., Academic Рress, San Diego, с. 803 и Jones F.G.W., и JoheS M. (1974) Pestsof of field Crops, 3rd. Ed., Arnold, London). На второй личиночной стадии J2, картофельная нематода Globodera pallida, мигрирует с поверхности корня во внутрь клетки через клеточную стенку, протыкая ее своим стоматостилетом. После того, как организм достигнет эндодермы, он выбирает исходную клетку для питания, внедряется в нее, после чего клетка увеличивается в объеме, вовлекая другие клетки в синцитий, который постепенно принимает характер системы переноса клеток примерно через 7 дней после инвазии. Эти организмы питаются из синцития, который поддерживается на протяжении всего периода питания нематоды. Животные, которые становятся самцами, питаются в течение двух стадий (J2 и J3), а животные-самки, кроме того, питаются в стадии (J4)и во взрослой стадии. Размер тела самки в 100 раз превышает размеры тела самцов, и от их питания самок в значительной степени зависит патология галловых нематод. Сорт Maris Piреr обладает резистентностью к Globodera rostochiensis (лишь патогены типа Rо1 и Rо4), и эта резистентность выражается неспособностью синцития развиваться после первых нескольких дней взаимодействия нематоды с клеткой. Самцы могут развиваться на таких растениях, а самки не способны развиваться на этих растениях, вследствие чего патогенность нематод значительно снижается. Поэтому целью сообщаемой новой резистентности является либо предупреждение, либо ограничение развития самок нематод. В своем четвертом варианте настоящее изобретение относится к использованию гена или другой ДНК, кодирующей ингибитор протеиназы, для получения трансгенного растения, обладающего резистентностью к нематодам. Субстратная специфичность протеиназ, происходящих от различных источников, может варьироваться, и критериев ее оценки не существует. Эти ферменты действуют посредством четырех различных каталитических механизмов, что позволяет их отнести к четырем различным классам, а именно: сериновые, цистеиновые, аспарагиновые и металлопротеинаэы. Сериновые протеиназы представляют широко распространенный класс, отличающийся большим разнообразием; цистеиновые протеиназы также являются широко распространенным классом, и обнаруживаются в бактериях, эукариотических микроорганизмах, растениях и животных. Металлопротеиназы также широко распространены, однако, класс аспарагиновых протеиназ является более ограниченным, и обнаруживается, в основном, в эукариотах. 3 39856 Существует широкий ряд ингибиторов протеиназ, многие из которых являются специфичными к одному классу протеиназ. Например, 1,10-фенантролин является хелатообразущим агентом, действующим как обычный ингибитор металлопротеиназы, не удаляя при этом кальций, который необходим для активности многих ферментов, включая некоторые другие протеиназы. Особый интерес представляют такие ингибиторы протеиназы, которые? будучи протеинами, должны быть субстратами, а не ингибиторами этих ферментов. Многие из этих ингибиторов являются запасными белками семян, которые аккумулируются в процессе развития семян, и могут представлять один из наиболее обильных белков в зрелых семенах. В настоящее время известными семействами ингибиторов протеиназы (P1) являются: семейства Bowman-Віrк, Kunitz картофеля 1, картофеля 2, тыквы, подсемейство зерновых, семейства Radi 12, кукур узы 22кДа, и семейство цистатина. Предпочтительным ингибитором протеиназы, используемым в настоящем изобретении, является семейство Bowmann-Birk; другие подходящие ингибиторы принадлежат к семействам кукурузы 22кДа и цистатин.. Семейство цистатина включает в себя орцицистатин 1 и 11, которые происходят из риса. Другой член этого семейства происходит из кукурузы и отличается от ингибитора кукурузы 22кДа. Ингибитор, происходящий из кукурузы 22кДа, является бифункцинальным ингибитором трипсина и a-амилазы, а также обладает противогрибковой активностью. Семейство Bowma-Віrк включает в себя ингибиторы протеиназы, выделенные из Vigna unquiculata (коровий горох). Ингибиторы трипсина коровьего гороха (CpTis) представляют собой небольшие полипептиды из около 80 аминокислот и являются двухконцевыми ингибиторами сериновой протеиназы. Были получены последовательности белка и кДНК CpTis (ЕР-А-0272144, Hilder и др. (1989) Protein and кDNA sequenced of BowmanBirk protease inhibitor from cowpea (Vigna unquiculata Walp) Plant Molecular Biology 13 701710 and Hilder и др. (1987) Nature 300, 160-163). В этих работах сообщается, что изменение СрТiуровней в семенах коровьего гороха может коррелировать с полевой резистентностью к жукам Callosobruch maculatus. Кроме того, введение СрТі в искусственную среду ингибирует развитие Heliothis, Spodoptera, Diabroti и Тrіbolium. При этом также сообщается, что его употребление человеком вместе с пищей не приносило какого-либо вреда, а пища, приготовленная из этого коровьего гороха и скормленная крысам, не оказывала влияния на их рост. Кассета, включающая в себя промотор 35S CaMV и последовательность, кодирующую зрелый ингибитор СрТі, была введена в растение табака посредством Agrobasterium facien-опосредованной трансформации. При этом наблюдалась корреляция между уровнем экспрессии. CpTi и выживанием Heliotis virescens, а также уровнем поражения, растений личинками этих насекомых (Hilder и др. (1987) Nature 300, 160-163; ЕР-A-0272144) Существует много примеров, когда меры, предпринимаемые для защиты растений от насе комых-вредителей, не имели практического значения для защиты растения от нематод. Не имеется также данных относительно общей корреляции между природными генами резистентности к насекомым и нематодам. Никогда не наблюдалось случаев, где гены резистентности против картофельной нематоды (напр., H1 в Maris Рiреr) сообщали резистентность против жесткокрылых, например, колорадских жуков, или ген томата Мi, сообщающий резистентность против некоторых форм Meloidogyne sрр., имел какое-либо значение для резистентности против насекомых. Кроме того, многие широко используемые инсектициды, такие, как хлорорганические соединения, органофосфа ты и синтетические пиретроиды, не являются эффективными для нематод. Исключение составляет оксимкарбамат (алдикар), но он имеет очень широкий спектр активности против ацетилхолинэстеразы и является также очень токсичным для млекопитающих. Насекомые обнаруживают значительное различие в отношении своих протеиназ. Например, трипсин и химотрипсин-подобные ферменты обнаруживаются у саранчи и пчел, тогда, как тиоловые протеазы преобладают в пищеварительных процессах долгоносика Callosobruchus maculatis. Кроме того, протеиназы насекомых требуют оптимальных рН, и ингибиторы, например, такие, как ингибитор трипсина сои, будут ингибировать протеазы одних насекомых, и не будут ингибировать протеазы других насекомых. Поэтому эффективность СрТi против некоторых насекомых не может служить надежным показателем его эффективности против други х насекомых. При этом нет какихлибо оснований ожидать a priori, что нематоды имеют протеиназы, аналогичные протеиназам насекомых. В этом отношении нематоды отличаются от насекомых. Можно ожидать корреляцию между проглатываемой пищей и пищеварительными ферментами. Существует большое различие в способах питания жалящих жесткокрылых насекомых, таких, как амбарный долгоносик Callosobruchus maculatis и питающиеся флоэмой полужесткокрылые насекомые, такие как тля. Эти насекомые также вносят изменения в растение, однако, они не образуют синцитиллярных клеток, как это делают нематоды. По сравнению с травоядными жуками, галловые нематоды отличаются от них по своему механизму питания даже больше, чем тли. Из этого следует, что изучение насекомых, к сожалению, не дает надежной информации о питании нематод. Имеющаяся информация о протеиназах нематод также слишком недостаточна, чтобы можно было с уверенностью утверждать, что СpTi или другой трипсин или даже ингибитор протеиназы оказывает влияние на пищеварительные процессы. Многие работы исследователей, посвященные организмам-паразитам, были направлены на ферменты, секретируемые инфицирующими личинками, и поэтому они скорее рассматривают инвазию хозяйских тканей, а не питание, этих насекомых. В случае Aacaris Suum, было установлено, что инфицирующая личинка содержит сериновые протеиназы, но при этом предполагается, что в пищеварении взрослых особей участвуют тиоловые и карбоксильные протеиназы. Присутствую 4 39856 щие ферменты являются стадие-специфическими, и тесно связаны со специфическими требованиями паразитизма. Отсюда можно заключить, что любой ингибитор протеиназы, такой, как СрТi, должен оказывать воздействие на растительные нематоды, на что указывают исследования, проведенные на различных видах паразитов. Аналогично, свободноживущие нематоды являются бактериядными, и ферменты, необходимые для переваривания их пищи, могут сильно отличаться от ферментов растительных паразитов. Действительно, в некоторых ранних работах, посвященных растительным паразитам, делается предположение, что они имеют протеиназы с более низкой или значительно более низкой активностью, чем свободно живущие нематоды, исследованные одновременно с растительными нематодами. Из указанных выше исследований, показавших, что СрТi является эффективным ингибитором против насекомых, и что нематоды обычно уничтожаются совсем другими механизмами, очевидно, что антинематодная активность ингибиторов протеиназы не может быть предсказана на основании их инсектицидной активности трипсиновых ингибиторов, описанных, например, в ЕР-А0272144. Причина этого, вероятно, заключается в том, что как указывается в ЕР-А-0272144 на с. 3 (строка 58) - с. 4 (строка 2), именно резистентность к насекомым трансгенного растения значительно увеличивается, если растение было генетически трансформировано таким образом, что оно получило способность экспрессировать ингибитор трипсина по всему растению. Для использования в настоящем изобретении могут оказаться предпочтительными ингибиторы цистеиновых протеиназ, поскольку имеются свидетельства (представленные в примерах), что по крайней мере некоторые из мажорных протеиназ нематод являются цистеиновыми протеиназами. Предпочтительным ингибитором протеиназы настоящего изобретения является ингибитор трипсина, в частности ингибитор трипсина (СpTi) коровьего гороха, однако, в некоторых случаях могут оказаться более предпочтительными ингибиторы трипсина или других протеиназ, происходящи х, например, от других бобовых культур. CpTi может быть предпочтительно идентичным натуральному СрТi в одной из своих аллельных форм, но это необязательно. Например, модификации в аминокислотной последовательности могут не оказывать неблагоприятного действия на активность фермента, или даже наоборот, могут улучшить эту активность. В основном, можно сказать, что ингибитор протеиназы, используемый в настоящем изобретении, будет обладать свойствами, аналогичными свойствам натурального ингибитора протеиназы, и гомологией, достаточной для полноправного члена протеиназного семейства, такого, как СрТi-семейства, в соответствии с имеющимися научными критериями. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая СpTi, может, обладать достаточной гомологией, для гибридизации с нуклеиновой кислотой, кодирующей, натуральный СрТi, в жестких условиях гибридизации. Примерами таких жестких условий может служить использование солевого раствора приблизитель но 0,9 М при температуре от 35°С до 65°С. Нуклеиновая кислота, используемая в настоящем изобретении может, кроме того, удовлетворять вышеуказанным критериям, но для вырождения генетического кода. При необходимости гликозилирование может присутствова ть или отсутствовать. Ингибиторы трипсина типа Bowman-Birk коровьего гороха кодируются семейством умеренно повторяющихся генов, которые экспрессируются в семядолях коровьего гороха в виде че тырех ингибиторов, которые могут быть разделены с помощью ионообменной хроматографии. Все эти четыре изо-ингкбитора(fI, fII, fIII и fIV) имеют аналогичную трипсин-ингибиторную активность, измеряемую in vitro-анализом активации фермента. Главным изо-ингибитором коровьего гороха является fIV. Гены, кодирующие указанные изо-ингибиторы, обладают гомологией, достаточной для перекрестной гибридизации с кДНК-зондами полного СрТi в 0,45М NаСl, 0,045 М Nа-цитрата (3х SSG) при 68°С. Примеры первичной последовательности изо-ингибитора fIV (определенной с помощью секвенирования белка (Sammour (1985)), PhD Thesis, University of Durham) или предсказанной в результате секвенирования кДНК СрТi представлены на рис. 1 ЕР-А-0272144. Трансгенные растения, обладающие резистентностью к нематодам, сообщаемой в результате экспрессии трансгена ингибитора трипсина или другого фермента, могут быть получены в соответствии с описанием, представленным в ЕР-А0272144 (которое вводится в настоящее описание посредством ссылки в той степени, насколько это допускается законом). Вкратце этот способ получения трансгенных растений включает в себя следующие стадии: 1) выделение полиаденилированной РНК; 2) получение кДНК для клонирования; 3) синтез кДНК; 4) синтез второй цепи; 5) обработка концов дц-ДНК для клонирования; 6) клонирование в хозяина (напр., E.coli) с использованием вектора, такого, как плазмида (например, рВR322 или рUC19); 7) скрининг рекомбинантов на СрТi (или другой ингибитор) - кодирующую последовательность; 8) перенос клонированных СрТi-кодирующи х последовательностей в вектор экспрессии (например, Agrobacterium BIN); 9) Перенос в организм-хозяина для трансгенеза (например, Agrobacterium tumefasiens); и 10) инфицирование растения хозяином. Следует отметить, что необязательно точно следовать указанным стадиям. Например, для синтеза ингибитор-кодирующей ДНК может быть использована химическая техника синтеза ДНК. Модификации могут быть введены либо на стадии de novo-синтеза, либо путем сайт-направленного мутагенеза, осуществляемого на уже имеющейся последовательности. Аналогично может быть использован соответствующий вектор экспрессии. Выбор подходящего вектора экспрессии может зависеть от присутствия в нем промотора, под контролем которого бу 5 39856 дет происходить экспрессия ингибитора. При этом может быть желательной нерегулируемая или индуцибельная экспрессия. Другой фактор, влияющий на выбор, заключается в том, что может быть предпочтительным чтобы экспрессия происходила по всему растению, либо локализовалась в какойлибо его части; причем на практике предпочтительными будут, вероятно, корне- или другие тканеспецифические промоторы. Для трансгенеза могут быть использованы и другие методы, например, конструирование последовательности, кодирующей соответствующий промотор, а в некоторых случаях может быть предпочтительным метод "микровыстреливания". Настоящее изобретение может быть использовано для борьбы с некоторыми видами нематод, включая яванскую галловую нематоду и др угие галловые нематоды. Примерами галловых нематод являются нематоды рода Heterodera и Globodera. В этот род входят такие виды, как H. glycines, Н. shachtii (свекловичная нематода), Н. avenae (галловая нематода зерновых), и картофельные нематоды G. rostochiensis и G. pallida. Яванские галловые нематоды принадлежат к роду Maloidogyne, в частности к видам М. javanica, M. hapla, М. аrenarіа, и М. incognita. Другими важными в промышленном отношении нематодами являются нематоды рода Хірhinema, в частности, X. index и X. Italiae (которая переносит на виноград вирус короткоузлия виноградной лозы (GFLV), X. americanum, которая имеет большое экономическое значение в США и в др уги х регионах мира, и X. diversicaudatum (которая переносит на растения малины и другие растения вирус арабис-мозаики, на зерновые растения вирус мозаики костера, и на малину, розу, смородину черную и другие растения вирус кольцевой пятнистости земляники, и нематоды-паразиты рода Pratilenchus, в частности P. penetrans, P. brachyurus и Р.zеае (которая связана с поражениями кукурузы), Р. coffeae, Р. grachyurus и другие (кофе), Р. coffeae и Р. goodeyi (бананы), Р. brachyurus (ананас посевной), Р. zеае и Р. brachyurus (рис), Р. brachyurus и Р. zеае (овощные культуры) и Р. thornei (пшеница). Следует отметить, что Pratylenchus spp. имеет широкий круг хозяев и не ассоциируется с каким-либо одним конкретным культурным растением. Padopholus similis аналогичны членам рода Pratylenchus и является даже более важным вредителем для бананов. Нематоды-паразиты, такие, как нематода рода Pratylenchus, проникают в корни и питаются, продвигаясь по корням, нанося сильные разрушения окружающим клеткам. Периодически эти организмы могут покидать корни и внедряться в другие ткани, продолжая пожирать содержимое клеток и размножаться. Термин "свободноживущие" иногда используют в отношении нематод, таких, как Xiphinema, которые никогда не проникают в растение, но питаются из почвы путем протыкания растительных клеток своими стилетами. То есть в растение проникают только их стилеты, а поэтому, фактически, эти вредители являются эктопаразитами, однако, тем не менее, настоящее изобретение также является эффективным в борьбе против этих вредителей. Ингибитор может быть использован для защиты против более чем одной имеющей экономическое значение нематоды, поражающей культурное растение. Например, Meloidogyne и Hetezodera glycines являются главными вредителями сои культурной, Meloidogyne и Pratylenchus являются главными вредителями для кукурузы, a Heterodera schactii, Longidorus, Trichodorus и Paratrichodorus для сахарной свеклы. Галловая нематода (такая, как Globodera или Heterodera проникает с поверхности корня вовнутрь клетки, и разрушая клетку, обеспечивает себе исходное питание. Нематода Рratylenchus ведет себя аналогичным образом, поскольку она также проникает в клетку. Разница заключается только в том, что Рratylenchus питается от каждой клетки до того, как она проникает в нее. Если протеиназы участвуют в процессе миграции, то следует ожидать, что эти ферменты являются сходными. Аналогично, галловые нематоды при их начальном питании, перед тем, как модифицировать клетку, вытягивают из нее содержимое для своего питания. Если при таком экстракорпоральном пищеварении используются протеиназы, то они должны быть аналогичными протеиназам Рratylenchus. Белки являются главным питанием для указанных паразитов, поскольку сами они неспособны синтезировать нужные аминокислоты. Протеиназы используются этими организмами для расщепления белков на более мелкие молекулы (пептиды), которые усваиваются ими как часть их пищи. Поэтому нематоды, питающиеся на растениях, должны обладать протеиназами, способными расщеплять белки, имеющиеся в растениях, иначе говоря, природа этих протеиназ должна зависеть от конкретных аминокислот, имеющихся в растительных клетках и отвечающих потребностям пожирающих их организмов. Очевидно, нет таких нематод, которые бы не могли использовать имеющийся белок с помощью своих протеиназ. Поскольку многие нематоды могут поражать одинаковые растения например, картофель является хозяином для Globodera, нескольких видов Meloidogyne, и Рratylenchus, то имеются все основания предполагать, что эти виды имеют одинаковые протеиназы. Поэтому, ингибиторы должны быть подходящими для ингибирования переваривания белков протеиназами способом, описанным в настоящем изобретении. Для борьбы против конкретных видов нематод или против ряда различных нематод могут быть использованы комбинации различных ингибиторов. Этот принцип наилучшим образом может быть проиллюстрирован при рассмотрении картофельной нематоды (PCN). На второй ювенильной стадии PCN, а также для взрослой самки РСN, важную роль играет активность цистеиновой протеиназы, как в условиях кислотного рН, так и в условиях рН, близкого к нейтральному значению. Вероятно, что металлопротеиназы играют важную роль на второй ювенильной стадии при нейтральном рН, а для самок при кислотных значениях рН. Поэтому комбинация ингибиторов для этих обеих групп должна быть эффективной против начального развития на второй ювенильной стадии, а также против последующего развития самки. Ин 6 39856 гибиторы карбоксипептилазы, происходящие из клубней картофеля и его листьев, являются характерными примерами ингибиторов металлопротеиназы. Кроме того, как было показано выше, настоящее изобретение предусматривает использование двух (или более) ингибиторов для борьбы против двух различных нематод, которые могут поражать одни и те же культурные растения, но которые обладают, до некоторой степени различными протеиназами. Например, Meloidogine spp. и Н. glycine, обе поражают сою культурную, a Globodera spp. и Moloidogyne spp. обе поражают картофель. Многие культурные растения могут быть защищены способом настоящего изобретения, а поэтому они являются кандидатами для их генетического трансформирования в целях сообщения им способности экспрессировать один или несколько трансгенных генов, кодирующих ингибиторы протеиназы. В принципе, любое культурное или какое-либо другое растение, подверженное поражению нематодами, независимо от того являются ли эти нематоды корневыми или галловыми, могут быть защищены способами настоящего изобретения. Иллюстративными, но не ограничивающими примерами таких растений являются виноград, табак, томат, хлопчатник, масличный рапс и другие культуры, такие, как соя культурная, сахарная свекла, зерновые и картофель. Средствами настоящего изобретения могут быть также защищены декоративные растения. Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям per se, которые в своей естественной форме подвергаются поражению нематодами, но не подвергаются в значительной степени поражению насекомыми. Предпочтительные отличительные особенности трансгенных растений настоящего изобретения приводятся в настоящем описании для разных вариантов изобретения. Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение. Эти примеры сопровождаются рисунками, где: на фиг. 1 представлена схематически структура гена Т-ДНК от рRОК-СрТi+5; на фиг. 2 показан рост Globodera pallida на трансгенных картофельных растениях, который представлен как временная зависимость объема тела от времени после введения в корни растения паразитов на ювенильных стадиях. Растения либо экспрессировали (заштрихованные кружочки) либо не экспрессировали (незаштрихованные кружочки) ген лектина гороха. Объем нематод из растений, экспрессирующих лектин гороха, составлял 70% и 85% по сравнению с контрольными через 12 и 16 дней, соответственно. Величины объемов выражены в натуральных логарифмах и показывают экспоненциальный суточный рост на 23,9% в день в течение 2-12 дней для нематод на контрольных растениях; на фиг. 3 показан рост Globodera pallida на трансгенных картофельных растениях, который представлен как изменение объема тела со времени после введения в корни растения инфективных ювенильных особей. Растения либо экспрессировали (заштрихованные кружочки, либо не экспрессировали (незаштрихованные кружочки) инги битор трипсина коровьего гороха (СрТi).Объем нематод из растений, экспрессирующи х CpTi, был значительно меньше, чем для контрольных растений через 12 дней. Величины объемов даны в натуральных логарифмах и показывают экспоненциальный суточный рост на 21,3% в день через 212 дней для нематод на контрольных растениях; на фиг. 4 показан объем тела на стадиях развития Globodera pallida, присутствующей на картофельных растениях 12 дней после введения в корни растения инфективных ювенильных особей. Растения либо экспресоировали (+), либо не экспрессировали (-) ингибитор трипсина коровьего гороха (CpTi). Величины объемов даны в натуральных логарифмах, а пол незрелых особей определяли на предзрелой стадии (J4). Объемы незрелых особей на предзрелой стадии и самок на СрТi-растениях составляли 39% и 54% для самок и самцов соответственно; на фиг. 5 показано соотношение каждого пола Globodera pallida на картофельных растениях 1224 дней после введения инфективных ювенильных особей в корни растения. Растения либо экспрессировали (заштрихованные символы), либо не экспрессировали (не заштрихованные символы) ген лектина гороха; (самцы представлены квадратами, а самки кружочками); на фиг. 6 представлена круговая диаграмма, где показаны процентные содержания каждого пола Globodera pallida на трансгенных растениях картофеля 12 дней после введения в корни растения. Растения либо экспрессировали (правая диаграмма), либо не экспрессировали (левая диаграмма) ингибитор трипсина коровьего гороха. Результаты были получены на основе наблюдений свыше 120 нематод для каждой обработки. Особи, которые были слишком незрелыми для определения пола, обозначены (J); на фиг. 7, которая относится к примеру 4, показано, что уровень экспрессии СрТі-экспрессирующих растений составляет около 1% от полного белка; на фиг. 8, которая относится к примеру 5, проиллюстрирован ингибирующий эффект различных концентраций ингибитора протеиназы, происходящего от кукур узы. Примеры Пример 1 Получение трансгенных растений картофеля Трансгенный картофель получали следующим образом. Конструирование гена СаМV-35-СрТi Ген СрТi был получен из плазмиды pUSSR с3/2 (Hilder и др (1987), Nature 33, 160-163 и ЕР-А0272144). CpTi-кодирующая последовательность (240 п.о.) содержалась внутри 550 п.о. Alul-Scalрестрикционного фрагмента. Этот фрагмент, также содержащий более длинную лидерную последовательность и 3'-нетрансполированную последовательность (96 п.о.), клонировали в Smal-сайт Тi-плазмидного вектора (происходящего от Agrobaсterium tumefaciens) pROK 2 (Bevan 1984). Nucleic Acids Research 12, 8711-8721 и Bevan и др. (1985), ЕМВО J. 4, 1921-1926), рBОК СрТi+5 (Нilder и др., 1987, см. выше). Плазмида рВОК 2 является производной бинарного A. tumefaciens-вектора pBIN 19 (Bеvаn 7 39856 1984, см. выше). Кроме того, она содержит ген резиcтентности к канамицину, активный в растительных клетках; сайт множественного клонирования, расположенный между высокоэкспрессирующим СаМV-35S-промотором и последовательностью терминации транскрипции гена нопалин-синтазы (Guilley и др. (1982), Cell 30, 763-773 и Веvаn, и др. (1983) Nucleic Acids Research 11(2) 369-385), Плазмиду pРОК-СрТі+5 переносили в штамм LBA 4404 бак. А. tumefaciens, содержащий обезвреженную Ti-плазмиду (Bevan, 1984 см. выше). Более подробно структура гена Т-ДНК из рРОК СрТi+5 показана на фиг. 1. Получение и регенетация трансгенных растений Трансгенные побеги картофеля получали с использованием агробактерии штамма LBA4404/рAL5505, содержащего рRОК СрТi+5 и регенерировали в зрелые растения в соответствии со следующей процедурой: Аксенические культуры побегов Solanum tuberosum (сорт Desiree) выдерживали на стандартной поддерживающей среде для культур побегов (MS соли и витамины) (Murashige и Skoog (1962), Rhysiologia Plantarum 15, 473-497), 2% (масс./об.) сахарозы, и 0,8% (масс./об.) DIFCO очищенный агар, рН 5,7, в регулируемых комнатных условиях с фотопериодом 16 час (облучение при 40 мкЕ м-2с-1) при 24°С (DIFСО означает торговую марку). Затем верхушки побегов субкультивировали на свежей среде каждые 14 дней. Штамм Agrobacteriumtune Saciens, содержащий рRОК CpTi, культивировали в dУТ-среде (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl), содержащей 20 мг/л канамицина в течение 24 час при 27°С. Затем бактерии осаждали, промывали три раза в 2 мМ МgSО 4, и ресуспендировали в РСМ-среде (MS-соли и витамины, 2% (масс./об.) сахарозы, 2 мг/л 2,4-дихлорофеноксиуксусной кислоты, 0,5 мг/л зеатина, pH 5,7, при плотности приблизительно 109 кл/мл. Вырезанные квадраты (прибл. 7х7 мм) из мезофилла картофеля от стабилизированной культуры побегов инкубировали 30 мин в бактериальной суспензии, слегка размешивая, затем быстро блотировали и переносили (нижней поверхностью вверх) на РСМ-среду, содержащую 0,8% очищенного агара DIFСО. После 2-дневного культивирования при 24°С (фотопериод 16 час, 40 мкЕм -2с-1 РАR), эксплантаты промывали в течение ночи в РСМ, содержащей 100 мг/л аугментина, блотировали и переносили на отвержденную PСM, содержащую 100 мг/л а угментина и 100 мг/л канамицина кислый сульфат. После культивирования в течение 4 дней на РСМ, содержащей 100 мл/л канамицина, 100 мг/л аугментина, эксплантаты переносили на среду для индуцирования побегов (MSсоли + витамины, 2% (масс./об.) сахарозы, 0,5 мг/л зеатина, 2 мг/л гибберелловой кислоты, 0,8% очищенного агара DIFCO, рН 5,7, содержащей 100 мг/л аугментина и 100 мг/л канамицина. После 6-недельного культивирования, трансгенные побеги вырезали и переносили на стандартную поддерживающую среду для укоренения побегов. Проростки субкультивировали каждые 14 дней до тех пор пока они не достигнут стадии, приемлемой для их трансплантации в почву (приблизительно 3 субкультуры). Затем растения выращивали до полной зрелости. Вестерн-блоттинг и ДСН-ПААГ-вылеленные эксракты В основе используемого способа лежал метод, описанный Laemli (1970) Science 227,680-685. Растворимые белки экстрагировали в фосфатносолевом буфере (PBS, 8 г/л NaCl, 0,02 г/л KCL, 1,15 г/л Nа2НРО4, 0,02 г/л KH2PO4, pH 7,2), и концентрацию доводили до 20 мг/мл, затем 50 мкл каждого выпаренного экстракта загружали в 17% полиакриламидный гель и подвергали электрофорезу в течение ночи при 7 мА. После этого выделенные белки переносили на нитроцеллюлозу, используя систему полусухого электроблоттинга (LKB Pharmacia). Раствор свободнотекущего порошка (5% масс./об сухого молока в PBS), как описано Jonson и др. (1984), Gene Analysis Technicues 1, 3-8. Иммунологическое обнаружение связанного СрТi осуществляли с использованием кроличьих анти-СрТi первичных антител (поставляемых Durham University), а затем вторичных 125I-конъюгированных ослиных антикроличьих антител (Амеrsham International рІс, Bucks). Фильтр инкубировали при 42°С в течение 2 час с первичными антителами, а затем промывали 15 мин блокирующим раствором. После этой промывки, фильтр инкубировали с вторичными антителами также при 42°C и также 2 час. После этого фильтр промывали, как и в первый раз, а затем осушали и обрабатывали. Полученные фильтры подвергали авторадиографии традиционными методами. Вестерн-анализ подтвердил, что все трансгенные клоны экспрессировали зрелый CpTi-белок в молодых листьях и корнях. Экстракция ДНК и Саузерн-анализ Приблизительно 3 г ткани листьев растений замораживали в жидком азоте и измельчали вместе с промытым кислотой песком в ступке с помощью пестика. Затем к этому измельченному материалу добавляли 5 мл 100 мМ Трис-НС1 (рН 8,5), 100 мМ NаСl, 50 мМ ЭДТК, 2% ДСН, 0,1 мг/мл протеиназы К. После 1-чаcового легкого размешивания при комнатной температуре, к суспензии добавляли 5 мл фенольной смеси (Stlarer (1984), The Extraction of Total RNA by the Detergent and Phenol Method в "Metods in Molecular Biology", т. 2 изд. Walker J.M., Human a Press, с. 101-108), уравновешенной 100 мМ Трис-HС1. pH 8,5, 100 мМ NaCl, 50 мМ ЭДТК. После 30-минутного легкого размешивания смесь центрифугировали, и водную фазу снова три раза экстрагировали фенольной смесью: хлороформа (1:1, по объему), и один раз хлороформом. Затем к водной фазе добавляли 0,5 мл 3М ацетата натрия, рН 5,2, и 10 мл 100% этанола при комнатной, температуре. Осажденную ДНК распрямляли, используя стерильную пластиковую петлю, и ресуспендировали в 0,4 мл ТЕ-буфере, содержащем 50 мкг/мл РНКазы, в течение 1-2 час при 37°С. Затем ДНК снова экстрагировали, как описано выше, и осаждали из водной фазы путем добавления 0,1 объемов 3 М ацетата натрия, рН 5,2, и 3 объемов 100% этанола, и инкубировали при -20°С в течение ночи. Затем ДНК промывали два раза в 70% этаноле, ресуспендировали в 50 мкл 8 39856 два раза дистиллированной стерильной воды и хранили при -80°С. 10 мкл-образцы переваривали рестриктирующим ферментом Hind111 и подвергали в течение ночи электрофорезу на 0,8% агарозном геле при 25В. При этом использовали стандартную технику, описанную Маниатисом и др. (1982) в "Моlесular Cloning: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Затем гель депуринизировали в 0,25 М HC1 в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали в дистиллированной воде и денатурировали в 1,5 М NаС1, 0,5 М NаОН в течение 20 мин при комнатной температуре. ДНК переносили на найлоновые мембраны (Genescreen Plus, Dupont Co, NEN Products, Boston, Mass, USA), используя LКВ VACUGENE-систему вакуумного блотирования (Pharmatica Ltd, Milton Keynes, Bucks, UK). (Gene screen Plus и VACUGENE означают торговые марки). После переноса, который осуществляли в течение 60 мин при комнатной температуре в вакууме при 40 см Н2О в 0,4 М NаОН, фильтр нейтрализовали в 1,5 М NаCl, 0,5 М Триса, рН 7,5, в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем тщательно осушали воздухом. До гибридизации фильтры хранили при 4°С. Полученные таким образом фильтры обрабатывали одним из двух зондов (фиг. 1). Они представляли собой Alul/Sca1-фрагмент (564 п.о.) от рUSSR с3/2, который содержал CpTi-кодирующую последовательность; и Pst1/BamH1-фрагмент (800 п.о.) от рNЕО, который содержал последовательность, кодирующую ген резистентности к канамицину NPT11 рNЕО является производным pUC8, содержащим химерный ген резистентности к канамицину, обнаруженный в рВІN6 (Bevan, 1984, см. выше), и полученным из Отделения биологических наук, Даремский университет). Оба зонда были меченными с высокоспецифической активностью (>9х108 число распадов в минуту на мкг) с использованием набора для рандомизированного примирования (Boehringer Mannheim Ltd., Sussex). Для гибридизации и промывки использовали стандартную технику (Маниатис и др., 1982, см. выше). Фильтры подвергали авторадиографии в течение 4 дней при -70°С. На фиг. 1 показана структура Т-ДНК, содержащая химерный ген СрТi, который был введен в растения картофеля. Единичный Нind111рестрикционный сайт находился между CpTi- и NРТ 11-генами. Таким образом, Ніnd111-перевар генома растения, содержащего одну копию Т-ДНК, будет генерировать два сочлененных фрагмента. Поскольку сайт интеграции, а, следовательно, и расстояние до следующей смежной последовательности узнавания Hind111 в растительной ДНК, будет варьироваться для отдельных трансформантов, то размер соединенных фрагментов также может варьироваться. Аналогично множественные копии Т-ДНК, интегрированной в различные сайты внутри одного и того же генома, будут продуцировать соответствующее число полос, если используются зонды с последовательностью, специфичной к одному из участков соединения. Это позволяет совершенно точно определить число копий гена. Для Саузерн-анализа геномную ДНК экстрагировали из одной линии с относительно высокой экспрессией CpTi, и двух линий с низкой экспрессии, а затем переваривали Hind111. После выделения с помощью гель-электрофореза и последующего блотирования полученные фильтры зондировали либо с СрТi-кодирующей последовательностью, либо с последовательностью, кодирующей резистентность к канамицину. Каждая из двух низкоэкспрессирующи х линий давала одну полосу, что свидетельствовало о присутствии одной копии химерного СрТi-гена, интегрированного в ДНК растения. Как и ожидалось, эти линии были разных размеров, что указывало на то, что интеграция имела место в различных сайтах внутри генома обоих трансформантов. Относительно выоокоэкспрессирующая линия имела приблизительно семь копий CpTi. Жесткая гибридизация c зондом, происходящим от NРТ 11-кодирующей последовательности, наблюдалась в геномной ДНК, эксрагированной из всех трех CpTi-положительных линий. Альтернативно, трансгенный картофель может быть получен способами, описанными в ЕР-А0272144. Пример 2 Выведение и развитие G. pallida в трансгенном картофеле - культивирование трансгенных растений Трансгенный картофель, полученный как описано выше, сначала отбирали как обычные растения, выращенные монаксенически на 50 мл питательного агара в 250-мл стеклянных сосудах с крышкой. Эти растения выращивали в вегетационной камере (Conviron SlОН) с циклом день:ночь = 16 час:8 час при 20°С и интенсивностью фотонного излучения 80 мкЭ/м 2). Затем растения субкультивировали каждые 14 дней, снимая боковые стебли и сажая новые растения в дополнительные стерильные горшки. Таким способом культивировали 4 линии растений. Одна из них, как было показано выше, экспрессировала высокий уровень ингибитора трипсина коровьего гороха (СрТi), вторая была трансформирована аналогичной конструкцией, в которой отсутствовал СрТi-ген. Третий растительный экспрессировал лектин гороха, и наконец, четвертый клон имел аналогичную конструкцию, но в которой отсутствовал лектин гороха. В первом эксперименте растения с лектином гороха и их контроль переносили из агаровой культуры в небольшие горшки диаметром 5 см, содержащие песок с размером зерен 50-400 мкм для создания благоприятных условий для инвазии нематод. Затем в каждый горшок добавляли 500 свежевыведенныхGlobodera pallida. Через 4 дня песок с нематодами, которые не были инвазированы в растения, промывали от растений, а растения пересаживали в песчаную суглинистую почву. Число особей, присутствующих на растениях, оценивали через 4 дня и через 21 день после инвазии. Во всех последующи х экспериментах партии эксплантатов переносили не в песок или почву, а в вегетационные мешочки (Northrup King, Minneapol and Vaughan Seed Co., Иллинойс). Эти растения выращивали в мешочках, содержащих 10 мл среды с 25% конц. солью Hoaglands, и в эти х условиях растения культивировали 10 дней. После этого 9 39856 растения были готовы к инфицированию Globodera pallida. Популяцию Globodera pallida, которая представляла собой стандартную популяцию фенотипа Ра2, выращивали на сорте Maris Piper на открытом воздухе, и инфицированную почву осушали и сохраняли. По необходимости, для этих экспериментов галлы экстрагировали из сухой почвы путем флотации (Southey J.F. (1986) "Laboratory Methods for Work c Plant и Soil Nemathodes" Her Majesty Stationery Office, London). Эти галлы отделяли от другого плавающего дебриса путем их "скатывания" с наклонной металлической пластины. Серии галлов (несколько сотен) погружали на 7 дней при 15°С, а затем переносили на 40 мкм найлоновое сито, которое частично погружали в диффузат из корней картофеля. Этот раствор изготавливали стандартным способом (Southey, см. выше) путем пропускания воды через клубни молодого картофеля, после чего диффузат хранили в пластиковых сосудах при 4°С. Перед использованием диффузат фильтровали. Молодые особи, появлявшиеся из галлов, использовали через два дня после их появления. Эксперименты хронировали так, чтобы имелось достаточное количество молодых особей для одновременного заражения экспериментальных партий и соответствующи х контрольных растений. Растения инфицировали в 1 см от кончика корня (4-6 корней) после того, как эти корни высаживали в бумажные пакетики помещенные на ленточный фильтр из стекловолокна(Whatman 1А). 50 особей на стадии J2 вводили примерно в 10 мкл диффузата корней картофеля в водопроводной воде на поверхность корня на расстоянии примерно 1-2 см от его верхушки, а вторую часть стекловолокна помещали над корнем. Фильтры вынимали через 24 час и корневые системы промывали водой для удаления нематод, не внедрившихся в корни к этому времени. Затем растения возвращали в вегетационную камеру в их мешочках и держали их там до завершения эксперимента. Инфицированные корни отделяли от растения и сразу погружали на 1 мин в кипящий 1% кислый Funchin (44). Затем корни обесцвечивали примерно в течение 24 час в подкисленном глицерине при 50°С, в результате чего окрашенные нематоды были хорошо видны в корнях. После этого регистрировали число нематод в каждом кончике корня, их стадии развития и положение относительно васкулярной ткани. В некоторых экспериментах, объем каждой нематоды оценивали следующим образом. Контур особи обводили с использованием 40х-объектива и камеры-люсида на ацетатной пластине. Микрометрическая шкала была также преобразована соответствующим образом. Затем эту пластину прикрепляли к экрану микрокомпьютера MS-DOS (AMSTRAD 1512) и контур особи копировали с помощью компьютерного манипулятора типа "мышь" (MS-DOS и АMSTRAD - означают торговые знаки). Для оценки объема по контуру нематоды использовали соответствующую компьютерную программу. Результаты и обсуждение Растения, инфицированные в песке, дали аналогичные степени инфицирования на 4-день по сле инфицирования как для клонов, экспрессирующих лектин гороха, так и для их контроля. Через 21 день большинство самцов покинуло растение, но процентное содержание особей, добавившихся к песку и уже сформировавшихся и ставших самками, было аналогично для обоих клонов (табл. 1). Таблица 1 Процентное содержание G. pallida, закончивших рост и дошедших до зрелой стадии на трансгенном картофеле, выращенном в песке и почве Экспрессированный ген Контроль С лектином гороха Стабилизированные (4 дня) 21,8±2,5 Самки (21 день) 113,3±1,6 21,9±2,4 14,8±1,8 Растения были перенесены из песка в почву на 4 день. Величины представляют значения ±ср. кв.ош.; 100%=500 нематод на растение. Растения в мешочках были инфицированы обычным способом с использованием 20-30% особей, добавленных на поверхность корней, с периодом инвазии 24 час (точно). Такой ограниченный период инфицирования дает процент инвазии, аналогичный тому, который достигается в 4-х дневном эксперименте с растениями, выращиваемыми на песке, но с тем преимуществом, что это инфицирование является в высокой степени синхронизированным. Тот факт, что животные не внедрялись в корни до 15 час, свидетельствовала полоса, полученная в течение примерно 9 час между первой и последней инвазированной особью. Это говорит об адекватной степени синхронности для данных экспериментов. Экспрессия лектина гороха в корнях картофеля не препятствовала адаптации нематод на 2, 4 или 8 день после инвазии. Таблица 2 Адаптация G.pallida в местах питания в трансгенном картофеле % адаптированных особей через Экспрессиро3 дня после ванный ген инвазии 2 4 дня 8 дней дня Контроль 29,3±4,5 25,5±4,1 27,1±3,2 С лектином гороха 32,2±4,8 25,9±4,5 26,2±3,5 Контроль 21,0±3,0 20,7±3,2 23,5±3,4 С СрТi 18,0±3,2 19,4±3,6 17,7±4,1 Все величины представляют собой процент нематод/кончик корня ±ср. кв.ош. (100%=50 нематод на кончик корня). Для растений с СрТi наблюдалась слегка более низкая инвазия, чем для их соответствующего контроля, однако этот эффект не имеет статистической значимости. 10 39856 Рост Globodera pallida после инвазии прослеживали по логарифмической кривой, которая приближается к экспоненциальной кривой, на ранних стадиях инфицирования (фиг.1 и 2). После инвазии, оценивали объем особей, который составлял 126±1,9 пл. В случае экспериментов с растениями, экспрессирующими лектин гороха, этот объем возрастал на 23,9% в течение первых 12 дней. Объем особей на растениях с лектином гороха составлял 70% от объема контрольных через 12 дней и 85% через 16 дней. Отсюда видно, что экспоненциальная фаза роста не сохранялась после 12 дня, а поэтому последующие эксперименты с СрТi-растениями завершали через 12 дней. Степень роста для нематод на контрольных растениях в эти х экспериментах была эквивалентна 21,3%-ному возрастанию объема (в день) в течение 0-12 дней. Такая же скорость роста наблюдалась в течение 0-8 дней для растений, экспрессирующих CpTi, но в промежутке между 8 и 12 днем значительного увеличения объема не наблюдалось (фиг. 3). Подавление скорости роста может наблюдаться для обоих полов, или оно может происходить в результате предотвращения развития самок. Последний случай имеет место для Globodera rostochiensis Ro1 на сортах, несущих ген H1, сообщающий резистентность к этому типу патогенов. Поэтому каждую особь на СpТiрастениях и на соответствующи х контрольных растениях распределяли по их стадиям развития. Инвазивная стадия (J2) и последующая стадия очень малы, и поэтому для этих анализов их совмещали. Пол предвзрослой стадии легко определяется, и поэтому особи на этой стадии распределяли по полу. Взрослые особи прекращали развитие к 12 дню. Полученные результаты показали, что особи предвзрослой стадии обоих полов были меньше, чем особи на контрольных растениях на 12 день (фиг. 4). Самцы на предвзрослой стадии развивались в кутикуле третьей стадии, и полный размер этих особей составлял лишь 39% от контрольных. В случае самок, предвзрослые особи на СрТi-растениях составляли лишь 54 % от размера этих особей на контрольных растениях. Развитие самцов и самок более полно прослеживалось в эксперименте с лектином гороха. В этом эксперименте определяли соотношение полов на 12, 16, 18 и 24 день после добавления особей к корням. Это соотношение составляло около 1 самец на 1 самку через 16 дней (фиг. 5). По истечении этого времени самцы вылезали из ювенильной кутикулы, в которой они находились, и мигрировали из корней в поисках самок. Это явление давало сдвиг в соотношении полов в пользу самок, которые оставались в корнях в течение нескольких недель. Растения, экспрессирующие лектин гороха, показывали небольшое, но значимое снижение такого сдвига со значимой разницей в эти х соотношениях на 18 день. Это находится в соответствии с небольшим снижением в скорости роста особей, которое может приводить к небольшому замедлению достижения самцами взрослой стадии. Эксперименты с СрТі-растениями завершали через 12 дней, поскольку небольшая скорость роста к этому времени может привести к дифференцированной гибели особей одного пола, что будет искажать данные о соотношении полов. К 12 дню большинство животных может быть точно распределено по полу, но среди них были такие, которые не достигали взрослой стадии и они регистрировались как молодые особи. Оба пола питаются на третьей молодой стадии, но самцы в предвзрослой или взрослой стадии не питаются от растения. Самки же интенсивно питаются в течение более чем 25 дней, и именно на этой стадии они являются наиболее патогенными для растения. Оценивали свыше 120 особей для СрТiрастений и для контрольных растений. В случае контроля наблюдалось следующее соотношение: 65±5% составляли самки, 17±3% составляли самцы, и 18±3% составляли особи молодой стадии обоих полов были меньше, чем особи на контрольных растениях на 12 день (фиг. 4). Самцы на предвзрослой стадии развивались в кутикуле третьей стадии, и полный размер этих особей составлял лишь 39% от контрольных. В случае самок предвзрослые особи на СрТi-растениях составляли лишь 54% от размера этих особей на контрольных растениях. Развитие самцов и самок более полно прослеживалось в эксперименте с лектином гороха. В этом эксперименте определяли соотношение полов на 12, 16, 18 и 24 день после добавления особей к корням. Это соотношение составляло около 1 самец на 1 самку через 16 дней (фиг. 5). По истечении этого времени самцы вылезали из ювенильной кутикулы, в которой они находились, и мигрировали из корней в поисках самок. Это явление давало сдвиг в соотношении полов в пользу самок, которые оставались в корнях в течение нескольких недель. Растения, экспрессирующие лектин гороха, показывали небольшое, но значимое снижение такого сдвига со значимой разницей в эти х соотношениях на 18 день. Это находится в соответствии с небольшим снижением в скорости роста особей, которое может приводить к небольшому замедлению достижения самцами взрослой стадии. Эксперименты с CpTi-растениями завершали через 12 дней, поскольку небольшая скорость роста к этому времени может привести к дифференцированной гибели особей одного пола, что будет искажать данные о соотношении полов. К 12 дню большинство животных может быть точно распределено по полу, но среди них были такие, которые не достигали взрослой стадии, и они регистрировались как молодые особи. Оба пола питаются на третьей молодой стадии, но самцы в предвзрослой. или взрослой стадии не питаются от растения. Самки же интенсивно питаются в течение более чем 25 дней, и именно на этой стадии они являются наиболее патогенными для растения. Оценивали свыше 120 особей для СрТiрастений и для контрольных растений. В случае контроля, наблюдалось следующее соотношение: 65±5% составляли самки, 17±3% составляли самцы, и 18±3% составляли особи молодой стадии (фиг. 6). Эти результаты аналогичны результатам для самок, развившихся из особей, которые рассматривались в более ранних экспериментах как стабилизированные в растениях с лектином горо 11 39856 ха и в их контролях (табл. 1) В противоположность этому, процентные содержания самок на СрТiрастениях составляли 30% (самцы 50±6%, молодые 30±5%) (фиг. 6). Такое сильное снижение числа самок по сравнению с контрольным числом было статистически значимым (X2