Жива послаблена ротавірусна вакцина для перорального застосування
Формула / Реферат
1. Рідка ротавірусна імуногенна композиція, придатна для перорального призначення малюкам людини, що містить ротавірусний антиген, цукор та карбоксилат, де вказана композиція має рН приблизно 5,0-8,0 та містить менше 1 мМ фосфату, де вказаний карбоксилат є похідним від дикарбонової кислоти з рКа>4.
2. Рідка композиція за п. 1, де вказана композиція містить менше 0,1 мМ фосфату.
3. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1, 2, де вказана композиція позбавлена фосфату.
4. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-3, де рН вказаної композиції приблизно 5,5-7,5.
5. Рідка композиція за п. 4, де рН вказаної композиції приблизно 6,0-7,0.
6. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-5, де вказаний карбоксилат вибраний з групи, яку складають адипат, малат, сукцинат, малонат, глутарат, малеат, фумарат, тартрат та будь-яка комбінація з двох або більше зазначених карбоксилатів.
7. Рідка композиція за п. 6, де вказаним карбоксилатом є адипат.
8. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-7, де вказаний карбоксилат присутній у концентрації приблизно 50 мМ - 2 М.
9. Рідка композиція за п. 8, де вказаний карбоксилат присутній у концентрації приблизно 100 мМ - 1 М.
10. Рідка композиція за п. 9, де вказаний карбоксилат присутній у концентрації приблизно 400 мМ - 700 мМ.
11. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-10, де вказаний цукор вибрано з групи: гліцерин, еритроза, еритріол, ксилітол, арабітол, рибоза, ксилоза, арабіноза, глюкоза, тагалоза, маноза, галактоза, фруктоза, інозитол, сорбітол, манітол, галактитол, комбінація глюкози та фруктози, мальтоза, софороза, лактоза, целобіоза, мелібіоза, трегалоза, сахароза, палатиноза, мальтулоза, лактилоза, мальтитол, лактитол, рафіноза, мальтотріоза, мелезитоза, целотріоза, циритол, мальтотетраоза, стахіоза, целотетраоза, мальтопентаоза, целопентаоза, мальтогексаоза, целогексаоза, олігосахариди.
12. Рідка композиція за п. 11, де вказаним цукром є сахароза або декстроза.
13. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-12, де концентрація вказаного цукру приблизно 1-70 мас. %.
14. Рідка композиція за п. 13, де концентрація вказаного цукру приблизно 25-60 мас. %.
15. Рідка композиція за п. 14, де концентрація вказаного цукру 50 або 55 мас. %.
16. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-15, що містить крім того карбонову кислоту.
17. Рідка композиція за п. 16, де вказану карбонову кислоту вибрано з групи: адипінова кислота, яблучна кислота, оцтова кислота, бурштинова кислота, карбонатна кислота, пропіонова кислота, масляна кислота, малонова кислота, глутарова кислота, малеїнова кислота, гліколева кислота, молочна кислота, глюконова кислота, фумарова кислота, винна кислота.
18. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-17, що містить крім того іони кальцію.
19. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-18, де вказаним ротавірусним антигеном є живий ротавірус, як-то живий послаблений ротавірус.
20. Рідка композиція за 19, де вказаним живим послабленим ротавірусом є живий послаблений ротавірус людини.
21. Рідка композиція за п. 20, де вказаний живий послаблений ротавірус людини вибрано з групи: штам HRV 89-12С2, депонований під номером АТСС VR 2272, його потомство, реасортанти та імунологічно активні похідні; штам HRV P43, депонований під номером ЕКАСС 99081301, його потомство, реасортанти та імунологічно активні похідні.
22. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-21, де вказана композиція має антацидну здатність принаймні 8 хвилин, яку оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків.
23. Рідка композиція за п. 22, де вказана композиція має антацидну здатність принаймні 12 хвилин, яку оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків.
24. Рідка композиція за п. 22, де вказана композиція має антацидну здатність між 8 та 23 хвилинами, яку оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків.
25. Рідка композиція за п. 24; де вказана композиція має антацидну здатність між 12 та 23 хвилинами, яку оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків.
26. Рідка композиція за п. 23 або п. 25, де вказана композиція має антацидну здатність між 12 та 20 хвилинами, яку оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків.
27. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-26, де вказана композиція є стабільною за принаймні одної з наступних умов: протягом 7 діб при 37 °С, протягом одного року при 4 °С, протягом двох років при 4 °С.
28. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-27, котрою є вакцина.
29. Рідка композиція за будь-яким з пп. 1-28, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози між 0,2 та 2,0 мл.
30. Рідка композиція за п. 29, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози між 0,5 та 1,5 мл.
31. Рідка композиція за п. 30, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози приблизно 1,5 мл.
32. Спосіб попередження або лікування асоційованих з ротавірусом хвороб у людей застосуванням до людини, яка цього потребує, ефективної кількості рідкої композиції за будь-яким з пп. 1-31.
33. Спосіб за п. 32 для попередження ротавірусної інфекції у людей.
34. Спосіб за п. 32 для попередження ротавірусного гастроентериту у людей.
35. Спосіб за п. 34 для попередження ротавірусного суворого гастроентериту у людей.
36. Спосіб за п. 34 або 35, де вказаний гастроентерит або суворий гастроентерит викликано ротавірусним штамом відмінного серотипу відносно такого ротавірусного штаму, що міститься у вказаній рідкій композиції.
37. Спосіб за будь-яким з пп. 32-36, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози між 0,2 та 2,0 мл.
38. Спосіб за п. 37, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози між 0,5 та 1,5 мл.
39. Спосіб за п. 37 або п. 38, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози приблизно 1,5 мл.
40. Спосіб отримання рідкої ротавірусної композиції за будь-яким з пп. 1-31, що полягає у змішуванні ротавірусного антигену, цукру та карбоксилату з фармацевтично прийнятним розріджувачем.
Текст
1. Рідка ротавірусна імуногенна композиція, придатна для перорального призначення малюкам людини, що містить ротавірусний антиген, цукор та карбоксилат, де вказана композиція має рН приблизно 5,0-8,0 та містить менше 1мМ фосфату, де вказаний карбоксилат є похідним від дикарбонової кислоти з рКа>4. 2. Рідка композиція за п.1, де вказана композиція містить менше 0,1мМ фосфату. 3. Рідка композиція за будь-яким з пп.1, 2, де вказана композиція позбавлена фосфату. 4. Рідка композиція за будь-яким з пп.1-3, де рН вказаної композиції приблизно 5,5-7,5. 5. Рідка композиція за п.4, де рН вказаної композиції приблизно 6,0-7,0. 6. Рідка композиція за будь-яким з пп.1-5, де вказаний карбоксилат вибраний з групи, яку складають адипат, малат, сукцинат, малонат, глутарат, малеат, фумарат, тартрат та будь-яка комбінація з двох або більше зазначених карбоксилатів. 7. Рідка композиція за п.6, де вказаним карбоксилатом є адипат. 8. Рідка композиція за будь-яким з пп.1-7, де вказаний карбоксилат присутній у концентрації приблизно 50мМ - 2М. 9. Рідка композиція за п.8, де вказаний карбоксилат присутній у концентрації приблизно 100мМ 1М. 10. Рідка композиція за п.9, де вказаний карбоксилат присутній у концентрації приблизно 400мМ 700мМ. 2 (19) 1 3 91044 4 імунологічно активні похідні; штам HRV P43, депонований під номером ЕКАСС 99081301, його потомство, реасортанти та імунологічно активні похідні. 22. Рідка композиція за будь-яким з пп.1-21, де вказана композиція має антацидну здатність принаймні 8 хвилин, яку оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків. 23. Рідка композиція за п.22, де вказана композиція має антацидну здатність принаймні 12 хвилин, яку оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків. 24. Рідка композиція за п.22, де вказана композиція має антацидну здатність між 8 та 23 хвилинами, яку оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків. 25. Рідка композиція за п.24; де вказана композиція має антацидну здатність між 12 та 23 хвилинами, яку оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків. 26. Рідка композиція за п.23 або п.25, де вказана композиція має антацидну здатність між 12 та 20 хвилинами, яку оцінено дослідженням РоссеттаРайса малюків. 27. Рідка композиція за будь-яким з пп.1-26, де вказана композиція є стабільною за принаймні одної з наступних умов: протягом 7 діб при 37°С, протягом одного року при 4°С, протягом двох років при 4°С. 28. Рідка композиція за будь-яким з пп.1-27, котрою є вакцина. 29. Рідка композиція за будь-яким з пп.1-28, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози між 0,2 та 2,0мл. 30. Рідка композиція за п.29, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози між 0,5 та 1,5мл. 31. Рідка композиція за п.30, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози приблизно 1,5мл. 32. Спосіб попередження або лікування асоційованих з ротавірусом хвороб у людей застосуванням до людини, яка цього потребує, ефективної кількості рідкої композиції за будь-яким з пп.1-31. 33. Спосіб за п.32 для попередження ротавірусної інфекції у людей. 34. Спосіб за п.32 для попередження ротавірусного гастроентериту у людей. 35. Спосіб за п.34 для попередження ротавірусного суворого гастроентериту у людей. 36. Спосіб за п.34 або 35, де вказаний гастроентерит або суворий гастроентерит викликано ротавірусним штамом відмінного серотипу відносно такого ротавірусного штаму, що міститься у вказаній рідкій композиції. 37. Спосіб за будь-яким з пп.32-36, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози між 0,2 та 2,0мл. 38. Спосіб за п.37, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози між 0,5 та 1,5мл. 39. Спосіб за п.37 або п.38, де вказану композицію запропоновано в об'ємі дози приблизно 1,5мл. 40. Спосіб отримання рідкої ротавірусної композиції за будь-яким з пп.1-31, що полягає у змішуванні ротавірусного антигену, цукру та карбоксилату з фармацевтично прийнятним розріджувачем. Заявлений винахід стосується нових рідких ротавірусних композицій, що корисні як фармацевтичні композиції та вакцини, способу їх отримання та їх застосування у попередженні ротавірусу, зокрема асоційованих з ротавірусом хвороб людини. Гостра інфекційна діарея є головною причиною хвороби та смерті у багато зонах світу. У країнах, що розвиваються, вплив діарейної хвороби є дуже суттєвим. Для Азії, Африки та Латинської Америки оцінено, що є 3-4 більйона випадків діареї кожного року та з цих випадків приблизно 5-10 мільйонів призводять до смерті (Walsh, J.A. et al.: N. Engl. J. Med., 301:967-974(1979)). Ротавіруси визнані як одна з найбільш суттєвих причин суворої діареї у малюків та / молодших дітей (Estes, Μ. Κ. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition, edited by Fields et al., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Оцінено, що ротавірусна хвороба є відповідною за зверх 600000 смертей щорічно. Індукована ротавірусом хвороба найбільш звичайно впливає на дітей між 6 та 24 місяці віку, а пік поширення хвороби загалом відбувається протягом холодніших місяців у помірному кліматі, та протягом усього року у тропічних зонах. Ротавіруси звичайно переходять від особи до особи фекально-пероральним шляхом з інкубаційним періодом приблизно від 1 до 3 діб. На відміну від інфекції у 6-24-місячній віковій групі, новонароджені є загалом безсимптомними або мають тільки помірну хворобу. На відміну від суворої хвороби, з якою звичайно стикаються у молодших дітей, дорослі найбільше захищені в результаті попередньої ротавірусної інфекції таким чином найбільші інфекції у дорослих є помірними або безсимптомними (Offit, P.A. et al. Сотр. Then, 8(8):21-26, 1982). Ротавіруси сферичні, та їх назва є похідною від їх характерної зовнішньої та внутрішньої або двооболонкової капсидної структури. Звичайно, двооболонкова капсидна структура ротавірусу оточує внутрішню білкову оболонку або серцевину, що містить геном. Геном ротавірусу складається з 11 сегментів дволанцюгової РНК, котрі кодують принаймні 11 відмінних вірусних білків. Два з цих вірусних білків, позначені як VP4 (Р білок) та VP7 (G білок), є структурними білками, розташованими з зовнішнього боку двооболонкової капсидної структури. Внутрішній капсид ротавірусу представляє один білок, котрий є білком ротавірусу, позначеним VP6. Відносна важливість цих 5 трьох окремих білків ротавірусу у виявленні імунної реакції нижченаведеної ротавірусної інфекції не є поки ясною. Однак, VP6 білок визначає групу та підгрупу антигену, a VP4 та VP7 білки є детермінантами серотипової специфічності. Для довідки, принаймні 14 серотипів ротавірусу G та 11 серотипів ротавірусу Ρ ідентифіковано (Linhares A.C. & Bresse J.S., Pan. Am. J. Publ. Health 2000, 9, 305-330). Серед них 10 серотипів G та 6 серотипів Р ідентифіковані серед ротавірусів людини. \/Р7-білок є глікопротеїном 38000 MM (MM 34000, якщо неглікозилований), котрий є продуктом трансляції геномного сегменту 7, 8 або 9, залежно від штаму. Цей білок стимулює утворення головного нейтралізувального антитіла після ротавірусної інфекції. VP4 білок є неглікозилованим білком приблизно 88000 MM, котрий є продуктом трансляції геномного сегменту 4. Цей білок також стимулює нейтрапізувальне антитіло після ротавірусної інфекції. Оскільки білки VP4 та VP7 є вірусними білками, проти котрих нейтралізувальні антитіла спрямовані, вони, можна вважати, є основними кандидатами для розробки ротавірусних вакцин, даючи захист від ротавірусної хвороби. Природна рота вірусна інфекція протягом раннього дитинства викликає захисну імуногенність. Початкова розробка вакцин для попередження ротавірусних інфекцій почалася у 1970-х після відкриття вірусу. Спочатку, досліджували послаблені штами від тварин та людей, а пізніше спроби були сфокусовані на реасортантах людинитварини. Розробка нових ротавірусних композицій повинна погоджуватися з рядом потреб, охоплюючи всесвітнє поширення потенціалу та стабільності у широких межах умов довкілля та зберігання. Зокрема, стабільність композиції, особливо фармацевтичної або вакцинної композиції, загалом є кращою при нижчих температурах порівняно з кімнатною або вищою температурою. Тому один спосіб стабілізації застосовано для розробки вакцинних композицій, що можна зберігати замороженими (-20°С - -70°С) або альтернативно для розробки ліофілізованої вакцини, що можна витримувати протягом подовженого періоду часу приблизно при температурі холодильника (2°С-8°С). Однак, відомий факт, що спосіб ліофілізації має обмежену продуктивність та асоційований з високою вартістю продукції. Крім того ліофілізовані вакцини мають більше складностей для застосування, оскільки вони можуть потребувати більшої складності, звідси відносно коштовних пристроїв, як-то багатокамерні ампули для вакцини, з активним інгредієнтом в одній камері та рідкого розріджувачу у ще одній камері. Ліофілізовані вакцини також асоційовані з вищою вартістю транспортування та зберігання. Ці альтернативи можуть бути неадекватними для деяких країн у світі, що розвиваються, де пристрій для застосування повинен бути фінансово можливим, та де наявність інфраструктури для отримання та зберігання може бути неіснуючою або ненадійною. 91044 6 Оскільки ротавірус звичайно застосовують перорально малюкам людини, цей шлях приносить кілька викликів стосовно імуногенної ротавірусної композиції. Ротавірус швидко інактивується у кислотному середовищі, при дії кислотного буферу або кислого шлункового соку, наприклад, (С. Weiss та Н.F. Clark, 1985, J. Gen. Virol., 66, 2725- 2730; Т. Vesikari et al., 1984, The Lancet, page 700; R.H.Foster та AJ.Wagstaff, 1998, BioDrugs Feb: 9(2) 155-178). Тому бажано створювати ротавірусні композиції таким чином, щоб вони були стабільні при зберіганні та після застосування реципієнтом. Ротавірусні вакцини головним чином призначені для застосування до немовлят у віці 4 тижні. Невеликий об'єм дози вакцини, як-то нижче 2мл або навіть 1,5мл, буде сприятливим для цієї популяції. Тому, бажано створювати ротавірусні композиції у невеликому об'ємі дози. Стабілізувальні композиції для рідкої вірусної вакцини відомі. Наприклад, ЕР 0 065 905 загалом розкриває стабілізувальні композиції, придатні для серії вірусів, як-то композиції, викликаючі кір або грип, та зокрема розкриває стабілізувальний фосфатний буфер, що містить розчини, придатні для живого послабленого вірусу. Інші стабілізувальні композиції розкриті у WO 98/13065 та у Clark et al. (Pediatr Infect Dis J. 2003 Oct; 22(10):914-20). Такі композиції також потребують, серед інших складових, присутність фосфату як буферувального засобу для нейтралізації шлункової кислотності. Ці композиції однак не сумісні з вищенаведеними потребами для успішної розробки ротавірусної композиції, особливо вони є не сумісні зі зменшеним об'ємом дози вакцини, що є найпридатнішим для малюка людини. Зокрема, винахідником виявлено, що адаптування цієї композиції рівня техніки у тару малого об'єму, як-то 1,5мл або нижче, підтримуючи ефективну антацидну здатність, призводить до проблем від недоречної концентрації складових композиції, зокрема фосфатного буферу. Тому є потреба у розробці альтернативної ротавірусної композиції, зокрема альтернативної рідкої композиції, що може протистояти шлунковій кислотності, та є стабільною у холодильнику, незважаючи на відсутність фосфату. На додаток, є потреба у тому, щоб такі альтернативні композиції бути також успішно створені в об'ємі дози вакцини настільки невеликій, як можливо. Тому заявлений винахід не тільки стосується альтернативної стабільної імуногенної композиції без фосфату або тільки з мінімальними кількостями фосфату, але яка також дає змогу ротавірусу бути створеним у малому об'ємі дози, придатному для перорального застосування до малюків людини. Фіг.1 - Стандарті криві кислотно-основного титрування для чотирьох карбоксилатів Фіг.2А - Антацидна здатність різних композицій з вмістом адипату Фіг.2В - Експериментальна структура дослідження Россетта-Райса малюків Фіг.3 - Індекс рефракції композицій з вмістом адипату. 7 Фіг.3А показує, що на стадії адипатного буферу цільовим значенням є 58,5мас.% сахарози, що дає індекс рефракції 1,4578 у суміш. Фіг.3В показує, що на кінцевому етапі цільової композиції є 55мас.% сахарози, що призводить до індексу рефракції 1,4480. Фіг.4 - Огляд фази II схеми клінічного дослідження. Відповідно, згідно з першим аспектом заявленого винаходу, запропоновано рідку ротавірусну імуногенну композицію, котра є придатною для перорального застосування для малюка людини, що містить ротавірусний антиген, цукор та карбоксилат, де вказана композиція має рН між приблизно рН5,0 та приблизно рН8,0 та містить менше 5мМ фосфату. Відповідним чином концентрація фосфату у заявленій композиції не перевищує 1мМ. Згідно з особливим аспектом винаходу, придатною дозою вакцини звичайно буде 1,5мл або будь-який об'єм менше 2,5мл, як-то об'єм 2мл або менш, що є придатним для перорального застосування до немовлят або малюків. Зокрема об'єм дози буде таким, щоб була можливою технічна здійсненність композиції і не було шкідливого впливу на імуногенний потенціал композиції. Заявлена композиції надає переваг над композиціями рівня техніки з вмістом фосфату тим, що вони можуть протистояти шлунковій кислотності, залишаючи імуногенність та стабільність протягом довгого строку збереження, в той час будучи сумісними з композицією у об'ємі дози менше звичайного, як-то менше 2,0мл або навіть сумісними з об'ємом дози 1,5мл або менше. В особливому втіленні, рідка імуногенна композиція згідно з винаходом має антацидну здатність 6-23 хвилин як показано дослідженням Россетта-Райса малюків (адаптованим, як деталізовано у прикладі III,2,2 від лужного тесту Россетта-Райса). Відповідним чином антацидна здатність буде принаймні 8 хвилин, звичайно принаймні 12 хвилин, а придатні межі між 12 та 20 хвилин. Несподівано, заявлені композиції показали не тільки прийнятну, але вищу антацидну здатність навіть у меншому об'ємі дози, порівняно з композиціями рівня техніки з вмістом фосфату. Згідно з ще одним аспектом, запропоновано спосіб отримання вказаної рідкої ротавірусної імуногенної композиції, що полягає у змішуванні ротавірусного антигену, цукру та карбоксилату з фармацевтично прийнятним розріджувачем. Винахід також стосується згідно з ще одним аспектом застосування ротавірусного антигену у суміші з карбоксилатом та цукром для вироблення пероральної імуногенної композиції для попередження або лікування асоційованих з ротавірусом хвороб у людей, де вказана композиція не містить більше 5мМ фосфату та має рН між приблизно рН5,0 та приблизно рН8,0. Згідно з ще одним наступним аспектом винахід стосується способу лікування або попередження асоційованих з ротавірусом хвороб у людей застосуванням до людини, яка цього потребує, ефективної кількості вказаної рідкої імуногенної композиції. 91044 8 Інші аспекти та переваги заявленого винаходу описані далі у наступному детальному описі його кращих втілень. Винахідником розроблено нові рідкі ротавірусні композиції, що є імуногенними, стабільними при температурі холодильника (між 2 та 7°С, звичайно при 4°С), можуть протистояти кислоті шлунка, при пероральному застосуванні та сумісні з невеликим об'ємом дози. Рідка композиція означає композицію у текучій формі, як протилежно сухій формі, об'єм якої є фіксований при постійних конкретних умовах (наприклад, при кімнатній температурі або при температурі холодильника, при атмосферному тиску) та чию форму визначає тара. Предмет обговорення та інформація розкриті у публікаціях та патентах або патентних заявках, згаданих у цьому описі і уведених тут як посилання. Терміни 'містять' та 'містить' можуть бути як варіант, заміщені термінами 'складається з', та 'складаються з', відповідно, у кожному випадку. Заявлений винахід стосується рідкої ротавірусної імуногенної композиції, що містить ротавірусний антиген, цукор та карбоксилат, де вказана композиція має рНміж приблизно рН5,0 та приблизно рН8,0 та містить менше 5мМ фосфату. Композиції винаходу показують дуже гарний профіль стабільності, при порівнянні з композиціями з вмістом фосфату, у той же час підтримуючи профіль імуногенності. Ці композиції принаймні такі ж стабільні, як їх подоби з вмістом фосфату. Наступна перевага заявлених композицій у тому, що їх можна отримати у невеликому об'ємі дози, як-то нижче 2,0мл, звичайно 1,5мл, наприклад, порівняно з композиціями рівня техніки, у котрих присутній фосфат. В особливому втіленні концентрація фосфату в імуногенній композиції не перевищує 5мМ, відповідним чином 1мМ, зокрема не перевищує 0,5мМ. Фосфат - це сіль фосфатної кислоти (також відомої як ортофосфатна кислота (Н3РО4)), звичайно застосовують солі натрію або калію чи змішані солі натрію та калію (наприклад: Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, K3РО4, K2НРО4, KН2РО4). Відповідним чином, концентрація фосфату є 0,4мМ або нижче, звичайно 0,2мМ або нижче, ідеально 0,1мМ або нижче. У ще одному особливому втіленні композиція, яку заявлено тут, позбавлена від фосфату. Звичайно фосфат, при наявності, поступає з середовища клітинних культур або сольового буферу, застосовуваного як розріджувач, як-то DMEM (модифіковане Дульбекко середовище Ігла), основне ВМЕ-середовище Ігла або буферований фосфатом фізіологічний розчин. Концентрація фосфату, до котрої це стосується в описі, слід розраховувати за кількістю фосфату з вмістом хімікатів в отриманні заявленої композиції. Альтернативно, концентрацію фосфату, наявну у композиції, яку заявлено тут, можна вимірювати експериментально, застосовуючи звичайні аналітичні способи. Одним придатним способом є колориметричне дослідження, назване 'Nanocolor' від MachereyNagel (№ за каталогом 918 78). Цей спосіб є на основі фотометричного визначення жовтого ком 9 плекс, утвореного фосфатною кислотоюмолібдатом-ванадатом у кислому розчині. Обмеження кількісного аналізу є 2мкг/мл фосфату або 0,02мМ. Альтернативним способом є дозування фосфору (Р) атомною емісійною спектроскопією, як-то сполучена з плазмою атомна емісійна спектроскопія (ICP-AES) (Boss & Fredeen, in Concepts, Instrumentation, and Techniques in Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy, Perkin Elmer eds, second edition, 1997 - дивись Методологію на стор. 72 далі). Обмеження кількісного аналізу є 0,030мкг/мл фосфору відповідно концентрації фосфату 0,00032мМ. В одному втіленні рН композиції є між рН5,0 та рН8,0. У ще одному особливому втіленні рН заявленої композиції є між приблизно рН5,5-рН7,5. 'Приблизний рН' означає в межах 0,2 одиниці встановленої величини рН. Зокрема, рН композиції є між рН5,5 та рН7,5. Наприклад, рН композиції є між приблизно рН6,0-рН7,0, зокрема між рН6,0 та рН7,0, звичайно між рН6,2 та рН6,8 або між рН6,2 та рН6,6. Розглянуто рН приблизно 6,4, зокрема 6,4. Відомо, що на ротавірус негативно впливає кислотний рН, як-то рН нижче 4,0, та слід очікувати максимум стабільності при нейтральному або навіть слабко лужному рН, тобто межах рН7,08,0, котрі отримані, наприклад, у буферованій фосфатом композиції рівня техніки. Як показано в експериментальному розділі, композиції винаходу, незважаючи на відсутність фосфату, показали гарний профіль стабільності у заявлених межах рН, та крім того мають несподівано прийнятний профіль стабільності та імуногенності навіть у помірно кислотних умовах, тобто приблизно рН6,07,0, як-то при рН приблизно 6,4, наприклад. Рідка композиція, яку заявлено тут, містить карбоксилат. Карбоксилат (-СОO-) є дисоційованою формою карбонової кислоти, утвореною нейтралізацією кислотної функціональної групи (-СООН) лужною речовиною. Карбоновою кислотою є сполука, що містить карбоксил: - СООН; котрий є формально поєднанням карбонілу (-СО-) та гідроксилу (-ОН). Однак, взаємодія між ними таким чином модифікує їх хімічні властивості, що суцільну групу розглядають як нову функцію з характерними властивостями (Organic Chemistry, J. В. Hendrickson, D.J. Cram, та G. S. Hammond, McGraw-Hill Book Company, third edition 1970 page 131). Хоча Міжнародний союз чистої та прикладної хімії (IUPAC) рекомендує до застосування номенклатуру алканових кислот (для монокарбонових кислот) та алкандіонових кислот (для дикарбонових кислот), у цьому тексті застосовано більшість тривіальних назв карбонових кислот, оскільки ці продукти добре відомі спеціалісту. Наприклад, назва IUPAC оцтової кислоти є етанова кислота, а для адипінової кислоти гександіонова кислота. 91044 10 В особливому втіленні, застосовують карбоксилатну сіль неорганічної кислоти або, відповідним чином, органічної кислоти. В особливому втіленні, вказаний карбоксилат є похідним слабкої кислоти. Наприклад, вказаний карбоксилат є карбоксилатною сіллю, вибраною з групи: адипат, цитрат, малат, ацетат, сукцинат, пропіонат, бутират, малонат, глутарат, малєат, гліколят, лактат, глюкглюкоглюкглюконат, фумарат, тартрат, пімелат та будьяка їх комбінація. Придатними карбоксилатами є карбоксилати, похідні від карбонової кислоти з рKa більше 4 або карбоксилати, похідні від ді- або трикарбонової кислоти (ді- або три-карбоксилати) з середнім рKa більше 4 (Таблиця 9). Приклади попереднього класу охоплюють карбоксилати, похідні від пропінової, масляної та оцтової кислот. Приклади останнього класу охоплюють карбоксилати, похідні від лимонної, малеїнової, малонової, бурштинової, адипінової, глутарової та яблучної кислот. В особливому втіленні вказаний карбоксилат належить до переліку GRAS, тобто карбоксилатів, що загалом визнані у США як безпечні для застосування у їжі та ліках, та вибрані з переліку, що містить ацетат, пропіонат, малат, глутарат, адипат, лактат, фумарат та тартрат. Відповідним чином карбоксилат є сіллю адипінової кислоти, тобто мононатрієвою сіллю адипінової кислоти, монокалієвою сіллю адипінової кислоти, відповідним чином динатрій адипатом або дикалій адипатом, або кальцій адипатом. В особливому втіленні, концентрація карбоксилату між 50мМ до 2Μ є відповідно застосовуваною у рідкій ротавірусній композиції. Ясно, що концентрація карбоксилату у вищезгаданих межах може бути відповідно адаптованою звичайним експериментом згідно з природою карбоксилату, антацидною здатністю, що треба досягти, та об'єму дози вакцини. Наприклад, концентрації карбоксилату вище 1 Μ можна застосовувати, при потребі високого антацидрого потенціалу, як-то вище 8 хвилин, відповідно вище 10 хвилин, або вище 12 хвилин як оцінено тестом Россетта-Райса малюків для об'єму дози 1,5мл. Концентрації 1Μ або нижче є звичайно застосовуваними, як-то концентрації між 100мМ та 1М, звичайно концентрації між 200мМ та 800мМ. Придатні концентрації карбоксилату є між приблизно 300мМ та приблизно 800мМ, відповідно між 400мМ та 700мМ. Зокрема, коли карбоксилат є адипатом, придатною концентрацією є 400-500мМ. Однак, спеціалісту ясно, що концентрації 10-20 процентів встановленої величини можуть бути доречними, тобто, коли встановлено 100мМ, межі 80-90мМ-110-120мМ є також розкриті та охоплені. Ілюстративні концентрації надані у нижченаведеній таблиці 1 для різних карбоксилатів. 11 91044 12 Таблиця 1 Антацидна здатність карбоксилатів при певній концентрації Ці ілюстративні параметри надані для об'єму дози 1,5мл та відповідають згаданому номеру прикладу у таблиці 1 Карбоксилат (Мм) Адипат (144) Адипат (144) Адипат (144) Адипат (144) D,L-малат (132) D,L-малат (132) D,L-малат (132) Ацетат (59) Цитрат (189) Концентрація карборН у РРМ при t=0 ксилату (М) 0,372 6,38 0,465 6,24 0,5486,50 0,652 6,11 0,621 6,15 0,746 6,08 0,895 5,35 1,000 6,14 0,441 6,55 Антацидна здатність (хвилин)* 8 12 16 20 8 12 15 12 12 № зразку у прикладі II 91 92 93 94 72 64 77 89 129 *оцінено тестом Россетта-Райса малюків (РРМ), адаптованим згідно з прикладом lll,2,2 рН рідкої ротавірусної імуногенної композиції, яку заявлено тут, можна отримувати змішуванням карбонової кислоти та карбоксилату. Зокрема, карбонову кислоту можна застосовувати у суміші з відмінним карбоксилатом, наприклад, цитрат поєднують з адипіновою кислотою. Це може бути сприятливим при застосуванні комерційно доступних хімікатів, деякі з яких можуть не бути легко доступними, або для спрощення. Наприклад, одну (або більше) з вказаних карбонових кислот можна вибрати з групи: адипінова кислота, лимонна кислота, яблучна кислота, оцтова кислота, бурштинова кислота, карбонатна кислота, пропіонова кислота, масляна кислота, малонова кислота, глутарова кислота, малеїнова кислота, гліколева кислота, молочна кислота, глюконова кислота, фумарова кислота, винна кислота, пімелінова кислота, та змішувати у придатній пропорції з одним (або більше) карбоксилатами, вибраними з групи: адипат, цитрат, малат, ацетат, сукцинат, прогїюнат, бутират, малонат, глутарат, малєат, гліколят, лактат, глюкглюконат, фумарат, тартрат, пімелат. Рідка композиція, яку заявлено тут, містить цукор. Сахароза є особливо придатною. Декстроза є ще одним придатним цукром. Інші цукри або цукрові спирти можна також застосовувати замість сахарози або декстрози, наприклад: гліцерин, еритрозу, еритриол, ксилітол, арабітол, рибозу, ксилозу, арабінозу, глюкозу, тагалозу, манозу, галактозу, фруктозу, інозитол, сорбітол, манітол, галактитол, суміш глюкози та фруктози, мальтозу, софорозу, лактозу, целобіозу, мелібіозу, трегалозу, сахарозу, палатинозу, мальтулозу, лактилозу, мальтитол, лактитол, рафінозу, мальтотриозу, мелезитозу, целотриозу, циритол, мальтотетраозу, стахіозу, целотетраозу, мальтопентаозу, целопентаозу, мальтогексаозу, целогексаозу, олігосахариди. Звичайні концентрації цукру приблизно від 1мас.% до 70мас.%, наприклад, приблизно від 25мас.% до 60мас.%. Спеціалісту, однак, ясно, що природу та концентрацію цукру слід оптимізувати так, щоб гарантувати задовільну вірусну життєзда тність, підтримуючи у той же час в'язкість на рівні, що є сумісним з нижченаведеними етапами процесу створення композиції, як-то фільтрування. В особливому втіленні застосовують сахарозу. Звичайно, її концентрацію підтримують при мінімум 30мас.%. Вищі, тобто вище 30мас.%, концентрації сахарози можна крім того застосовувати для гарантування довгого терміну зберігання, оскільки очікують, що високий ізоосмотичний тиск таких композицій попереджуватиме бактеріальний ріст. Відповідно, нижче обмеження концентрації сахарози у рідких композиціях, які заявлено тут, є відповідно 30мас.% або вище, як-то 35мас.% або вище, відповідно 40мас.% або вище. Придатна концентрація сахарози приблизно від 40мас.% до 70мас.%. Наприклад, придатна концентрація сахарози буде між 45мас.% та 60мас.%, відповідно між 50мас.% та 55мас.%. Зокрема, застосовують сахарозу при концентрації приблизно 50мас.% або приблизно 55мас.%. Кінцеві концентрації сахарози 50мас.% або 55мас.% придатні. Спеціалісту ясно, що звичайну оптимізацію концентрації цукру можна проводити для гарантування вірусної стабільності, коли ще один цукор замінює сахарозу. Крім того встановлені величини для цукрів можуть бути трохи адаптовані для узгодження з параметрами композиції/вироблення, як-то об'єм дози. Тому, спеціалісту ясно, що концентрації у межах 10% встановленої величини можуть бути доречні, тобто, коли встановлено 50мас.%, межі 45мас.%-55мас.% також розкриті та охоплені. Рідка ротавірусна імуногенна композиція заявленого винаходу також містить ротавірусний антиген. Зокрема рідка композиція, яку заявлено тут, є імуногенною композицією, наприклад, вакцинною композицією. Ротавірусний антиген означає будьякий ротавірусний антиген, що є придатним для застосування у вакцинній композиції. Пероральні живі ротавірусні антигени розглянуті особливо. Наприклад, будь-як придатний ротавірусний антиген можна вибрати з групи: живий послаблений ротавірус від тварин або людей, зокрема живий 13 послаблений ротавірус людини; реасортантний ротавірус, зокрема, але без обмеження реасортантний ротавірус людини-людини, реасортантний ротавірус корови-людини або реасортантний ротавірус макаки резус-людини. Усі ротавірусні штами, штами людини або тварини, розглянуті у заявленому винаході. Ротавірусні штами людини придатні. Зокрема, ротавірусним антигеном є в одному втіленні послаблена популяція ротавірусу людини, що містить єдиний варіант або по суті єдиний варіант, вказаний варіант визначено нуклеотидною послідовністю, що кодує принаймні один з головних вірусних білків, позначений як VP4 та VP7, як розкрито у WO 01/12797, зокрема будь-який, охоплюючий один або більше з варіантів, позначених мутаціями, представленими у таблицях 2, 3,1 та 3,2 of WO 01/12797. В особливих втіленнях, ротавірусний антиген є будь-яким з таких живих послаблених ротавірусних штамів людини: штаму HRV 89-12С2, депонованого під номером АТСС VR 2272 (як описано у ЕР 0 557 427), його потомства, реасортантів та імунологічно активних похідних; штаму HRV P43, депонованого під номером ЕКАСС 99081301 (як описано у WO 01/12797), його потомства, реасортантів та імунологічно активних похідних. Ротавірусні популяції, що мають характеристики будь-якого з вищезгаданих депонованих штамів є також придатними вакцинними штамами. Похідні від вказаних депонованих штамів можна отримувати піддаванням вказаних штамів наступній обробці, як-то їх розмноженням з наступним пассажуванням, тонуванням або іншими способами, застосовуючи живий вірус, або модифікуванням вказаних депонованих штамів будь-яким шляхом, охоплюючи способи генної інженерії або реасортантні способи. Такі етапи та способи добре відомі у рівні техніки. Ротавірусними антигенами особливого інтересу є потомство будь-якого з вказаних депонованих штамів та їх імунологічно активних похідних. Імунологічно активні похідні - це матеріали, отримані з будь-якого з депонованих штамів, зокрема штаму HRV Р43, депонованого під номером ЕКАСС 99081301, особливо антигени вірусу, котрі здатні виявляти імунну реакцію, що є реактивною проти ротавірусу, при ін'єкції у хазяїна-тварину. Матеріали, похідні від вищезгаданих депонованих штамів, є також придатними ротавірусними антигенами та охоплюють білковий та генний матеріал. Особливий інтерес мають реасортантні ротавіруси, котрі містять принаймні один антиген або принаймні один сегмент будь-якого з вказаних депонованих штамів, наприклад, реасортантів, котрі містять вірулентний штам ротавірусу, де один або частина одного з 11 сегментів геному заміщено сегментом геному або його частиною з будь-якого з вказаних депонованих штамів. Особливо ротавірусний реасортант, де сегмент або частковий сегмент, що кодує NSP4, є сегментом або частковим сегментом будь-якого з вказаних депонованих штамів, може мати корисні властивості. Реасортантні ротавіруси та способи їх отримання добре відомі (Foster, R. Η. and Wagstaff, A. 91044 14 J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178, 1998). Ротавірусний антиген заявленої композиції можна отримувати звичайними способами. Звичайно ротавірусні антигенні препарати можна отримувати з культур тканин способами, застосовуваними для розмноження вірусу або експресії реасортантних ротавірусних антигенів. Придатні клітинні субстрати для вирощування вірусу охоплюють, наприклад, клітини нирок собаки, як-то MDCK або клітини від клону MDCK, клітини MDCKтипу, клітини нирок мавпи, як-то клітини AGMK, охоплюючи клітини Vera, котрі є особливо придатними, інші клітинні лінії, похідні від нирок мавпи, як-то BSC-1, LLC-MK2 та МА104, придатні лінії клітин свиней, або будь-яких клітин інших ссавців, придатних для продукції ротавірусу для вакцин. Придатні клітинні субстрати також охоплюють клітини людини, наприклад, клітини MRC-5. Придатні клітинні субстрати не обмежені лініями клітин; наприклад, первинні клітини охоплені також. Також у рамках винаходу є суміші будь-яких вищезгаданих депонованих штамів з іншими ротавірусними варіантами, наприклад, іншими клонованими варіантами або іншими реасортантними ротавірусами, або з іншими вірусами зокрема іншими послабленими вірусами. Зокрема композиція згідно з винаходом містить два ротавірусні антигени. Зокрема один антиген у композиції - штам HRV P43, депонований під номером ЕКАСС 99081301, а інший антиген є його реасортантим похідним або будь-яким його імунологічно активним похідним. Ротавірусний антиген для уведення у заявлені композиції може бути моновалентним ротавірусним штамом, тобто містити єдиний ротавірусний штам, або бути полівалентним, тобто містити принаймні два або більше ротавірусних штами. Спеціалісту ясно, що інші легко доступні послаблені штами від людини або тварин, що можна отримувати з депозитаріїв також придатні та їх можна застосовувати як замісники згаданих депонованих штамів. Згідно з заявленим винаходом придатна імуногенна композиція містить ротавірусний антиген, зокрема послаблений штам Р43 людини (депонований під номером ЕКАСС 99081301, дивись WO 01/12797) у концентрації 105-106 уоо на дозу (або еквівалент до 105,5-106,5 як виражено у ІДКК50 на дозу), 55мас.% сахарози, 0,465 Μ динатрій адипат (відповідно 132,74мг на дозу), та має рН приблизно 6,2-6,6, у 1,5мл об'єму дози. Для цієї композиції вміст DMEM є 6мас.%, а тому вміст фосфату менше 0,1мМ. Композиція згідно з заявленим винаходом може крім того охоплювати додатковий антацидний компонент, як-то неорганічний антацид, наприклад, алюміній гідроксид АІ(ОН)3 та магній гідроксид Мg(ОН)2. Алюміній гідроксид є особливо придатним. Інші комерційно доступні антациди, котрі придатні для застосування у винаході, охоплюють Mylanta™, котрий містить алюміній гідроксид та магній гідроксид. Вони нерозчинні у воді та надані у суспензії. Ще одним особливо придатним антацидом, що може бути додатково застосовуваним у 15 91044 16 вакцинній композиції заявленого винаходу є нерозчинна неорганічна сіль, кальцій карбонат (СаСО3). Звичайна концентрація СаСО3 є 80мг на дозу вакцини, наприклад. Іншими придатними водо-нерозчинними антацидами є магній карбонат, алюміній карбонат, алюміній фосфат, суміш алюміній гідроксиду та магній карбонату, алюміній-магній-гідрокарбонат, алюміній гідроксид-магній карбонат-сорбітолманітол, гідрокси-алюміній-натрій-карбонат, дигідрокси-алюміній-калій-карбонат, магапдрат, гідроталькіт, алмагцит, магній-алюміній-силікат-гідрат. Імуногенна композиція згідно з заявленим винаходом може додатково містити фармацевтично придатні сполуки та/або носії, зокрема відомі у рівні техніки як придатні для перорального застосування, особливо для малюків. Такі носії охоплюють без обмеження вуглеводи, поліспирти, амінокислоти, алюміній гідроксид, магній гідроксид, гідроксіапатит, тальк, титан оксид, ферум гідроксид, магній стеарат, карбоксиметилцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, мікрокристалічну целюлозу, желатин, рослинний пептон, ксантан, карагінан, гуміарабік, β-циклодекстрин. Композиція згідно з заявленим винаходом може додатково містити іони кальцію для стабілізації ротавірусу. В'язкі агенти можуть додатково бути уведеними у композиції. Можливі в'язкі агенти, що можна застосовувати, охоплюють псевдопластичні наповнювачі. Придатні в'язкі агенти охоплюють: пропіленгліколь, гуміарабік, камедь алдраганту, агар-агар, альгінат, пектин, натрій-карбоксиметилцелюлозу (Tyloses C®), метилцелюлозу (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose ΜΗ® та MB®), гідроксипропілметилцелюлозу (Klucels®), гідроксипропілцелюлозу (Methocels Ε® та Κ®, Vicotrans MPHC®), Carbopol®, ксантанову камедь, Veegum® (Магнійалюміній силікат), Avicel® (приблизно 89% мікрокристалічна целюлоза та 11% карбоксиметилцелюлоза-Na). Ксантанова камедь або крохмаль є особливо придатними в'язкими агентами для додаткового застосування у рідкій композиції згідно з винаходом. Може також бути сприятливим уведення у заявлені композиції носіїв на основі ліпідів, як-то віросоми або ліпосоми, емульсії масло-у-воді або частинки носія. Альтернативно або на додаток можуть бути уведені у композиції імуностимулятори, як-то відомі у рівні техніки для пероральних вакцин. Такі імуностимулятори охоплюють бактеріальні токсини, особливо токсин холери (ТХ) у формі холотоксину (суцільна молекула) або тільки В-ланцюга (В-ТХ) та інактивований теплом ентеротоксин Е. coli (LT). Мутовані LT (mLT), котрі менш ймовірно повертаються у їх активну форму, ніж природний LT, описані у WO 96/06627, WO 93/13202 та US 5,182,109. Композиція згідно з винаходом може крім того містити ад'ювант або імуностимулятор, як-то, але без обмеження детоксикований ліпід А з будьякого джерела та нетоксичні похідні ліпіду А, сапонінів та інших реагентів, здатних стимулювати реакцію типу ТН1. Давно відомо, що ентеробактеріальний ліпополісахарид (ЛПС) є потужним стимулятором імунної системи, хоча його застосування у ад'ювантах обмежено його токсичною дією. Нетоксичне похідне ЛПС, монофосфорилліпід А (МФЛ), утворюють видаленням серцевинної вуглеводневої групи та фосфату з відновлювано-кінцевого глюкозаміну, як описано Ribi et al (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419), та має таку структуру: Наступна детоксикована версія МФЛ походить від видалення ацильного ланцюга з 3-положення дисахаридної основи, та має назву 3-Одеацилований монофосфорилліпід А (3D-МФЛ). Його можна очищати та отримувати способами, представленими у GB 2122204В, це посилання також розкриває отримання дифосфорилліпіду А, та 3-О-деацилованих його варіантів. 17 Придатним 3D-MФЛ є у формі емульсії, що має невеликий розмір частинок менше 0,2мкм у діаметрі, а його спосіб вироблення розкрито у WO 94/21292. Водні композиції, що містять монофосфорилліпід А та сурфактант, описані у WO9843670A2. Бактеріальні ліпополісахаридні похідні ад'юванти для композицій заявленого винаходу можна очищати та переробляти з бактеріальних джерел, або альтернативно вони можуть бути синтетичними. Наприклад, очищений монофосфорилліпід А описано Ribi et al 1986 (вище), а 3-Одеацилований монофосфорил- або дифосфорилліпід А, похідний від Salmonella sp., описано у GB 2220211 та US 4912094. Інші очищені та синтетичні ліпополіса-хариди описані (Hilgers et al., 1986, Int.Arch.Allergy.lmmunol., 79(4):392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6; та ЕР 0 549 074 B1). Особливо придатним бактеріальним ліпополісахаридним ад'ювантом є 3D- МФЛ. Відповідно, похідні ЛПС, що можна застосовувати у заявленому винаході, є такими імуностимуляторами, що подібні за структурою до такого ЛПС або МФЛ або 3D-МФЛ. Згідно з ще одним аспектом заявленого винаходу похідні ЛПС можуть тоді бути ацилованим моносахаридом, котрий є субфрагментом вищенаведеної структури МФЛ. Синтетичні похідні ліпіду А відомі також, охоплюючи, але без обмеження: ОМ174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(R)-3додеканоїлокситетра-деканоїламіно]-4-офосфоно-β-D-глюкопіранозил]-2-[(R)-3гідрокситетрадеканоїламіно]-α-Dглюкопіранозилдигідрогенфосфат), (WO 95/14026) ОМ294 DP (3S,9R)-3-[(R)додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-оксо-5-аза9(R)-[(R)-3-гідрокситетрадеканоїламіно]декан-1,10діол,1,10-біс(дигідрофосфат) (WO 99/64301 та WO 00/0462) ОМ197 МР-Ас DP (3S-,9R)-3-[(R)додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-оксо-6-аза-[(R)-3-гідрокситетрадеканоїламіно]декан-1,10діол, 1-дигідрофосфат 10-(6-аміногексаноат) (WO 01/46127) Очищені сапоніни як пероральні ад'юванти описані у WO 98/56415. Сапоніни та монофосфорилліпід А можна застосовувати окремо або у комбінації (наприклад, WO 94/00153) та можуть бути створеними у системах ад'ювантів разом з іншими засобами. 3D-МФЛ є добре відомим ад'ювантом, виробленим Ribi Immunochem, Montana та його вироблення описано у GB 2122204. Ще одним кращим імуностимулятором для застосування у заявленому винаході є сапонін Quil А та його похідні. Сапоніни приведені у: LacailleDubois, Μ та Wagner Η. (1996. А review of biological та pharmacolpgical activity of saponines. Phytomedicine vol 2 pp 363-386). Сапоніни є стероїдними або тритерпеновими глікозидами, широко розповсюдженими у рослинах та морських тваринах. Сапоніни утворюють колоїдні розчини у воді, котрі утворюють піну при струшуванні та осаджують холестерин. Коли сапоніни є поблизу клітинних мембран, вони створюють структури типу пір у 91044 18 мембрані, у мембрані, котрі викликають розрив мембрани. Гемоліз еритроцитів є прикладом цього явища, котре є властивістю деяких, але не усіх сапонінів. Сапоніни відомі як ад'юванти у вакцинах для системного застосування. Ад'ювантна та гемолітична активність індивідуальних сапонінів добре досліджено у рівні техніки (Lacaille-Dubois та Wagner, вище). Наприклад, Quil А (похідні з кори південноамериканського дерева Quillaja Saponaria Molina), та їх фракції, описані у US 5,057,540 та "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, С. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; та ЕР 0 362 279 B1 Сипучі структури під назвою Імунні Стимулювальні Комплекси (ISCOMS), що містять фракції Quil А, є гемолітиками та є застосовуваними у виробленні вакцин (Моrеіn, В., ЕР 0 109 942 В1; WO 96/11711; WO 96/33739). Гемолітичні сапоніни QS21 та QS17 (очищені ВЕРХ фракції Quil А) описані як потужні системні ад'юванти, а спосіб їх продукції розкрито у патенті США №5,057,540 та ЕР 0 362 279 В1. QS-21 є природним похідним сапоніну з кори Quillaja saponaria Molina, котрий індукує CD8+ цитотоксичні Т-клітини (CTL), ТМклітини та панівну реакцію ІgG2а-антитіл та є придатним сапоніном у контексті заявленого винаходу. Інші сапоніни, котрі є застосовуваними у системних дослідженнях вакцинації, охоплюють ці похідні від інших видів рослин, як-то Gypsophila та Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992). Посилена система залучає комбінацію нетоксичного похідного ліпіду А та похідного сапоніну, особливо комбінацію QS21 та 30-МФЛ, яку розкрито у WO 94/00153, або менш реактогенну композицію, де QS21 гаситься холестерином, як розкрито у WO 96/33739. Сапоніни, що утворюють частину заявленого винаходу можуть бути окремо у формі міцел, або можуть бути у формі великих упорядкованих структур, як-то ISCOMs (ЕР 0 109 942 В1) або ліпосоми), при створенні з холестерином та ліпідом, або у формі емульсії масло-у-воді (WO 95/17210). Сапоніни можуть відповідно бути асоційовані з сіллю металу, як-то алюміній гідроксид або алюміній фосфат (WO 98/15287). Особливо потужну композицію ад'юванту, що містить QS21 та 3D-MФЛ в емульсії масло-у-воді, описано у WO 95/17210 та у WO 99/11241 та WO 99/12565, та є придатною композицією. Загальне обговорення носіїв та ад'ювантів для пероральної імунізації можна знайти у Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell та Newman, Plenum Press, New York, 1995. Вакцинна композиція згідно з винаходом може містити додаткові компоненти, охоплюючи, наприклад, ароматизатори (особливо для пероральних вакцин) та бактеріостатичні засоби. В особливому втіленні, рідка композиція згідно з винаходом має антацидну здатність між 6 та 23 хвилин, як оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків (адаптованим, як деталізовано у прикладі ІІІ,2,2 від лужного тесту Россетта-Райса). Згідно з заявленим винаходом 'антацидна здатність' означає період часу у хвилинах, протягом котрого рН 19 композиції при тестуванні залишається вище 4, як оцінено згідно з експериментальним способом, даним у прикладі ІІІ,2,2. Відповідно антацидна здатність буде між 12 та 20 хвилин. Антацидна здатність вище 23 хвилин, як-то 29-30 хвилин, наприклад, є також чудово прийнятною у перспективі розробки вакцин, але така висока продуктивність є надлишковою. Зокрема, антацидна здатність принаймні 8 хвилин, принаймні 10 хвилин, принаймні 12 хвилин є розглянутою особливо. Антацидна здатність принаймні 12 хвилин, принаймні 13 хвилин, принаймні 14 хвилин, принаймні 15 хвилин, принаймні 16 хвилин, є придатною. Відомо, що шлунок невеликих малюків, які не їли протягом трьох годин є дуже кислотним, та що на ротавірус негативно впливає такий кислотний рН. Іншими словами, працюючи з низьким об'ємом композиції, котра є бажаною, неможливо вимірювати антацидну здатність класичних композицій з вмістом фосфату, оскільки розчинності фосфатів легко перевищувалися та відбувалася кристалізація складових при створенні композиції та/або короткому терміні зберігання. За контрастом, заявлені композиції несподівано показали прийнятну, але вищу антацидну здатність навіть у меншому об'ємі дози, порівняно з композиціями рівня техніки з вмістом фосфату. У ще одному особливому втіленні вказана рідка імуногенна композиція є стабільною за принаймні одної з наступних умов: протягом 7 діб при 37°С, протягом одного року при 4°С, протягом 18 місяців при 4°С, протягом двох років при 4°С. Згідно з заявленим винаходом стабільність даної композиції оцінено виміром вірусного титру (тобто вірусної стабільності), способом, наведеним у прикладі lll,1, після зберігання композиції протягом позначеного періоду часу при даній температурі. Стабільність композиції може бути оціненою прискореним тестом стабільності, наприклад, після зберігання композиції протягом одного тижня при 37°С. Стабільності композиції можуть бути альтернативно оцінено протягом довшого періоду часу, як-то протягом кількох місяців, при температурі холодильника (між 2 та 7°С, звичайно при 4°С) або при кімнатній температурі (20-22°С). У цих умовах, стабільною є композиція, що має максимум втрати титру ротавірусу 1, як виражено log10 уоо/дозу у позначених умовах тестування. Особливо придатними є композиції, де максимум 0,5 log10, наприклад, 0,4 або менше, 0,3 або менше, 0,2 або менше або відповідно 0,1 log10 уоо на дозу вакцини, втрачається при прискореному тесті стабільності при 37°С протягом одного тижня. Альтернативно, рідка імуногенна композиція, яку заявлено тут, може бути заморожена та зберігатися замороженою при -20°С або нижче, або при -70°С протягом кількох років, та залишатися стабільною при 4°С протягом принаймні одного року при розтопленні. Звичайно заморожена композиція буде стабільною протягом принаймні 6 місяців, принаймні 12 місяців, принаймні 18 місяців, принаймні 2 років, або принаймні 3 років, та залишатися стабільною при 4°С протягом принаймні одного року, відповідно 18 місяців або 2 років при розтопленні. 91044 20 Композицією згідно з заявленим винаходом є імуногенна композиція, наприклад, вакцинна. Наприклад, заявлена імуногенна композиція здатна, звичайно після одної, допустимо двох доз, відокремлених одним або двома місяцями, для виявлення імунної реакції, наприклад, чудового вакцинного реагування та специфічної lgA-реакції у сироватці на ротавірус. 'Вакцинне реагування' позначено як процент осіб, що виявляють серологічну реакцію, наприклад, появу ІgА до ротавірусу у сироватці після імунізації при титрі 20U/мл (ELISA), та/або з зниженням ротавірусу (ELISA) у будьякому зразку екскрементів. Вакцинне реагування можна позначити як зниження вірусу вакциною у будь-якому зразку екскрементів, зібраних між першою дозою та аж до 1 до 2 місяців після другої дози. В особливому втіленні, вакцина згідно з винаходом здатна до зниження випадків будь-якого, а переважно суворого, ротавірусного гастроентериту порівняно з плацебо. Звичайно вакцина здатна надавати крос-захист проти циркулюючих штамів інших, ніж наявних у вакцині. Звичайно, коли вакцина містить штам типу G1, як-то послаблений вірус людини Р43, імунна реакція в індукованому до серотипу G1 та принаймні одного з не-GI серотипів, вибраних з групи: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 та G14. Відповідно вакцини, що містять штам G1, здатний надавати захист від штамів G1 та не-GI, як-то штами G2, G3 та/або G4, а зокрема від глобально виявленого серотипу G9. В особливому втіленні, вказаний гастроентерит або суворий гастроентерит викликано ротавірусним штамом відмінного від серотипу у заявленій композиції. Зокрема, якщо ротаві-русний штам, наявний у заявленій композиції є серотипом G1, як-то, але без обмеження штамом живого послабленого ротавірусу людини HRV P43 (ЕКАСС 99081301), попередження надається проти гастроентериту або суворого гастроентериту, викликаного ротавірусним штамом серотипу G1, а також ротавірусним штамом серотипу не-GI, наприклад, ротавірусним штамом, що має серотип, вибраний з групи: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 та G14. В окремому втіленні імуногенна композиція, заявлена тут, здатна до індукування імунної реакції проти, та/або забезпечувати захист проти гастроентериту або суворого гастроентериту, викликаного принаймні одним, допустимо усіма з таких серотипів не-G1: G2, G3, G4 та G9. У ще одному особливому втіленні, якщо ротавірусний штам, наявний у заявленій композиції, ε ротавірусом типу Р[8], як-то, але без обмеження, живий послаблений штам ротавірус людини HRV P43 (ЕКАСС 99081301), попередження надається проти гастроентериту або суворого гастроентериту, викликаного ротавірусним штамом типу Р[8] та типу не-Р[8], наприклад, ротавірусним штамом, що має серотип, вибраний з групи: Р1, Р2, Р3, Р4, Р5, Р6, Р7, Р9 та Р11 типів. Зокрема, заявлена тут імуногенна композиція здатна до індукування імунної реакції проти, та/або забезпечення захисту проти гастроентериту або суворого гастроентериту, викликаного принаймні одним, допустимо усіма з таких типів не-Р[8]: Р4, Р6. У ще одному втіленні 21 заявлена композиція здатна до індукування імунної реакції до, та/або забезпечення захисту проти гастроентериту або суворого гастроентериту, викликаного ротавірусним штамом відмінного G-типу та відмінного Р-типу до штаму, наявного у застосованій композиції. Зокрема, заявлена композиція містить ротавірусний штам G1P[8] та є також здатна до індукування імунної реакції до, та/або забезпечення захисту проти гастроентериту або суворого гастроентериту, викликаного ротавірусним штамом G2P[4]. Відповідно композицію згідно з винаходом застосовують перорально. Відповідно композицію постачають у одно-дозовому пристрої, як-то скляна або пластикова пляшечка або шприц, придатний для уведення невеликим малюкам. Вакцини винаходу можна створювати та застосовувати відомими способами, застосовуючи придатну кількість живого вірусу для забезпечення ефективного захисту проти рота-вірусної інфекції без значної шкідливої побічної дії у звичайних вакцинах. Відповідно заявлений винахід стосується способу отримання рідкої ротавірусної композиції або імуногенної композиції, як описано тут, що містить змішаний ротавірусний антиген, цукор та карбоксилат з фармацевтично прийнятним розріджувачем. Придатна кількість живого вірусу звичайно буде між 104 та 107 уоо на дозу. Звичайна доза вакцини може містити 105-106 уоо на дозу та може бути даною кількома дозами протягом період часу, наприклад, двома дозами з інтервалом два місяці. Титр ротавірусу можна також виражати у ІДКК50 та це можна оцінити у контексті цього винаходу, що ІДКК50 1060 є еквівалентом уоо 1055 на дозу. Користь можна, однак, отримувати більше, ніж 2 дозами, наприклад, 3 або 4 дозами, особливо у країнах, що розвиваються. Першу дозу можна відповідно давати малюкам при віку від 4 тижнів до 14 або 15 тижнів, відповідно 6-14 тижнів віку. Інтервал між дозами є принаймні 4 тижнів, але може бути більше або менше двох місяців, наприклад, другу дозу та будь-яку наступну дозу, якщо доречно, можна давати через один місяць або три місяці після попередньої дози, залежно від програми локальної імунізації. Оптимальну кількість живого вірусу для єдиної дози або для багатодозового режиму, та оптимальний розрахунок часу для дози, можна встановити стандартними дослідженнями, що залучають спостерігання титрів антитіл та інших реакцій у осіб. Звичайно об'єм дози вакцини згідно з винаходом звичайно буде 2,5мл або нижче, звичайно між 0,5мл та 2,5мл. Згідно з особливим аспектом винаходу, придатною дозою вакцини звичайно буде 1,5мл або відповідно будь-як об'єм менше 2,5мл, як-то об'єм 2мл або менше, що є придатним для перорального застосування до немовлят або малюків. Зокрема об'єм дози буде таким, щоб була можливою технічна здійсненність композиції і не було шкідливого впливу на імуногенний потенціал композиції. Заявлені композиції дає перевагу над композиціями рівня техніки, що містять фосфат, у тому, що вони можуть протистояти шлунковій кис 91044 22 лотності, залишаються імуногенними та стабільними протягом довгого строку збереження, в той час будучи сумісними з композицією в об'ємі дози менше звичайного, як-то менше 2,0мл або навіть, відповідним чином, 1,5мл або менше. Звичайно об'єм дози вакцини згідно з винаходом є між 0,5мл та 2,0мл, відповідно приблизно між 1,0мл та 1,5мл, як-то приблизно 1,3мл або приблизно 1,4мл або приблизно 1,5мл. Звичайний об'єм дози може також бути 2мл або нижче, як-то, наприклад, 1,1мл, 1,2мл, 1,3мл, 1,4мл або 1,5мл. Об'єми 1мл або об'єми менше 1мл, наприклад, від 200мкл до 800мкл, також розглянуті у рамках заявленого винаходу. Об'єм рідини, що можна застосовувати перорально, може також бути частково визначеним пристроєм для уведення вакцини. Імуногенну композицію винаходу можна також створювати з вмістом інших антигенів, зокрема антигенів від інших придатних живих вірусів для захисту проти інших хвороб, наприклад, поліовірусних. Вказані додаткові активні інгредієнти, придатні для перорального застосування, можна давати у суміші з ротавірусною композицією, або альтернативно можуть бути співзастосованими (тобто окремою дозою, але при тій же оказії) з ротавірусною композицією, заявленою тут. Заявлену композицію можна також давати разом з іншими не-пероральними вакцинами, наприклад, з парентеральними вакцинами, придатними для педіатричної популяції вакцин, як-то вакцини DTPw або DTPa (вакцини проти Bordeteila pertussis - коклюш, дифтерія, стовбняк), вакцини проти індукованого грипом В Hemophilus менінгіту, гепатиту В, або корі, свинки, краснухи (MMR), вакцини проти стрептококової пневмонії, для оптимізації числа візитів до доктора. У ще одному втіленні винахід також стосується способу лікування або попередження асоційованих з ротавірусом хвороб у людей, особливо у молодших дітей, як-то немовлята або малюки, застосуванням до вказаної людини, яка цього потребує, ефективної кількості рідкої композиції, зокрема імуногенної композиції або вакцини, яку заявлено тут. Зокрема заявлена композиції попереджуватиме від ротавірусних інфекцій. В особливому втіленні, заявлені тут композиції здатні забезпечувати захист проти ротавірусного гастроентериту, зокрема проти суворого гастроентериту. Суворий гастроентерит позначено як випадок, потребуючий госпіталізації та/або регідратаційної терапії (еквівалентно схемі В або С WHO) у медичних сприятливих умовах, або випадок з балом більше 11 на 20-бальній шкалі Vesikari (Ruuska T and Vesikari Т. Rotavirus disease in Finnish children: use of numerical scores for severity of diarrheal episodes. Scand J Infect Dis 1990, 22:259-67). У ще одному наступному втіленні, винахід стосується застосування ротавірусного антигену, карбоксилату та цукру у виробленні імуногенної композиції, наприклад, вакцин, для лікування або попередження асоційованих з ротавірусом хвороб у людей, де вказана імуногенна композиція має рН між рН5,0 та рН8,0 та містить менше 5мМ фосфату. Зокрема, попередження ротавірусних інфекцій, 23 та/або захист проти гастроентериту, а більше конкретно проти суворого гастроентериту розглянуто особливо. У ще одному особливому втіленні винахід також стосується застосування живого послабленого ротавірусу людини для вироблення імуногенної композиції, яку заявлено тут, для лікування або попередження асоційованих з ротавірусом хвороб, не викликаючи інтусусцепції. Зокрема, вказане лікування або попередження полягає у застосуванні двох пероральних доз або більше безпечної та ефективної кількості композиції живого послабленого ротавірусу людини для малюка у межах 414 або 15 тижнів віку на час дози 1. Звичайно малюк буде віком від 6 до 14 тижнів на час першої дози. У контексті заявленого винаходу малюк означає малюка віком від 4 до 14 або 15 тижнів після народження. У ще одному втіленні винахід також стосується рідкої імуногенної композиції, що містить ротавірусний антиген, цукор, фосфат та карбоксилат, де вказана композиція має рН приблизно 5,0-8,0, та де вказаний карбоксилат вибрано з групи: адипат, малат, ацетат, пропіонат, бутират, малонат, глутарат, гліколят, глюкглюконат, пімелат та будь-яка комбінація з двох або більше їх. В особливому втіленні вказаний карбоксилат є адипатом. Звичайно фосфат буде наявним у концентрації 10мМ 1М. Винахідником виявлено, що ці конкретні карбоксилати, котрі не асоційовані з розробкою пероральних вакцинних композицій, задовольнили усі бажані потреби стабільності, кислотостійкості, імуногенності та складу у невеликому об'ємі дози, що наведено у представленому описі для розробки придатної пероральної ротавірусної вакцини для малюків. Зокрема вказані карбоксилати не мають шкідливого вплив на титр ротавірусу у композиції. Ці карбоксилати можуть адекватно діяти як альтернативні стосовно звичайних карбоксилатів, як-то сукцинат, глутамат та цитрат, наприклад, у тих ротавірусних композиціях, що містять фосфат. Усі інші особливі втілення, які описано тут вище також застосовано для цього аспекту заявленого винаходу. Звичайно межі рН композиції, які позначено тут, представляють антацидну здатність та строк збереження стабільності. Винахід також стосується способу отримання вказаної композиції, застосування та способів попередження або лікування малюків, застосовуючи вказану композицію. Винахід далі описано наступними, необмежувальними прикладами: Приклад 1 - Композиція рідкої вакцини живого послабленого ротавірусу людини і) у відсутності доданого фосфату та карбоксилату, та іі) у присутності цитрату як карбоксилату у відсутності доданого фосфату 1,1. Отримання композицій 1,1,1. Композиція середовища DMEM (для отримання 1л DMEM): Вода для ін'єкції: 0,8л Розчиняють послідовно наступні сполуки: Натрій хлорид: 6,40г Калій хлорид: 0,40г Магній сульфат,7 Н2О: 0,20г 91044 24 Додають розчин ферум нітрату при 0,1г/л: 1,00мл NaН2РО4 Н2О: 0,1412г Натрій піруват: 0,11г Безводна глюкоза: 4,50г Розчин вітамінів (500 концентрований): 2,00мл Вода для ін'єкції: 1,50мл Хлоридна кислота (концентрована): 0,083мл L-цистин: 0,048г L-тирозин: 0,072г Вода для ін'єкції: 2,00мл Розчин амінокислот: 20,00мл L-Глутамін: 0,5846 Кальцій хлорид-2Н2О: 0,2649г Натрій гідрокарбонат: 3,70г Вода для ін'єкції до 1л DMEM представляє 5%, 6% або 8% композиції, деталізованої у прикладі II. Це відповідає: - кінцевій концентрації фосфату 0,059мМ, 0,071мМ та 0,094мМ, відповідно, та кінцевій концентрації пірувату 0,065мМ, 0,078мМ та 0,104мМ відповідно. Розчин вітамінів (500 концентрований): Вода для ін'єкції: 80,00л Фолієва кислот: 200,10г Кальцій пантеноат: 200,10г Холін хлорид: 200,10г Інозитол: 350,00г Нікотинамід: 200,00г Піридоксин хлоргідрат: 200,10г Тіамін хлоргідрат: 200,10г Рибофлавін: 20,002г Вода для ін'єкції до 100л. Розчин амінокислот: Вода для ін'єкції: 144,00л L-Аргінін: 755,70г Гліцин: 270,10г L-Пстидин: 378,00г L-ізолейцин: 943,40г L-Лейцин: 943,50г L-Лізин 2 HCI: 1,315,80г L-Метіонін: 270,00г L-Фенілаланін: 594,10г L-Треонін: 856,30г L-Триптофан: 144,00г L-Серин: 377,90г L-Валін: 842,00г Вода для ін'єкції: до 180л. Розчин ферум нітрату Вода для ін'єкції: 1,035,000мл ферум нітрат,9 Н2О: 0,115г Вода для ін'єкції: до 1,150л l,1,2. Отримання ротавірусних композицій у відсутності доданого фосфату та карбоксилату Композицію 60, представлену у таблиці 2, зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 166,6 дози 1,5мл (1,95г) кожна. Композиція №60: до 143г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) додають: 162,5г сахарози (50мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 1060 уоо 25 91044 на дозу. У цьому випадку об'єм дози є 1,5мл. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. 26 Дані антацидної здатності, початкового вірусного титру та вірусної стабільності показані у таблицях 2-4. Таблиця 2 Oб’єм дози 1,5мл № Сахароза мас.% DMEM мас.% РРМ* рН при t=0 60 50,0% 6% 7,82 PPM* час при рН 4 (хвилин) Менше 1 Вірусний титр при t=0 Вірусна втрата Вірусний титр (log10 yoo на дозу вапісля 1 тижня 37°С кцини) 37°С 6,3 5,4 0,9 оцінено тестом Россетта-Райса малюків (РРМ), адаптованим згідно з прикладом ІІІ,2,2 Таблиця 3 Oб'єм дози 1,5мл - Вірусна стабільність при кімнатній температурі n0 Вірусне титрування після зберігання при кімнатній температурі (log10 уоо на дозу вакцини) 60 1м* 5,6 2м* 5,6 3м* 5,0 4м* НВ 5 м* НВ 6м* НВ 7m* НВ 8m* НВ 9m* НВ 10m* НВ *= місяці; НВ=не визначено Таблиця 4 Oб’єм дози 11,5мл - Вірусна стабільність при 4°С № 60 Т=0 6,3 Вірусне титрування після зберігання при 4°С (Іоg10 уоо на дозу вакцини) після 1 тижня 1м* 2м* 4м* 6м* 9м* 37°C 4°С 4°С 4°С 4°С 4°С 5,4 6,2 5,8 6,0 5,5 НВ 12м* 4°С НВ * = місяці; НВ= не визначено l,1,3. Отримання ротавірусних композицій, що містять карбоксилат Лимонну кислоту (при наявності) та цитрат змішують у пропорціях та умовах, показаних у таблицях 5 та 6. Ротавірусну стабільність та антацидну здатність композицій вимірюють способами, даними у прикладах lll,1 та Іll,2, відповідно. Композиції 110-115 та 128-130 отримували так. Об'єм дози був 2,5мл для композицій 110-115 та 1,5мл для композицій 128-130. Композиції 110-115, представлені у таблиці 5, зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 100 доз по 2,5мл (3,25г) кожна. Композицію 110 отримували так. До 123,71г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: 19,29г тринатрій цитрату (Na3Цитрат 2Н2О, Мм 294) (відповідно кінцевій концентрації 262мМ) та 162,50г сахарози (50мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавіру су, для отримання 106,0 на дозу. У цьому випадку об'єм єдиної дози є 2,5мл або 3,25г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі середовище DMEM представляє 6мас.%, відповідно кінцева концентрація фосфату 0,059мМ. Композиції 111-115 отримані способом, подібним описаному для композицій 110, за винятком того, що кількість інгредієнтів адаптовано, як деталізовано у таблиці 5. Наприклад, композицію 111 отримували змішуванням наступних інгредієнтів: 123,73г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г), 19,07г три-натрій цитрату (Na3Цитрат 2Н2О, Мм 294) (відповідно кінцевій концентрації 259мМ), 0,197г лимонної кислоти (Мм 192) (відповідно кінцевій концентрації 4мМ) та 162,50г сахарози (50мас.%). Решту процедур виконували, як для композиції 110. Дані антацидної здатності, початкового вірусного титру та вірусної стабільності показані у таблицях 5-8. 27 91044 28 Таблиця 5 Oб'єм дози 2,5мл № 110 111 112 113 114 115 Вірусний Вірусний Лимонна Na3 ЦитРРМ* РРМ* час Вірусна втрата Сахароза, DMEM, титр при титр після 1 Кислота рат, РН при при рН>4 при 37°С після 1 мас.% мас.% t=0 тижня (на (М) 2Н2О t=0 (хвилин) тижня вакцини) log10 yoo дозу 0 0,262 50% 6% 8,15 14 5,7 4,8 0,9 0,004 0,259 50% 6% 6,95 14 5,3 5,4 0 0,010 0,256 50% 6% 6,51 12-13 5,6 5,6 0 0,014 0,249 50% 6% 6,34 12 5,6 5,4 0,2 0,034 0,283 50% 6% 5,94 12-13 5,6 5,3 0,3 0,093 0,333 50% 6% 5,37 14 5,7 5,6 0,1 * оцінено тестом Россетта-Райса малюків (РРМ), адаптованим згідно з прикладом III,2,2 Композиції, представлені у таблиці 6, зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 166,6 дози 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: лимонна кислота, 1Н2О (Мм 210), Na3Цитрат 2Н2О (Мм 294). Композицію 128 отримано змішуванням 110,89г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) з наступними інгредієнтами: 31,78г три-натрій цитрату (Na3Цитрат 2Н2О, Мм 294) (відповідно кінцевій концентрації 432мМ), 0,328г лимонної кислоти (лимонна кислота, 1Н2О, Мм 210) (відповідно кінцевій концентрації 6мМ) та 162,50г сахарози (50мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ро тавірусу, для отримання 106,0 уоо на дозу. У цьому випадку доза є 1,5мл або 1,95г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі середовище DMEM представляє 6мас.%, відповідно кінцева концентрація фосфату 0,059мМ. Композиції 129 та 130 отримані подібно способу, описаному для композиції 128 у той же час адаптуючи кількості інгредієнтів згідно з таблицею 6. Н2О Композицію 130 отримано змішуванням 2,75г лимонної кислоти (лимонна кислота, 1Н2О Мм 210) (відповідно кінцевій концентрації 52мМ) та 34,7г три-натрій цитрату (Na3Цитрат 2Н2О (Мм 294) відповідно кінцевій концентрації 472мМ). Решта інгредієнтів та пропорції є у таблиці 6. Таблиця 6 Oб'єм дози 1,5мл Вірусний Вірусний Лимонна PPM* PPM* час Вірусна втрата Сахароза, DMEM, титр при титр після № Кислота Na3Цитрат 2Н2О рН при при pH>4 при 37°С після 1 мас.% мас.% t=0 log10 1 тижня (М) t=0 (хвилин) тижня вакцини) yoo (на дозу 128 0,006 0,432 50,0% 6% 6,97 13 6,1 5,8 0,3 129 0,015 0,426 50,0% 6% 6,55 12 5,9 5,8 0,1 130 0,052 0,472 50,0% 6% 5,92 13 5,9 5,8 0,1 * оцінене тестом Россетта-Райса малюків (РРМ), адаптованим згідно з прикладом III,2,2 Таблиця 7 Об’єм дози 1,5мл - Вірусна стабільність при кімнатній температурі 128 129 130 Вірусне титрування після зберігання при кімнатній температурі (log10 уоо на дозу вакцини) 1м* 2м* 3м* 4м* 5м* 6м* 7м* 8м* 9м* 10м* НВ НВ НВ НВ 5,4 5,1 НВ НВ НВ НВ НВ НВ НВ НВ 5,4 5,0 НВ НВ НВ НВ НВ НВ НВ НВ 5,6 5,0 НВ НВ НВ НВ *=місяці; НВ=не визначено 29 91044 30 Таблиця 8 Об’єм дози 1,5мл - Вірусна стабільність при 4°С № 128 129 130 Т=0 6,1 5,9 5,9 Вірусне титрування після зберігання при 4°С (log10 уоо на дозу вакцини) після 1 тижня при 1м* 2м* 4м* 6м* 9м* 37°С 4°С 4°С 4°С 4°С 4°С 5,8 НВ НВ НВ 5,8 НВ 5,8 НВ НВ НВ 5,8 НВ 5,8 НВ НВ НВ 5,9 НВ 12м* 4°С 5,7 5,6 5,4 *=місяці; НВ=не визначено 1,2 ротавірусна стабільність та антацидна здатність - дані Вірусне титрування ротавірусу у відмінні моменти часу визначено способом, наданим у прикладі lll,1, а антацидну здатність композиції визначено наступним протоколом, наданим у прикладі ІІІ.2. Дані показані у таблицях 2-8. рН для контрольної композиції 60 без карбоксилату та доданого фосфату не мав антацидної здатності, а крім того рН виявлявся впритул до верхнього обмеження рН 8,0 для вірусної стабільності. Для усіх експериментальних композицій, тестованих у таблицях 5-8, рН підтримували у межах приблизно 5,0-7,0 за винятком композиції 110, де рН був вище 8,0. Як можна бачити з даних вірусного титру та вірусної втрати, ротавірусна стабільність у рідкій композиції пов'язана з рН цієї композиції у межах приблизно рН 5,4 (тобто композиції 115) до рН7,0 (тобто композицій 111 та 128), вірусна втрата після 7 доби при 37°С трималася на низькому рівні (тобто нижче log 0,5), і це контрастувало з результатом, отриманим для композиції 110 (рН більше 8, з втратою вірусного титру log 0,9). На додаток, композиції 111-115 та 128-130 показали подібну антацидну здатність до композиції 110, як оцінено дослідженням Россетта-Райса малюків (дивись Приклад III,2,2). Ця антацидна здатність добре перевищувала нижче обмеження 8 хвилин для 2,5мл, а також для об'єму дози композиції 1,5мл, та дійсно досягала мінімум 12 хвилин, та її розглядали тому високо задовільною. Альтернативні карбоксилати тестовані також, оскільки вони можуть представляти технічно здійснені альтернативи, коли можуть бути бажаними відносно низькі кількості карбоксилатів, наприклад, працюючи з дуже невеликими об'ємами дози. Приклади композицій, що містять такі альтернативні карбоксилати. надані у прикладі та таблицях 10-39. Приклад II - Композиції з альтернативним карбоксилатом у відсутності доданого фосфату Наступні карбоксилати застосовані для створення буферної здатності: ацетат, малонат, сукцинат, глутарат, адипат та малат. Згідно з рKа карбонової кислоти та залежно від її молекулярної маси, можливо знайти кількості для досягнення цільової антацидної здатності принаймні 8 хвилин, відповідно принаймні 12 хвилин, як оцінено тестом РРМ, в той час будучи в інтервалі рН5,0-8,0. Хімічно кажучи, "буферний" вплив отримують, при змішуванні сильної кислоти (типу НСІ) та солі, похідної від слабкої кислоти (типу натрій ацетату). Величина рН відповідає середині буферного плато і дорівнює рKа слабкої кислоти. рKа карбонової кислоти є виміром кислотної сили, іншими словами індикатором ефективних буферувальних меж сполуки. Оскільки ротавірус швидко розкладається нижче рН4 (С. Weiss та Н. F. Clark, 1985 J. Gen. Virol.,66, 2725-2730), буферне плато вище рН4 є бажаним, це відповідає карбоксил атам з рKа більше 4 або ді-карбоксилатам з середнім рKа більше 4. Придатні карбоксилати надані у таблиці 9. Надані середні величини рKа. 31 Стандартну криву кислотно-основного титрування для чотирьох карбоксилатів (натрій малат, натрій ацетат, натрій цитрат та натрій адипат) показано у Фіг.1. Це показує, що корисну антацидну здатність між рН4,0 та рН7,0, наприклад, мають 72,50%, 68,75%, 57,70% та 41,25% натрій адипат, натрій ацетат, натрій цитрат та натрій малат, відповідно. Композиції отримані з наступними карбоксилатами: ацетат, малонат, сукцинат, глутарат, адипат та малат. Усі композиції, показані у цьому прикладі отримані в об'ємі дози 1,5мл. II,2. Композиції з ацетатом ll,2,1. Композиції, представлені у таблиці 10, зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 166,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: оцтова кислота (Мм 60), NaOH (Mм 40). Композиція 36: до 148,84г води (кількість, достатня для досягнення кінцевих 325г) послідовно додають: 10,66г NaOH, льодяну оцтову кислоту до рН7,16 та 130г сахарози (40мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, додають до розчину, для отримання 1060 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 91044 32 1,5мл або 1,95г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. Композиції 37 та 42: це роблять, як композицію 36, але кількості підганяють згідно з таблицею 10. Композиція 87: до 75,00г води послідовно додають: 8,00г NaOH, 15,00г льодяну оцтову кислоту, достатню кількість 1Η розчину NaOH для досягнення рН7,00 (у цьому випадку 2г 1Η NaOH додавали), додаткову воду для досягнення достатньої кількості 325г (у цьому випадку додавали 43,00г води), та 162,50г сахарози (50мас.%). Решту процедур проводять як для композиції 36. Приклад для композицій 88-90: це робили як для композиції №87 за винятком того, що кількості адаптовані, як згадано у таблиці 10. Приклад для композицій 33-35: це робили як для композиції №36 за винятком того, що кількості адаптовані, як згадано у таблиці 10, a NaOH заміщено Са(ОН)2. Композиції 33-35 не уводили у низько-термінальне дослідження стабільності внаслідок невдачі погодження з тестом стабільності 1 тиждень при 37°С. Задовільні дані у присутності додаткового іону кальцію однак представлені у адипатній серії (дивись Приклад II. 5. 4 та Таблицю 26). 33 ll,2,2. Композиції, представлені у таблиці 11 зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 166,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: Натрій ацетат, 3Н2О(Мм136). Приклад для композиції 58: до 113,00г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: 30,00г натрій ацетату-3 Н2О та 162,50г сахарози (50мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умо 91044 34 вах 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, додають до розчину, для отримання 1060 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 1,5мл або 1,95г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. Композиції 59, 66, 69, та 70: це роблять подібно композиції 58 з підігнаними кількостями (дивись Таблицю 11). 35 II,2,3. ротавірусна стабільність та антацидна здатність - дані Вірусне титрування ротавірусу у відмінні моменти часу визначено способом, наданим у прикладі lll,1, а антацидну здатність композиції визна 91044 36 чено наступним протоколом, наданим у прикладі ІІІ,2,2. Дані показані у таблицях 10, 11,12 та 13. На завершення, ротавірусна стабільність у рідкій композиції ацетату пов'язана з рН. Придатні робочі межі є між рН6,0-7,5. =місяці; Пусті комірки = критерії не визначено 37 91044 38 II,2. Композиції з малонатом ll,2,1. Композицію 67 (дивись таблицю 14) зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 166,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: малонова кислота (Мм 104), NaOH (Mм 40). Композицію 54 (дивись таблицю 14) зроблено у загальній кількості 44г (35мл), що представляє 20 доз по 1,75мл (2,2г) кожна. Антацидні матеріали: малонова кислота (Мм 104), NaOH (Мм 40). Композиція №67: до 110,70г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: 14,00г NaOH, 18,230г малонової кислоти та 162,5г сахарози (50мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 1060 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 1,5мл або 1,95г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. Композиція №54: до 16,64г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 44г) послідовно додають: 2,4г NaOH, 3,1213г малонової кислоти та 19,5г сахарози (44мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 2,34г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 106,0 на дозу. У цьому випадку дозою є 1,75мл або 2,2г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. ll,2,2. Композицію, представлену у таблиці 15, зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє147,7 доз по 1,75мл (2,20г) кожна. Антацидний матеріал: динатрій малонат (Мм 148). Композиція №62: до 138,50г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: 23,00г динатрій малонат та 144,00г сахарози (44мас.%). Після повного розчи нення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, додають до розчину, для отримання 1060 уоо на дозу. У цьому випадку дозою ε 1,75мл або 2,20г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. 39 91044 II,2,3. Ротавірусна стабільність та антацидна здатність - дані На завершення, ротавірусна стабільність у рідкій композиції малонату пов'язана з рН: рН6,5 дає гарну стабільність протягом 1 тижня при 37°С, у той час, як спостерігають log втрати більше 0,9 при рН8,2. ll,3 Композиції з сукцинатом ll,3,1. Композицію 127 (дивись таблицю 16) зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 166,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: бурштинова кислота (Мм 118), NaOH (Mм 40). Композиція 51 (дивись таблицю 16) зроблено у загальній кількості 44г (35мл), що представляє 20 доз по 1,75мл (2,2г) кожна. Антацидні матеріали: бурштинова кислота (Мм 118), NaOH (Мм 40). 51 1,71 0,857 44% 6% 7,20 40 Композиція 127: до 120,16г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: 9,10г NaOH, 13,74г бурштинової кислоти та 162,5г сахарози (50мас.%). Решта етапів композиції ідентичні описаним для композиції 67. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. Композиція 51: до 16,22г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 44г) послідовно додають: 2,4г NaOH, 3,5414г бурштинової кислоти та 19,5г сахарози (44мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 2,34г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 1060 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 1,75мл або 2,2г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. 20 oo oo oo оцінено тестом Россета-Райса малюков (РРМ), адаптованим згідно з прикладом ІІІ,2,2. Композицію 51 відбраковували від довго-термінового дослідження стабільності, оскільки її антацидну здатність визначали надто довго oo II,3,2. Композицію 56 представлено у таблиці 17 та зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 166,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: Динатрій сукцинат (Мм 162). Композиція 56: До 122,50г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: 20,50г динатрій сукцинату та 162,50г сахарози (50мас.%). Решта етапів композиції ідентичні описаним для композиції 62. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. 41 ll,3,3. Ротавірусна стабільність та антацидна здатність - дані На завершення, ротавірусна стабільність у рідкій композиції сукцинату пов'язана з рН: рН6,3 дає гарну стабільність протягом 1 тижня при 37°С, у той час, як спостерігають втрату 0,8 log при рН8,1. ll,4. Композиції з глутаратом ll,4,1. Композиції з глутаратом представлені у таблиці 18. Композицію 65 зроблено у загальній кількості 320,8г (246мл), що представляє 164 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: глутарова кислота (Мм 132), NaOH (Mм 40). До 114,1г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 320,8г) послідовно додають: 9,3г NaOH, 15,40г глутарової кислоти та 162,5г сахарози. (50,6мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 1060 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 1,5мл або 1,95г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6,08мас.%. Композицію 50 зроблено у загальній кількості 44г (35мл), що представляє 20 доз по 1,75мл (2,2г) 91044 42 кожна. Антацидні матеріали: глутарова кислота (Мм 132), NaOH (Mм 40). До 15,8г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 44г) послідовно додають: 2,4г NaOH, 3,964г глутарової кислоти та 19,5г сахарози. (44мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 2,34г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 1060 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 1,75мл або 2,2г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. Композиції 125 та 126 зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 166,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: глутарова кислота (Мм 132), NaOH (Мм 40). Композиція 125: до 100,35г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: 9,10г NaOH, 15,40г глутарової кислоти та 162,5г сахарози. Решта етапів композиції ідентичні описаним для композиції 67. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. Композиція 126: це робили як для композиції 125, але з підігнаними кількостями (дивись Таблицю 18). 43 ІІ,4,2. Ротавірусна стабільність та антацидна здатність - дані На завершення, ротавірусна стабільність у рідкій композиції глутарату пов'язана з рН: рН6,17 дає гарну стабільність протягом 1 тижня при 37°С, у той час, як спостерігають втрату 0,7 log при рН8,1. ІІ,5. Композиції з адипатом ІІ,5,1. Композиції з вмістом адипату, представлені у таблиці 19, зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 166,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна, виключено композицію n0 45, котрої отримано 44г (35мл), що представляє 20 доз по 1,75мл (2,2г) кожна, та №63, котрої отримано 320,8г (247мл), що представляє 164 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: адипінова кислота (Мм 146), NaOH (Mм 40). Композиція 45; до 15,38г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 44г) послідовно додають: 2,4г NaOH, 4,3809г адипінової кислоти та 19,5г сахарози (44мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 2,34г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 1060 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 1,75мл або 2,2г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. Композиція 63: до 112,50г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 320,8г) послідовно додають: 9,3г NaOH, 17,00г адипінової 91044 44 кислоти та 162,5г сахарози. Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 1060 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 1,5мл або 1,95г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6,08мас.%. Композиція 81: до 116,70г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: 9,28г NaOH, 17,00г адипінової кислоти та 162,5г сахарози (50мас.%). Решта етапів композиції ідентичні описаним для композиції 67. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. Композиції 82, 83. 91-97, 100-109, 122-124. 131-134. 136-145, 147, 148: До води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: NaOH, адипінову кислоту та сахарозу у кількості, як описано у таблицях 19 та 23. Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 1060 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 1,5мл або 1,95г. Утворену суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. Кілька параметрів, показаних жирним у таблиці 19, змінені для виконання тестування утворених композицій відносно антацидної здатності та вірусної стабільності. 45 91044 46 47 91044 II,5,2. Ротавірусна стабільність та антацидна здатність - дані Вірусне титрування ротавірусу у відмінні моменти часу визначено способом, наданим у прик 48 ладі III,1, а антацидну здатність композиції визначено наступним протоколом, наданим у прикладі ІІІ,2,2. Дані показані у таблицях 19, 20, 21 та 22. Таблиця 20 Вірусна стабільність при кімнатній температурі Вірусне титрування після зберігання при кімнатній температурі (log10 уоо на дозу вакцини) № 63 81 82 83 91 92 93 94 95 96 97 105 106 132 1м* 5,8 *= місяці; Пусті комірки= не визначено 2м* 3м* 4м* 5м* 5,8 5,5 5,4 5,6 5,6 5,5 5,6 5,6 5,6 5,8 5,7 5,5 5,5 5,0 5,5 5,8 5,5 5,8 5,4 5,3 5,5 4,6 5,4 5,5 5,4 4,8 5,8 6м* 7м* 8м* 4,9 4,9 5,1 5,3 5,2 5,5 5,0 5,0 5,0 5,2 4,9 5,4 5,7 5,3 5,4 5,7 5,4 5,1 5,2 4,9 5,2 5,5 4,7 49 91044 50 Таблиця 21 Вірусна стабільність при 4°С Вірусне титрування після зберігання при 4е С (log10 уоо на дозу вакцини) після № 63 81 82 91 93 95 97 6,0 6,1 5,9 5,8 6,1 6,1 6,0 5,8 5,8 6,3 6,0 6,1 6,1 Т=0 6,0 5,9 5,9 5,9 6,0 6,0 6,1 5,9 5,9 6,0 5,8 5,5 6,0 5,8 5,9 5,7 5,8 5,8 5,5 6,0 5,8 1м* 2 м* 4 м* 6 м* 9 м* 12 м* 15м* 1w37°C 4°С 4°С 4°С 4°С 4°С 4°С 4°С 5,6 5,7 5,7 5,8 5,7 5,7 5,8 5,8 6,0 5,9 5,6 5,7 5,8 5,8 5,9 5,7 6,1 6,1 6,0 5,4 5,4 5,7 5,8 5,9 6,1 6,2 5,9 5,7 5,7 5,8 5,9 5,8 5,9 6,0 5,8 5,8 5,9 6,0 6,0 5,8 5,9 5,8 5,7 5,8 5,8 5,9 5,8 5,8 5,7 5,5 5,4 5,4 5,8 6,0 5,8 5,9 5,8 5,8 5,7 5,8 5,9 5,8 5,9 6,0 6,1 5,9 5,8 6,1 6,1 6,0 5,8 5,8 6,3 6,0 6,1 6,1 *= місяці; Пусті комірки= не визначено Антацидну здатність композицій 91-94 вимірювали способом Россетта-Райса (дивись Приклад llІ,2,2), це показує можливості досягнення 8, 12,16, або 20 хвилин при рН більше 4. Дані показані у таблицях 22 та у Фіг.2А. Таблиця 22 Композиція 94 час (хвилин) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 РН 6,11 5,11 5,03 4,96 4,90 4,85 4,79 4,74 4,68 4,63 4,57 4,51 4,46 4,40 4,35 4,29 4,23 Композиція 93 Композиція 92 Композиція 91 РН РН РН 6,5 5,07 4,98 4,9 4,83 4,76 4,69 4,62 4,56 4,49 4,42 4,36 4,29 4,22 4,15 4,07 3,98 6,24 4,93 4,84 4,75 4,67 4,58 4,51 4,42 4,34 4,26 4,17 4,08 3,98 3,87 3,75 3,6 6,37 4,79 4,67 4,56 4,45 4,34 4,23 4,12 4оо 3,86 3,70 51 17 18 19 20 21 22 23 24 91044 4,17 4,11 4,05 3,98 3,91 3,83 3,75 3,65 52 3,88 3,78 3,66 На завершення, як спостерігали для інших композицій карбоксилату, у адипатній серії висока величина рН не давала гарної стабільності (дивись, наприклад, композицію 124, котра має рН9,5 та показує більше 2,85 log втрати вірусу після 1 тижня зберігання при 37°С). Найвище обмеження прийнятності рН є приблизно 8,0 (дивись, наприклад, величину рН7,96, отриману для композиції 143), для котрої спостерігають вірусну втрату 0,5 log після 1 тижня при 37°С. Придатні межі рН є між приблизно рН5,5 та приблизно рН8 для цих композицій, з найбільш придатними межами між рН6,0 та рН7,7. Адипатна (матеріал харчової добавки) композиція є гарним компромісом з оптимальними величинами рKа (рKа1 5,4 та рKа2 4,43), що дає цільову антацидну здатність (наприклад, t=12 хвилин) для досягнення, застосовуючи розумну кількість матеріалу (приблизно 100мг на дозу). На додаток, ця кількість сумісна з параметрами розчинності, дозволяючи тим утворення вакцини в об'ємі дози 1,5мл. Це не є можливим з класичними цитратнофосфатними композиціями внаслідок технічної непрактичності, як-то кристалізації фосфату (дивись порівняльний приклад IV). Вони також сумісні з параметрами токсичності, оскільки дані токсичності низькі (пероральна ЛД50 у щурів: 5,7г/кг) для адипату порівняно з іншими карбоксилатами. II,5,3. Вплив титру вірусу у дозі вакцини на вірусну стабільність Наступний експеримент проводили для визначення впливу початкового титру ротаві-русу (1060, 1065,1052) у дозі вакцини 1,5мл на стабільність ротавірусу. Вірусне титрування ротавірусу у відмінні моменти часу визначено способом, наданим у прикладі lll,1, і визначено наступним протоколом, наданим у прикладі III,2,2. Дані показані у таблицях 23, 24, та 25. Таблиця 24 Вірусна стабільність при кімнатній температурі № 100 101 102 Вірусне титрування після зберігання при кімнатній температурі (log10 уоо на дозу вакцини) 1м* 2м* 3м* 4м* 5м* 6м* 7м* 8м* 9м* 10м* 5,4 5,0 6,0 5,5 4,9 4,4 *= місяці; пусті комірки= не визначено 53 91044 54 Таблиця 25 Вірусна стабільність при 4°С № 100 101 102 Вірусний титр при t=0 6,0 6,7 5,4 Вірусний титр після 1 тижня при 37°С 5,7 6,5 5,4 1м* 2м* 3м* 6м* 12м* 6,0 6,6 5,3 4м* 5,8 6,4 5,2 *= місяці; пусті комірки= не визначено На завершення, у визначених межах ротавірусна стабільність залишається подібною та прийнятною при будь-якому початковому вірусному титрі. II,5,4. Композиції з адипатом у присутності іонів кальцію Повідомлено, що кальцій може впливати на стабільність та конформацію глікопротеїну VP7 ротавірусу SA11, експресованого у Dictyostelium discoideum (K.R. Emslie et al., 1996, Journal of Biotechnology 50, 149-159). Може бути корисним додавати іони кальцію до ротаві-русної рідкої композиції винаходу з адипатом, оскільки вона може сприяти стабілізації ротавірусу у композиції. Відповідно, різні кількості іонів кальцію тестовано у композиції з адипатом (Таблиця 26). Дві альтернативи тестовано: СаСІ2 та Са(ОН)2. Композиції 98. 116-118: до 9,28г NaOH послідовно додають: воду (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г), 17,00г адипінової кислоти, СаСІ2, як встановлено у таблиці 26, (осадження відбувається, але осад знов розчиняється через одну годину перемішування при кімнатній температурі, окрім композиції №117), та 178,75г сахарози. Решта етапів композиції іденти чні описаним для композиції 82. У цій композиції вміст DMEM 6мас.%. Композиція 99: до води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: Са(ОН)2, як встановлено у таблиці 26,17,00г адипінової кислоти, 9,02г NaOH та 178,75г сахарози. Решта етапів композиції ідентичні описаним для композиції 82. У цій композиції вміст DMEM 6мас.%. Вірусне титрування ротавірусу у відмінні моменти часу визначено способом, наданим у прикладі lll,1, а антацидну здатність композиції визначено наступним протоколом, наданим у прикладі III,2,2. Дані показані у таблицях 26, 27 та 28. Композиції 119-121: до СаСІ2, як встановлено у таблиці 26, послідовно додають: воду (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г), 9,28г NaOH (у цьому випадку осадження Са(ОН)2 відбувалося, але осад знов розчиняється після додавання адипінової кислоти окрім композиції №121), 17,00г адипінової кислоти та 178,75г сахарози. Решта етапів композиції ідентичні описаним для композиції 82. У цій композиції вміст DMEM 6мас.%. 55 91044 56 Таблиця 27 Вірусна стабільність при кімнатніи температурі № 98 118 116 119 120 99 Вірусне титрування після зберігання при кімнатнійтемпературі (log10 yoo на дозу вакцини) 1м* 2м* 3м* 4м* 5м* 6м* 7м* 8м* 9м* 10м* 5,5 5,7 5,5 5,2 6,0 5,7 5,0 5,9 5,6 5,1 5,8 5,3 5,7 5,1 5,4 5,4 5,2 4,9 *= місяці; пусті коюмірки= не визначено Таблиця 28 Вірусна стабільність при 4°С № 98 118 116 119 120 99 Вірусний титр Вірусний титр після при t=0 1 тижня при 37°С 6 5,8 6,1 5,8 5,9 5,8 5,9 6 6 5,8 5,8 5,7 1м* 2м* 5,9 3м* 5,9 4м* 6м* 12м* 99 5,8 6,2 5,9 5,9 5,9 5,8 6,0 6,1 6,1 5,9 5,9 5,7 *= місяці; пусті коюмірки= не визначено Висновок: показано стабільність ротавірусу у присутності іонів кальцію: не більше 0,3 log втрати спостерігають після 1 тижня при 37°С, що подібно результату, отриманому для композицій, зроблених у тих же умовах, що містять ті ж інгредієнти крім доданих іонів кальцію (дивись, наприклад, композицію 83 у таблицях 19-21). II,5,5 Композиції з адипатом у присутності пероральних поліо-вірусів Деякі схеми звичайної імунізації можуть поєднувати у той же час пероральну поліо- та ротавірусну вакцинацію. Об'єктом наступного експерименту була оцінка, чи є обидві вакцинації сумісними. Експериментальна пероральна поліо/ротавірусна поєднана вакцина була тому отримана. Композицію OPV-середовища застосовували для композицій 149,151-155 57 91044 Вода для ін'єкції: 80,00л Лактальбумін гідролізат: 1500,00г Вода для ін'єкції: 200,00л Натрій хлорид: 2040,00г Калій хлорид: 120,00г Магній сульфат 7.Н2О: 30,00г KН2РО4: 38,00г Безводна глюкоза: 1200,00г Неоміцин сульфат: 15,00г Твін 80: 6,00г Кальцій хлорид 2Н2О: 80,00г Натрій гідроксид: 30,00г Натрій гідрокарбонат: 660,00г Фенол червоний: 6,00г L-цистин: 30,00г Хпоридна кислота 1Η: 550,00г Поліміксиксин В сульфат: 30,00г 58 Вода для ін'єкції до 300,00л Композиції 149-155: До води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325г) послідовно додають: NaOH та адипінову кислоту у кількості, описаній у таблиці 29, та 178,75г сахарози. Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм у стерильних умовах, та додавали кількості, як описано у таблиці 29, середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 1065 ІДКК50 на дозу та OPV-середовища, що містять обов'язкову кількість поліо-вірусів для отримання 106,6 типу І, 105,6 типу ll, 106,1 типу III ІДКК50 на дозу. У цьому випадку дозою є 1,5мл або 1,95г. Утворену суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цих прикладах вміст DMEM 6мас.%, сахарози 55мас.%, NaOH 0.92M, адипінової кислоти 0.466М. Таблиця 29 NaOH 149 150 151 152 153 154 155 г 9,2 9,2 9,2 9,2 9,2 9,2 9,2 Адипінова кислота г 17 17 17 17 17 17 17 вода г 92,55 100,55 92,55 92,55 92,55 92,55 92,55 Ротасередовище DMFM г 19,5 14,24 14,24 19,5 19,5 19,5 19,5 Ротавірус г 5,26 5,26 OPVсередовище г 8,00 8,00 0,07 2,70 7,47 5,90 OPV Тип І г 5,30 5,30 OPV ТипІІ г 0,53 0,53 OPV Тип III г 2,10 2,10 Вірусне титрування ротавірусу у відмінні моменти часу визначено способом, наданим у прикладі lll,1, а антацидну здатність композиції визначено наступним протоколом, наданим у прикладі llІ,2,2. Дані показані у таблиці 30. Таблиця 30 У цій таблиці: усі вірусні титри надані у ІДКК50/дозу** РРМ* Цільовий Цільовий Цільовий Цільовий Рота Титр хвилин Рота OPV Типі OPV Тип II OPV Тип III t=4°С 149 150 151 152 153 154 155 12 нема 106,5 106,5 нема нема нема нема нема нема нема 106,6 106,6 нема нема нема нема нема 105,6 нема 105,6 нема нема нема нема 106,1 нема нема 106,1 106,2 106,3 Рота Титр OPV І 1 тижд. титр 37°С OPV II OPV III титр титр 106,2 106,3 106,7 105,6 106,2 *оцінено тестом Россетта-Райса малюків (РРМ), адаптованим згідно з прикладом lll,2,2. ** Можна оцінити, що відповідність між уоо та ІДКК50 є приблизно 0,5 log (наприклад 10 60, що виражено у ІДКК50, еквівалентна приблизно 1055, що виражено у уоо на дозу). Пусті комірки: не визначено "нема" означає, що відповідний вірус не уведено у формулу Висновки: 1) Поліо-середовище є сумісним з антацидною здатністю (РРМ 12 хвилин у композиції №149). 2) Поліо-середовище є сумісним з ротавірусом (порівнюючи композицію №150 з композицією №151, де можна бачити, що ті ж титри отримані для обох композицій, при t=0 4°C та після одного тижня при 37°С). 3) Ротавірусна композиція є сумісною з поліовірусом (отримано очікуваний поліо-вірусний титр у композиції № 152). 59 91044 II,5,6 Стабільності композицій з адипатом при заморожуванні ll,5,6,1. Заморожування при -20°С Ротавірусну композицію n0 95, після 6 місяців зберігання між +4°С та +8°С піддавали з послідовним заморожуванням (-20°С) згідно з наступним розрахунком часу (Таблиця 31) 60 ll,5,6,2. Заморожування при -70°С Ротавірусну композицію №95, після 14 місяців зберігання між +4°С та +8°С піддавали одному заморожуванню при -70°С згідно з наступним розрахунком часу (Таблиця 31): Таблиця 31 t=0 (після 6 місяців при4-8°С) t=120 доби t=120 доби Назад від -20: 9 пляшечки 3 пляшечки: 1 -20°С 9 пляшечок 6 пляшечок t=196 доби t=197 діб Назад від -20: 6 пляшечки 3 пляшечки: 2 -20°С 3 пляшечки t=224 доби Назад від -20: 3 пляшечки: 3 -20°С Тривалість при -70^С t=0 (після 14 місяців при 4-8°С) t=15 діб Назад від -70: 3 пляшечки 1 -70°С Зразки аналізували та порівнювали з вірусним титром при t=0 (4°С), а також з вірусним титром зразків того ж віку, що зберігали при звичайній температурі холодильника (15 місяці при +4°С у цьому випадку). Дані показані у таблиці 32. Таблиця 32 №95 №95 1 №95 2 №95 3 №95 1 t=0, 4°C 6,0 -20°С -20°С -20°С -70°С t=15 місяці, 4°С 5,9 5,8 5,9 5,9 5,9 На завершення, композиція №95 (з адипатом) є сумісною з принаймні 3 послідовними заморожуваннями при -20°C, а також сумісною з принаймні одним заморожуванням при -70°С. II,6. Композиції з малатом як карбоксилатом ll,6,1. Композиції, представлені у таблиці 33 (виключено композиції 46, 64, 84, 85 та 86) зроблено у загальній кількості 325г (250мл), що представляє 166,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: D.L-яблучна кислота (Мм 146), NaOH (Mм 40). Композицію №46 зроблено у загальній кількості 44г (35мл), що представляє 20 доз по 1,75мл (2,2г) кожна. Антацидні матеріали: D.L-яблучна кислота (Мм 146), NaOH (Mм 40). Композиція 46: до 15,74г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 44г) послідовно додають: 2,4г NaOH, 4,0211г яблучної кислоти та 19,5г сахарози (44мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 2,34г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 106,0 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 1,75мл або 2,2г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. 3 пляшечки Композицію № 64 зроблено у загальній кількості 318,4г (244,5мл), що представляє 163 дози по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: D.Lяблучна кислота (Мм 146), NaOH (Мм 40). Композицію №84 зроблено у загальній кількості 130г (100мл), що представляє 66,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: D-яблучна кислота (Мм 146), NaOH (Мм 40). Композицію №85 зроблено у загальній кількості 130г (100мл), що представляє 66,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: L-яблучна кислота (Мм 146), NaOH (Мм 40). Композицію п° 86 зроблено у загальній кількості 130г (100мл), що представляє 66,6 доз по 1,5мл (1,95г) кожна. Антацидні матеріали: D.L-Яблучна кислота (Мм 146), NaOH (Мм 40). Композиція 64: до 97,3г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 318,4г) послідовно додають: 14,6г NaOH, 24,50г яблучної кислоти та 162,5г сахарози (51мас.%). Після повного розчинення розчин стерилізують фільтруванням на мембрані 0,2мкм. У стерильних умовах додають 19,5г середовища DMEM, що містить обов'язкову кількість ротавірусу, для отримання 106,0 уоо на дозу. У цьому випадку дозою є 1,5мл або 1,95г. Суміш гомогенізують та розподіляють у доречну тару. У цьому прикладі вміст DMEM 6,12мас.%. Композиція 71: до 103,9г води (кількість визначено таким чином, щоб досягти кінцевих 325 отримання) послідовно додають: 14,90г NaOH, 25,00г адипінової кислоти та 162,5г сахароз (50мас.%). Решта етапів композиції ідентичні описаним для композиції 67. У цьому прикладі вміст DMEM 6мас.%. Композиції 72-77. 84-86: це робили як для композиції 71, але з підігнаними кількостями (дивись таблицю 33). Композиція 78: до 75,00г води послідовно додають: 8,00г NaOH, 25,00г яблучної кислоти, достатню кількість 1Η розчину NaOH для досягнення рН6,48, додаткову воду для досягнення 325г та 162,50г сахарози (50мас.%). Решта етапів компо
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюLive attenuated rotavirus vaccine for oral administration
Автори англійськоюVande Velde Vincent
Назва патенту російськоюЖивая ослабленная ротавирусная вакцина для перорального применения
Автори російськоюВанде Вельде Винсент
МПК / Мітки
МПК: A61P 1/00, A61K 39/15, A61K 47/26, A61K 47/12
Мітки: жива, вакцина, застосування, перорального, ротавірусна, послаблена
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/52-91044-zhiva-poslablena-rotavirusna-vakcina-dlya-peroralnogo-zastosuvannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Жива послаблена ротавірусна вакцина для перорального застосування</a>
Попередній патент: Ліжко відкидне “екма”
Наступний патент: Заварювальний вузол
Випадковий патент: Фундамент під щоглу судна