Сполука-імуномодулятор для лікування, профілактики, інгібування або зменшення проявів алергійної хвороби або її ефектів

Реферат: Сполука-імуномодулятор формули А, або її фармацевтично прийнятна сіль R NH CH (CH2)n C X COOH O (А), де n являє собою 2, R являє собою водень, ацил, алкіл, та X являє собою L-триптофан або Dтриптофан, для застосування для лікування, профілактики, інгібування або зменшення проявів алергійної хвороби або її ефектів у суб'єкта. UA 100018 C2 (12) UA 100018 C2 UA 100018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресні посилання до зв'язаних заявок Дана заявка заявляє пріоритет за Російською Заявкою № 2007118237, поданою 17 травня 2007 року, та пріоритет за Американською Тимчасовою Заявкою № 60/957,201, поданою 22 серпня 2007 року. Галузь винаходу Даний винахід відноситься до галузі лікування алергійної хвороби. Опис попереднього рівня техніки Атопічна бронхіальна астма являє собою широко розповсюджену хворобу у промислово розвинених країнах. Роль T лімфоцитів та цитокінів, що виробляються ними, наразі без всякого сумніву полягає в патогенезі астми. Відповідно до однієї з провідних гіпотез, зсув у балансі T хелперів у напрямку T хелперів другого типу, що супроводжується домінуючим виробленням інтерлейкіну-4 (IL-4), являє собою важливий фактор в ініціюванні та підтриманні астматичного процесу у легеневій тканині. Алергійні стани, у поєднанні з погіршенням у стані імунореактивності організму пацієнта та прогресуюче забруднення довкілля, є широко розповсюдженими у промислово розвинених країнах. Наразі для профілактики та лікування алергій використовують препарати, що належать до різних фармацевтичних груп. Зокрема, пропонується застосування протизапальних засобів (аспірин, ібупрофен, вольтарен, гідрокортизон); антигістамінні препарати (димедрол, піполфен) використовують у різних схемах та комбінаціях з блокаторами кальцієвого каналу жирових клітин (натрію хромалін) та гормональною терапією, об'єднаною з симптоматичними агентами, бронходилататорами, адсорбентами та різними гомеопатичними препаратами природного та синтетичного походження, кортикостероїдами, тощо (RU 2240126, 2002; RU 2139100, 1996; RU 21167691, 1994; Handbook for the Practical Physician, Moscow, Meditsina, 1988, том 1, стор. 60-68; SU 1544438, 1990; Immunocorrection on Pulmonology/під ред. A. G. Chuchalin, Мoscow, Meditsina, 1989, стор. 202-210; Allergology. General Allergology, том 1/ під ред. G. B. Fedoseev, St. Petersburg, Nordmed Publishers, 2001, 816 стор.). Недоліком найбільш відомих препаратів є відносно низька ефективність, і також велика кількість протипоказань. Зокрема натрію хромоглікат (інтал) ефективний тільки під час дії інгаляції та тільки у випадку невеликих проявів алергійної хвороби; антигістамінні препарати є неефективними при астмі, та аспіринова тріада показує явні побічні ефекти (RU 2170091, 1994), тощо. В останні роки, загальноприйнятою вважали теорію, відповідно до якої алергійні хвороби викликаються порушеннями в регулюванні у імунній системі, пов'язаними з активацією алергенспецифічних клонів T-лімфоцитів хелперів, названих Типом 2 T-хелперних клітин (Тh2) (Allergology. General Allergology, том 1/під ред… G. B. Fedoseev, St. Petersburg, Nordmed Publishers, 2001, 816 стор.). У цьому зв'язку використання взаємного регулювання T-хелперних клонів шляхом введення індукторів диференціювання антагоністичного Типу 1 T-хелперних клонів (Th1), або використання цитокінів, синтезованих ними, було запропоновано для лікування алергії. Зокрема інтерлейкін 12, гамма інтерферон (IFN- g) та інші речовини використовувалися в цих цілях. Однак, виявилося, що отримані результати були недостатньо надійними та, у багатьох випадках, суперечливими. Таким чином, було продемонстровано, що рівень IFN-g корелює з інтенсивністю запальної алергійної реакції та серйозністю клінічних проявів хвороби (Leonardi A., Curnow S., Zhan H., Calder V. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast culture. Clin. Exp. Allergy, 2006, том 36, стор. 777-784). У той же самий час, у багатьох моделях астми у мишей, було продемонстровано, що введення IFN-g тваринам може призвести до збільшення у гіперактивності бронхів (Hessel E., Van Oosterhout A., Van Ark I. et al. Development of airway hyperresponsiveness is dependent of IFN-gamma and independent of eosinophil infiltration. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1997, том 16, стор. 325-335). Введення препарату рекомбінантного інтерлейкіну-12 у хворих з астмою викликало скорочення у еозинофілії, але не приводило до зниження у гіперактивності та симптомів бронхоспазму на фоні достатньо високої загальної токсичності (Bryan S., O'Connor B., Matti S. et al. Effects of recombinant human IL-12 on eosinophils, airway hyper-responsiveness, and the late asthmatic response. Lancet, 2000, том 356, стор. 2149-2153). Інтерлейкін-18 (IL-18) використали для лікування алергійної хвороби (Wild J., Sigounas A., Sur N. et al. IFN-g-inducing factor (IL-18) increases allergic sensitization, serum IgE, Th2 cytokines, and airway eosinophilia in a mouse model of allergic asthma. J. Immunol., 2000, том 164, стор. 27012710). Введення IL-18 тваринам, що загалом створює позитивний ефект на організм, у деякому 1 UA 100018 C2 5 10 випадку, приводить до збільшення алергійних проявів. Очевидно, це пов'язане з фактом, що IL18 здатний активувати обидва типи T-хелперних клонів та посилення синтезу як IFN-g, так і IL-4. Недоліком IL-18 та інших згаданих вище препаратів є поліклональна активація імунної системи, відсутність селективності ефекту, та висока токсичність, що була знайдена під час клінічних випробувань. У даній галузі техніки залишається необхідність у способах обробки для лікування, профілактики, інгібування або зменшення проявів алергійної хвороби або її ефектів у суб'єкта. У відповідності з даним винаходом, спосіб обробки для лікування, профілактики, інгібування або зменшення алергійної хвороби або її ефектів у суб'єкта, включає введення зазначеному суб'єкту ефективної кількості сполуки - імуномодулятора формули A: R NH CH (CH2) n C COOH 15 20 25 X O У Формулі A, n являє собою 1 або 2, R являє собою водень, ацил, алкіл або пептидний фрагмент, та X являє собою ароматичну або гетероциклічну амінокислоту або їх похідну. Переважно, X являє собою L-триптофан або D-триптофан.На Фіг. 1 графічно показано результати одного варіанту втілення. На Фіг. 2 графічно показано додаткові результати винаходу. На Фіг. 3 графічно показано додаткові результати винаходу. На Фіг. 4 графічно показано додаткові результати винаходу. На Фіг. 5 графічно показано додаткові результати винаходу. На Фіг. 6 графічно показано додаткові результати винаходу. На Фіг. 7 графічно показано додаткові результати винаходу. На Фіг. 8 графічно показано додаткові результати винаходу. Короткий опис винаходу Відповідно до одного варіанту втілення, даний винахід відноситься до способу обробки для лікування, профілактики, інгібування або зменшення проявів алергійної хвороби, такої як астма або її ефекти у суб'єкта, переважно людського пацієнта. У певних варіантах втіленнях лікується атопічна бронхіальна астма. Сполуки-імуномодулятори відповідно до даного винаходу включають імуномодулятори формули A: R NH CH (CH2) n C X (A) COOH 30 35 40 45 50 O У Формулі A, n являє собою 1 або 2, R являє собою водень, ацил, алкіл або пептидний фрагмент, та X являє собою ароматичну або гетероциклічну амінокислоту або її похідну. Краще, коли X являє собою L-триптофан або D-триптофан. Відповідні похідні ароматичних або гетероциклічних амінокислот для "X" являють собою: аміди, моно- або ди-(C1-C6) алкіл-заміщені аміди, ариламіди, та (C1-C6) алкіл або арил- складні ефіри. Відповідні ацильні або алкільні залишки для "R" являють собою: розгалужені або нерозгалужені алкільні групи, що складаються з від 1 до приблизно 6 атомів вуглецю, ацильні групи, що складаються з від 2 до приблизно 10 атомів вуглецю, та блокуючі групи, такі як карбобензилокси група та трет-бутилоксикарбоніл. Переважно атом вуглецю CH групи, показаний у Формулі A, має стереоконфігурацію, коли n являє собою 2, тоді відрізняється від стереоконфігурації X. Кращі варіанти втілення використовують сполуки, такі як g-D-глутаміл-L-триптофан, g-L-глутаміл-L-триптофан, g-L-глутаміл-Nin-форміл-L-триптофан, N-метил-g-L-глутаміл-L-триптофан, N-ацетил-g-L-глутаміл-L-триптофан, g-L-глутаміл-D-триптофан, b-L-аспартил-L-триптофан, та b-D-аспартил-L-триптофан. Особливо кращі варіанти втілення використовують g-D-глутаміл-L-триптофан, що іноді називається як SCV-07. Ці сполуки, способи для одержання цих сполук, фармацевтично прийнятні солі цих сполук та їх фармацевтичні композиції розкриті у Патенті США No. 5,916,878, що включений у даний опис шляхом посилання. SCV-07, g-D-глутаміл-L-триптофан, є членом класу препаратів - імуномодуляторів, які мають g-глутамільний або b-аспартильний залишки, що був виявлений російськими вченими та досліджується на ефективність у декількох показаннях у США SciClone Pharmaceuticals, Inc. 2 UA 100018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SCV-07 має цілий ряд імуномодулюючих активностей in vivo та in vitro. SCV-07 збільшує Con-A-викликану проліферацію тимоциту та лімфоциту, збільшує Con-A-викликане вироблення інтерлейкіну 2 (IL-2) та експресію рецептору IL-2 лімфоцитами селезінки, та стимулює експресію Thy-1.2 на клітинах кісткового мозку. In vivo, SCV-07 має сильний імуностимулюючий ефект на 5-FU-імуно-пригнічених тварин та у моделі імунізації з еритроцитами овець. Сполуки Формули А можуть бути введені у будь-якій ефективній дозі, наприклад, у дозах у діапазоні приблизно 0,001-10 мг. Дози можуть вводитися один або більше разів на тиждень, наприклад, щодня, дозами, що вводять один або більше разів на день. Введення може відбуватися будь-яким підходящим способом, включаючи пероральне, назальне, крізьшкірне, під'язичне, ін'єкцією, періодичну інфузію, безперервну інфузію, тощо. Дози можуть вводитися внутрішньом'язовою ін'єкцією, хоча можуть бути використані і інші форми ін'єкції та інфузії, та можуть бути використані інші форми введення, такі як пероральна або назальна інгаляція або пероральне ковтання. У кращих варіантах втіленнях сполуки Формули А вводять в дозі в межах діапазону приблизно 0,001-10 мг, більш переважно 0,01-1 мг, найбільше переважно в дозі приблизно 0,1 мг. Дози також можуть бути виміряні в мікрограмах на кілограм, з дозами в діапазоні приблизно 0,00001-100 мг/кг, більш переважно в межах діапазону приблизно 0,0001-1 мг/кг, ще більш переважно приблизно 0,001-0,01 мг/кг. SCV-07 містить діючу складову дипептид-g-D-Glu-L-Trp (гамма-D-глутаміл-L-триптофан), отриманий хімічним синтезом та очищений до однорідності високо ефективною рідинною хроматографією (RU 2091389, 1997; RU 2120298, 1998). Препарат раніше використовувався, щоб відновити імунітет при інфекційних хворобах та після хірургічних операцій. Зазначений препарат має імуно-стимулюючі ефекти при дозах від 0,00001 мг до 0,01 мг на кг маси тіла, тобто, він проявляє свій ефект у надзвичайно низьких концентраціях. Для лікування алергійних хвороб, препарат вводять в дозах, дозволених фармакопеєю. Залежно від форми введення до тіла та особливостей хвороби, у певних втіленнях добова доза препарату становить від 0,1 до 1,5 мг. Використання препарату в більш низьких дозах можливе, але зменшує терапевтичний ефект, та його використання в дозі більше, ніж 1,5 мг не є доцільним з економічної точки зору. Препарат є нетоксичним в дозах, які перевищують використовувані у мінімум 100 000 разів. При використанні парентерально (внутрішньом'язово або інтраабдомінально), у певних варіантах втіленнях препарат використовують у об'ємі 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію, у якому діюча речовина розчиняється (g-D-Glu-L-Trp 100 мкг) з наповнювачами (Dманітол 9,0 мг, хлорид натрію 1,0 мг). Єдина доза в певних варіантах втіленнях становить 0,1 мг (0,001 мг/кг). Лікування з препаратом проводять в певних варіантах втіленнях у формі курсу з 510 ін'єкцій. При використанні перорально, препарат використовують в певних варіантах втіленнях у формі таблеток, що містять 0,35 або 1,5 мг діючої речовини. Препарат використовують в певних варіантах втіленнях один раз або двічі на день протягом 1-2 тижнів. Включеними є біологічно активні аналоги, що мають заміщені, вилучені, подовжені, замінені або іншим чином модифіковані частини, які мають біоактивність, головним чином, подібну біоактивності SCV-07, наприклад, одержаний з SCV-07 пептид, що має достатню гомологію з SVC-07, таким чином, що він функціонує в основному тим же самим способом з по суті тією ж самою активністю що і SCV-07. Відповідно до одного варіанту втілення, сполука Формули А може бути введена пацієнтові таким чином, щоб істотно безупинно підтримують ефективну кількість сполуки Формули А у кровоносній системі пацієнта під час періоду лікування або профілактики. Хоча відповідно до даного винаходу розраховують на набагато більш довгі періоди лікування, варіанти втілення винаходу включають по суті безперервне підтримання ефективної кількості сполуки Формули А у кровоносній системі пацієнта під час періодів лікування принаймні приблизно 6, 10, 12 годин, або довше. В інших варіантах втілення періоди лікування протягом принаймні приблизно дня, і навіть впродовж багатьох днів, наприклад, тижня або довше. Однак, передбачають, що лікування, як визначено вище, у якому ефективні кількості сполуки Формули А істотно безупинно підтримуються у кровоносній системі пацієнта, може бути розділено періодами без лікування подібної або різної тривалості. Відповідно до одного варіанту втілення, сполуку Формули А безупинно вводять інфузією пацієнту, наприклад, внутрішньовенною інфузією, під час періоду лікування, таким чином, щоб по суті безупинно підтримувати ефективну кількість сполуки Формули А у кровоносній системі пацієнта. Інфузія може бути проведена будь-якими підходящими засобами, такими як мінінасос. 3 UA 100018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Альтернативно, режим ін'єкції сполуки Формули А може бути підтриманий, таким чином, щоб по суті безупинно підтримувати ефективну кількість сполуки Формули А у кровоносній системі пацієнта. Підходящі режими ін'єкції можуть включати ін'єкцію кожні 1, 2, 4, 6, і т.д. годин, таким чином, щоб по суті безупинно підтримувати ефективну кількість пептиду – імуномоделюючої сполуки у кровоносній системі пацієнта під час періоду лікування. Хоча передбачається, що під час безперервної інфузії сполуки Формули А, введення буде тривати впродовж істотно більш довгого періоду часу, відповідно до одного варіанту втілення безперервна інфузія сполуки Формули А триває протягом періоду лікування принаймні приблизно 1 годину. Більш переважно, безперервну інфузію проводять протягом більш довгих періодів, наприклад, впродовж періодів принаймні приблизно 6, 8, 10, 12 годин, або довше. В інших варіантах втіленнях безперервна інфузія триває протягом принаймні приблизно одного дня, та навіть впродовж багатьох днів, наприклад впродовж одного тижня або більше. У деяких варіантах втілення сполука Формули А знаходиться у фармацевтично прийнятному рідкому носії, такому як вода для ін'єкції, сольовий розчин у фізіологічних концентраціях, або подібні. Ефективна кількість сполуки Формули А може бути визначена звичайними експериментами титрування дози. Сполука Формули А також може бути введена з іншими лікуючими астму засобами. Наступні не обмежуючі приклади ілюструють даний винахід. Приклад 1: Лікування атопічної бронхіальної астми SCV-07 являє собою синтетичний імуномодулятор, що має широкий спектр дії на імунну систему та, зокрема здатний до посилення вироблення IL-2 та інтерферону-g. Ця активність очевидно походить із зсуву у балансі T хелперів під впливом препарату до T хелперів першого типу. Ціль цієї роботи полягала у дослідженні ефекту SCV-07 на експериментальну алергійну астму у мишей. Із цією метою автори використовують модель алергійної овальбумінової астми із введенням алергену інгаляцією. SCV-07 вводять тваринам після попередньої системної імунізації для того, щоб моделювати ситуацію стикання попередньо сенсибілізованого організму з алергеном. Моделювання експериментальної алергійної астми Жіночої статі, непатогенних мишей лінії Balb/С (тваринники лабораторії "Pushchtino") тримають в умовах SPF-віварію при постійній температурі, 12-годинному циклі день/ніч, та вони одержують стерильну їжу та воду за бажанням. У двох серіях експериментів мишей 6-8 тижневого та 18-20 тижневого віку використовують на початку експерименту, відповідно. Тварин імунізують двічі з 5-денними інтервалами за допомогою овальбумінового розчину (Сигма) у допоміжній речовині на основі сульфату амонію при дозі 8 мкг на мишу. SCV-07 вводять інтра-абдомінально в об'ємі 200 мкл при дозі 0,1 або 1,0 мкг/кг у PBS один раз на день від 6 до 11 днів після першої імунізації. У ті ж самі дні контрольна група отримує фізіологічний сольовий розчин. Кожна група включала 6-10 тварин. На 12-ий, 16-ий та 20-ий дні після першої імунізації тварин потім розміщають в герметичну коробку, у якій аерозоль 1 % овальбумінового розчину (OvA) у PBS створюють з ультразвуковим розпилювачем LD-207U (Little Doctor) протягом 1 хвилини з безперервним перемішуванням повітря. Тривалість піддавання тварин дії аерозолю становить 15 хвилин. Аналіз серйозності експериментальної алергійної астми проводять через 24 години після останнього піддавання дії аерозолю. Аналіз змін у серйозності експериментальної алергійної астми під час використання SCV-07 проводять відповідно до цитологічного складу бронхоальвеолярного лаважу, гістологічних досліджень, та визначення титрів специфічних для антигену антитіл IgE. Мишей умертвляють інтраабдомінальним введенням смертельної дози барбіталу натрію. Бронхоальвеолярний лаваж (BAL) отримують промиваючи легені через трахею за допомогою 1 мл розчину PBS. BAL клітини осаджують центрифугуванням, осад знову суспендують, концентрацію клітин визначають у камері Горяєва (Goryaev), та одержують мазки. Мазки висушують, фіксують та забарвлюють за допомогою барвнику Романовського (Romanovskii). Цитологічний склад бронхоальвеолярного лаважу досліджують під світловим мікроскопом з масляною імерсією (окуляр × 16, об'єктив × 100). Кількості моноциту/макрофагів, нейтрофілів, еозинофілів та лімфоцитів на 200 клітин обраховують, при цьому розглядають не менше ніж 5 візуальних областей. Відносну кількість клітин кожної популяції клітин виражають як відсоток від загальної кількості клітин. Після взяття бронхоальвеолярного лаважу легені фіксують у 4 %-ому параформальдегіді протягом 3 - 7 днів, пропускають через розчин Петерфі (Peterfi) відповідно до зростаючих кількостей спиртів (2 %-ий целуідин-касторове масло) та хлороформу, та виливають у парафін. Одержують секції 5 мкм товщини. Секції забарвлюють за допомогою гематоксилін-еозину, щоб 4 UA 100018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 оцінити інтенсивність інфільтрації клітин, та Шифф-йодною кислотою, щоб порахувати кількість бокалоподібних клітин. Кількісну оцінку перібронхіальної та періваскулярної інфільтрації здійснюють морфометрично з пакетом програми Scion Image. Три бронхи та три судини аналізують на секціях легенів від кожної тварини. Область інфільтрації розраховують як різницю між областю тканини, що містить бронхи або судину та інфільтрацією, що оточує її, та областю судини або бронха безпосередньо. Індекси інфільтрації розраховують як відношення області інфільтрації до області судини або бронха. Експериментальні групи порівнюють в одиницях області бронхів, та судин, що включені в аналіз (різниці між групами є не значними, р > 0,6). Кількість бокалоподібних та епітеліальних клітин на секціях бронхів розраховують у не менше ніж п'ятьох візуальних областях на секціях від легенів від кожної тварини та виражають як відсоток від загальної кількості клітин. Експериментальні групи порівнюють у вимірах бронхів, включених в аналіз (різниці між групами, у одиницях кількості клітин у бронху, є не значними, р > 0,5). Периферичну кров збирають з обернено-орбітальної порожнини. Титр анти-OvA IgE у сироватці та бронхоальвеолярному лаважі визначають із твердою фазою IFA відповідно до наступної схеми. Щурячі антитіла до мишачого IgE, міченого біотином (Caltag), вводять у 96лунковий планшет для IFA ((Corning Costar) при розведенні, рекомендованому виготовлювачем (100 мкл/лунку), інкубують протягом однієї години при кімнатній температурі, та промивають. Зразки сироватки або BAL потім вводять в послідовних розведеннях та інкубують при кімнатній температурі протягом однієї години та промивають. Потім додають OvA, маркірують пероксидазою хрону, інкубують на апараті для струшування протягом однієї години при кімнатній температурі, промивають та вводять субстрат для пероксидази (OPD, Sigma), та інкубують протягом 15 хвилин. Реакцію зупиняють, додаючи 1М H 2SO4 та планшети аналізують на спектрофотометрі Victor2 (Wallac) при довжині хвилі 450 нм. Для кількісного порівняння титрів антиген-специфічного IgE після вирахування фону, автори розраховують середню оптичну густину у кожному розведенні для зразків контрольної групи тварин, та виражають оптичні густини у зразках від всіх тварин в експерименті у відповідному розведенні як відсотки від отриманих значень. Статистичну обробку результатів проводять з Microsoft Excel та програмами SPSS для Windows v.13. Нормальність розподілу визначають із критерієм Колмогорова-Смірнова. Щоб оцінити значення різниць між групами для нормально розподілених значень, автори використовують двосторонній тест Стьюдента із нерівними відхиленнями, для ненормально розподілених різниць, використовують тест Манна-Вітні (Mann-Whitney). Різниці вважають значними при p < 0,05. Якщо інакше не заявлено, дані представлені у формі середніх ± стандартне відхилення. Відповідно до отриманих результатів, аналіз складу клітини BAL в експериментах на молодих тваринах (вік 6-8 тижнів на початку експерименту) не показує значного ефекту SCV-07. Повна насиченість клітинами BAL у всіх групах становить приблизно однакові значення (2,00±0,34 мільйонів клітин у контрольній групі, 1,96±0,99 мільйонів у групі, що одержала 0,1 мкг/кг препарату, та 2,21±1,16 мільйонів у групі, що одержала 1 мкг/кг). Порівнюючи відносні відсотки від окремих груп лейкоцитів у BAL, автори відзначили значно більш низький відсоток еозинофілів та більш високий відсоток макрофагів у групі, що одержала 1 мкг/кг SCV-07, у порівнянні із тваринами контрольної групи (див. Таблицю 1). Абсолютна кількість клітин окремих груп у BAL значно не різниться між групами. Таблиця 1 Відсотковий склад BAL клітин (тварини 6-8 тижневого віку). Показник еозинофіли, % моноцити/макрофаги, % нейтрофіли, % лімфоцити, % Групи тварин SCV-07 0,1 мкг/кг 57,4 ± 21,3 41,2 ± 20,7 0,9 ± 0,8 0,4 ± 0,5 Контроль 65,1 ± ,1 32,9 ± 5,3 1,2 ± 1,0 0,8 ± 0,8 SCV-07 1 мкг/кг 56,7 ± 9,5* 40,6 ± 9,4* 2,1 ± 0,9 0,6 ± 0,7 * р < 0,05 у порівнянні з контрольною групою В експериментах на тваринах від 18 до 20 тижневого віку зміни в клітинному складі BAL та 5 UA 100018 C2 5 груп, які одержують SCV-07, були по суті різні. Ми відзначили значне скорочення загальної кількості клітин у лаважах у групі, що одержала 0,1 мкг/кг препарату (1,12 ± 0,15 мільйонів у порівнянні з 2,03 ± 0,78 мільйонами у контрольній групі, p < 0,05), та різна тенденція до скорочення цього показнику в групі, що одержала 1 мкг/кг SCV-07 (1,32 ± 0,23 мільйонів). За відсутності значних різниць у відсотковому вмісті лейкоцитів окремих субпопуляцій, аналіз абсолютних значень показав значне скорочення кількості еозинофілів, нейтрофілів та лімфоцитів у групі, що одержала 0,1 мкг/кг SCV-07, та моноцитів/макрофагів, нейтрофілів та лімфоцитів у групі, що одержала 1,0 мкг/кг препарату (див. Таблицю 2, Фігуру 1, у якій SCV-07 згадується як SCV-07). 10 Таблиця 2 Склад субпопуляції BAL клітин (тварини 18-20 тижневого віку). Контроль 1151 ± 655 в Групи тварин SCV-07 0,1 мкг/кг 456 ± 144* SCV-07 1 мкг/кг 690 ± 247 806 ± 178 629 ± 134 586 ± 144* 44 ± 33 30 ± 9 Показник Еозинофіли, в тисячах Моноцити/Макрофаги, тисячах Нейтрофіли, в тисячах Лімфоцити, в тисячах 17 ± 14* 22 ± 11* 18 ± 10* 26 ± 9* * р < 0,05 у порівнянні з контрольною групою 15 Вимірювання титрів, специфічних для антигену IgE, використовуваних у моделі у сироватці та бронхоальвеолярному лаважі тварин від 6 до 8 місячного віку [sic], показує значне скорочення титрів у сироватці групи, що одержує 0,1 мкг/кг SCV-07 у порівнянні з контрольною групою. У мишей, які одержали 1 мкг/кг SCV-07, титри анти-OvA IgE були значно нижче як у сироватці, так і у бронхоальвеолярній рідині (див. Таблицю 3, Фігуру 2, у якій SCV-07 згадується як SCV-07). Таблиця 3 Титри анти-OvA IgE (тварини 6-8 тижневого віку). Показник Титр IgE сироватки, розведення 1:640, % середнього контрольної групи Титр IgE BAL, розведення 1:8, % середнього контрольної групи Контроль Групи тварин SCV-07 0,1 мкг/кг SCV-07 1 мкг/кг 100 ± 26 86 ± 42 65 ± 26* 100 ± 47 59 ± 33* 46 ± 24* * p < 0,05 у порівнянні з контрольною групою 20 В експериментах, у яких використовують мишей від 18 до 20 тижневого віку, автори також спостерігали тенденцію до скорочення титрів, специфічних для IgE після використання SCV-07, але у всіх групах показник мав дуже високу варіабельність, та різниці були не статистично важливі (див. Таблицю 4). 6 UA 100018 C2 Таблиця 4 Титри анти-OvA IgE (тварини 18-20 тижневого віку). Показник Контроль Титр IgE сироватки, розведення 1:400, % середнього контрольної групи Титр IgE BAL, розведення 1:32, % середнього контрольної групи 5 Групи тварин SCV-07 0,1 мкг/кг SCV-07 1 мкг/кг 100 ± 44 92 ± 44 79 ± 46 100 ± 91 85 ± 70 101 ± 51 Морфологічний аналіз секцій мишей показує більше ніж дворазове скорочення відсотку бокалоподібних клітин у епітелії бронхів тварин, які одержали 0,1 мкг/кг SCV-07, значне у порівнянні з контрольною групою (див. Таблицю 5). Морфометрична оцінка інтенсивності перібронхіальної та періваскулярної інфільтрації не була закінчена в цей час. Таблиця 5 Відсоток бокалоподібних клітин у епітелії бронхів (тварини 6-8 тижневого віку). Контроль % бокалоподібних клітин від загальної кількості клітин (середнє, мінімум-максимум) 39,3 (3-85) SCV-07 1 мкг/кг 15,2* (4-90) Показник Групи тварин SCV-07 0,1 мкг/кг 36,5 (3-92) * p < 0,05 у порівнянні з контрольною групою 10 Морфометричне оцінювання інтенсивності перібронхіальної та періваскулярної інфільтрації дозволила одержати надійне зменшення у інфільтрації навколо бронхів обох груп, що одержують SCV-07, які показують. Інтенсивність інфільтрації навколо судин також має окрему тенденцію до зменшення у групах, що одержують SCV-07, однак відмінність від контролю не є статистично надійною через високу варіабельність симптомів (див. Таблицю 6) Таблиця 6 Інтенсивність інфільтрації легеневої тканини. Показник Контроль Показник перібронхіальної 0,52 ± 0,23 інфільтрації, звичайні одиниці Показник періваскулярної 2,46 ± 2,22 інфільтрації, звичайні одиниці Групи тварин SCV-07 0,1 мкг/кг SCV-07 1 мкг/кг 0,39 ± 0,19* 0,35 ± 0,14** 1,67 ± 1,08 1,48 ± 1,02 * р < 0,05 у порівнянні з контрольною групою ** р < 0,01 у порівнянні з контрольною групою 15 20 Отримані результати вказують, що під час використання SCV-07 у моделі алергійної астми спостерігається зменшення серйозності експериментального процесу, специфічна поява лейкоцитів у порожнині бронхів та перібронхіальної інфільтрації зменшується, еозинофілія бронхоальвеолярного лаважу зменшується, кількість антиген-специфічного IgE у сироватці крові та лаважу знижується, та кількість утворюючих слиз бокалоподібних клітин у епітелії бронхів також зменшується. Приклад 2. Ефект SCV-07 на вироблення цитокінів клонами Тh1 та Тh2. SCV-07 вводять інтактним диким мишам у формі п'яти щоденних інтраабдомінальних ін'єкцій при дозі 0,1 та 1,0 мкг/кг маси тіла. Після цього проводять виділення клітин селезінки, 7 UA 100018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 синтез цитокіну викликають у культурі шляхом стимулювання клітин з конканаваліном А при дозі 5 мкг/мл. Рівні синтезованих цитокінів визначають кількісним імуноферментним аналізом. Результати експерименту представляють на Фіг. 1, що показує викликане мітогеном вироблення інтерлейкіну-4 та інтерферону-γ мишачими спленоцитами після інтраабдомінального введення SCV-07. Зміни у ConA-викликаному виробленні двох інших [sic] цитокінів - IFN-γ та IL-4, як очевидно з Фіг. 1, є взаємними по природі. Під впливом SCV-07 (1 мкг/кг), відзначають дворазове скорочення вироблення IL-4 спленоцитами та майже п'ятикратне збільшення IFN-g вироблення. Ці дані припускають, що SCV-07 не тільки стимулює функціональну реакцію Тклітин селезінки, підсилюючи вироблення IL-2, але, у той же самий час, впливає на поляризацію T-хелперів, головним чином, активуючи T-хелперні клітини типу 1. Приклад 3. Лікування бронхіальної астми за допомогою SCV-07. Пацієнт B-skii, 1952 року народження, надіслав скарги про напади диспное по 6-7 разів на день, кашель з мокротинням, що є важким для виділення, задишку та носову обструкцію. З історії хвороби відомо, що, з 1985 року, він переніс бронхіальну астму, був госпіталізований кілька разів службою невідкладної медичної допомоги в Алергологічне Відділення у зв'язку із загостренням хвороби. З 1997 року, він приймав системні глюкокортикоїди (Преднізолон 2 таблетки/день - підтримуюча доза). Він також одержує Beklazom LD 250 (до 1000 мкг/день), Flixotide 250 (до 1000 мкг/день), пролонговані бронхолітики (Serevent 25 мкг/одиницю 50 мкг/с), Teotard 200 (2 к/день, 400 мг/день). Напади лікують сальбутамолом (Ventolin). У 1994 році, він пройшов алергологічну експертизу в Муніципальному Управлінні з Алергії (Municipal Allergy Office) та були знайдені домашні алергени (домашній пил, домашні пилові кліщі); пиловий ASIT не проводили, через серйозний перебіг хвороби. Останнє загострення було 2 тижні тому, коли напади диспное зустрічалися на фоні основної терапії та лікувалися із труднощами за допомогою бета-2 агоністів (короткострокових), та бронхоспазм і задишка збільшилися. Він був госпіталізований в Аллергологічне Відділення GUZ Лікарні № 2 у зв'язку із несприйнятливістю до амбулаторного лікування. Спадковість для алергійної патології спостерігають по матеріальній лінії. Історія алергії: - Лікарський засіб - негативний; - Їжа – мед, цитрусові, диня, кавун (закладення носу, напади диспное, кашель); - Домашній (хатній пил) – напади диспное, кашель, закладення носу, ринорея; - Епідермічний - негативний; - Сезонне пилове загострення риніту, кон'юнктивіт, збільшена частота диспное у літньоосінній період (липень-жовтень) впродовж 10 років; - Комахи - негативний; На експертизі: стан середньої важкості. Положення пацієнта вимушене (сидіння). Шкірні покрови - чисті, бліді, сухі. Підшкірні лімфатичні вузли не збільшені. Щитовидна залоза не пальпується. Носове дихання серйозно ускладнене, рідкий слиз відділяється з носових шляхів; не сприймає аромати. Кон'юктива - рожева. Носова слизова оболонка (під час риноскопії) бліда, набрякла. Слизова оболонка у роті - рожева. Задишка експіраторного характеру. Частота дихання = 24 на хвилину. Бочкоподібна западина грудей. Перкусія - капсульний резонанс легеневих звуків. Вислуховування - поширені сухі хрипи, розповсюджені по всіх областях легень. Серцеві тони є ритмічними. Пульс = Р5=78 на хвилину. Тиск = 130/85 мм рт.ст… Язик покритий білим нальотом. Черевна порожнина м'яка, безболісна. Печінка знаходиться вздовж краю реберної арки. Область нирок не змінена, синдром Пастернака негативний по обидва боки. При надходженні, проводилася експертиза: . 12 Загальний клінічний аналіз крові: еритроцити – 5,07 10 /л, гемоглобін = 167 г/л, лейкоцити = 9 11,6…10 /л, ESR=5 мм/годину, B=1 %, E=3 %, паличкоподібні ядра = 10 %, сегментовані ядра = 70 %, лімфоцити = 11 %, MON=5 %. Загальний аналіз мокротиння: колір - сірий, характер - слизуватий, структура – в'язка, плаский епітелій - 10-12 x, альвеолярний епітелій - 3-5 x, L-10-12 x, еритроцити - немає, бокалоподібні клітини - не знайдені. Біохімія крові: глюкоза – 5,9 ммоль/л, повний білірубін - 11 мкмоль/л, ALT – 0,24, AST – 0,16 ммоль/год./л, сеча – 5,12 ммоль/л, креатинін – 0,108 ммоль/л, L-амілаза – 7,0 ммоль/л. Гормональний статус: серологічний кортизол – 39,8 нмоль/л Оцінка імунного статусу: + CD3 -53 % IgG-8,74 TSIK-40 відносні одиниці + CD4 -34 % IgA-0,67 NST-94/158/1,7 8 UA 100018 C2 + 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CD8 -15 % IgM-1,39 + CD16 -12 % IgE-1130,6 + CD20 -18 % + CD25 -1,3 % EKG: синусовий ритм. Пульс = 76 ударів/хвилину зір: без патологій FVD: FVC=66 %, FEV=52 %, FEV/FVC=61 %, МОС75=37 %, МОС50=34 %, МОС25=51 %. PTM: L/exp – 2,0 л/с L/exp – 1,0 л/с. Рентгенографія грудної клітки: легеневе поле емфізематозне, дифузний пневмосклероз у більш низьких відділеннях. Консультація ЛОРа: Діагноз: постійний алергійний риніт. Хронічний фарингіт. Пацієнта діагностують у такий спосіб: DS: бронхіальна астма, постійний, важкий перебіг, гормонозалежний, загострення. Ускладнення: DN2. Емфізема легенів, пневмосклероз. Супровідна хвороба: постійний алергійний риніт. Поліноз, не загострений. Пацієнту запропоноване лікування: 1. Вентолін (Ventolin) через розпилювач під час нападів задишки - протягом 2 днів, потім Асталін (Astalin) (DAI) під час задишки не більше, ніж 3-4 рази на день; 2. Внутрішньовенне вливання: 1. Преднізолон 90 nu-60 nu-30 nu у 200,0 мл фізіологічного сольового розчину; 2. Еуфілін 2,4 % - 10,0-5,0 мл. 3. Гепарин 5000 одиниць. 4. Бенакорт 200 (800 мкг/день). 5. Преднізолон 4 т /день (8:00, 12:00) 6. Лазолван через розпилювач, потім Амброгексал 1 т/3 рази на день. Під час полегшення гострого стану (на 8-ий день госпіталізації), SCV-07 прописують у кількості 0,1 мг у 1,0 мл фізіологічного сольового розчину один раз на день № 5 щодня [sic] внутрім'язового. Після того, як курс лікування був проведений (5 внутрім'язових ін'єкцій), у пацієнта було відзначено значне покращення самопочуття, позитивний настрій, ніяких побічних ефектів не було відзначено, препарат добре переносився, температура тіла була в межах нормальних значень. Пацієнту провели іншу експертизу при динамічних умовах (через 24 години після 5-ої внутрім'язової ін'єкції SCV-07): . 12 9 Загальний аналіз крові: еритроцити – 5,12 10 /л, Нв - 159 г/л, лейкоцити – 9,7. 10 /л, ESR – 6 мм/годину, b-, e-2 %, паличкоподібні ядра - 5 %, сегментовані ядра - 67 %, лімфоцити – 20 %, М - 6 %. Біохімія крові: Цукор – 5,7; Повний білірубін – 8,9, ALT – 0,12, AST – 0,13, сечовина – 5,12, креатинін – 0,073 Загальний аналіз мокротиння - характер - слизуватий, колір сірий, консистенція в'язка, плаский епітелій 7-8, альвеолярний епітелій - немає, лейкоцити - 1-2 х у візуальній області. Гормональний статус - кортизол – 72,4 Оцінка імунного статусу + CD4 - 36 Ig G – 11,5 + CD3 - 52 Ig A – 1,11 + CD8 - 15 Ig M – 0,9 + CD16 - 7 Ig Е – 672,1 NST – 100/163 + CD20 -11 к – 1.6 + CD25 -1,3 TSIK – 77 Позитивна динаміка хвороби була відзначена у пацієнта: усунення нападів диспное, кашлю, риніту, скорочення задишки (до 16 на хвилину), закладення носу, пацієнт почав відчувати аромати. Пацієнт був виписаний на п'ятнадцятий день з лікарні в задовільному стані з кортикостероїдною терапією, зменшеною до підтримуючої дози (Преднізолон 2 таблетки на день), та з рекомендацією основної терапії та повторної перевірки через 1 місяць. Приклад 4. Використання SCV-07, щоб посилити ефективність специфічної імунної терапії полінозу. Пацієнт. - P-na М. N., 45 років. Дата першої консультації - жовтень 2004 року. Діагноз: Поліноз із лабораторно підтвердженою сенсибілізацією до пилку дерев, ринокон'юктивальна форма, ремісія поза сезоном. Результати первинної лабораторної експертизи: помірна еозинофілія (7 %), помірна 9 UA 100018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гіпер IgE імуноглобулінемія (165 МЕ/мл), високі (MAST-клас 3) рівні серологічного алергенспецифічного IgE до пилку берези та лісового горіха, зменшений (0,88) імунний регуляторний показник. З кінця листопада 2004 року до середини березня 2005 року пацієнт отримував специфічну імунотерапію (SIT) для полінозу, використовуючи алергоїд ("Puretal-tree") відповідно до схеми: підшкірно один раз на тиждень, починаючи з однієї дози застосовуваного алергоїду 0,025 мл, наступна доза нарощується протягом лікування до досягнення однієї дози 0,5 мл (0,025 мл – 0,05 мл, -0,1 мл – 0,2 мл – 0,3 мл – 0,4 мл – 0,5 мл), та наступні дози залишаються на цій дозі. Природа наступного періоду сезонного загострення полінозу (квітень - червень 2005 року) показала надзвичайно низьку ефективність SIT: різко виражені ринокон'юктивальні симптоми усе ще потребують використання невід'ємних дозових режимів системних пероральних антигістамінів (Erius) та місцевого лікування стероїдами (Nasonex). Приймаючи до уваги вищезгадану ситуацію, протягом жовтня 2005 року, щоб збільшити клінічну ефективність SIT, за початкових або попередніх умов, імунна стимуляція - курс препарату "SCV-07" - перорально вводять в такий спосіб: 1,5 мг один раз на день щодня протягом 10 днів к ряду. По завершенні курсу "SCV-07" пацієнт, із середини листопада 2005 року до середини березня 2006 року, отримував інший курс SIT для полінозу, використовуючи алергоїд "Puretaltree" відповідно до попередньої схеми. Інтервал між курсом "SCV-07" та початком SIT курсу для полінозу становив 15 днів. Природа наступного періоду сезонного загострення полінозу (квітень - червень 2006 року) показала значно збільшену ефективність проведеного SIT: сезонні ринокон'юктивальні симптоми фактично були відсутні; ні антигістамінних препаратів, ні місцевих стероїдів не використовували для пацієнта протягом сезону запилення дерев. Отримані результати вказують на ефективність використання "SCV-07”для запобігання та лікування алергійних хвороб. Безпека препарату та його відносно дешева вартість робить його багатообіцяючим для широко розповсюдженого використання для цієї мети як незалежну терапію та у контексті інтегрованої терапії. Приклад 5: Ефективність SCV-07 у моделі алергійної хвороби у морської свинки Астма являє собою порушення легень, що характеризується бронхоспазмом, інфільтрацією запальної клітини в легені (особливо еозинофіли), гіперреактивністю дихальних шляхів та збільшеною секрецією слизу. Алергійна астма може бути змодельована у морських свинок зі значною безпосередньою реакцією бронхоконстриктору на алерген, так само як інфільтрацією запальної клітини та ураження легені, що є очевидним через 24 години після виділення алергену. Ціль даного дослідження полягає в тому, щоб визначити, чи міг би SCV-07 зменшити інфільтрацію запальної клітини в легені після алергенної провокації. Морських свинок сенсибілізують внутрішньочеревинною ін'єкцією овальбуміну. У дні 17 - 21, їх обробляють внутрішньочеревинно із PBS носієм, SCV-07 при 1 мкг/кг або SCV-07 при 10 мкг/кг. У день 21, всіх тварин попередньо обробляють антигистамином, щоб зменшити безпосередню реакцію бронхоконстриктору, що може бути фатальною. Згодом, тварин піддають впливу аерозольного овальбуміну, щоб викликати алергійну реакцію. Контрольних тварин сенсибілізують овальбуміном та піддають дії аерозольного сольового розчину як контролю. SCV-07 лікування - Знижений кашель, задишка, та загальне нездужання тварин під час безпосередньої алергійної реакції. - Зменшені постійні еозинофіли та нейтрофіли в тканині легені - Зменшене алергійне ушкодження легені, про що свідчить значне ослаблення витоку еритроцитів в бронхоальвеолярному лаважі - Помітно не інгібує інфільтрацію запальної клітини у алергійну легеню або вироблення овальбумін-специфічного антитіла Висновок: SCV-07 показує перспективу в зменшенні безпосередньої алергійної реакції та наступного ушкодження легені, але неефективний у запобіганні інфільтрації запальних клітин в алергійну легеню. Майбутні дослідження повинні простежити здатність SCV-07 інгібувати викликаний алергеном бронхоспазм. Крім того, з огляду на захисний ефект SCV-07 на витоку еритроцитів, повинна бути оцінена його здатність запобігати викликаним алергеном змінам в капілярній проникності, так само як вивільненню медіатора тучної клітини. 10 UA 100018 C2 Абревіатури EPO MPO WBC RBC BAL NSS PBS OVA вч 5 10 15 еозинофільна пероаксидаза мієлопероксидаза біле кров'яне тільце (лейкоцит) червоне кров'яне тільце (еритроцит) бронхоальвеолярний лаваж нормальний сольовий розчин фосфат-забуферений сольовий розчин овальбумін внутрішньочеревинний Вихідні дані: Випадки з життя показують, що люди із хронічною астмою, що одержує SCV-07 для інших показань, могли зменшити їх використання рятувальних ліків для їхньої астми. Припущення: використання агоністів β2 у хворих було зменшено, припускаючи, що гіперреактивність дихальних шляхів та/або викликані алергеном рання та пізня фази бронхоспазму були зменшені за допомогою SCV-07. Дослідження астми на моделі миші також припускають, що клітинна інфільтрація може бути трохи зменшена після введення алергену (SciClone communication). Мета: визначити, чи полегшує SCV-07 симптоми астми у моделі астми у морської свинки. Специфічна мета: визначити, чи введення SCV-07 після сенсибілізації, але до введення алергенної провокації знижує клітинну інфільтрацію у моделі астми у морської свинки. Матеріали та способи Тварини Морських свинок жіночої статі Dunkin-Hartley (200-350 г) купляють у Charles River, Kingston, New York facility, Barrier K81. Тварин відправляють до Duluth, Minnesota, та тримають в наших приміщеннях для тварин протягом 5-7 днів до початку експерименту. Експериментальні групи лікування змальовують загалом у Таблиці 7. Таблиця 7 Експериментальні лікувальні групи Назва лікувальної групи PBS NSS PBS OVA SCV 1 NSS SCV 1 OVA SCV 10 NSS SCV 10 OVA Сенсибілізація OVA OVA OVA OVA OVA OVA Пептидне лікування PBS PBS SCV-07 1 г/кг SCV-07 1 г/кг SCV-07 10 мкг/кг SCV-07 10 мкг/кг Аерозольна провокація NSS OVA NSS OVA NSS OVA N 8 7 8 8 8 7 20 25 30 35 П'ять окремих експериментів з 8-10 тваринами у експерименті проводять за приблизно 6місячний період. Перший експеримент складається з 4 PBS NSS тварин та 4 PBS OVA тварин, щоб гарантувати, що експериментальна система працює належним чином та що у OVA спровакованих тварин розвивається значна еозинофілія. Наступні 4 експерименти, що включають десь від 1 до 3 тварин з кожної з 6 груп лікування з кінцевою кількістю N 7-8 тварин на групу лікування, як показано в Таблиці 7. Експериментальна процедура Тварин сенсибілізують у день 0 внутрішньочеревинно за допомогою 50 мг/кг OVA. У Дні 17, 18, 19 і 20, тварини одержують внутрішньочеревинно ін'єкцію між 8 та 10 годинами ранку з PBS, SCV-07 при 1 мкг/кг, або SCV-07 при 10 мкг/кг (Пептидне лікування). Між 8 та 10 годинами ранку у День 21, тваринам вводять пептид за 2 години до OVA або сольової (NSS) аерозольної провокації. За 30 хвилин до OVA або NSS аерозольної провокації кожній тварині вводять внутрішньочеревинною ін'єкцією антигістамін (6,1 мг/кг піриламіну малеат), щоб запобігти смерті через анафілактичну реакції, що супроводжує аерозольну OVA провокацію. Тварин піддають впливу аерозолю парами або з 1 %-им OVA розчином або з NSS протягом 5 хвилин в камері з органічного скла (22 × 22 × 29 см), використовуючи ультразвуковий розпилювач DeVilbiss Model 35B. За тваринами спостерігають впродовж всього 5 хвилин аерозолізації та коментарі 11 UA 100018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 записують. Протягом 22-24 годин після провокації, тварин піддають евтаназії, знекровлюють кардіальною пункцією, промивають та долі легені вилучають для вимірювання клітинної інфільтрації. Під час OVA або NSS провокаації та евтаназії, маса тварин знаходиться у інтервалі приблизно від 350 до 550 г, із середньою масою приблизно 420 г. Цей експериментальний протокол подібний використовуваному в раніше виданих дослідженнях (Regal та Fraser, 1996; Regal et al., 2000). Визначення клітинної інфільтрації Тварини піддають евтаназії з пентобарбіталом (100-200 мг/кг), знекровлюють кардіальною пункцією, промивають за допомогою PBS кімнатної температури. Для бронхоальвеолярного лаважу (BAL) трахею канюлюють, та 4 об'єми PBS вводять в трахеальну канюлю та обережно вилучають. Загальний об'єм лаважу становить 60 мл/кг. BAL центрифугують до осадження клітин, та BAL клітинний осад знову суспендують у 1,0 мл PBS для визначення загальної кількості лейкоцитів (WBC), що відновили в BAL кожної тварини. BAL супернатант заморожують о при -70 C для визначення загального білку, що відновили у супернатанті BAL, використовуючи метод Лорі (Lowry) та ін. (1951). Загальну кількість лейкоцитів в BAL обраховують за стандартними методами в гемацитометрі, використовуючи розчин Турка (Turk's solution). 4 Диференційні кількості отримують із цитоспінових препаратів BAL клітин (3 × 10 клітин), що забарвлюють модифікованим барвником Райта (Wrights" stain) (Diff Quik, American Scientific Products, McGraw Park, IL). Чотириста клітин підраховують та ідентифікують як еозинофіли, нейтрофіли, або мононуклеарні клітини. BAL клітинний диференціал та кількості лейкоцитів використовують для обчислення загальної кількості клітин кожного типу, відновлених на тварину з BAL. Для оцінок кількостей еозинофілів та нейтрофілів у тканині легені, ліву долю легені обробляють для вимірювання активності еозинофільної пероксидази (EPO) та праву долю легені для мієлопероксидази (MPO), відповідно (Fraser et al., 1995). Залишок від легені висушують при 80 C протягом 3-5 днів для визначення грамів сухої маси. Активність EPO з гомогенізованої легені після лаважу виражають як загальне OD/хвил. від лівої хвостової частки. Активність MPO з гомогенізованої легені після лаважу виражають як загальні одиниці ферментної активності з правої хвостової частки. SCV-07 при 1 мкг/мл не інгібує MPO або EPO дослідження. Кількість RBC у BAL обраховують кількісно, визначаючи OD 412 повторно суспендованого BAL осаду клітин після лізису RBC як описано раніше (Fraser et al., 1995). OD412 BAL супернатанту також визначають, щоб оцінити кількість RBC, які лізують під час процедури лаважу та до повторного суспендування клітин для обрахунку. SCV-07 при 0,3 мкг/мл не заважають OD 412 вимірюванням in vitro. OVA специфічне IgG1 OVA специфічне IgG1 у сироватці визначають за допомогою ELISA як раніше описано (Fraser et al., 1998; Regal et al., 2000). Дані виражають як концентрацію OVA специфічного IgG1 у зразку, поділену на концентрацію OVA специфічного IgG1 у стандарті, визначеному як 1. Стандарт IgG одержують, пропускаючи пул сироватки від OVA сенсибілізованих морських свинок через Білок-А- Сефарозну колонку. Відновлений IgG діалізують до NSS та відбирають аліквоту для використання як стандарт у дослідженні. Реагенти SCV-07 200 мг SCV-07 відправляють до Дулуту (Duluth) за допомогою SciClone та зберігають при 70 °C. Сполуку зважують у лабораторії з вимкненим світлом та зберігають у темряві. Вихідні розчини 20 мкг/мл та 2 мкг/мл SCV-07 роблять в PBS та зберігають в поліпропіленових пробірках (Sarstedt tubes; Ref 72.694.105) у 1 мл аліквотах в -70 °C морозильнику. PBS, використовуваний для одержання розчинів SCV-07, також аліквотують та заморожують для контрольних PBS ін'єкцій (PBS каталожний номер, Gibco 10010, ніякого кальцію або магнію, Ендотоксин тестують як менше ніж 0,03 ЕО/мл). Аліквоти відтаюють у день використання та зберігають на льоді у темряві у обернених фольгою пробірках. Якщо їх не повністю використовують у той день, їх зберігають в темряві в холодильнику та витрачають на наступний день, або відкидають. Тваринам вводять 0,5 мл/кг PBS, 2 мкг/мл SCV-07 або 20 мкг/мл SCV-07, що приводить до одержання доставленою дози SCV 1 (1 мкг/кг) або SCV 10 (10 мкг/кг). OVA для сенсибілізації Одержують 100 мл розчину овальбуміну (A5503 з Sigma) при 25 мг/мл у сольовому розчині о (Baxter, Стерильний, непірогенний). Чотири мілілітрові аліквоти заморожують при -70 С у Nunc кріопробірках (Кат. 337516). Тваринам вводять 2 мл/кг цього OVA розчину внутрішньочеревинно з голкою на 21 г, що приводить до одержання кінцевої доставленої дози 50 мг/кг. Всіх тварин у цьому експерименті сенсибілізують за допомогою OVA. OVA для аерозольної провокації. 12 UA 100018 C2 5 10 15 20 25 1 % OVA розчин одержують свіжим у день аерозольної провокації у NSS кімнатної температури (Baxter, Стерильний, непірогенний). Статистичний аналіз Всі дані логарифмічно трансформують для того, щоб зрівняти розходження та одержати нормальне параметричне моделювання. Для значень OVA специфічних IgG1, до статистичного аналізу константу 0,01 додають до всіх значень, щоб мінімізувати вплив дуже низьких значень на розходження у логарифмічному масштабі. Значення у всіх фігурах представляють геометричне середнє + стандартна помилка (SE) 7-8 значень. Статистичний аналіз застосовує ANOVA з контрастами, використовуючи програмне забезпечення JMP (SAS Institute Inc., Cary, N.C., USA). Статистичну достовірність визначають як p < 0,05. Результати Ефект SCV-07 на безпосередню реакцію на OVA аерозоль За тваринами спостерігають під час OVA аерозолізації, та зареєстровані коментарі підсумовують у Таблиці 8. Експериментатор не діє наосліп при лікуванні. Як замічено в лівій стороні Таблиці 8, тварини, спровоковані NSS аерозолем, показують нормальну поведінку, та ніяких змін у моделі дихання або русі не зареєстровано. Загалом, тварини, сенсибілізовані та спровоковані за допомогою OVA, та попередньо оброблені антигістаміном, не будуть вмирати від алергенної провокації, але будуть мати ускладнене дихання та часто кашель та задихання. Як і очікувалося, всі 7 тварин у PBS OVA лікувальній групі мали деяку видиму реакцію. Помітною знахідкою є кількість тварин у SCV 1 OVA та SCV 10 OVA лікувальних групах, у яких не було ніякої очевидної реакції на OVA аерозоль. Ці дані припускають, що SCV-07 попередня обробка або при 1 або при 10 мкг/кг є захисною від негайних анафілактичних ефектів алергенної сенсибілізації та провокації. Очевидне припущення полягає в тому, що SCV-07 зменшує безпосередній бронхостеноз до алергенної провокації. Наступні експерименти пояснюються цим спостереженням. Таблиця 8 Коментарі, що записують під час аерозолізації морських свинок (46 тварин) Обробка PBS NSS PBS NSS PBS NSS PBS NSS скупчення реакції скупчення реакції скупчення реакції скупчення реакції Коментар у кутку, Обробка ніякої у кутку, ніякої у кутку, ніякої у кутку, ніякої у кутку, ніякої Коментар PBS OVA Легкий кашель PBS OVA Легкий кашель PBS OVA PBS OVA PBS NSS скупчення реакції PBS NSS ніякої реакції PBS OVA PBS NSS PBS NSS ніякої реакції ніякої реакції PBS OVA SCV 1 NSS SCV 1 NSS SCV 1 NSS SCV 1 NSS SCV 1 NSS SCV 1 NSS SCV 1 NSS скупчення у кутку скупчення у кутку скупчення у кутку ніякої реакції ніякої реакції ніякої реакції ніякої реакції SCV 1 OVA SCV 1 OVA SCV 1 OVA SCV 1 OVA SCV 1 OVA SCV 1 OVA SCV 1 OVA SCV 1 NSS ніякої реакції SCV 1 OVA PBS OVA 13 задишка після вилучення з камери перевертання ногами до гори, важке страждання через 4 хвил. перевертання ногами до гори, важке страждання через ~2 хвил. кашляння ~3 хвил. із стражданням задишка, страждання ніякої реакції Легкий кашель 1x? ніякої реакції ніякої реакції ніякої реакції 1 кашляння? ніякої реакції Кашляння близько аерозолізації до кінця UA 100018 C2 Продовження таблиці 8 Обробка SCV 10 NSS SCV 10 NSS SCV 10 NSS SCV 10 NSS SCV 10 NSS SCV 10 NSS SCV 10 NSS SCV 10 NSS 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Коментар скупчення у кутку, ніякої реакції скупчення у кутку, ніякої реакції ніякої реакції ніякої реакції ніякої реакції ніякої реакції ніякої реакції ніякої реакції Обробка SCV 10 OVA SCV 10 OVA SCV 10 OVA SCV 10 OVA SCV 10 OVA SCV 10 OVA SCV 10 OVA Коментар ніякої реакції Легкий кашель ніякої реакції ніякої реакції 1 кашляння? Глибше дихання Глибше дихання Ефект SCV-07 на OVA-викликану клітинну інфільтрацію в легеню Всіх тварин сенсибілізують за допомогою OVA, та ефект SCV-07 визначають як на тваринах, спровокованих NSS аерозолем (негативний контроль, ніякої алергійної реакції), так і на тваринах, спровокованих OVA аерозолем. Еозинофіли в тканині легені оцінюють вимірюванням еозинофільної пероксидази в гомогенізованій легені, та нейтрофілів у тканині легені оцінюють вимірюванням мієлопероксидази (Фіг. 4). Попередні дослідження, як від нашої лабораторії, так і від інших, затвердили ці вимірювання як оцінки запальних клітин у тканині. Крім того, автори визначили кількості та типи лейкоцитів, які були присутні в повітряному просторі, тобто BAL клітинах (Фіг. 5-6). Ефект SCV-07 на резидентні клітини у легені Статистичний аналіз спочатку залучає ANOVA з контрастами контрольних тварин, спровокованих тільки NSS аерозолем (n=24), щоб визначити, чи був значний ефект SCV-07 на резидентськіеозинофіли або нейтрофіли у тканині легені або повітряному просторі. Як видно на Фіг. 4, SCV-07 при 1 мкг/кг значно зменшує MPO у тварин, спровокованих NSS аерозолем, та SCV-07 при 10 мкг/кг значно зменшує EPO (*p