Авірулентна активована жива вакцина mycoplasma hyopneumoniae

Реферат: Винахід належить до композиції для анти-М. hyopneumoniae імунної відповіді у тварини, де вказана композиція включає імунологічно ефективану кількість живого авірулентного штаму М. hyopneumoniae, геном якого має послідовність нуклеїнової кислоти, яка є принаймні на 90 % гомологічною послідовності нуклеїнової кислоти еталонного штаму J, який є вибраним із штамів АТСС 25934 та АТСС 27715, та біологічно прийнятий ад’ювант, вибраний з одного або більше: SLCD (сульфоліпоциклодекстрин), карбополу та SP-олії. Також даний винахід належить до способу захисту тварин від хвороби, асоційованої з вірулентним штамом М. hyopneumoniae; способу запобігання або полегшення спалаху М. hyopneumoniae та способу посилення імунної відповіді на М. hyopneumoniae. UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заявлений винахід загалом стосується імунології та ветеринарної медицини. Більш конкретно, заявлений винахід загалом стосується композицій активованої живої авірулентної вакцини Mycoplasma hyopneumoniae на основі штаму J M. hyopneumoniae, у тому числі імуногенних композицій або композицій вакцин, що допомагають у зменшенні суворості та/або у запобіганні хвороб, викликаних одним або більше вірулентними штамами М. hyopneumoniae. Також запропоновані композиції активованої живої авірулентної М. hyopneumoniae, у тому числі імуногенні композиції або композиції вакцин, що крім того містять модифіковану химерою свинячого цирковірусу типу 1-типу 2 живу вакцину (cPCV1-2). Одно- або дво-дозове уведення тваринам описаних композицій активованої живої авірулентної М. hyopneumoniae є ефективним у забезпеченні імунітету, у тому числі опосередкованого клітинами імунітету та/або гуморального імунітету, від інфекції вірулентним штамом М. hyopneumoniae. Mycoplasma hyopneumoniae (також позначена як М. hyopneumoniae) є етіологічним агентом мікоплазматичної пневмонії свиней. Хвороба викликає хронічний кашель, тьмяний волосяний покрив, сповільнений ріст та хворобливі вияви, що тривають кілька тижнів. Характеристичні ураження від пурпурових до сірих зон затвердіння, особливо у вентральних апікальних та серцевих частках спостерігають у інфікованих тварин. Хоча хвороба викликає малу смертність, вражені свині часто схильні до вторинних інфекцій умовно-патогенними мікроорганізмами, що призводить до падежу або стресу. (R. F. Ross, Mycoplasmal diseases, pp. 436-444, in A. D. Laman, et al., (eds.) Diseases of Swine, Iowa State University Press, 1986). Хвороба, можна вважати, є однією з найбільш важливих причин асоційованої з хворобами втрати свиней (Whittlestone, pp. 133-176, in Tully and Whitcomb (eds.), The Mycoplasma Vol 2: Human and Animal Mycoplasmas, New York, Academic Press, (1979)). Через хворобу тварини загалом недостатньо нарощують масу, вони хирляві та хворобливі. Також, вражені свині часто схильні до вторинної інфекції умовно-патогенними організмами (Burch, Pig America pp. 26-27, December, 1982). Економічний вплив хвороби є значним. Тільки економічні втрати складають 200-250 мільйонів доларів щорічно. Mycoplasma hyopneumoniae є повільно зростаючою, вередливою бактерією, що не має стінок клітин. Її часто важко виділяти з респіраторного тракту внаслідок того, що Mycoplasma hyorhinis, загальний вторинний агент, також розташований у респіраторному тракті. Хвороба поширюється аерозолем, утвореним відхаркуванням, та безпосереднім контактом з ураженою або видужуючою свинею-носієм. Спілкування інфікованих тварин та неінфікованих тварин призводить до ранньої та частої повторної інфекції. Інфекція часто починається інфекцією поросят носієм під час опоросу. В умовах племінного господарства інфекція може стати явною тільки через деякий час. Додаткову інфекцію звичайно спостерігають після відривання від матері, коли свиней об'єднують. Відкриту хворобу звичайно спостерігають у свиней у віці 6 тижнів або старше. Темпи набирання ваги та споживання кормів у вражених тварин помітно знижені. Відоме лікування із застосуванням антибіотиків є дорогим і тривалим. Повторне інфікування тварин залишається проблемою. Отже, вакцини зараз найбільш ефективні для уникання інфекцій та їх наслідків. Було багато спроб створення вакцин для захисту свиней проти Mycoplasma hyopneumoniae. Кілька дослідників оголосили про створення вакцин, які містять рекомбінантно отримані поверхневі антигени Mycoplasma hyopneumoniae, Schaller et al., Патент США № 4,894,332, від. 16.01.1990; Європейський патент №. 283,840, від 28.09.1988. Публікація РСТ № WO 86/00019, від 3.01.1986, розкриває вакцину Mycoplasma hyopneumoniae, що містить виключно мембрани плазми Mycoplasma hyopneumoniae, вільні від інших компонентів клітин. Etheridge et al., Res. Vet. Sci. 33:188 (1982), знайшли неповний захист проти колонізації легень Mycoplasma hyopneumoniae, коли живу вакцину було застосовувано внутрішньовенно, підшкірно, або інтраперитонеально. Kristensen et al., Am. J. Vet. Res. 42:784 (1981), не знайшли захисту свиней проти мікопламатичної пневмонії після ін'єкції інактивованого нагріванням Mycoplasma hyopneumoniae. Ross et al., Am. J. Vet. Res. 45:1899 (1984), знайшли, що застосування екстрактів Mycoplasma hyopneumoniae, отриманих способом заморожування-розтоплення, для імунізації свиней, забезпечувало тільки змінний захист, а у деяких випадках, посилене ураження розвитку було поміченим у імунізованих свиней. Ці дослідники також досліджували суцільноклітинну вакцину, отриману інактивуванням формаліном. Інактивування формаліном значно блокувало захисну імуногенність Mycoplasma hyopneumoniae, та ця вакцина не була ефективною. Yoshioka et al., Патент США № 3,917,819 (від 4.11.1975) розкриває кілька послаблених вакцин мікоплазми, що містять інактивовану формаліном мікоплазму, у тому числі інактивовану вакцину для Mycoplasma hyopneumoniae. Chung-Nan Європейський патент № 1 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 571,648 розкрив вакцину М. hyopneumoniae на основі високопроліферативного та антигенного штаму PRIT-5. Вакцини на основі інактивованих вірулентних штамів Mycoplasma hyopneumoniae є у продажу. Fort Dodge Animal Health (FDAH) реалізує бактерин Mycoplasma hyopneumoniae під назвою Suvaxyn® та Respifend® Mycoplasma hyopneumoniae для застосування як вакцини для захисту здорових свиней проти клінічних ознак, викликаних Mycoplasma hyopneumoniae. Ця бактерин-вакцина є рекомендованою як дво-дозова вакцина для свиней принаймні одного тижня віку, з другою дозою від двох до трьох тижнів після першої вакцинації. Штам J M. hyopneumoniae є непатогенним штамом зі зменшеною здатністю прилипати до війок свиней та, тому, до причин хвороб. Castro et al., Veterinary Microbiology 116:258-269 (2006) та Vasconcelos et al., J. Bacteriol. 187(16): 5568-5577 (2005) (описуючи повну послідовність геному штаму J M. hyopneumoniae (ATCC 25934)). Порівняння геномів патогенного та непатогенного штамів (штам J) виявило варіації у поверхневих білках, у тому числі адгезину війок, що, можна вважати, є визначальним стосовно патогенних властивостей між штамами Mycoplasma hyopneumoniae. Vasconcelos et al. (2006) та Djordjevic et al., Infection and Immunity 72(5): 2791-2802 (2004). M. hyopneumonia експресує, на її клітинній поверхні, мембранні ліпопротеїни, особливо білки Р46, Р65, та Р97, які несуть різновид-специфічні антигенні детермінанти. Нещодавно Bouh et al. описали моноклональні антитіла до Р46 та Р65 живого авірулентного еталонного штаму J M. hyopneumoniae ATCC 25934. Clin. Diag. Lab. Immunology 10(3): 459-468 (2003). Blank та Stemke описали фізичну та генетичну карту геному штаму J Mycoplasma hyopneumoniae, Can. J. Microbiol. 46:832-840 (2000), та Wilton et al. описали скринування бібліотек експресії, створених з непатогенного штаму J M. hyopneumoniae, та скринування цих бібліотек гіперімунною антисироваткою свиней проти М. hyopneumoniae. Існує необхідність у композиціях, у тому числі імуногенних композиціях або композиціях вакцин, отриманих із живої активованої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae, які забезпечують ефективність проти вірулентних штамів М. hyopneumoniae. Згадування будь-якої публікації не слід вважати вказівкою на те, що воно є частиною рівня техніки стосовно цього винаходу. Заявлений винахід стосується композицій, у тому числі імуногенних композицій або композицій вакцин, що містять імунологічно ефективну кількість живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae та біологічно прийнятний ад'ювант. Композиції, розкриті тут, викликають імунні відповіді на Mycoplasma hyopneumoniae, таким чином запобігаючи та/або мінімізуючи суворість хвороби, викликаної цим організмом, або полегшуючи принаймні один симптом, асоційований з хворобою. Відповідно, в одному аспекті винахід стосується композиції для виклику імунної відповіді на Mycoplasma hyopneumoniae у тварини, вказана композиція містить імунологічно ефективну кількість живого авірулентного штаму Mycoplasma hyopneumoniae та біологічно прийнятний ад'ювант. Згідно з одним втіленням композиція містить живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, чий геном містить послідовність нуклеїнової кислоти, що має принаймні приблизно 90 % гомології з послідовністю нуклеїнової кислоти еталонного штаму J. Згідно з одним втіленням композиція містить живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, чий геном містить послідовність нуклеїнової кислоти, що має принаймні приблизно 95 % гомології з послідовністю нуклеїнової кислоти еталонного штаму J. Згідно з одним втіленням композиція містить живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, чий геном містить послідовність нуклеїнової кислоти, що має принаймні приблизно 99 % гомології з послідовністю нуклеїнової кислоти еталонного штаму J. Згідно з одним втіленням композиція містить живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, що має принаймні приблизно 70 % поліморфної ідентичності з еталонним штамом J. Згідно з одним втіленням композиція містить живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, що має принаймні приблизно 85 % поліморфної ідентичності з еталонним штамом J. Згідно з одним втіленням композиція містить живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, що має принаймні приблизно 95 % поліморфної ідентичності з еталонним штамом J. Згідно з одним втіленням процент гомології живого авірулентного штаму Mycoplasma hyopneumoniae, застосовуваного у композиціях, описаних тут, визначають порівнянням з авірулентним еталонним штамом J, що має № АТСС 25934 (GenBank № АЕ017243) або 27715. 2 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно з певними іншими втіленнями еталонний штам може бути штамом, що є вірулентним штамом, наприклад, тим, що має №№ АТСС 25617 або 25095. Згідно з одним втіленням процент поліморфної ідентичності живого авірулентного штаму Mycoplasma hyopneumoniae, застосовуваного у композиціях, описаних тут, визначають порівнянням з авірулентним еталонним штамом J, що має № АТСС 25934 або 27715. Згідно з певними іншими втіленнями еталонний штам може бути штамом, що є вірулентним штамом, наприклад, той, що має №№ АТСС 25617 або 25095. Згідно з одним втіленням живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, застосовуваний у композиціях, описаних тут, є штамом J, позначеним як АТСС № 25934 або 27715. Згідно з одним втіленням живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, застосовуваний у композиціях, описаних тут, є штамом J, позначеним як АТСС № 27715. Згідно з одним втіленням імунна відповідь, що викликається живим авірулентним штамом Mycoplasma hyopneumoniae захищає тварин проти інфекції Mycoplasma hyopneumoniae, або зменшує суворість принаймні одного симптому, асоційованого з інфекцією вірулентним штамом Mycoplasma hyopneumoniae. Згідно з одним втіленням одно-дозове застосування до тварин композиції активованої живої авірулентної М. hyopneumoniae, розкритої тут, є ефективним у забезпеченні імунітету тварини від інфекції Mycoplasma. Згідно з одним втіленням дво-дозове застосування до тварин композиції активованої живої авірулентної М. hyopneumoniae, розкритої тут, є ефективним у забезпеченні імунітету тварини від інфекції Mycoplasma. Активовані композиції живої авірулентної вакцини Mycoplasma hyopneumoniae, розкриті тут, можна відповідно застосовувати для свиней проти інфекції та хвороб, викликаних Mycoplasma hyopneumoniae та будуть корисними у лікуванні та/або запобіганні поширення інфекції та хвороб, викликаних Mycoplasma hyopneumoniae у популяціях свиней. Таким чином, імуногенні композиції та композиції вакцин заявленого винаходу застосовують один або більше живих авірулентних Mycoplasma hyopneumoniae у комбінації з одним або більше ад'ювантами, як-то біологічно прийнятними ад'ювантами. Біологічно прийнятний ад'ювант може, як варіант, бути одним або більше ад'ювантами вибраними з групи: СП-олія, СПЦД, полімер акрилової кислоти (як-то Carbopol®, Noveon, Inc., Cleveland, ОН), та суміш здатної до метаболізму олії, як-то один або більше ненасичених терпенових вуглеводнів, наприклад, сквален або сквалан, та блок-кополімер поліоксіетилен-поліпропілен, як-то Pluronic® (BASF, Florham Park, New Jersey). Концентрація ад'юванту, застосовуваного у композиціях, описаних тут, залежатиме від природи ад'юванту. Ад'юванти є звичайно у композиціях, описаних тут, при кінцевій концентрації приблизно 1-50 об%, а більш звичайно при кінцевій концентрації приблизно 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, або 30 об%. у композиціях, що містять СП-олію, ад'ювант складає звичайно приблизно 125 об%, більш звичайно приблизно 5-15 об%, як-то, наприклад, приблизно 10 об%. у композиціях, що містять полімер акрилової кислоти та суміш метаболізовуваної олії, що містить один або більше терпенових вуглеводнів та блок-кополімер поліоксіетилен-поліпропілен, співвідношення полімеру акрилової кислоти до суміші метаболізовувана олія/блок-кополімер поліоксіетилен-поліпропілен є звичайно приблизно 1:25 та приблизно 1:50, звичайно при кінцевій концентрації приблизно 1-25 об%. Згідно з одним втіленням біологічно прийнятний ад'ювант містить СП-олію. Згідно з одним втіленням СП-олія має концентрацію приблизно 1-25 об%. Згідно з одним втіленням СП-олія має концентрацію приблизно 5-15 об%. Згідно з одним втіленням СП-олія має концентрацію приблизно 10 об%. Згідно з певними втіленнями композиції, розкриті тут, можуть містити у комбінації ще одне або більше з нижченаведеного: інші живі бактерії, бактерин, токсоїд, та/або вірусний антиген. Таким чином, у певних аспектах цих втілень композиція активованої живої авірулентної М. hyopneumoniae може містити імунологічно ефективну кількість живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae та один або більше біологічно прийнятних ад'ювантів у комбінації з нижченаведеним: (а) одна або більше живих бактерій; (b) один або більше бактеринів; (с) один або більше очищених токсоїдів від одного або більше патогенів, як-то, наприклад, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae та бактерії leptospira; та/або (d) один або більше вірусних антигенів, де вірус вибрано з групи: вірус грипу свиней (SIV), вірус репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRSV), поксвірус єнотів, що експресує PRRS та/або інші антигени, TGEV, що експресує PRRS та/або інші антигени, та цирковірус 3 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 свиней (PCV). У певних аспектах цих втілень показаними тут є композиції, у тому числі імуногенні композиції або композиції вакцин, котрі застосовують, у наступній комбінації, модифіковану химерою свинячого цирковірусу типу 1-типу 2 живу вакцину (cPCV1-2). Згідно з цими або альтернативними втіленнями композиції, у тому числі імуногенні композиції або композиції вакцин, можуть додатково або, як варіант, містити консервант та стабілізатор, як-то, наприклад, SGGK, тимерсол та/або ЕДТА. Концентрація такої іншої живої бактерії, бактерину, токсоїду та/або вірусного антигену, застосовуваних у композиціях, описаних тут, залежатиме від природи живої бактерії, бактерину, токсоїду та/або вірусного антигену та є звичайно у композиціях, описаних тут. Для таких композицій, де інший антиген є бактеріальним, бактерії мають звичайно кінцеву концентрацію приблизно 0,5×105 - 0,5×1010 на мілілітр. Альтернативно, бактерії мають кінцеву концентрацію приблизно 0,5×106 - 0,5×109 на мілілітр або кінцеву концентрацію приблизно 0,5×107 - 0,5×108 на мілілітр. Другий аспект винаходу стосується способів викликання імунної відповіді на Mycoplasma hyopneumoniae, або для захисту тварин від хвороб, викликаних Mycoplasma hyopneumoniae, та/або для запобігання або полегшення спалаху такої хвороби серед популяцій тварин застосуванням композиції активованої живої авірулентної М. hyopneumoniae, як описано тут. У пов'язаному аспекті заявлений винахід також стосується способів посилення імунної відповіді на Mycoplasma hyopneumoniae. Такі способи мають полягають в уведенні тваринам, як-то свиням, однієї або двох доз композиції, що містить один або більше активованих живих авірулентних штамів Mycoplasma hyopneumoniae. Згідно з одним втіленням способи винаходу застосовують живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, чий геном містить послідовність нуклеїнової кислоти, що має приблизно 90 % гомології з послідовністю нуклеїнової кислоти еталонного штаму J. Згідно з одним втіленням способи винаходу застосовують живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, чий геном містить послідовність нуклеїнової кислоти, що має приблизно 95 % гомології з послідовністю нуклеїнової кислоти еталонного штаму J. Згідно з одним втіленням способи винаходу застосовують живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, чий геном містить послідовність нуклеїнової кислоти, що має приблизно 99 % гомології з послідовністю нуклеїнової кислоти еталонного штаму J. Згідно з одним втіленням способи винаходу застосовують живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, що має принаймні приблизно 70 % поліморфної ідентичності з еталонним штамом J. Згідно з одним втіленням способи винаходу застосовують живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, що має принаймні приблизно 85 % поліморфної ідентичності з еталонним штамом J. Згідно з одним втіленням способи винаходу застосовують живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, що має принаймні приблизно 95 % поліморфної ідентичності з еталонним штамом J. Згідно з одним втіленням живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, застосовуваний у способах винаходу, як описано тут, є штамом J, позначеним як АТСС № 25934 або 27715. Згідно з одним втіленням живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae, застосовуваний у способах винаходу, як описано тут, є штамом J, позначеним як АТСС № 27715. Згідно з одним втіленням винахід стосується способу посилення імунної відповіді на Mycoplasma hyopneumoniae, який полягає в тому що: a) по-перше, тваринам уводять першу імуногенну композицію, що містить імунологічно ефективну кількість живого авірулентного штаму Mycoplasma hyopneumoniae, активованого біологічно прийнятним ад'ювантом; b) по-друге, тваринам уводять другу імуногенну композицію, що має імунологічно ефективну кількість живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae, активованої біологічно прийнятним ад'ювантом. Згідно з певними втіленнями залежно від точного застосування, композиції можна уводити парентерально, як-то внутрішньом'язовою, підшкірною або інтраперитонеальною ін'єкцією, або місцевим застосуванням крему. Композиції можна також уводити аерозольними, інтраназальними або пероральними шляхами, як-то інтраназальним розпиленням або перорально. Третій аспект винаходу стосується застосування описаних штамів Mycoplasma hyopneumoniae та композиції, що містить ці штами, для отримання медикаменту для лікування 4 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 тварин, що потерпають від інфекції Mycoplasma hyopneumoniae або потерпають від принаймні одного симптому, асоційованого з інфекцією Mycoplasma hyopneumoniae. Ці та інші втілення, особливості та переваги винаходу стануть зрозумілими з докладного опису та нижченаведеної формули винаходу. Усі патенти, патентні заявки, тощо, уведені тут як посилання. У випадку суперечності заявлений винахід є переважним. Способи та методологія лікування описано, зрозуміло, без обмеження певними способами та описаними експериментальними умовами, оскільки такі способи та умови можна варіювати. Також зрозуміло, що застосовувана тут термінологія є тільки для опису певних втілень та не призначена для обмеження. Відповідно, у цій заявці, можна застосовувати звичайні способи молекулярної біології, мікробіології та рекомбінантної ДНК. Такі способи є у літературі. Дивись, наприклад, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (тут "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes І та II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Хоча будь-які способи та матеріали, подібні або еквівалентні описаним тут, можна застосовувати на практиці або при тестуванні винаходу, кращі способи та матеріали є тут описаними. Усі згадані публікації уведені тут як посилання. Терміни, застосовувані тут, мають загальновизнані та відомі значення, однак, для зручності та повноти, певні терміни та їх значення нижченаведені. Термін "приблизно" означає статистично значущі межі значень. Такі межі можуть порядку, звичайно 50 %, більш звичайно 20 %, більш звичайно 10 %, та навіть більш звичайно 5 %. "Ад'ювант" означає композицію, що містить одну або більше речовин, що посилюють антигеннність живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae у композиції, звичайно композиції вакцини. Ад'ювант може бути тканинним депо, що повільно вивільняє антиген, а також активатором лімфоїдної системи, що неспецифічно посилює імунні відповіді (Hood, et al., Immunology, Second Ed., Menlo Park, CA: Benjamin/Cummings, 1984. p. 384). Часто, первинна вакцинація тільки антигеном, у відсутність ад'юванту, буде недостатньою для виклику гуморальної або клітинної імунної відповіді. Ад'юванти охоплюють, але без обмеження, повний ад'ювант Фрейнда, неповний ад'ювант Фрейнда, мінеральні гелі, як-то алюміній гідроксид, поверхнево-активні речовини, як-то лізолецитин, плюронові поліоли, поліаніони, пептиди, олійні або вуглеводневі емульсії, гемоціаніни брюхоногих блюдечок та потенційно корисні ад'юванти людини, як-то N-ацетил-мураміл-L-треоніл-D-ізоглутамін (thr-MDP), N-ацетил-нор-мураміл-Lаланіл-D-ізоглутамін, N-ацетилмураміл-L-аланіл-D-ізоглутамініл-L-аланін-2-(1'-2'-дипальмітоїлsn-гліцеро-3-гідроксифосфорилокси)-етиламін, BCG (bacille Calmette-Guerin) та Corynebacterium parvum. Переважно, ад'ювант є біологічно прийнятним. Ад'юванти, застосовувані у композиціях, описаних тут, є звичайно "біологічно прийнятними ад'ювантами", таким чином, їх можна застосовувати у комбінації з живим авірулентним Mycoplasma hyopneumoniae так, що утворені композиції можна застосовувати до тварини in vivo без супутньої токсичності. Показаними тут є композиції, у тому числі живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae у комбінації з одним або більше біологічно прийнятними ад'ювантами, вибраними з групи: СП-олія, СПЦД, карбопол, та суміш метаболізовуваної олії, якто один або більше ненасичених терпенових вуглеводнів, наприклад, сквален або сквалан, та блок-кополімеру поліоксіетилен-поліпропілен, як-то Pluronic®. Живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae або молекула звідти є "антигенним", коли він є здатним до специфічної взаємодії з молекулою визнання антигену імунної системи, як-то імуноглобулін (антитіл) або рецептор Т клітинного антигену. Звичайно, антигенною молекулою є поліпептид, або його варіант, що містить "епітоп" принаймні приблизно з 5 та звичайно принаймні приблизно з 10 амінокислот. Антигенна частина поліпептиду, також названа тут "епітоп" може бути частиною, що є імунодомінантом для антитіла або рецептору визнання Т клітин, або вона може бути частиною, застосовуваною для створення антитіл до молекули кон'югуванням антигенної частини з поліпептидом носія для імунізації. Молекула, що є антигенною, не має потреби бути самою імуногенною, тобто, здатною викликати імунні відповіді без носія. Термін "принаймні" означає не менше, ніж. 5 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "бактерин" означає збір інактивованих бактерій, що у комбінації з певними ад'ювантами можуть викликати імунітет для захисту від хвороби або інфекції при застосуванні до тварини. Полімером акрилової кислоти є звичайно карбомери. Карбомери є у продажу під назвою "карбопол" та описані, наприклад, у патентах США №№ 2909462 та 3790665, уведених тут як посилання. Термін "носій" стосується розріджувачу, ад'юванту, наповнювачу, стабілізатору, консерванту та/або носія, із котрими застосовують сполуку або композицію. Такі носії можуть бути стерильними рідинами, як-то вода та олії, у тому числі з нафти, тваринного, рослинного або синтетичного походження, як-то арахісова олія, олія сої, мінеральна олія, кунжутна олія тощо. Вода або водні фізіологічні розчини, наприклад, буферований фосфатом фізіологічний розчин, розчин Рингера та водні розчини декстрози та гліцерину часто застосовують як носії, особливо для ін'єктовуваних розчинів. Носій або розріджувач повинен бути нетоксичним та не впливати на біологічну активність антигену/імуногену. Інші додаткові допоміжні речовини, як-то змочувальні або емульгатори, ПАР, рН-буфери тощо, можна також застосовувати у композиціях винаходу. Консерванти можуть охоплювати, наприклад, тимерсол та/або ЕДТА. Придатні фармацевтичні носії є описаними у "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin, 18th Edition. Багато різних носіїв є добре відомими, та вибір певних носіїв є добре відомим. Термін "колонієтвірна одиниця" або "КТО" є одиницею виміру, застосовуваною для вказівки числа організмів, здатних до реплікації у наданому зразку. Це є на основі теорії, що колонія є похідною від реплікації пари/кластеру або одиничної клітини бактерії. "Імунологічно ефективна кількість" є кількістю живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae, що викликатиме імунні відповіді на Mycoplasma hyopneumoniae. "Імунологічно ефективна кількість" залежатиме від різновиду, виду, віку, розміру, стану здоров'я реципієнта та буде під впливом попереднього піддавання тварини дії одного або більше штамів Mycoplasma hyopneumoniae, щоб виявити, чи один або більше штамів є вірулентним штамом або авірулентним штамом Mycoplasma hyopneumoniae. Як застосовувано тут, "імунологічно ефективна кількість" живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae, при застосуванні у комбінації з придатним ад'ювантом, є кількістю Mycoplasma hyopneumoniae, що є достатньою для посилення імуногенності живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae, та таким чином стосується захисного імунітету проти антигенного стимулювання вірулентним штамом Mycoplasma hyopneumoniae. Згідно з одним втіленням імунологічно ефективна кількість складає мінімум приблизно 1×103 організмів. Згідно з одним втіленням межі імунологічно ефективної кількості є приблизно 1×103 колонієтвірних одиниць/мл (КТО/мл) до приблизно 1×1011 КТО/мл. Згідно з одним втіленням імунологічно ефективна кількість є приблизно 5×107 КТО/мл. Як застосовувано тут, термін "імуногенні" засоби, що є живим авірулентним Mycoplasma hyopneumoniae, здатним викликати гуморальні та/або клітинні імунні відповіді. Імуногенний штам є також антигенним. Імуногенною композицією є композиція, що викликає гуморальну та/або клітинну імунну відповідь при застосуванні до тварини. Термін "імуногенна композиція" стосується будь-якої фармацевтичної композиції, що містить антиген, наприклад, мікроорганізм. Таку композицію можна застосовувати для виклику імунної відповіді у ссавця. Імунна відповідь може охоплювати відповідь Т клітин, В клітин окремо, або відповідь Т клітин та В клітин. Композиція може слугувати для викликання чутливості ссавця презентації антигену в асоціації з молекулами МНС на поверхні клітин. На додаток, антигенспецифічні Т-лімфоцити або антитіла можна створювати для дозволяння майбутнього захисту імунізованого хазяїна. "Імуногенна композиція" може містити живу, послаблену або неживу або інактивовану вакцину, що містить цілі мікроорганізми або імуногенні частини, отримані з цілих мікроорганізмів, що індукують будь-яку опосередковану клітинами (Т клітин) імунну відповідь або опосередковану антитілами (В клітин) імунну відповідь, та може захищати тварини від одного або більше симптомів, асоційованих з інфекцією мікроорганізмом, або може захищати тварину від загибелі внаслідок інфекції мікроорганізмами. Як застосовувано тут, термін "виділений" означає, що матеріал видаляють з його природного оточення. Таким чином, виділений біологічний матеріал може бути вільним від деяких або усіх клітинних компонентів, у котрих є природний матеріал (наприклад, цитоплазматичний або мембранний компонент). Матеріал є виділеним, якщо він є в екстракті або супернатанті клітин. Виділений білок може бути асоційованим з іншими білками або нуклеїновими кислотами, з котрими він асоціюється у клітині, або з клітинними мембранами, якщо він є асоційованим з мембранами білком. Виділені органели, клітини або тканини видаляють від анатомічної зони, у котрій їх знайдено в організмі. Виділений матеріал може бути чи ні очищеним. 6 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як застосовувано тут, термін "MHDCE" означає еквіваленти ДНК клітин Mycoplasma hyopneumoniae та його визначено як одиницю виміру, застосовувану для визначення приблизного числа організмів Mycoplasma hyopneumoniae у наданому зразку. Термін "парентеральне застосування", як застосовувано тут, означає застосування деякими іншими засобами, ніж через шлунково-кишковий тракт, особливо для уведення речовини в організм внутрішньовенною, підшкірною, внутрішньом'язовою або внутрішньомозковою ін'єкцією, але також іншими неоральними та неназальними шляхами застосування, як-то інтраперитонеальні ін'єкції або місцеве застосування. Термін "поліморфна ідентичність з еталонним штамом J" стосується подібності між профілем експресії білку одного штаму Mycoplasma hyopneumoniae з еталонним штамом J Mycoplasma hyopneumoniae. Поліморфна ідентичність може бути на основі одної або більше характеристик одного або більше білків, у тому числі, але без обмеження, наприклад, кількості або розміру одного або більше білків мікроорганізму Mycoplasma hyopneumoniae, швидкості седиментації одного або більше білків, або зміни фізичних або біохімічних характеристик одного або більше білків. Термін може також охоплювати подібність нуклеотидних послідовностей, що кодують будь-який один або більше білків одного штаму Mycoplasma hyopneumoniae та еталонного штаму J Mycoplasma hyopneumoniae та охоплює будь-які мутації у цих послідовностях, у тому числі делеції або заміщення. Зміна нуклеотидної або амінокислотної послідовності дозволяє збереження авірулентної природи організму Mycoplasma hyopneumoniae. Багато різних аналізів для спостереження порушень нуклеотидних та амінокислотих послідовностей є добре відомими. Наприклад, розмір та структуру нуклеотидних та амінокислотих послідовностей спостерігають за допомогою Норзерн, Саузерн, Вестерн блотування, аналізу SDS-PAGE ELISA, PCR та протоколів секвенсування ДНК (дивись, наприклад, Calus, D. et al. Veterinary Microbiology, Vol. 120, 3-4 10.03.2007, pages 284-291; Scarman, AL, et al. Microbiology (1997), Vol. 143: 663-673). На додаток, інші способи спостереження порушень нуклеотидних та амінокислотих послідовностей, як-то аналіз поліморфізму одинично-ланцюгової конформації, є добре відомими (дивись, наприклад, Патент США № 5,382,510 від 7.09.1999, та Патент США № 5,952,170 від 17.01.1995). Термін "очищений" як застосовувано тут, стосується матеріалу, що виділено за умови, що зменшують або елімінують присутність непов'язаних матеріалів, тобто, забруднень, у тому числі природних матеріалів, з котрих матеріал отримують. Наприклад, очищені бактерії або білок є звичайно по суті вільними від клітин хазяїна або компонентів культури, у тому числі культури тканин або білків яєць, неспецифічних патогенів, тощо. Як застосовувано тут, термін "по суті вільний" застосовують у контекст аналітичного тестування матеріалу. Звичайно, очищений матеріал, по суті вільний від забруднень є принаймні на 50 % чистим; більш звичайно принаймні на 90 % чистим, та більш звичайно принаймні на 99 % чистим. Чистоту можна оцінювати хроматографією, гель-електрофорезом, імуноаналізом, аналізом складу, біологічним аналізом та іншими відомими способами. Способи очищення є добре відомими. Термін "по суті чистий" вказує на найвищий ступінь чистоти, що можна досягнути, застосовуючи звичайні відомі способи очищення. "Еталонний штам" стосується штаму мікроорганізму, наприклад, Mycoplasma hyopneumoniae, що отримують з певних джерел, що можна застосовувати як контрольний штам для порівнянь з іншими невстановленими або невідомими культурами. У заявленому винаході, еталонні штами Mycoplasma hyopneumoniae можуть бути авірулентними штамами J, що отримують з АТСС та мають №№ АТСС 25934 та 27715. У заявленому винаході, ці "еталонні штами", що мають №№ АТСС 25934 або 27715 також застосовувані для отримання імуногенної композиції винаходу. Згідно з іншими певними втіленнями винаходу, еталонні штами Mycoplasma hyopneumoniae можна отримувати від АТСС та мають №№ АТСС 25617 та 25095. Термін "СПЦД" стосується сульфоліпоциклодекстрину, що є циклодекстринним ад'ювантом, що описано у патентах США №№ 6,610,310 та 6,165,995. Звичайно, СПЦД формують у суміші із метаболізовуваною олією, як-то один або більше ненасичених терпенових вуглеводнів, наприклад, сквалан та переважно з неіонною ПАР, як-то поліоксіетилен-сорбітан-моноолеат. Термін "СП-олія" стосується ад'юванту, що є емульсією олії, що містить: 1-3 об% блоккополімеру поліоксіетилен-поліоксипропілен; 2-6 об% сквалану; 0,1-0,5 об% поліоксіетиленсорбітан-моноолеату; та буферований розчин солі. Терміни "вакцина" або "композиція вакцини", котрі застосовують взаємозамінювано, стосуються фармацевтичної композиції, що містить принаймні одну імуногенну композицію, що індукує імунну відповідь у тварини. Вакцина або композиція вакцини може захищати тварини від хвороб або можливої загибелі внаслідок інфекції, та може містити або не містити один або більше додаткових компонентів, що посилюють імунологічну активність активного компоненту. 7 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Вакцина або композиція вакцини може додатково містити наступні компоненти, типові для фармацевтичної композиції. Вакцина або композиція вакцини може додатково містити наступні компоненти, типові для вакцини або композиції вакцини, у тому числі, наприклад, ад'ювант або імуномодулятор. Імуногенно активний компонент вакцини може містити живі організми у будьякій формі, або як послаблені організми у модифікованій живій вакцині, або організми, інактивовані прийнятними способами у послабленій або інактивованій вакцині, або субодиницю вакцини, що містить один або більше імуногенних компонентів вірусу, або генетично модифіковані, мутовані або клоновані вакцини, отримані відомими способами. Вакцина або композиція вакцини може містити один або одночасно більше, ніж один з елементів, описаних вище. Як застосовувано тут, "вірулентний" стосується здатності штаму Mycoplasma hyopneumoniae спричиняти хворобу, асоційовану з інфекцією Mycoplasma hyopneumoniae. Вірулентність можна оцінювати спостереженням прогресу хвороби у тварини Прикладом "вірулентного" штаму Mycoplasma hyopneumoniae є показаний антигенно-стимулювальним штамом Mycoplasma hyopneumoniae, як описано та застосовувано у заявленому винаході. Інші вірулентні штами Mycoplasma hyopneumoniae від АТСС визначені як штами № 25617 або 25095. Термін "авірулентний" стосується штамів Mycoplasma hyopneumoniae, що втратили вірулентність, а саме авірулентні штами, ізоляти або констракти, що є непатогенними та є нездатними викликати хворобу. Як застосовувано тут, термін "авірулентний" застосовують синонімічно з терміном "невірулентний". Показаними тут є композиції із застосуванням культури авірулентного живого штаму М. hyopneumoniae J (FCX3-Line 1, що є доступним від АТСС як штам № 27715). Ще один "авірулентний" штам, що є також доступним від АТСС, є визначеним як штам № 25934. Штам J, визначений як АТСС № 27715, було клоновано з вихідного штаму J, визначеного як АТСС № 25934, як описано у каталозі АТСС. Заявлений винахід є на основі відкриття, що одно- або дво-дозові режими композиції М. hyopneumoniae, у тому числі імуногенної композиції або композиції вакцини, застосовуючи один або більше живих авірулентних Mycoplasma hyopneumoniae, як-то, наприклад, штам J (FCX3Line 1; АТСС № 27715), та один або більше ад'ювантів, звичайно біологічно прийнятних ад'ювантів, є ефективними у захисті від хвороб та/або запобігання або полегшення хвороб, асоційованих з вірулентною інфекцією Mycoplasma hyopneumoniae. Згідно з одним втіленням інші живі авірулентні штами Mycoplasma hyopneumoniae, у тому числі, але без обмеження, штами J, чий геном містить послідовність нуклеїнової кислоти, що має принаймні приблизно 90 % гомології, або принаймні приблизно 95 % гомології, або принаймні приблизно 99 % гомології з еталонним штамом J, є розглянутими для застосування у композиціях та способах винаходу. Згідно з одним втіленням інші живі авірулентні штами Mycoplasma hyopneumoniae, у тому числі, але без обмеження, штами J, котрі мають принаймні приблизно 70 % поліморфної ідентичності, або принаймні приблизно 85 % поліморфної ідентичності, або принаймні приблизно 95 % поліморфної ідентичності, відносно еталонного штаму J, є розглянутими для застосування у композиціях та способах винаходу. Еталонний штам J можна вибрати з штамів Mycoplasma hyopneumoniae, визначених за АТСС № 25934 або 27715. Згідно з одним втіленням живий авірулентний штам J, застосовуваний у композиціях та способах винаходу є штамом J, позначеним як АТСС № 25934 або 27715. Згідно з одним втіленням живий авірулентний штам J, застосовуваний у композиціях та способах винаходу, є штамом J, позначеним як АТСС № 27715. Також тут розкрито, що композиції, у тому числі композиції вакцин, котрі застосовують один або більше живих авірулентних штамів Mycoplasma hyopneumoniae у наступній комбінації з модифікованою химерою свинячого цирковірусу типу 1-типу 2 живою вакциною (CPCV1-2) (Дивись Патенти США №№ 2003/0170270 та 2004/0253270) є також ефективними у захисті від хвороби та/або запобіганні або полегшенні хвороби, асоційованої з вірулентною інфекцією Mycoplasma hyopneumoniae та/або вірулентною інфекцією цирковірусу свиней. Згідно з певними втіленнями композиції винаходу, крім того, містять одну або більше живих бактерій, бактерин та/або один або більше очищених токсоїдів, вибраних з групи: Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, та бактерії leptospira. Згідно з певними втіленнями композиції винаходу, крім того, містять один або більше вірусних антигенів, вибраних з групи: антиген вірусу грипу свиней (SIV), антиген вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRSV), поксвірус єнотів, що експресує 8 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 PRRS або інші антигени, TGEV, що експресує PRRS або інші антигени, та антиген цирковірусу свиней (PCV). Згідно з певними втіленнями заявлений винахід описано далі з посиланням на захист проти інфекції гомогенатом легень, визначеним як LI-34, що містить вірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae 11 (Дивись J. Clin. Microbiol. 1999 Маr; 37(3): 620-7. Однак, розглянуто, що композиції, розкриті тут, будуть ефективними у захисті від хвороби та/або запобіганні або полегшенні хвороби або принаймні одного симптому, асоційованого з хворобою, що є асоційованою з багатьма вірулентними інфекціями Mycoplasma hyopneumoniae. Ряд вірулентних ізолятів Mycoplasma hyopneumoniae є відомими та є доступними від різних джерел у тому числі АТСС, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852. Приклади цих вірулентних штамів охоплюють, але без обмеження, №№ АТСС 25095, 27714 та 25617. Композиції, зокрема, імуногенні композиції або композиції вакцин, заявленого винаходу можна отримувати з ліофілізованих або щойно зібраних культур живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae одною або більше методологією, що є легко доступною. Показаними тут є композиції, що містять живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae J (FCX3-line 1), котрий є доступним як АТСС № 27715 (фільтрований та клонований 3 рази ізолят АТСС № 25934). Живу авірулентну Mycoplasma hyopneumoniae можна культивувати методологією, описаною у патентах США №№ 5,338,543 та 5,565,205, уведених тут, як посилання. Більш конкретно, Mycoplasma hyopneumoniae можна розмножувати у культурному середовищі, як-то повне середовище PPLO (Плевропневмонія-подібний організм) (Difco; Becton Dickinson та Company, San Jose, California). Ріст організму відстежують стандартними способами, як-то визначенням одиниці зміни кольору (CCU), та збирають, коли досягнуто достатньо високий титр. Вихідні можна, крім того, концентрувати або ліофілізувати звичайними способами перед уведенням у склад композиції. Інші способи, як-то описані Thomas et al., Agri-Practice 7(5):26-30, можна застосовувати також. Умови, у котрих вирощують ізолят Mycoplasma hyopneumoniae, можуть варіювати залежно від точного складу середовища та конкретного вирощуваного ізоляту. Ізоляти Mycoplasma hyopneumoniae звичайно вирощують протягом приблизно 48-144 годин від часу інкубації до часу збору. Залежно від точної композиції, що формують, Mycoplasma hyopneumoniae можна концентрувати, наприклад, ультрацентрифугуванням або ультрафільтруванням Концентровану Mycoplasma hyopneumoniae можна отримувати відомою методологією та можна змішувати з придатним фізіологічно прийнятним носієм - звичайно водними середовищами, як-то, наприклад, фізіологічний розчин, буферований фосфатом фізіологічний розчин (PBS), мінімальне основне середовища (MEM), або MEM із ГЕПЕС-буфером. Це можна тоді крім того комбінувати з прийнятним ад'ювантом для забезпечення потрібної об'ємної концентрації. Композиції можуть додатково містити один або більше хелаторів, як-то ЕДТА, звичайно при концентрації приблизно 0,05 - приблизно 0,20 мас/об%. Альтернативно, штам Mycoplasma hyopneumoniae для застосування в імуногенній композиції або композиції вакцини можна концентрувати як описано вище, або ліофілізувати та ресуспендувати у прийнятному ад'юванті при потрібній концентрації. Як вказано вище, композиції, у тому числі імуногенні композиції або композиції вакцин заявленого винаходу загалом містять живий авірулентний штам Mycoplasma hyopneumoniae у комбінації з одним або більше ад'ювантами, звичайно біологічно прийнятними ад'ювантами. Для одно-дозового застосування, композиції можуть містити кількість живої авірулентної Mycoplasma pneunomoniae, відповідну приблизно 1×108 - 3×1011 MHDCE/мл. Альтернативно, композиції можуть містити кількість живої авірулентної Mycoplasma pneunomoniae, відповідну приблизно 1×109 - 3×109 MHDCE/мл. Композиції формують так, щоб кожна доза була приблизно 1-5 мл, або приблизно 2 мл, на тварин для застосування внутрішньом'язово, підшкірно, або інтраперитонеально та приблизно 1-10 мл, або приблизно 2-5 мл, для застосування перорально або інтраназально. Для дво-дозового застосування, композиції звичайно містять кількість живої авірулентної Mycoplasma pneunomoniae приблизно 1×108 - 3×1011 MHDCE/мл, більш звичайно приблизно 1×109 - 3×109 MHDCE/мл. Згідно з певними втіленнями для дво-дозового застосування, композиції можуть містити кількість живої авірулентної Mycoplasma pneunomoniae, що містить приблизно 103 КТО/мл - 10 11 КТО/мл. Композиції формують так, щоб кожна доза була приблизно 1-5 мл, переважно приблизно 2 мл на тварину для застосування внутрішньом'язово, підшкірно, або інтраперитонеально та приблизно 1-10 мл, звичайно приблизно 2-5 мл для застосування перорально або інтраназально. 9 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ад'ювантна суміш для застосування в імуногенній композиції та композиції вакцини заявленого винаходу посилює імунну відповідь стимулюванням опосередкованої клітинами та/або локальної (секреторної ІgА) імунної реакції. Біологічно прийнятним ад'ювантом може, наприклад, бути один або більше ад'ювантів, вибраних з групи: СП-олія, СПЦД, полімер акрилової кислоти (як-то карбопол), та суміш метаболізовуваної олії, як-то один або більше ненасичених терпенових вуглеводнів, наприклад, сквален або сквалан, та блок-кополімеру поліоксіетилен-поліпропілен, як-то Pluronic®. Ад'юванти можна, крім того, вибирати з цитокінів, як-то IL-12 та IL-18; алюміній гідроксид; кополімер етилен-малеїнова кислота; DEAE-декстран; похідний від стінок клітин мікобактерій ад'ювант; тощо. Концентрація ад'юванту, застосовуваного у композиціях, описаних тут, залежатиме від природи ад'юванту. Ад'юванти є звичайно у композиціях, описаних тут, при кінцевій концентрації приблизно 1-50 % та більш звичайно при кінцевій концентрації приблизно 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, або 30 %. Концентрацію антигену в ад'юванті можна отримувати на основі маса на об'єм або об'єм на об'єм. Наприклад, антиген для доставляння у композиціях винаходу можна отримувати у ліофілізованій формі, з наступним розбавленням в ад'юванті безпосередньо для отримання певних концентрацій на основі маса на об'єм. Альтернативно, антиген можна спершу відтворювати у прийнятному розріджувачі (наприклад, буфері), до котрого тоді додають ад'ювант в об'ємі, достатньому для отримання певних концентрацій антигену та ад'юванту на основі маса на об'єм чи об'єм на об'єм, як описано вище. Згідно з певними втіленнями ад'ювант можна застосовувати з антигеном/імуногеном як одиничну композицію, або можна застосовувати до, одночасно або після застосування антигену/імуногену. Вибір ад'юванту залежить від стабільності антигену/імуногену, що містить ад'ювант, шляху застосування, режиму дозування, ефективності ад'юванту для вакцинованого виду. У композиціях, що містять СП-олію, ад'ювант є звичайно при приблизно 1-25 об%, більш звичайно приблизно 5-15 об%, як-то, наприклад, приблизно при 10 об%; у композиціях, що містять полімер акрилової кислоти та суміш метаболізовуваної олії, що містить один або більше терпенових вуглеводнів, та блок-кополімер поліоксіетилен-поліпропілен, співвідношення полімеру акрилової кислоти до суміші метаболізовувана олія/блок-кополімер поліоксіетиленполіпропілен є звичайно у співвідношенні приблизно 1:25-1:50. Метаболізовувану олію, блоккополімер поліоксіетилен-поліпропілен, та полімер акрилової кислоти можна застосовувати у формі емульсії олія у воді, де полімери акрилової кислоти звичайно застосовують при концентрації приблизно 0,5-10 г/л; метаболізовувані олії звичайно застосовують при концентрації приблизно 2 мл/л - 6 мл/л; та поліоксіетилен-пропілен блок-кополімери звичайно застосовують при концентрації приблизно 1 мл/л - 3 мл/л. Зразкові придатні суміші ад'юванту охоплюють, але без обмеження, суміші одного або більше полімерів акрилової кислоти з сумішшю метаболізовуваної олії, наприклад, ненасиченого терпенового вуглеводню або продукту його гідрування, переважно сквалану (2,3,10,15,19,23-гексаметилтетракозан) або сквалену, та блок-кополімеру поліоксіетиленполіоксипропілен. Таким полімером акрилової кислоти може бути гомополімер або кополімер. Полімером акрилової кислоти є звичайно карбомери. Карбомери є у продажу під назвою карбопол та є описаними, наприклад, у патентах США №№ 2,909,462 та 3,790,665, уведеними тут, як посилання. Блок-кополімерами поліоксіетилен-поліоксипропілену є ПАР, звичайно рідкі ПАР, котрі допомагають у суспендуванні твердих та рідких компонентів. ПАР є у продажу як полімери під назвою Pluronic®. ПАР полоксамер 401 є у продажу під назвою Pluronic® L121. Суміш ад'юванту може містити метаболізовувану олію, полімер акрилової кислоти та блоккополімер поліоксіетилен-поліоксипропілен, виготовлений як емульсія у водному середовищі. Згідно з певними втіленнями суміш ад'юванту може містити метаболізовувану олію та блоккополімер поліоксіетилен-поліоксипропілен, як-то суміш сквалану та Pluronic® L121 (полоксамер 401), що може бути у кількості приблизно 50 мл/л - 100 мл/л та карбоксиметилен-полімером може бути карбопол 934Р (Карбамер 934Р), що може бути у кількості приблизно 2 мл/л. Кращі полімери акрилової кислоти є у продажу від В.F Goodrich як карбопол 934 Р NF та 941 NF, що є полімерами акрилової кислоти, перехресно-зв'язані з поліалілсахарозою та мають хімічну формулу (СН2СНОООН)n. Ці полімери утворюють водні гелі, котрі відповідно формують з водними носіями. Блок-кополімерами поліоксіетилен-поліпропілену можуть бути неіонні ПАР, що є у продажу від BASF, як-то Pluronic® L121, L61, L81 або L101. Згідно з певними втіленнями композиції, розкриті тут, можна застосовувати, у комбінації з одною або більше інших живими бактеріями, бактерином, токсоїдом та/або вірусним антигеном. Таким чином, у певних аспектах цих втілень композиція активованої живої авірулентної М. 10 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 hyopneumoniae може містити імунізувальну кількість живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae та один або більше біологічно прийнятних ад'ювантів у комбінації з нижченаведеним: (а) одна або більше живих бактерій, як-то, наприклад, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, та бактерії leptospira; (b) один або більше бактеринів; (с) один або більше очищених токсоїдів від одного або більше патогенів, як-то, наприклад, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, та бактерії leptospira; та/або (d) один або більше вірусних антигенів, де вірус вибрано з групи: вірус грипу свиней (SIV; як-то штами SIV H1N1, H1N2, та H3N2), вірус репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRSV), поксвірус єнотів, що експресує PRRS та/або інші антигени, TGEV, що експресує PRRS та/або інші антигени, та цирковірус свиней (PCV). Показаними тут є композиції, у тому числі композиції вакцин, котрі застосовують один або більше живих авірулентних штамів Mycoplasma hyopneumoniae у комбінації з модифікованою химерою свинячого цирковірусу типу 1-типу 2 живою вакциною (cPCV1-2) (Дивись Патенти США №№ 2003/0170270 та 2004/0253270). Згідно з цими або альтернативними втіленнями композиції, у тому числі композиції вакцин, можуть додатково або, як варіант, містити консервант, як-то, наприклад, тимерсол та/або ЕДТА. Дивись, також, Патенти США №№ 2002/0131980 та 2003/0017171, уведеними тут, як посилання. Концентрація таких інших живих бактерій, бактерину, токсоїду та/або вірусного антигену, застосовуваних у композиціях, описаних тут, залежатиме від природи бактерину, токсоїду та/або вірусного антигену та є звичайно у композиціях, описаних тут, при кінцевій концентрації приблизно 0,5×105 - 0,5×1010 на мл. Альтернативно, бактерії є у кінцевій концентрації приблизно 0,5×106 - 0,5×109 на мл або приблизно 0,5×107 - 0,5×108 на мл. Композиції заявленого винаходу знайдуть корисність у способах захисту тварин від хвороб, викликаних Mycoplasma hyopneumoniae та/або для запобігання або полегшення спалаху такої хвороби серед популяцій тварин застосуванням композиції активованої живої авірулентної М. hyopneumoniae, як описано тут. Композиції, описані тут, можна також сприятливо застосовувати у способах посилення у тварини імунної відповіді, як-то опосередкованої клітинами та/або гуморальної імунної відповіді на Mycoplasma hyopneumoniae. Такі способи мають етапи застосування до тварин, звичайно свиней, одною або двома дозами, композиції, що містить один або більше активованих живих авірулентних штамів Mycoplasma hyopneumoniae. Залежно від точного розглянутого застосування композиції можна застосовувати внутрішньом'язово, підшкірно, перорально, аерозолем, або інтраназально. Згідно зі способами заявленого винаходу, бажаний режим дозування залучає застосування одної або більше доз потрібної композиції вакцини до свиней. Звичайно, де застосовують до тварин дві дози, дози застосовують приблизно 1 тиждень нарізно - чотири (4) тижні нарізно, більш звичайно приблизно 2 тижні нарізно - три (3) тижні нарізно. Приклади Заявлений винахід краще зрозуміти з посиланням на нижченаведені необмежувальні приклади: Приклад 1: Отримання Авірулентної Активованої Живої Вакцини М. hyopneumoniae. Цей приклад розкриває отримання зразкової композиції активованої живої авірулентної М. hyopneumoniae згідно з заявленим винаходом. Mycoplasma hyopneumoniae можна отримувати з будь-якого числа легко доступних джерел. Згідно з одним втіленням, описаним тут, культуру штаму J авірулентної живої М. hyopneumoniae (FCX3-Line 1), отримували від АТСС (АТСС; Manassas, VA) як АТСС штам № 27715. Будь-який інший авірулентний штам М. hyopneumoniae можна застосовувати для отримання композицій, наприклад, вихідний штам J, визначений як АТСС № 25934. Згідно з певними іншими втіленнями, припускають, що будь-який живий вірулентний штам Mycoplasma pneumoniae, можна модулювати, послабляти або мутувати до встановлення авірулентності культури, як визначено тестуванням in vitro або in vivo, відомими способами. Повну геномну послідовність штаму J АТСС 25934 опубліковано Vasconcelos et al (J Bacteriol. (2005), 187(16): 5568-5577) під № АЕ017243. Кілька послідовностей, асоційованих з штамом 25934 АТСС можна знайти у PubMed, вони мають №№ GenBank AY737012 (ген рибосомальної PHK16S), AY512905 (ген адгезину, AF013714 (ген проліпопротеїну р65), U02538 (ген pPHK23S) та гени гомологу білку резистентності до багатьох ліків U02537). Кожну композицію вакцини для бактерицидного аналізу отримували з одної склянки регідратованої люфілізованої культури М. hyopneumoniae, 20 мл нормального фізіологічного розчину. Композиції вакцин містили комбінацію 5 мл регідратованої культури та достатню 11 UA 98812 C2 5 концентрацію ад'юванту у кінцевому об'ємі 10 мл. Контрольну композицію також отримували комбінуванням 5 мл регідратованої культури з 5 мл нормального фізіологічного розчину. Усі композиції змішували протягом 5 хвилин перед збиранням зразків. Зразки відбирали з усіх композицій на 5 хвилині (0 годин), 3 годині, та 7 годині після змішування. Живучість кожної вакцини визначали колонієтвірними одиницями (КТО) при кожному збиранні зразків (дивись таблицю 1). Таблиця 1 Ад'ювант 30 % СПЦД 10 %СПЦД Контроль 5 % СП-олії 5 % СП-олії / 0,2 % Контроль 10 % СП-олії Контроль 10 %СП-олії + 0,2 % 0,2 % карбополу контроль 10 15 20 25 0 1,44 1,48 8,30 9,46 1,50 2,17 1,09 3,50 5,20 6,80 2,90 КТО/мл 3 0 6,40 1,06 7,60 5,61 1,41 1,07 4,75 1,30 6,67 без 7 0 5,2 9,0 2,5 4,5 9,8 7,1 7,2 8,1 6,6 5,5 0 1,15 2,87 3,62 4,67 4,27 1,91 3,40 1,03 5,50 1,63 1,23 MPN/мл 3 0 8,4 6,2 9,4 7,7 8,4 7,7 8,4 1,9 1,3 без 7 0 0,0 3,6 6,2 2,8 4,6 3,6 3,1 2,2 4,4 1,3 Середню живучість вихідної культури визначали усередненням усіх контрольних живучостей на 0 годину, у середньому 9,09×107 КТО/мл. У порівнянні, найбільш ймовірне число (MPN) визначали для вихідних культур, утворених при 1,85×108 MPN/мл. Змішування вакцин та вакцинація звичайно бере менше, ніж 3 годин; тому при огляді бактерицидної дії ад'ювантів час 3 години є найбільш важливим. Тенденцією для СП-олії при 5 % та 10 % при збиранні зразків на 3-годину порівняно з контролем є 2-кратно різниця та 4-кратно різниця, відповідно. Вакцину А отримували регідратуванням склянок ліофілізованої культури розріджувачем, що має кінцеву концентрацію 10 об% СП-олії. Плацебо-вакциною був стерильний нормальний фізіологічний розчин. Приклад 2: In vivo Ефективність Авірулентної Активованої Живої Вакцини М. hyopneumoniae у свиней Цей приклад демонструє in vivo ефективність композиції зразкової активованої живої авірулентної вакцини М. hyopneumoniae. Загалом 30 свиней 4-6 тижнів віку отримали від Fort Dodge Animal Health's SPF, Charles City, Iowa. Свиней тримали на кормі без антибіотиків або стимуляторів росту та надавали воду та їжу досхочу. Тварин, що отримували композиції вакцин та контрольні композиції поміщали у відмінні кімнати та усіх свиней тримали у подібних умовах протягом вакцинації, моніторингу та періодів антигенного стимулювання. 30 свиней були випадково поділяли на 3 групи таким чином: 1 група отримувала композицію вакцини, 1 група отримувала плацебо, та 1 група була контрольною. Свиней групували як показано у таблиці 2. 30 Таблиця 2 Група Вакцина 1 2 3 35 Загальне число свиней 13 12 5 А плацебо не виявлено Число антигенно стимульованих свиней 13 12 не виявлено Свиней 4-6 тижнів віку вакцинували внутрішньом'язово дозою 2 мл прийнятної вакцини. Група 1 застосовували вакцин А, група 2 застосовували плацебо. Свиней з групи 3 не вакцинували чи антигенно стимулювали, застосовуючи як контролі. Свиней у групі 1 вакцинували двічі, два тижні нарізно. Два тижні після другої вакцинації, усіх свиней у групах 1 та 2 антигенно стимулювали гомогенатом легень (LI-34), що містив вірулентний штам М. hyopneumoniae штам 11 (J. Clin. Microbiol., 1999 Маr; 37(3):620-7). Чотири тижні після антигенного стимулювання, усіх свиней у групах 1-3 вбивали та оцінювали ураження легень. 12 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Отримання гомогенату легень (LI-34) для антигенно-стимулювального штаму М. hyopneumoniae Сім перехресно-виведених свиней отримували від Spring Prairie Colony Farms (Genetipork) та прищеплювали інтратрахельно 10 мл розбавлення 1:30 10 % сирого гомогенату легень (LI31) штаму Mycoplasma hyopneumoniae 11. Сирий гомогенат LI31 легень отримали пропусканням гомогенату легень, що містить М. hyopneumoniae у певних свиней без патогену та збиранням утворених пневмонічних легень на ранній серединній стадії хвороби. Гомогенати легень зберігали при -70 °С до потребування. Сироватку збирали при прибутті та при розтині трупа з усіх свиней та оцінювали у ISU Ветеринарній діагностичній лабораторії (ISU-VDL) стосовно наявності антитіл на TGE (PRCV), SW та PRV. На додаток, виконували ELISA для антитіл PRRSV та М. hyopneumaniae та усі зразки були негативними для усіх з вищенаведених респіраторних патогенів. Усіх свиней вбивали. Пентобарбітал було застосовувано для індукування глибокої анестезії свиней перед знекровленням. Стінку вентральної грудної клітки відкривали та зони пневмонічних уражень М. hyopneumoniae видаляли асептично та поміщали індивідуально у стерильні контейнери. Невелику частину кожних легень розтирали та перевіряли на чистоту на агарових планшетах з кров'ю, настої коров'ячого серця, та середовищі Фрііза. Розбавлення виконували у середовищі Фрііза для титрування М. hyopneumoniae. Залишкові шматки легень були заморожені у тубах 50 мл для центрифугування при -70 °С доки не були відомі результати бактеріології та виділення мікоплазм. Частки легень від 3 з 7 свиней були застосовуваними для отримання інокуляту легень М. hyopneumoniae. Частки від свиней #329, 331, та 332 розморожували та розтирали у середовищі Фрііза, що не містить антибіотиків. Чистоту інокуляту легень підтверджували за допомогою культури на настої коров'ячого серця, агарі з кров'ю та середовищі Фрііза. Тільки мікрококи з оточенням забруднення були знайденими на одному планшеті. Інокулят легень титрували на рівні М. hyopneumoniae та знайшли вміст приблизно 107 КТО/мл. Аліквоту представляли на ISU-VDL для аналізів виділення вірусу для SN, EMS, ентеровірусу, HEV, PRCV, PRRSV, Pseudorabies, TGE, парвовірусу та ротавірусу. Результати усіх аналізів були негативними. Кінцевий об'єм розтертого інокуляту легень (мічений LI 34) був 1780 мл з 178,1 г тканини легень. Це аліквотували в об'єми 100×5 мл та 110×10 мл. У другій фазі дослідження були застосовуваними 9 свиней у визначенні концентрації інокуляту легень, потрібної для індукування 8 % пневмонічних уражень легень у мінімум 80 % свиней. Усіх свиней антигенно стимулювали штамом LI34 Mycoplasma hyopneumoniae 11 інтратрахельно, як описано заздалегідь. Розбавлення антигенного стимулювання охоплювали 1:30, 1:100 та 1:500. Свиней забивали. Пентобарбітал було застосовувано для індукування глибокої анестезії перед знекровленням. Легені видаляли та ураження легень зображували на стандартних діаграмах легень. Сироватку збирали з усіх свиней та аналізували ELISA на антитіла на М. hyopneumoniae. Усі свині були низькопозитивними або серонегативними стосовно М. hyopneumoniae, що свідчить про відсутність попереднього піддавання дії М. hyopneumoniae перед прибуттям. Трахеальні мазки збирали асептичнно з усіх свиней. Pasteurella multocida та Haemophilus parasuis були виділеними з 4 та 3 свиней відповідно. М. hyopneumoniae було виділено з усіх антигенно стимульованих свиней. Абриси легень оцінювали системою аналізу відображень Zelss для визначення проценту пневмонічного ураження легень. Антигенне стимулювання свиней було успішним та розбавлення 1:100 є оптимальним розбавлення для застосування. Середній процент індукованої пневмонії був 10,17 +/- 6,6, що є вищим, ніж нормальний, однак це можна віднести до присутності Pasteurella multocida та/або parasuis у свиней. На додаток, 100 % свиней, прищеплених інокулятом антигенного стимулювання мали значні ураження легень. Загалом, ці результати є фактично типовими стосовно спостережених у нашому дослідженні М. hyopneumoniae, у тому, що якщо є інші патогени, є збільшення пневмонії. Це може бути внаслідок взаємодії між патогенами та імунною системою. Ми отримали 1600 мл інокуляту легень М. hyopneumoniae для застосування в експериментах антигенного стимулювання. Інокулят даватиме принаймні 8 % або вище пневмонічних уражень легень у мінімум з 80 % прищеплених свиней, при застосуванні при 1:100 розбавленні інтратрахельно. Вакцину титрували перед добою вакцинації та бактерицидні аналізи проводили для визначення прийнятної ад'ювантної системи для застосування (дивись Приклад 1). З цих даних ад'ювантну систему з 10 % СП-олії вибирали для наступного дослідження. Середня живучість вихідної культури була 3,64×109 КТО/Флакон. 13 UA 98812 C2 5 10 15 На добу першого застосування, композиції вакцин отримували таким чином: Вакцина А кожні з трьох склянок ліофілізованої культури авірулентної М. hyopneumoniae регідратували 10 мл розріджувачу з 10 % СП-олії. Три склянки композиції вакцини для кожного типу розріджувачу об'єднували та змішували протягом 20 хвилин на планшеті з перемішуванням. Плацебо було нормальним фізіологічним розчином, що аліквотували у стерильний флакон для застосування. Композиції залишали на льоді протягом курсу вакцинації протягом 2 годин. На добу другого застосування, композиції вакцин отримували таким чином: Вакцина А кожні з трьох склянок ліофілізованої культури авірулентної М. hyopneumoniae регідратували 10 мл розріджувачу з 10 % СП-олії. Три склянки регідратованої культури для кожного типу розріджувачу об'єднували та змішували протягом 20 хвилин на планшеті з перемішуванням. Плацебо було нормальним фізіологічним розчином, що аліквотували у стерильний флакон для застосування. Композиції залишали на льоді протягом курсу вакцинації протягом 2 годин. Концентрацію життєздатної М. hyopneumoniae у кожній композиції визначали перед та після застосування. Живучість оцінювали визначенням колонієтвірних одиниць (КТО/мл). Склянки ліофілізованої вихідної культури регідратували 10 мл нормального фізіологічного розчину, змішували протягом 20 хвилин та застосовували як контроль для аналізу живучості. Оскільки живучість першого контролю була нижче, ніж живучість тест-вакцини, протягом другого застосування, дві склянки регідратували та об'єднували для контролю (дивись таблицю 3 стосовно живучості тест-вакцин та контролю живучості). 20 Таблиця 3 Вакцина Група 1: Ад'ювант 10 % СП-олії Контроль живучості 25 30 35 40 45 Перша Вакцинація КТО/мл Друга Вакцинація КТО/мл 2,79Е+08 2,27Е+08 1,29Е+08 2,69Е+08 Усіх свиней спостерігали щодоби стосовно температури та клінічних симптомів, що починалися за дві доби перед кожним застосуванням та продовжувалися протягом 7 діб після кожного застосування. Свиней спостерігали на клінічні симптоми, котрі охоплювали, але без обмеження, відхаркування, чхання, назальні виділення, депресію, втрату апетиту та задишку. 14 діб після другого застосування, свиней у групі 1 антигенно стимулювали транс-трахельно вірулентним штамом М. hyopneumoniae. На добу антигенного стимулювання, вірулентну М. hyopneumoniae, вихідну з замороженого (-70 °C) гомогенату легень (LI-34), розморожували швидко під нагрітою водою та розбавляли (1:100 розбавлення). Свиней заспокоювали сумішшю ксилазин-кетамін-телазол™, що складається 50 мг/мл ксилазину, 50 мг/мл кетаміну та 100 мг/мл телазолу. Кожній свині було надано 10 мл матеріалу антигенного стимулювання транс-трахельно. Для гарантії розміщення повітря відтягували голкою у шприц перед застосуванням матеріалу антигенного стимулювання. Усіх свиней спостерігали щодоби на клінічні симптоми після антигенного стимулювання. Свиней знекровлювали для сироватки на доби 0, 14, 28, та 56. Серологічні реакцією свиней на антигенне стимулювання М. hyopneumoniae визначали за допомогою ELISA. Чотири тижні після антигенного стимулювання, усіх свиней з групи 1-3 вбивали та легені видаляли. Тестгрупи підраховували на великі ураження легень. Атипові ураження М. hyopneumoniae фіксували формаліном для наступного гістопатологічного оцінювання. Зразки мазків від вражених легень збирали для бактеріального виділення. Середній показник ураження легень для свиней у групі 1 (5,9 %) був приблизно на 50 % менше, ніж у плацебо-групі (14,8 %). Коли статистичний аналіз було проведено для поросят, зменшена частина для групи 1 була 69,2 % зменшення суворості ураження легень, при порівнянні з контролями. Ці дані є зведеними у таблиці 4. Усі свині були серо-негативними на добу першого застосування, вказуючи, що свині були сприйнятливими до інфекції М. hyopneumoniae. За винятком одної (1) свині у групі СП-олії, свині не серо-перетворювалися після першої вакцинації. Усі свині, що отримували активовану СП-олією композицію вакцини виявляли відповідь на антитіло після другого уколу. Серологічна реакція демонструє, що виявляли імунну відповідь на М. hyopneumoniae. (Дивись таблицю 9. для результатів серології). 50 14 UA 98812 C2 Таблиця 4 Вакцина Вакцина А Контроль 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Опис зменшена частка Зменшення уражень порівняно з контролем зменшена частка Зменшення нижчого довірчого рівня 69,2 40,2 не виявлено не виявлено Авірулентна жива М.hyopneumoniae з 10 % СП-олії Плацебо Статистичний аналіз даних повинен відповідати критеріям для зменшеної частини (30 %) для зменшення ураження легень для вакцини, ефективної стосовно М. hyopneumoniae. Взагалі, ці дані демонструють, що живу авірулентну активовану М. hyopneumoniae можна сприятливо застосовувати для виклику захисної імунної відповіді, при застосуванні in vivo до тварин. Тоді як винахід описано у кожному з різних втілень, очікують, що певні його модифікації можна проводити без відходу від рамок винаходу, як представлено у попередньому описі та у нижченаведеній формулі винаходу. Заявлений винахід не обмежено у рамках певними втіленнями, описаними тут. Такі модифікації охоплено рамками формули винаходу. Також зрозуміло, що усі значення є приблизними, та запропоновані для опису. Усі патенти та патентні заявки уведені тут як посилання. Приклад 3: Попереднє дослідження імуногенності Mycoplasma hyopneumoniae Модифікована Жива Химера Mycoplasma hyopneumoniae Живий Авірулентний штам цирковірусу свиней Типу 1 - Типу 2 Комбінація вакцини у свиней 3-4 тижнів віку Цей приклад розкриває ефективність комбінації вакцин, що містить вакцину штаму активованої живої авірулентної Mycoplasma hyopneumoniae J (FCX3-line1) та живу Химеру цирковірусу свиней (PCV) Типу 1 - Типу 2 (cPCV1-2; дивись Патенти США №№ 7,279,166 та 7,276,353), при застосуванні внутрішньом'язово (ВМ) або інтраназально (ІН) у свиней 3-4 тижнів віку. Ця комбінація вакцин (PCV/MH) є придатною для застосування для вакцинації здорових свиней як допомога у запобіганні та/або для зменшення суворості хвороб, викликаних М. hyopneumoniae та цирковірусом свиней. Цільові тест-вакцини містять приблизно 4,0 Log10 FAID50/дозу cPCV1-2 модифікованого живого вірусу та 4×108 КТО/дозу штаму J M. hyopneumoniae (дивись King et al, Journal of Comparative Medicine and Vet. Science, 29: 85-89 (1965) та Патент США № 4,824,785 для способу FAID). Вакцина була активована вмістом 10 об% СП-олії. Плацебо-вакциною був стерильний нормальний фізіологічний розчин. Загалом 66 свиней 3-4 тижнів віку застосовували у цьому дослідженні. 16 свиней застосовували 2 мл живої вакцини PCV/MH внутрішньом'язово одноразово та були антигенно стимульованими (Група 1); 15 свиней застосовували 2 мл живої вакцини PCV/MH внутрішньом'язово двічі (два тижні нарізно) та були антигенно стимульованими (Група 2); 15 свиней застосовували 2 мл (1 мл/ніздрю) живої вакцини PCV/MH інтраназально двічі (два тижні нарізно) та були антигенно стимульованими (Група 3); 15 свиней не застосовували живої вакцини PCV/MH та були антигенно стимульованими (Група 4); та 5 свиней були контролями (Група 5). Вакциною, застосовуваною у дослідженні, розкритому тут, була комбінація МН люфілізованого живого антигену (lot#1744-56) та розріджувачу, що містив живу вакцину PCV (LotC108-56). На добу вакцинації ліофілізований шар живої МН на фільтрі регідратували розріджувачем, що містив живий вірус PCV (4,0Log10FAID50/мл активованої 10 % СП-олії). Кінцева вакцина була визначена як Lot# 2315-30. Живучість для фракції МН визначали перед та після вакцинації, 3,18×108 КТО/мл (перед) та 1,65×108 КТО/мл (після), відповідно. PCV-титр для вакцини до та після вакцинації був 4,09 Log10 FAID50 та 3,7Log10 FAID50, відповідно. Вакцину для другої вакцинації отримували як вище та визначали як Lot# 2315-32. Живучість для МНфракції була 1,24×108 КТО/мл та 1,5×108 КТО/мл до та після вакцинації відповідно. Живучість для фракції МН була 4,36 Log10 FAID50 та 3,83 Log10 FAID50, відповідно. Свиней спостерігали протягом 7 діб після вакцинації на будь-яку побічну реакцію на вакцину. Три свині загинули протягом спостереження після вакцинації внаслідок не-МН або пов'язаних з PCV причин. Зведення клінічних спостережень з періоду після вакцинації є у таблиці 5. 15 UA 98812 C2 Таблиця 5 Група Число свиней Лікування Шлях Дозування 1 16 Вакцинація ВМ 1 доза 2 15 Вакцинація ВМ 2 дози 3 15 Вакцинація ІН 2 дози 4 15 Фізіологічний розчин ВМ 2дозs 5 5 Без вакцинації НЗ НЗ Спостереження після вакцинації Одна свиня мала підвищену температуру 40,62-41,23 °C (105,1106,2 °F) протягом 7 наступних діб, що починалися на 15 добу після першої вакцинації. Ще одна свиня мала підвищену температуру, втрату апетиту та депресію протягом 4 наступних діб, що починалися на 18 добу після першої вакцинації. Одна свиня загинула за добу перед другою вакцинацією внаслідок можливої інфекції HPS або S. suis. Клінічні ознаки депресії помічали перед вакцинацією. Одна свиня мала підвищену температуру 40,6-41,5 °C (105,0106,7 °F) 3 наступні доби, що починалися на 5 добу після першої вакцинації. Дві доби перед другою вакцинацією одна свиня загинула внаслідок кишкового прориву. Дві свині мали опухлі суглоби та відхаркування протягом 8 послідовних діб перед першою вакцинацією. Дві інші свині за одну добу перед другою вакцинацією мали опухлі жижки протягом 7 послідовних діб, а у одної це призводило до абсцесу, інші вилікувалися. Одна свиня мала опухлі жижки, помічені перед першою вакцинацією. Ще одна свиня також мала опухлі жижки протягом кількох діб дослідження. Одна свиня мала дві доби підвищеної температури. протягом двох послідовних діб 40,62 °C та 41,39 °C (105,1 °F та 106,5 °F), що починалися 6 діб після другої вакцинації. Свині, яких тримали під час вакцинації з групою 4. Побічних реакцій не помічено. НЗ: не застосовне ІН: інтраназально ВМ: внутрішньом'язово 5 10 Усіх свиней у групах 1-4 антигенно стимулювали вірулентним штамом М. hyopneumoniae (гомогенат легень свині, що містить вірулентний МН (LI-34)). Свиней з групи 1 антигенно стимулювали чотири тижні після першої вакцинації. Свиней у групах 2-4 антигенно стимулювали два тижні після другої вакцинації. На чотири тижні після антигенного стимулювання, усіх свиней у групах 1-5 вбивали та оцінювали ураження легень. Вакцину титрували перед добою вакцинації. Ліофілізовану культуру авірулентної М. hyopneumoniae регідратували на добу вакцинації. Концентрація організмів Mycoplasma hyopneumoniae у вакцині була приблизно 2×108 КТО/мл. Зразок вакцини отримували та аналіз живучості виконували перед та після вакцинації для підтвердження реальної КТО/мл. Вакцину тримали на льоді протягом курсу вакцинації. 16 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 Усіх свиней спостерігали щодоби стосовно температури та клінічних ознак, що починається два доби перед кожною вакцинацією, продовжуючи протягом 7 діб після кожної вакцинації Свиней спостерігали стосовно клінічних симптомів, котрі охоплювали, але без обмеження, відхаркування, чхання, назальні виділення, депресію, втрату апетиту та задишку. 14 діб після другої вакцинації, свиней у групах 1-4 антигенно стимулювали транс-трахельно вірулентним штамом М. hyopneumoniae. На добу антигенного стимулювання, вірулентний М. hyopneumoniae вихідний, заморожений (-70 °C) гомогенат легень (LI-34) розморожували швидко під нагрітою водою та розбавляли (1:100 розбавлення), застосовуючи стерильне середовище для вирощування М. hyopneumoniae. Свиней заспокоювали сумішшю ксилазин-кетамін-телазолТМ, що містить 50 мг/мл ксилазину, 50 мг/мл кетаміну та 100 мг/мл телазолу. Кожній свині було надано 10 мл матеріалу антигенного стимулювання транстрахельно. Для гарантії розміщення повітря відтягували голкою у шприц перед застосуванням матеріалу антигенного стимулювання. Усіх свиней спостерігали стосовно клінічних ознак після антигенного стимулювання. Спостереження проводили щодоби для будь-якої анормальної клінічної ознаки. Свиней знекровлювали для сироватки (не більше, ніж 13 мл суцільної крові) на добу 0, 14, 28, та 56 дослідження. Сироватку збирали, але не оцінювали. ELISA можна проводити для оцінювання серологічної реакції свиней, застосовуючи сироватку, збирану протягом дослідження, у майбутньому. Чотири тижні після антигенного стимулювання, усіх свиней з групи 1-5 вбивали та легені видаляли. Атипові ураження М. hyopneumoniae фіксували формаліном та зразки перевіряли гістопатологією. Зразки мазків від вражених легень збирали для бактеріального виділення. Свиней, що загинули після антигенного стимулювання вбивали та зразки збирали як описано вище. Ефективність вакцини визначали як комбінований середній показник ураження легень вакцинованих, що був на 50 % менше, ніж комбінований середній показник ураження легень контролів. На добу розтину трупа усіх свиней вбивали, ураження легень підраховували та збирали зразки мазків для бактеріального виділення. Бактерії, виділені з мазків, складалися з нижченаведеного: Staphylococcus heamolyticus, Streptococcus suis (P322), Staphylococcus epidermis, A. pyogenes, aerococus species, S. uberis, Bordetella bronchiseptica (P344) та Microbacterium. Статистичний аналіз для показників ураження легень є у таблиці 6 Таблиця 6 Група Вакциновано одиничною дозою ВМ Вакциновано подвійною дозою ВМ Вакциновано подвійною дозою ІН Контроль Нижчий Доведена Коефіцієнт довірчий ЗЧ захисту рівень поросят ЗЧ Доведений процент НДР Стандартне Середній показника показник відхилення процент ураження ураження ураження уражень легень легень легень поросят 1/15 52,9 % 19,6 % 6,30 % 3,86 % 4,41 0,37 3/15 63,8 % 33,8 % 5,03 % 2,39 % 4,59 0,31 0/14 -8,6 % -51,8 % 12,86 % 8,59 % 7,38 0,65 0/15 НЗ НЗ 11,46 % 8,41 % 5,5 0,62 НДР = нижчий довірчий рівень ЗЧ = зменшена частка 35 Статистичний аналіз даних відповідав критеріям для зменшеної частини (30 %) для зменшення ураження легень. Цей приклад демонструє (а) ефективність вакцини MH/PCV для МН двома дозами 2 мл застосовуваного ВМ, при 3,18×108 КТО/мл та (b) безпечність вакцини MH/PCV внаслідок втрат клінічних ознак, пов'язаних з МН або PCV після вакцинації. 17 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 30 35 Приклад 4: Дослідження імуногенності Mycoplasma hyopneumoniae Комбінація Вакцини з Модифікованої Живої Химери Mycoplasma hyopneumoniae та Живого Авірулентного штаму цирковірусу свиней Типу 1 - Типу 2 у свиней віком 3-4 тижні. Цей приклад розкриває дослідження імуногенності, котре підтримує результати від дослідження, представленого у прикладі 4, та підтверджує ефективність химерної модифікованої живої комбінованої вакцин живого авірулентного штаму цирковірусу свиней Типу 1 - Типу 2 М. hyopneumoniae (cPCV1-2) (MH/PCV) при застосуванні внутрішньом'язово. Вакцину MH/PCV розкриту тут, можна відповідно застосовувати для вакцинації здорових свиней як допомогу у запобіганні та/або мінімізуванні суворості хвороб, викликаних М. hyopneumoniae та цирковірусом свиней. Свині у цьому дослідженні були серо-негативними до М. hyopneumoniae, як визначено з допомогою ELISA. Загалом 79 свиней, віком 3-4 тижні рандомізували на чотири групи. В Групі 1 24 свині вакцинували одиничною дозою комбінації живої вакцини PCV/MH. В Групі 2 24 свині вакцинували комбінацією вакцини двічі через два тижні. В Групі 3 24 свині вакцинували нормальним фізіологічним розчином двічі через два тижні для контролю антигенного стимулювання. Усі вакцини застосовували внутрішньом'язово. Чотири свині в Групі 4 не було вакциновано чи антигенно стимульовано, вони слугували контролем. Вакциною, застосовуваною у дослідженні, була комбінація МН ліофілізованого живого антигену (Lot1744-66) та розріджувачу, що містив живу вакцину PCV (cPCV1-2 LotC108-56). На добу вакцинації шар на фільтрі ліофілізованої живої МН регідратували розріджувачем, що містить живий вірус PCV (3,5Log10FAID50/мл, активований 10 % СП-олією). Кінцевою вакциною була Lot2315-40. Живучість для МН визначали перед та після вакцинації, 2,09×108 КТО/мл та 1,56×108 КТО/мл відповідно. Плацебо-вакциною був стерильний нормальний фізіологічний розчин. Вакцину для другої вакцинації отримували як вищенаведено та надано Lot# 2315-42. Живучість для МН була 1,05×108 КТО/мл та 6,72×107 КТО/мл до та після вакцинації відповідно. Живучість для розріджувачу PCV була 3,44 Log10 FAID50. Вакцину титрували перед добою вакцинації. Ліофілізовану культуру авірулентної М. hyopneumoniae регідратували на добу вакцинації. Зразок вакцини отримували та аналіз живучості виконували перед та після вакцинації для визначення КТО/мл. Вакцину залишали на льоді протягом вакцинації. Усіх свиней спостерігали щодоби стосовно температури та клінічних ознак, що починалися за дві доби перед кожною вакцинацією, продовжуючи протягом 7 діб після кожної вакцинації. Свиней спостерігали стосовно клінічних симптомів, що охоплювали, але без обмеження, відхаркування, чхання, назальні виділення, депресію, втрату апетиту та задишку. Свиней спостерігали протягом 7 діб після вакцинації стосовно будь-якої побічної реакції на вакцину. Три свині загинули протягом спостереження після вакцинації внаслідок не пов'язаних МН або з PCV причин. Зведення клінічних спостережень з періоду після вакцинації є у таблиці 7. 40 Таблиця 7 Група Число свиней Лікування Дозування 1 24 Вакцинація 1 доза 2 24 Вакцинація 2 дози 3 24 4 4 Вакцинація фізіологічним розчином Без вакцинації Спостереження після вакцинації Не помічали побічних реакцій внаслідок вакцинації Одна свиня загинула у цій групі внаслідок кишкового прориву. На 5 добу після першої вакцинації одна свиня мала температуру 40,84 °C (105,5 °F) та важке дихання протягом доби. НЗ На 6 добу після першої вакцинації одна свиня мала важке дихання протягом доби. НЗ Свині, яких тримали під час вакцинації з групою 3. Побічних реакцій не помічено. НЗ: Не застосовне 18 UA 98812 C2 5 10 15 20 25 Усіх свиней у групах 1-3 антигенно стимулювали вірулентним штамом М. hyopneumoniae приблизно у 7 тижнів віку. Свиней з групи 1 антигенно стимулювали чотири тижні після першої вакцинації. Свиней у групах 2 та 3 антигенно стимулювали два тижні після другої вакцинації. Вірулентний М. hyopneumoniae вихідний, заморожений (-70 °C) гомогенат легень (LI-34) розморожували швидко під нагрітою водою та розбавляли (1:100 розбавлення), застосовуючи стерильне середовище для вирощування М. hyopneumoniae. Свиней заспокоювали сумішшю ксилазин-кетамін-телазолТМ, що містить 50 мг/мл ксилазину, 50 мг/мл кетаміну та 100 мг/мл телазолу. Кожній свині було надано 10 мл матеріалу антигенного стимулювання транстрахельно. Свиней знекровлювали для сироватки на добу 0, 14, 28, та 56 дослідження. Зразки сироватки від цього дослідження можна тестувати для оцінювання серологічної реакції тварин на М. hyopneumoniae та PCV2, застосовуючи добре відомі способи ELISA. Зразки сироватки, що збирали від нуль-доби після вакцинації (0DPV) та нуль-доби після антигенного стимулювання (0DPC), можна тестувати для антитіла на грип свиней М. hyopneumoniae, (H1N1), та репродуктивний та респіраторний синдром свиней (PRRS), застосовуючи наявні у продажу тесткомплекти ELISA. Чотири тижні (28 DPC) після антигенного стимулювання, усіх свиней з групи 1-4 вбивали та легені видаляли. Показники ураження легень реєстрували та типові ураження М. hyopneumoniae фіксували формаліном. Зразки перевіряли гістопатологією. Зразки мазків від одної враженої М. hyopneumoniae частки збирали для бактеріального виділення для визначення вторинних інфекцій. На додаток, збирали бронхіальну альвеолярну промивальну рідину. Легені промивали буферованим фосфатом фізіологічним розчином та утворену рідину аліквотували для тестування за допомогою PCR. Для оцінювання зменшення суворості ураження легень, оцінювачем була статистика за зменшеною часткою (34). Зменшену частину розраховували як: ЗЧ де: 2W1 nc 1 nc nc n v nv W1 = статистичний показник рангових сум за критерієм Вілкоксона n c = кількість одиниць у контрольній групі 30 n v = кількість одиниць у вакцинованій групі Розраховували 95 % довірчий інтервал для зменшеної частини. Для зменшення суворості ураження легень: HO : Mv Mc HA : Mv Cc 35 де: Mv = Медіана ураження легень у вакцинованій групі Mc = Медіана ураження легень у контрольній групі 40 45 50 55 Розподіл частот безперервного підсумку змінних оцінювали, застосовуючи метод PROC UNIVARIATE, що виконує параметричний та непараметричний аналіз зразку від одиничної популяції. (SAS Institute Inc., Саrу NC). Логарифмічні перетворення титрів антитіл застосовували для задоволення звичайного припущення, потрібного для параметричних тестів. Вихідні обстеження для цінювання порівнянності груп поросят та стійла здійснено з допомогою критерію хі-квадрат. Суворість ураження легень порівнювали між кожною вакцинованою групою та контрольною групою з допомогою критерію Вілкінсона (метод PROC NPAR1WAY) із показником ураження легень як залежною змінною, а лікуванням як незалежною змінною. PROC NPAR1WAY, що виконує непараметричні тести для розташування та різниці шкал за одношляховою класифікацією; PROC NPAR1WAY також стосується стандартного аналізу варіантів та статистики на основі емпіричного розподілу функції. (SAS Institute Inc., Cary NC). Статистичний аналіз слід виконувати, застосовуючи систему SAS. У випадках, де перетворення не поліпшувало розподілу залишків для будь-яких перетворених змінних, як визначено за допомогою W-тесту для звичайного стану, непараметричні тести застосовували, якщо потрібно. Рівень значності був р