Днк-конструкт, що забезпечує підвищений вміст лізину в рослинах кукурудзи

1. ДНК-конструкт, який містить: (а) перший сегмент ДНК, який містить промотор кукурудзяного глобуліну 1; (b) другий сегмент ДНК, який містить інтрон гена рисового актину 1; 2 (19) 1 3 93654 4 11. Насінина кукурудзи Явища LY038, де репрезентативна насінина вказаного Явища LY038 депонована в Американській колекції типових культур під номером доступу PTA-5623. 12. Трансгенна рослина кукурудзи Явища LY038, де репрезентативний зразок вказаного Явища LY038 депонований в Американській колекції типових культур під номером доступу PTA-5623. 13. Частини рослини кукурудзи за п.11, які включають пилок, насінний зачаток, насінину, коріння або листя. 14. Потомство рослини кукурудзи за п.11, де вказане потомство містить ДНК-вставку, у якій 5'-сайт з'єднання з геномом кукурудзи містить SEQ ID NO: 5, а 3'-сайт з'єднання з геномом кукурудзи містить SEQ ID NO: 11. У даній заявці заявляється пріоритет відповідно до §119 (е) статті 35 Зводу Законів США, який відповідає пріоритету попередньої заявки США №60/529182, поданої 11 грудня 2003p., повністю включеної в даний опис за допомогою посилання. Даний винахід відноситься до галузі молекулярної біології рослин. Зокрема, він відноситься до трансгенної кукурудзи з підвищеним вмістом лізину, а також до аналізів та способів ідентифікації специфічної екзогенної ДНК, що забезпечує рослину підвищеним вмістом лізину. Кукурудза Zea mays широко використовується в приготуванні корму для тварин. Хлібні злаки, тобто зерно, є джерелами білка, крохмалю та жирів для свиней, великої рогатої худоби та домашньої птиці. З десяти амінокислот, які вважаються незамінними, лізин, треонін та метіонін містяться в кукурудзі в особливому дефіциті. Недолік вказаних амінокислот, особливо лізину, вимагає додавання вказаних поживних речовин в кормове зерно кукурудзи або кукурудзяне борошно, причому джерелом перших часто є соєве борошно. Таким чином, було б надзвичайно корисно підвищити вміст лізину в кукурудзяних зернах для збільшення поживності кукурудзяного зерна. Для підвищення вмісту лізину за допомогою молекулярно-біологічного підходу був ідентифікований і використаний нечутливий до дії механізмів зворотного зв'язку варіант принаймні одного з ферментів, що відносяться до зв'язаних з лізином метаболічних шляхів, а саме фермент дигідродипіколінатсинтаза (що згадується в даній заявці у вигляді абревіатури DHDPS). In vitro було показано, що ізольований з Е. соlі бактерійний ген DHDPS в 200 разів менш чутливий до інгібування, опосередкованого підвищенням рівня лізину, і надекспресія вказаного ферменту в тютюні за допомогою трансгеноза призводить до підвищення рівня лізину в тканині листя (Glassman et al., патент США 5288300). Falco із співавторами описали трансгенні рослини з підвищеним вмістом лізину в насінинах, а також гени, що використовуються для одержання подібних трансгенних рослин (патенти США 5773691 та 6459019; публікація патентної заявки США 2003/0056242, кожна з яких повністю включена в даний опис за допомогою посилання). У наведених повідомленнях Falco з колегами описали одержання нечутливого до дії механізмів зворотного зв'язку DHDPS з Е.соlі та DHDPS з Corynebacterium (також відомого як cordapA) і використання вказаного гена для одержання трансгенних насінин рапсу, тютюну, кукурудзи та сої з підвищеним вмістом лізину в насінині. Для зерен кукурудзи, трансформованих геном cordapA, Falco з колегами описали приблизно 130% збільшення вмісту вільного лізину в порівнянні з нетрансформованими зернами. У даному контексті може бути корисне виявлення присутності або відсутності специфічного трансгена в рослині або її насінині, або в потомстві таких рослин або насінин, причому не тільки відносно власне наявності трансгена, але також і відносно його місцеположення в геномі трансгенної рослини або її насінин. Надалі останнє забезпечує ідентифікацію «трансгенного Явища», за допомогою якого генний інженер вставив трансген в рослину-предок рослини або насінини. Даний винахід відноситься до конструкцій, які можуть бути використані для одержання трансгенних Явищ, а також до матеріалів та методів, які можуть бути використані для ідентифікації специфічних трансгенних Явищ, що призводять до одержання трансгенних рослин, що накопичують більші рівні лізину, ніж близькоспоріднені рослини, які не включили конструкцію. Зокрема, даний винахід відноситься до позбавленої маркера лінії трансгенної кукурудзи, яка містить визначену екзогенну ДНК, введену згідно зі стандартними протоколами трансформації кукурудзи (в даній заявці «Явище LY038»). Далі, даний винахід відноситься до способу виявлення присутності або відсутності Явища LY038 в ДНК, одержаної з кукурудзи. її насінин або зразків тканин. Кукурудза, що відноситься до даного винаходу, яка містить Явище LY038, містить підвищений рівень лізину в зернах в порівнянні з рослиною-предком або іншою близькоспорідненою рослиною. Крім того, даний винахід відноситься до екзогенної ДНК-конструкції, яка містить промотор глобуліну 1 кукурудзи, інтрон гена рисового актину 1, ДНК, кодуючу хлоропластний транзитний пептид кукурудзяної дигідродипіколінатсинтази, ДНК, кодуючу дигідродипіколінатсинтазу Corynebacterium та 3'-нетрансльовану ділянку гена глобуліну 1 кукурудзи, експресія яких в трансгенних рослинах та їх клітинах у вигляді вказаного ДНК-конструкта, в межах якого усі вищезазначені фрагменти ДНК оперативно зв'язані, призводить до підвищення вмісту лізину в зерні або його частинах, або в обробленому продукті, одержаному із зерна або рослин. В іншому втіленні, конструкція, крім вищепереліченого, містить loxсайт, введений як компонент механізму, що забезпечує видалення маркерного гена, що використо 5 вується для ідентифікації потрібних трансформантів. З точки зору ідентифікації рослин або насінин, одержаних внаслідок специфічного трансгенного перетворення, автори описують композиції та способи для виявлення ділянки геномної вставки в новому поколінні рослини кукурудзи, яка містить Явище LY038, тобто геномну ділянку, в якій локалізований вищеописаний конструкт. Винахід також відноситься до молекул ДНК, які містять як мінімум фрагмент вставленої в геном екзогенної ДНК і фрагмент ДНК генома кукурудзи, фланкуючий ділянку вставки (в даній заявці «послідовність ділянки з'єднання»). У ще одному втіленні, даний винахід відноситься до нових молекул ДНК, які містять як мінімум 20 пар нуклеотидів послідовності SEQ ID NO: 1 або 2, які містять пари нуклеотидів 1781-1782 або 200-201, відповідно. Далі, даний винахід відноситься до молекул ДНК, які містять послідовність ДНК амплікону SEQ ID NO: 6, одержаного шляхом ампліфікації ДНК за допомогою праймерів з послідовностями ДНК SEQ ID NO: 3 та 4; а також до гібридизаційного зонда, комплементарного вказаному амплікону, що має послідовність ДНК SEQ ID NO: 5 і комплементарну їй послідовність. Молекули ДНК, що мають послідовності SEQ ID NO: 5 або 6, покривають ділянку з'єднання між екзогенною ДНК та фланкуючим її фрагментом геномної ДНК кукурудзи і мають діагностичну цінність в плані можливості виявлення ДНК Явища LY038 при їх використанні у відповідних аналітичних тестах. Іншими переважними згідно з даним винаходом молекулами ДНК, що покривають ділянку з'єднання екзогенної ДНК/ділянку геномної вставки Явища LY038, є молекули, що мають послідовності ДНК SEQ ID NO: 1, 2 та 11, а також комплементарні їм. Стабільно трансформована кукурудза або її насінини являють собою інший аспект даного винаходу. Вираз «достатня довжина», що використовується в даній заявці щодо праймерів, означає, що дана довжина дозволяє праймеру функціонувати в реакції ПЛР і специфічно ампліфікувати цільову послідовність; достатньою є довжина приблизно від 11 нуклеотидів і більше, більш переважна довжина приблизно від 18 нуклеотидів і більше, ще більш переважна довжина приблизно від 24 нуклеотидів і більше, найбільш переважною є довжина приблизно від 30 нуклеотидів і більше, достатня для специфічної ампліфікації цільової послідовності. Фахівцеві в даній галузі повинне бути зрозуміло, що праймер, довжина якого перевищує 30 нуклеотидів, також може бути з успіхом використаний в реакції ПЛР і, відповідно, має достатню довжину. ПЛР-праймери, придатні для ідентифікації Явища LY038, включають в себе трансгенну частину послідовності ДНК SEQ ID NO: 1 достатньої довжини, а також 5'-фланкуючу послідовність ДНК кукурудзи SEQ ID NO: 1 достатньої довжини, або трансгенну частина послідовності ДНК SEQ ID NO: 2 достатньої довжини, а також З'-фланкуючу послідовність ДНК кукурудзи SEQ ID NO: 2 достатньої довжини. Дані праймери можуть бути використані 93654 6 в основаних на реакції ПЛР методах, які дозволяють одержати продукт ДНК-амплікону, що є діагностичним відносно Явища LY038 у рослини, а також у її потомства. ПЛР-праймери, гомологічні або комплементарні будь-якій послідовності підходящої довжини SEQ ID NO: 1 та 2, які можуть бути використані для одержання амплікону або зонда, яка є діагностичною відносно Явища LY038, являють собою ще один аспект даного винаходу. Наприклад, без обмеження, набір переважних праймерів, що є діагностичними відносно Явища LY038, включає в себе праймери, що містять як мінімум близько 18 суміжних нуклеотидів послідовностей, наведених в SEQ ID NO: 3 або 4. Амплікони, одержані за допомогою праймерів, що є діагностичними відносно Явища LY038 у рослини, а також у її потомства, являють собою аспект даного винаходу. Переважний амплікон, що є діагностичним відносно Явища LY038, має нуклеотидну послідовність, наведену в SEQ ID NO: 6. В іншому аспекті, даний винахід відноситься до способів виявлення присутності або відсутності ДНК, що відповідає Явищу LY038 в зразку. Такі способи включають в себе одержання ДНК з кукурудзи, її насінин або тканини, приведення ізольованої ДНК в контакт з набором ПЛР-праймерів, проведення реакції ПЛР та детектування присутності або відсутності амплікону. Набір переважних ПЛР-праймерів, що є діагностичними відносно Явища LY038, включає в себе праймери, які мають послідовності ДНК SEQ ID NO: 3 та 4, за допомогою яких одержують специфічний відносно Явища LY038 амплікон, що має послідовність ДНК, наприклад, SEQ ID NO:6, який може бути детектований за допомогою зонда, специфічного відносно Явища LY038, що має послідовність ДНК, наприклад, SEQ ID NO: 5. Гібридизація зонда, вказуючого на присутність Явища LY038, з ампліконом, який містить ДНК, специфічну відносно Явища LY038, може бути детектована будь-якими підходящими методами, відомими в сфері робіт з нуклеїновими кислотами, такими як TaqMan аналізи, Саузерн-блотінг та іншими, відомими фахівцям, які мають основні навички в галузі молекулярної біології. Фахівцеві в даній галузі повинне бути відомо, що виявлення амплікону може бути виконане з використанням методів, що не передбачають гібридизацію зонда з ампліконом, таких як електрофоретичні аналізи в агарозних та акриламідних гелях. Фахівцеві в даній галузі також повинне бути відомо, що довжина і послідовності як праймера, так і зонда можуть бути відмінні від наведених в послідовностях SEQ ID NO: 3, 4 та 5, і проте також успішно використовуватися для одержання амплікону або набору амплікону і зонда, що є діагностичними відносно Явища LY038. В іншому аспекті, даний винахід відноситься до способу одержання потомства рослин, що містять ДНК Явища LY038. Потомство рослин може бути інбредним або гібридним. Далі, даний винахід відноситься до виконання способу розведення, [що містить] ДНК Явища LY038, за допомогою маркерів. Згідно з іншим аспектом, даний винахід відноситься до стабільно трансформованої куку 7 рудзи, яка містить ДНК Явища LY038, а також підвищену кількість лізину в зерні або його частинах. Далі, даний винахід відноситься до набору для детектування ДНК, який містить, щонайменше, одну молекулу ДНК достатньої довжини, що складається з суміжних нуклеотидів, гомологічну або комплементарну послідовностям ДНК, наведеним в SEQ ID NO: 1 або 2, яка може функціонувати як ДНК-праймер або зонд, діагностичний відносно наявності Явища LY038 у рослини або її потомства. Далі, даний винахід відноситься до кукурудзи та її насінин з високим вмістом лізину (Zea mays) або до одержаних з них оброблених продуктів, які містять Явище LY038, і потомства одержаних з них рослин, що мають репрезентативні насінини, депоновані в АТСС під депозитним номером РТА5623. Крім цього, даний винахід також відноситься до кукурудзи або її частин, зокрема, наприклад, пилку або насінин, одержаних внаслідок вирощування рослин, що містять ДНК Явища LY038. Кукурудза або її насінини, які містять ДНК Явища LY038, для детектування LY038-специфічних послідовностей, в яких можуть бути використані молекули ДНК праймерів згідно з даним винаходом, становлять ще один аспект винаходу. Оброблений продукт Явища LY038 містить частину кукурудзяного зерна, наприклад, ендосперм. Кукурудзяний корм згідно з даним винаходом, який містить підвищений рівень лізину в порівнянні з іншими кукурудзяними кормами, які не містять трансгенної ДНК, може бути одержаний із зерен, що містять трансгенну молекулу ДНК LY03 8. Вищевикладені та інші аспекти даного винаходу стануть більш очевидними з нижченаведеного докладного опису, прикладів та супровідних фігур. Нижченаведені приклади включені, щоб продемонструвати приклади визначених переважних втілень даного винаходу. Фахівцям в даній галузі повинне бути зрозуміло, що розкриті в нижченаведених прикладах способи являють собою підходи, які, за даними авторів даної заявки, добре функціонують на практиці згідно з даним винаходом. Однак в світлі даного опису фахівцям в даній галузі також повинне бути зрозуміло, що специфічні втілення даного винаходу можуть зазнавати безліч різних змін, і проте призводити до подібних або схожих результатів, в рамках концепції та обсягу даного винаходу. На Фіг.1 зображена плазмідна карта pMON55221. На Фіг.2А зображена схема екзогенної ДНКвставки Явища LY038. Екзогенна ДНК і відповідні пари нуклеотидів виділені курсивом, геномна ДНК кукурудзи і відповідні пари нуклеотидів надруковані в звичайному шрифті. На Фіг.2В зображена послідовність 5'-кінця сайта з'єднання. На Фіг.2С зображена послідовність 3'-кінця сайта з'єднання. Молекули, що мають визначені послідовності і використовуються в контексті даного винаходу, наведені в списку послідовностей, поданому разом з даною заявкою. Далі йде короткий опис списку послідовностей 93654 8 SEQ ID NO: 1 являє собою полінуклеотидну послідовність 5' ДНК довжиною в 1961 пару нуклеотидів (п.н.), що містить фрагмент, відповідний геномній ДНК кукурудзи (п.н. 1-1781), фланкуючий 5'-кінець сайта вставки, і фрагмент трансгенної вставки ДНК Явища LY038 (п.н. 1782-1961). SEQ ID NO: 2 являє собою полінуклеотидну послідовність 3' ДНК довжиною в 867п.н., що містить геномний фрагмент кукурудзи (п.н. 201-867), фланкуючий 3і-кінець сайта вставки, і послідовність трансгенної вставки (п.н. 1-200) ДНК Явища LY038. SEQ ID NO: 3 та 4 являють собою полінуклеотидні послідовності ПЛР-праймерів, що використовуються для одержання амплікону, що є діагностичним відносно ДНК Явища LY038. SEQ ID NO: 5 являє собою полінуклеотидну послідовність олігонуклеотидного зонда, що використовується для детектування ДНК Явища LY038 за допомогою гібридизації з ампліконом. SEQ ID NO: 6 являє собою полінуклеотидну послідовність амплікону, діагностичного відносно ДНК Явища LY038. SEQ ID NO: 7 являє собою полінуклеотидну послідовність промотору глобуліну 1 кукурудзи (п.н. 48-1440; Kriz, Biochem. Genet., 27: 239-251, 1989; Belanger and Kriz, Genetics, 129: 863-872, 1991; патент США 6329574, повністю включений в дану заявку за допомогою посилання), інтрона гена рисового актину 1 (п.н. 1448-1928; McElroy et al., Plant Cell, 2: 163-171, 1990), хлоропластного транзитного пептиду DHDPS кукурудзи (п.н. 19302100; Frisch et al., Моl. Gen. Genet., 228: 287-293, 1991), гена DHDPS Corynebacterium (п.н. 21013003; Bonnassie et al., Nucleic Acids Research, 18: 6421, 1990); Richaud et al., J. Bacteriol., 166: 297300, 1986), 3'-нетрансльовану ділянку гена глобуліну 1 кукурудзи (п.н. 3080-4079; Belanger and Kriz, див. вище) та loxP-сайт (п.н. 4091-4124; Russell et al., Моl. Gen. Genet, 234: 45-59, 1992). SEQ ID NO: 8 являє собою полінуклеотидну послідовність гена DHDPS Corynebacterium (Bonnassie et al, Nucleic Acids Research, 18: 6421, 1990; Richaud et al., J. Bacteriol, 166: 297-300, 1986). SEQ ID NO: 9 являє собою полінуклеотидну послідовність в 1736п.н. додаткової геномної ДНК кукурудзи, фланкуючої 5'-кінець сайта вставки Явища LY038 (див. Фіг.2А). SEQ ID NO: 10 являє собою полінуклеотидну послідовність в 359п.н. додаткової геномної ДНК кукурудзи, фланкуючої 3'-кінець сайта вставки Явища LY038 (див. Фіг.2А). SEQ ID NO: 11 являє собою полінуклеотидну послідовність в 20п.н., що складається з 10 суміжних нуклеотидів трансгенної ДНК-вставки та 10 суміжних нуклеотидів геномної ДНК кукурудзи послідовності ділянки зчленування, як показано на Фіг.2С. Тут термін «екзогенна ДНК» відноситься до ДНК, яка звичайно (в природі) не зустрічається в даному конкретному конструкті, клітині або організмі. Екзогенна ДНК може включати в себе послідовність ДНК або РНК, нативну по відношенню до даного геному, однак яка має локалізацію, відмінну 9 від природної, або зв'язану з іншими елементами послідовності, в нормі не асоційованими з екзогенною ДНК в її нативному стані. Рекомбінантні ДНК-конструкти, що використовуються для трансформації клітин рослин, містять екзогенну ДНК і звичайно інші елементи, згідно з описаним нижче. Термін «трансген» відноситься тут до екзогенної ДНК, яка вбудована в геном хазяїна або здатної до автономної реплікації в клітинах-хазяїнах і забезпечує експресію одного або більше клітинних продуктів. Типові трансгени забезпечують клітинухазяїна або одержану з останньої рослину фенотипом, новим по відношенню до відповідних нетрансформованих клітин-попередників або рослин-попередників, або до відповідних трансформованих клітин або рослинпопередників, що містять інші трансгени, але не конкретний трансген, що розглядається. Трансгени можуть бути напряму введені в рослину шляхом генетичної трансформації або можуть бути успадковані від рослини будь-якої з попередніх поколінь, яка була трансформована екзогенною ДНК. Тут терміни «ген» або «кодуюча послідовність» відносяться до послідовності ДНК, з якої транскрибується молекула РНК. Молекулою РНК може бути мРНК, кодуюча білковий продукт, РНК, функціонуюча як антисмислова молекула, або структурна молекула РНК, така як тРНК, рРНК, snPHK або інші РНК. Термін «експресія» відноситься тут до комбінації внутрішньоклітинних процесів, включаючи транскрипцію і трансляцію, за допомогою яких молекула ДНК, така як ген, використовується для продукування поліпептиду або молекули РНК. Прикладом кодуючої послідовності є ген дигідродипіколінатсинтази Corynebacterium (DHDPS; Bonnassie et al., Nucleic Acids Research, 18: 6421, 1990; Richaud et al., J. Bacteriol., 166: 297300, 1986; п.н. 2101-3003 в послідовностях SEQ ID NO: 7 та 8), що використовується для одержання зерен кукурудзи з підвищеним вмістом лізину. Рослину кукурудзи, успішно трансформована та експресуюча ген DHDPS Corynebacterium, що призводить до підвищення вмісту лізину в тканині зерна, тут називають також «рослиною кукурудзи з високим вмістом лізину». Тут термін «промотор» відноситься до ділянки ДНК, необхідної для ініціація транскрипції ДНК, що призводить до утворення РНК, яка комплементарна транскрибованій ДНК; ці ділянки також називають «5'-регуляторними ділянками». Промотори локалізовані вище кодуючої послідовності, яка підлягає транскрипції, і містять ділянки, які служать як сайти зв'язування для РНК-полімерази, а також містять ділянки, взаємодіючі з іншими факторами для стимуляції транскрипції РНК. Рослинні промотори, що використовуються, включають в себе конститутивні, індуцибельні, тканиноспецифічні, регульовані у часі, циркадно-регульовані, індуковані посухою, стрес-індуцибельні, регульовані стадією онтогенезу, індуковані холодом, світлом тощо. Особливо важливим в контексті даного винаходу є ембріоспецифічний промотор, наприклад, без обмеження, промотор кукурудзяного глобуліну 1 (Kriz, Biochem. Genet., 27: 239-251, 93654 10 1989; Belanger and Kriz, Genetics, 129: 863-872, 1991; п.н. 48-1440 послідовності SEQ ID NO: 7). У даній галузі добре відомо, що рекомбінантні ДНК-конструкти, крім промотору, звичайно містять також і інші регуляторні елементи, такі як, без обмеження, З'-нетрансльовані ділянки (такі як сайти поліаденілювання або сигнали термінації транскрипції), ДНК, кодуючі транзитні або сигнальні пептиди, інтрони та маркерні елементи генів. У контексті даного винаходу може бути використана З'нетрансльована ділянка глобуліну 1 кукурудзи (3'UTR) (Kriz, Biochem. Genet., 27: 239-251, 1989; Belanger and Kriz, Genetics, 129: 863-872, 1991; п.н. 3080-4079 послідовності SEQ ID NO: 7). Прикладом транзитного пептиду може служити транзитний пептид DHDPS кукурудзи (Frisch et al, Моl. Gen. Genet., 228: 287-293, 1991; п.н. 1930-2100 послідовності SEQ ID NO: 7). Прикладом інтрона, який може бути використаний в контексті даного винаходу, є перший інтрон гена рисового актину 1 (McElroy et al., Plant Cell, 2: 163-171, 1990; п.н. 1448-1928 послідовності SEQ ID NO: 7). Тут термін «кукурудза» відноситься до Zea mays і включає в себе всі різновиди рослин, які можуть бути схрещені з кукурудзою, включаючи різновиди дикої кукурудзи. Способи та композиції для трансформації рослин шляхом введення екзогенної ДНК в рослинний геном в практиці даного винаходу можуть включати в себе будь-які способи та композиції, відомі і підтверджені в даній галузі. На сьогоднішній день існують два найбільш широко використовувані способи трансформації рослин - трансформація за допомогою мікрочастинок та опосередкована Agrobacterium трансформація. Трансформація за допомогою мікрочастинок являє собою доставку ДНК, іммобілізованої на мікрочастинках, які можуть бути доставлені в тканини-мішені різними способами. Agrobacteriumопосередкована трансформація передбачає використання генетично модифікованих ґрунтових бактерій, що належать роду Agrobacterium. Декілька видів Agrobacterium опосередковують перенесення специфічної ДНК, відомої як «Т-ДНК», яка може бути генетично модифікована таким чином, щоб доставляти будь-який бажаний фрагмент ДНК у безліч різних видів рослин. Переважними способами трансформації рослин є бомбардування мікрочастинками, як описано в патентах США 5015580; 5550318; 5538880; 6160208; 6399861 та 6403865; а також Agrobacterium-опосередкована трансформація, як описано в патентах США 5635055; 5824877; 5591616; 5981840; та 6384301, кожний з яких включений в дану заявку за допомогою посилання. Тут термін «трансгенний» відносно організму відноситься до організму, геном якого був змінений шляхом включення чужорідного генетичного матеріалу або додаткових копій нативного генетичного матеріалу, наприклад, шляхом трансформації або рекомбінації. Трансгенним організмом може бути рослина, ссавець, гриб, бактерія або вірус. Тут «трансгенна рослина» відноситься до стабільно трансформованої рослини або рослинипотомка останньої в будь-якому одержаному з неї подальшому поколінні, в якому ДНК рослини або її 11 потомка містить введену екзогенну ДНК, в нормі не присутню в нетрансгенних рослинах тієї ж лінії. Трансгенна рослина може додатково містити послідовності, які є нативними для рослини, що трансформується, але екзогенна ДНК яких змінена з метою зміни рівня або характеру експресії гена. Тут термін «стабільно» трансформована рослина відноситься до рослини, в якій екзогенна ДНК є успадкованою. Екзогенна ДНК може бути успадкованою, будучи представленою у вигляді внутрішньоклітинного фрагмента ДНК, не вбудованого в геном клітини-хазяїна. Переважно, щоб стабільно трансформована рослина містила екзогенну ДНК, вбудовану в хромосомну ДНК ядра, мітохондрій або хлоропластів, переважніше - в хромосомну ДНК ядра. Тут термін «трансгенна рослина R0» відноситься до рослин, які були безпосередньо трансформовані екзогенною ДНК, або були одержані з клітини або кластера клітин, які були трансформовані екзогенною ДНК. Термін «потомство», що використовується тут, відноситься до будь-якого подальшого покоління, включаючи рослини та їх насінини, одержаного з конкретної батьківської рослини або групи батьківських рослин; одержана лінія потомства може бути інбредною або гібридною. Потомство трансгенної рослини згідно з даним винаходом може бути, наприклад, піддане схрещуванню з представниками тієї ж лінії, з трансгенними або нетрансгенними рослинами і/або піддане зворотному схрещуванню. Насінини рослин згідно з винаходом можуть бути зібрані з трансгенних рослин, що сходять, і використані для вирощування потомствених поколінь рослин згідно з даним винаходом, зокрема гібридної лінії рослин, що містять екзогенну ДНК Явища LY038, що забезпечує підвищений вміст лізину в зернах кукурудзи. Кукурудзяні зерна можуть бути перероблені для приготування продуктів з кукурудзяного борошна і масла, або можуть бути використані як корм для тварин без додаткової обробки. Продукти, що містять борошно, зокрема, містять підвищений рівень лізину, що є агрономічною перевагою. Даний винахід відноситься до кукурудзяного корму, одержаного з сировини, що містить екзогенну ДНК Явища LY038, з підвищеним в порівнянні з іншими [сортами] кукурудзяного борошна вмістом лізину. Термін «ДНК Явища LY038» відноситься до сегмента ДНК, що містить екзогенну ДНК, вбудовану з визначеною локалізацією в геном з прилеглої фланкуючої геномної ДНК, яка згідно з очікуваннями повинна передаватися за спадщиною від рослини-попередника, що містить екзогенну ДНК, рослині-потомку. Конкретніше, ДНК Явища LY038 відноситься також до будь-якої з ділянок ДНК, що включають в себе місце стику геномної ДНК та екзогенної ДНК-вставки в геномній ДНК Roтрансформанта, наприклад, до ділянки, фланкуючої один з сайтів стику, де 5'-кінець належить геномній ДНК, а 3'-кінець - екзогенній ДНК. У доповнення до цього, послідовність екзогенної ДНК, що містить ДНК вказаного Явища, може змінюватися, зберігаючи, однак, локалізацію в геномі хазяїна, наприклад, частина послідовності може бути змі 93654 12 нена, делетована або ампліфікована, але проте повинна містити вказану екзогенну ДНК, що містить вказану ДНК вказаного Явища, в тій самій геномній локалізації. Трансгенне «Явище» продукується шляхом трансформації рослинної клітини екзогенним ДНКконструктом, подальшого одержання рослин, що містить вставлену в геном екзогенну ДНК, і селекції конкретних особин рослин, що характеризуються наявністю ДНК вказаного Явища. Звичайно трансформують цілий ряд рослин і одержують рослинну популяцію, з якої далі здійснюють селекцію конкретної рослини. Термін «Явище» відноситься до власне трансформантів R0, а також до потомства трансформантів, що включили екзогенну ДНК у визначений і єдиний сайт в геномі, тобто ДНК вказаного Явища. Термін «Явище» також відноситься до потомства, одержаного шляхом статевого ауткросингу, схрещування з особинами тієї ж лінії або послідовного зворотного схрещування, де, щонайменше, одна з рослин, що використовуються при виведенні, є представником будь-якого покоління, що походить з первинного трансформанта R0, який містить ДНК вказаного Явища. Таким чином, трансгенне «Явище» являє собою рослину, що містить і характеризується наявністю «ДНК вказаного Явища». Тобто «Явище LY038» включає в себе «ДНК Явища LY038». Рослина може містити дві або більше ДНК різних Явищ і, таким чином, містити два або більше Явищ. Крім того, рослина, позбавлена вказаного трансгенного Явища X, також не містить власне ДНК Явища X. ДНК вказаного Явища може передаватися від рослини до рослини, від покоління до покоління, при використанні будь-якої схеми виведення, способу або пристрою, відомого фахівцям в даній галузі. Звичайно трансформація рослин передбачає використання селективного маркера та способу селекції, щоб відрізнити трансформовані клітини культури від нетрансформованих. У ряді випадків селективний маркерний ген залишається в геномі трансгенної рослини; в інших випадках бажане видалення селективного маркера або інших послідовностей, введених в екзогенну ДНК. Гомологічна рекомбінація являє собою один із способів видалення маркерних генів з генома трансгенних рослин (патент США 6580019, повністю включений в дану заявку за допомогою посилання). Іншим способом видалення визначених послідовностей, що широко використовується, з генома рослин є використання сайт-специфічних рекомбіназ і відповідних ним специфічних сайтів-мішеней. Цілий ряд різних сайт-специфічних систем рекомбіназ може бути використаний відповідно до даного винаходу, зокрема і, без обмеження, система Cre/lox бактеріофага Р1 та дріжджова система FLP/FRT. Система Cre/lox бактеріофага Р1 і система FLP/FRT дріжджів є двома особливо часто використовуваними системами для сайтспецифічної інтеграції або виключення трансгенів. У вищезгаданих системах рекомбіназа (Сrе або FLP) специфічно взаємодіє з відповідними їй рекомбінаційними послідовностями (Іох або FRT, відповідно), що призводить до інвертування або 13 вирізування укладених між рекомбінаційними сайтами послідовностей. Послідовності ДНК рекомбінаційних сайтів для обох систем відносно короткі (34п.н. для Іох та 47п.н. для FRT), і, отже, зручні для використання з трансформаційними векторами. Була показана ефективність функціонування FLP/FRT та Cre/lox систем в рослинних клітинах. У переважному втіленні, Cre/lox рекомбіназна система використовується для видалення послідовностей селективних маркерів, зокрема, маркерного гена NPTII (див. Фіг.1), фланкованого рекомбінаційними сайтами ΙοxΡ (п.н. 4091-4124 послідовності SEQ ID NO: 7; Russell et al., Моl. Gen. Genet., 234: 45-59, 1992). Трансгенна рослина, насінини або їх частини, що виявляють підвищений рівень бажаного параметра, наприклад, підвищений вміст лізину, являють собою рослини, які містять екзогенну ДНК, що наділяє їх бажаною, вимірюваною зміною того або іншого параметра в порівнянні з рослинами в цілому того ж генотипу, однак позбавленими бажаної екзогенної ДНК. Переважно, коли підвищення рівня бажаного параметра може бути виміряне шляхом зіставлення цих параметрів в трансгенних рослинах, що містять екзогенну ДНК, асоційовану з придбанням підвищеного рівня бажаного параметра, і в рослинах в цілому того ж генотипу, але позбавлених трансгенної ДНК. Подібними рослинами, позбавленими екзогенної ДНК, можуть бути рослини дикого типу або трансгенні рослини, переважно того ж виду, що і трансгенна рослина. Переважно, якщо рослина, позбавлена екзогенної ДНК, являє собою позбавлену екзогенної ДНК рослину-сиблінга, що містить бажану екзогенну ДНК. Подібна рослина-сиблінг може містити інші екзогенні ДНК. Підвищений рівень лізину може бути досягнутий за рахунок накопичення підвищених кількостей амінокислоти в зерні і може бути виміряний за допомогою будь-яких підходящих методів, таких як мас-спектрометрія або високоефективна рідинна хроматографія підходящого тканинного екстракту. Тут термін «зонд» відноситься до виділеного олігонуклеотиду, до якого може бути тим або іншим чином прикріплена детектована мітка або репортерна молекула, наприклад, радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний агент, барвник або фермент. Такий зонд комплементарний одному з ланцюгів нуклеїнової кислоти-мішені. У випадку, що відноситься до даного винаходу, такий зонд комплементарний одному з ланцюгів геномної ДНК Явища LY038, наприклад, геномної ДНК з кукурудзи, її насінини або інших частин рослини LY038. Згідно з даним винаходом, зонди являють собою речовини, зокрема ДНК, РНК та поліаміди, які специфічно зв'язуються з послідовністю ДНКмішені і можуть бути використані для виявлення присутності послідовності ДНК-мішені. «Праймери» являють собою виділені олігонуклеотиди, здатні до відпалу на комплементарному їм ланцюзі ДНК-мішені шляхом гібридизації нуклеїнових кислот і далі до елонгації вздовж ланцюга ДНК-мішені за допомогою полімерази, наприклад. ДНК-полімерази. Праймери згідно з даним винаходом використовуються для ампліфікації ДНК 93654 14 мішені за допомогою, наприклад, полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і можуть бути також названі «ПЛР-прайм ерами». Зонди та праймери мають довжину нуклеотидної послідовності, достатню для того, щоб специфічно зв'язуватися з послідовністю ДНК-мішені в умовах гібридизації або умовах реакції, що визначаються фахівцем. Ця довжина може бути будьякою довжиною, достатньою для успішного використання у вибраному методі детектування. Звичайно вона становить довжину приблизно від 11 нуклеотидів і більше, більш переважна довжина приблизно від 18 нуклеотидів і більше, ще більш переважна довжина приблизно від 24 нуклеотидів і більше, найбільш переважною є довжина приблизно від 30 нуклеотидів і більше. Подібні зонди і праймери специфічно гібридизуються з послідовністю-мішенню. Переважно, щоб зонди і праймери згідно з даним винаходом мали повну схожість суміжних нуклеотидів між послідовністю ДНК і послідовністю-мішенню, хоча зонди, які відрізняються від послідовності ДНК-мішені, але зберігають здатність гібридизуватися з послідовністю ДНКмішені, можуть бути одержані стандартними способами. Способи одержання та використання зондів і праймерів відомі фахівцям в даній галузі, і відповідні протоколи, які можуть бути використані в контексті даного винаходу, викладені, наприклад, в книзі Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, тощо. Ідентифікація фланкуючих послідовностей геномної ДНК, що оточують сайт вставки трансгенного Явища, дозволяє створювати способи детектування, специфічні для даного трансгенного Явища, вбудованого у визначений сайт в геномі. Такий спосіб детектування, який дає можливість розрізнювати ідентичні і схожі трансгени, локалізовані в різних сайтах генома, називають способом детектування ДНК, специфічним для даного Явища, наприклад, аналізом, специфічним до даного Явища. Подібні аналізи описані - наприклад, Явище 603 для кукурудзи, стійкої до гліфосфату (публікація патентної заявки США 2002/0013960, повністю включена в дану заявку за допомогою посилання). У переважному втіленні, нуклеїнова кислотазонд згідно з даним винаходом специфічно гібридизується зі специфічним відносно Явища LY038 ампліконом, що має будь-яку з нуклеотидних послідовностей, наведених в SEQ ID NO: 3-6 або комплементарних їм, найбільш переважною є послідовність SEQ ID NO: 5 або комплементарна їй. В іншому аспекті даного винаходу переважна нуклеїнова кислота-зонд згідно з даним винаходом на 80%, переважніше, на 90%, переважніше, на 95%, ще переважніше, на 98%, і найбільш переважно, на 99% ідентична послідовності, наведеній в одній або більше з SEQ ID NO: 3-6 або комплементарних останнім послідовностям або фрагментам вищепереліченого. Прикладом зонда, специфічного відносно Явища LY038, є зонд, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 6. Подібні молекулярні зонди можуть бути використані фахівцями в даній галузі як маркери для ідентифікації потом 15 ства, одержаного в результаті генетичних схрещувань в ході виведення. Гібридизація зонда з послідовністю ДНК-мішені може бути виявлена будьяким з методів, відомих фахівцям в даній галузі. Подібні методи детектування включають в себе, без обмеження, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіл, а також хемілюмінесцентні мітки. Термін «гомологічний», що використовується в даній заявці, відноситься до послідовності нуклеїнової кислоти, що специфічно гібридизується в умовах високої жорсткості з послідовністю, комплементарною послідовності нуклеїнової кислоти, з якою порівнюють первинну ДНК. Підходящі умови жорсткості, зокрема час, температура і сольовий склад, при яких відбувається гібридизація ДНК, відомі фахівцям в даній галузі. Можна варіювати і температуру, і сольовий склад, або ж або температура, або сольовий склад можуть бути постійними, тоді як інші параметри можуть змінюватися. У переважному втіленні даного винаходу полінуклеїнова кислота згідно з винаходом специфічно гібридизується в умовах жорсткості, що варіюють від жорстких до помірних, з однією або більше молекулами нуклеїнових кислот, відповідними SEQ ID NO: 1 або 2 або послідовностями, комплементарними їм, або послідовностями фрагментів вищепереліченого. Гібридизація зонда з послідовністю ДНК-мішені може бути виявлена будь-яким з методів, відомих фахівцям. Подібні способи детектування включають в себе, без обмеження, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіл, а також хемілюмінесцентні мітки. Тут термін «амплікон» відноситься до продуктів ДНК-ампліфікації послідовності-мішені, що є частиною матричної нуклеїнової кислоти. Наприклад, для визначення того, чи містить одержана внаслідок статевого схрещування рослина (кукурудза) ДНК Явища LY038, одержану від рослини, що містить екзогенну ДНК LY038, ДНК, екстраговану з рослинних тканин, можна піддати методу ДНК-ампліфікації з використанням пари праймерів, що включає перший праймер, одержаний з фланкуючої послідовності геномної ДНК, прилеглої до сайту вставки гетерологічної ДНК, і другий праймер, одержаний з гетерологічної ДНК-вставки, внаслідок чого синтезується амплікон, що є діагностичним для ДНК даного Явища. Довжина і нуклеотидна послідовність одержаного амплікону також є діагностичною для даного Явища. Довжина амплікону може варіювати від суми довжин праймерів плюс одна пара нуклеотидів, переважно плюс близько 20 пар нуклеотидів, переважніше, плюс близько 50 пар нуклеотидів, ще переважніше, плюс близько 50 пар нуклеотидів, найбільш переважно, плюс 150 пар нуклеотидів і більше, залежно від методу, що застосовується для детектування амплікону. Як альтернатива, обидва праймера в парі можуть бути одержані з послідовностей, фланкуючих ДНК-вставку, таким чином, що одержаний внаслідок застосування цих праймерів амплікон буде включати в себе всю ДНКвставку цілком. Будь-який праймер з пари може бути одержаний з послідовності геномної ДНК ро 93654 16 слини, локалізованої на деякій відстані від послідовності ДНК-вставки. Дана відстань може варіювати від однієї пари нуклеотидних основ до довжини, що визначається обмеженнями самої реакції ампліфікації, тобто близько 20000 пар нуклеотидних основ. Використання терміну «амплікон» специфічно виключає димери праймерів, які можуть утворюватися в ході температурної реакції ампліфікації. Ампліфікація нуклеїнової кислоти може бути виконана за допомогою будь-якого з методів ампліфікації нуклеїнової кислоти, відомих в даній галузі, зокрема за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Послідовність гетерологічної ДНК-вставки або фланкуюча послідовність ДНК з Явища LY038 може бути вивірена (і при необхідності скоректована) шляхом ампліфікації подібних послідовностей на матриці ДНК, екстрагованій з депонованих в АТСС під номером доступу РТА5623 насінин або рослин за допомогою ДНКпраймерів, одержаних з представлених в даному винаході послідовностей, з подальшим ДНКсеквенуванням одержаного ПЛР-амплікону або клонованої ДНК. Розкриті в даному винаході праймери і зонди на основі послідовностей ДНК-вставки і фланкуючих її послідовностей, можуть бути використані для підтвердження (і, за потреби, коректування) також розкритих в даному винаході послідовностей ДНК рутинними методами, такими як повторне клонування та секвенування подібних молекул ДНК. Амплікони, одержані різними способами ампліфікації, можуть бути детектовані безліччю методів, таких як, без обмеження, гельелектрофоретичні методи, «genetic ЬіЇ»-аналіз (Nikiforov et al., Nucleic Acid Res., 22: 4167-4175, 1994), піросеквенування (Winge, M., Pyrosequencing - a new approach to DNA analysis, (2000), Innovations in Pharmaceutical Technology, vol 00, 4, p 18-24), флуоресцентна поляризація (Chen et al., Genome Res., 9: 492-498, 1999) та «molecular beacons»-технологія (Tyangi et al., Nature Biotech., 14: 303-308, 1996). Особливий інтерес в контексті даного винаходу являє собою детектування шляхом Tagman®aнaлiзy (Applied Biosystems, Foster City, California). Taqman-аналіз являє собою добре відомий в даній галузі метод детектування і кількісного визначення послідовності ДНК і повністю описаний в інструкціях виробника. Даний метод передбачає проведення ПЛР-ампліфікації і детектування продукту ампліфікації за допомогою спеціальних олігонуклеотидних FRET-зондів. Олігонуклеотидні FRET-зонди містять 5'-флуоресцентний репортер і 3'-гаситель флуоресценції (квенчер), ковалентно зв'язані з 5'- та 3'-кінцями олігонуклеотидного зонда. Дизайн зонда проводиться таким чином, щоб він покривав сайт з'єднання геномної ДНК та трансгенної ДНК-вставки. FRET-зонд та ПЛР-праймери (один праймер, специфічний відносно послідовності екзогенної ДНК, інший праймер -специфічний відносно фланкуючої геномної послідовності) вводять в циклічну температурну взаємодію в присутності термостабільної полімерази та dNTP. Гібри 17 дизація FRET-зонда призводить до відділення флуоресцентного фрагмента від фрагмента квенчера флуоресценції на FRET-зонді. Флуоресцентний сигнал вказує на наявність послідовності трансгенної ДНК-вставки/фланкуючої вставку послідовності, успішно синтезованих в результаті ампліфікації та гібридизації. Дизайн переважних для Taqman-аналізу ПЛРпраймерів створюють таким чином, щоб (а) одержані праймери мали довжину 18-25 нуклеотидів і підходящі послідовності в трансгенній вставці та фланкуючій вставку геномній ДНК, (b) розрахована температура плавлення одержаних праймерів становила приблизно 57-60°С, тобто відповідала б оптимальній температурі відпалу праймерів в реакції ПЛР (приблизно 52-55°С), і (с) продукт, одержаний внаслідок застосування даних праймерів, включав в себе ділянку з'єднання між трансгенною ДНК-вставкою і фланкуючою її геномною послідовністю, і довжина одержаного продукту становила приблизно 75-250п.н. Переважною локалізацією ПЛР-праймерів є така локалізація, при якій послідовність ділянки з'єднання відстоїть як мінімум на одну основу від 3'-кінця кожного з ПЛР-праймерів. Праймери не повинні містити ділянок само- або інтеркомплементарності. Дизайн FRET-зондів створюють таким чином, щоб останні покривали послідовність ділянки з'єднання. У переважному втіленні, FRET-зонди містять на 3'-кінці хімічний фрагмент, який в процесі відпалу зонда на матричній ДНК зв'язується з малою борозенкою ДНК, збільшуючи тим самим стабільність комплексу зонд-матриця. Переважно зонди мають довжину приблизно 12-17 основ, містять 3'-фрагмент, що зв'язується з малою борозенкою ДНК, і розрахована температура плавлення на 5-7°С перевищує температури плавлення ПЛРпраймерів. Дизайн зондів описаний в патентах США 5538848; 6084102 та 6127121. Іншим аналізом з використанням послідовності згідно з винаходом є аналіз на зиготність. Аналіз на зиготність може бути застосований для визначення того, чи є рослина, що містить дане Явище, гомозиготною за ДНК даного Явища, тобто такою, що містить екзогенну ДНК в одному і тому ж положенні на обох хромосомах, або гетерозиготною за ДНК даного Явища, тобто такою, що містить екзогенну ДНК тільки на одній з двох хромосом. В одному з втілень, для цих цілей може бути застосований трьохпраймерний аналіз, в якому праймер 1 гібридизується і починає елонгацію ланцюга з екзогенної ДНК-вставки, праймер 2 гібридизується і починає елонгацію ланцюга з геномної ДНК, фланкуючої екзогенну ДНК-вставку з 5'-кінця, а праймер 3 гібридизується і починає елонгацію ланцюга з геномної ДНК, фланкуючої екзогенну ДНК-вставку з 3'-кінця. Вказана трійка праймерів є діагностичною відносно даного Явища. У типовому випадку екзогенна ДНК має такий розмір, наприклад, приблизно 3-7 тисяч пар нуклеотидів або більше, що праймери 1 та 3 більше не продукують амплікон в реакції ПЛР. У тому випадку, якщо всі три праймера змішані в складі реакції ПЛР, що використовує як матрицю ДНК, виділену з рослини, гомозиготної за даним Явищем, праймери 1 та 2 продукують 93654 18 єдиний амплікон, розмір і нуклеотидна послідовність якого є індикаторними і діагностичними відносно ДНК даного Явища. У тому випадку, якщо всі три праймера змішані в складі реакції ПЛР, що використовує як матрицю ДНК, виділену з рослини, що не містить даного Явища, праймери 1 та 3 продукують єдиний амплікон, розмір і нуклеотидна послідовність якого є індикаторними і діагностичними для геномної ДНК кукурудзи, позбавленої екзогенної ДНК. У тому випадку, якщо всі три праймера змішані в складі реакції ПЛР, що використовує як матрицю ДНК, виділену з рослини, гетерозиготної за даним Явищем, продукуються два амплікони: 1) амплікон, що продукується праймерами 1 та 3, розмір і нуклеотидна послідовність якого є індикаторними і діагностичними для геномної ДНК кукурудзи, позбавленої екзогенної ДНК, і 2) амплікон, що продукується праймерами 1 та 2, розмір і нуклеотидна послідовність якого є індикаторними і діагностичними для ДНК даного Явища. Способи детектування різних ампліконів, що продукуються в аналізі на зиготність, добре відомі фахівцям в даній галузі і включають в себе, без обмеження, гель-електрофорез, TaqManoаналіз, Саузерн-блотінг, «іnvаdеr»-технологію, секвенування, «molecular bеасоns»-технологію, піросеквенування тощо. Розкриті в даний заявці композиції і широко відомі методи детектування ДНК можуть бути використані для розробки наборів для детектування ДНК. Дані набори можуть бути використані для визначення наявності ДНК Явища LY038 в зразку, а також використані в технологіях виведення кукурудзи, що містить ДНК Явища LY038. Подібні набори включають в себе послідовності ДНК, які можуть бути використані як праймери або зонди, і які гомологічні або комплементарні будь-яким фрагментам послідовностей SEQ ID NO: 1 або 2 або послідовностям ДНК, гомологічним або комплементарним ДНК, що міститься в будь-якому з трансгенних генетичних елементів pMON55221 (Фіг.1), вбудованих в геном кукурудзи, результатом чого є Явище LY038 (Фіг.2). Вказані послідовності ДНК можуть бути використані в методах ДНКампліфікації (ПЛР) або як зонди в методах гібридизації полінуклеїнових кислот, тобто Саузернабо Нозерн-блотінгу. Молекула ДНК (SEQ ID NO: 7), що міститься в геномі Явища LY038, містить гетерологічні трансгенні генетичні елементи, що включають в себе промотор глобуліну 1 кукурудзи (P-ZM globl), інтрон гена рисового актину 1 (I-Os actin), ДНК, кодуючу хлоропластний транзитний пептид кукурудзяної дигідродипіколінатсинтази (Zm DHDPS СТР), ДНК, кодуючу дигідродипіколінатсинтазу (DHDPS) Corynebacterium, 3'нетрансльовану ділянку гена глобуліну 1 кукурудзи (T-Zm globl) і loxP-сайт, і може бути використана або як матриця для ДНК-ампліфікації, або для селекції гомологічних або комплементарних молекул ДНК, які можуть бути використані як ДНКпраймер або зонд в методах детектування ДНК. Фахівець в галузі детектування ДНК повинен змогти вибрати одну або декілька молекул ДНК, гомологічних або комплементарних трансгенній ДНК послідовності SEQ ID NO: 7, які далі можуть бути 19 використані для детектування трасгенної ДНК в геномі LY038 і потомства даної рослини. Нижченаведені приклади включені для демонстрації визначених переважних втілень даного винаходу. Фахівцям в даній галузі повинне бути зрозуміло, що розкриті в нижченаведених прикладах методи являють собою підходи, які, за даними авторів даної заявки, добре функціонують на практиці згідно з даним винаходом і можуть, таким чином, служити прикладами переважних образів в практиці згідно з винаходом. Однак в світлі даного розкриття фахівцям в даній галузі також повинне бути зрозуміло, що специфічні втілення даного розкриття можуть зазнавати безліч різних змін, і проте призводити до подібних або схожих результатів, не виходячи за рамки концепції і в рамках обсягу даного винаходу. Приклад 1 Одержання трансгенних рослин Незрілі ембріони лінії кукурудзи Н99 були ізольовані для трансформації. Касетна ДНК, одержана з вектора pMON55221 (див. Фіг.1), який містить промотор глобуліну 1 кукурудзи (Kriz (1989), див. вище; Belanger and Kriz (1991), див. вище; патент США No. 6329574, повністю включений в дану заявку за допомогою посилання; п.н. 48-1440 послідовності SEQ ID NO: 7), інтрон гена рисового актину 1 (McElroy et al. (1990), див. вище; п.н. 14481928 послідовності SEQ ID NO: 7), ДНК, кодуючу хлоропластний транзитний пептид кукурудзяної DHDPS (Frisch et al. (1991), див. вище; п.н. 19302100 послідовності SEQ ID NO: 7), ДНК, кодуючу дигідродипіколінатсинтазу Corynebacterium (Bonnassie et al. (1990), див. вище; Richaud et al. (1986), див. вище; п.н. 2101-3003 послідовності SEQ ID NO: 7), 3'-нетрансльована ділянка гена глобуліну 1 кукурудзи (Belanger and Kriz (1991), див. вище; п.н. 3080-4079 послідовності SEQ ID NO: 7), loxP-сайт (патент США 5658772, зокрема, повністю включений в дану заявку за допомогою посилання; п.н. 4091-4124 послідовності SEQ ID NO: 7), а також 35S-npoMOTop (Kay et al., Science, 236: 1299-1302, 1987; патент США 5164316), ДНК, кодуючу селективний маркер NPTII (Potrykus et al. (1985), див. вище), 3'UTR без вказівки джерела (Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 80: 4803-4807 (1983), див. вище) і loxP-сайт (патент США 5658772, зокрема, повністю включений в дану заявку за допомогою посилання), була іммобілізована на частинках золота. Для доставки екзогенної ДНК в незрілі кукурудзяні ембріони використали бомбардування мікрочастинками за допомогою методів, відомих фахівцям в даній галузі. Селекцію трансформантів проводили згідно з методикою канаміцинової селекції. За допомогою канаміцин-резистентних calli за стандартними методами одержували декілька фертильних трансгенних рослин R0. Приклад 2 Розведення та аналіз на вміст лізину У таблиці 1 підсумовувані дані за схемою розведення та вмісту вільного лізину, використані в одержанні Явища LY038 кукурудзи, зерна якої мають підвищений вміст лізину. Рослини, одержані шляхом описаного в прикладі 1 методу трансфор 93654 20 мації, спочатку піддавали скринінгу на предмет присутності/відсутності послідовності DHDPS Corynebacterium за допомогою ПЛР. Для визначення кількості копій трансгенних вставок використали Taqman-аналіз. Рослини, що містять послідовність ДНК DHDPS Corynebacterium, оперативно зв'язану, згідно з описаним в прикладі 1 і проілюстрованим на Фіг.1, дозрівали, після чого з них одержували насінини F1A. Для одержання насінин F1A первинні трансгенні рослини R0 схрещували з елітною нетрансгенною інбредною лінією кукурудзи. Рослини F1A піддавали скринінгу на предмет присутності/відсутності послідовності NPTII за допомогою тесту на канаміцинову резистентність, який передбачає наявність кількості канаміцину в ґрунті, що оцінюється. Нечутливість до канаміцину була індикатором того, що рослина містить та експресує маркерний ген NPTII згідно з проілюстрованим на Фіг.1 та описаним в прикладі 1; далі ці рослини іменуються також NPTII+. NPTII+ рослини схрещували з трансгенною лінією кукурудзи, що експресує бактерійну Creрекомбіназу, внаслідок чого одержували насінини F1B. Далі автори визначали вміст вільного лізину в пробах із зерен F1B, зібраних з кожного з качанів. Сиблінгові насінини F1B, що містили більше 1000ррm вільного лізину, далі висаджували в ґрунт. Рослини F1B-потомства аналізували за допомогою ПЛР і/або Саузерн-блотінгу на присутність/відсутність послідовності гена DHDPS, кодуючої послідовності Cre-рекомбінази та послідовності маркерного селективного гена NPTII. Маркерний селективний ген NPTII в трансгенній конструкції згідно з винаходом фланкований loxPсайтами (рекомбінаційними сайтами), і, таким чином, дія Cre-рекомбінази на подібні рослини полягає у вирізуванні кодуючої NPTII з генома. Далі рослини, що містять послідовності DHDPS та Creрекомбінази, але позбавлені послідовностей NPTII, що далі іменуються рослинами з вирізаною маркерною послідовністю, самозапилювалися, результатом чого було одержання насінин F2A. Далі автори визначали вміст вільного лізину в позитивних та негативних насінинах F2A. Після одержання насінин F2A, які містять представляючий інтерес ген DHDPS і не містять селективного маркерного гена NPTII, було необхідно позбутися послідовностей Cre-рекомбінази. Насінини F2A, одержані з рослин з вирізаною маркерною послідовністю, були висаджені в ґрунт і ще раз проаналізовані за допомогою ПЛР і/або Саузерн-блотінгу для визначення наявності/відсутності послідовності гена DHDPS, кодуючої послідовності Cre-рекомбінази і послідовності селективного маркерного гена NPTII. Рослини, що містять послідовність DHDPS, але позбавлені послідовностей Cre-рекомбінази та NPTII, були відібрані як «позитивні» рослини. Рослини-сиблінги, позбавлені DHDPS, Cre-рекомбінази і NPTII. були відібрані як «негативні» і служили як негативний контроль. Далі рослини, що містять послідовність DHDPS, самозапилювалися, результатом чого було одержання насінин F3, які далі розсаджували в грунт для одержання наступного покоління рослин. Точно так само негативні рослини, позбавлені 21 DHDPS, Cre-рекомбінази та NPTII, самозапилювалися, результатом чого було одержання насінин F3. Далі автори визначали рівень вільного лізину в позитивних та негативних насінинах F3. Позитивні рослини вирощували в ґрунті з насінин F3. Одна рослина, що була, за даними Таgman®-аналізу, гомозиготною, була вибрана і названа LY038. Рослини F3 або А) самозапилювалися, результатом чого було одержання качанів F438, або В) зазнавали схрещування з інбредною лінією, результатом чого було одержання качанів F1-38A, які відповідали як позитивній, так і негативній селекціям. Визначали рівень вільного лізину в позитивних та негативних насінинах F4-38. Насінини F1-38A Явища LY038 ростили в ґрунті, після чого одержані рослини самозапилювалися, результатом чого було одержання насінин F2B, в яких далі визначали рівень лізину. Насінини F4-38 Явища LY038 ростили в ґрунті, одержували рослини F4-38, які далі або А) самозапилювалися, результатом чого було одержання насінин F5-38, або В) зазнавали схрещування з інбредною лінією, результатом чого було одержання гібридних насінин F1-38B, які далі використали для агрономічної оцінки. Насінини F5-38 Явища LY038 ростили в ґрунті, одержували рослини F5-38, які далі або А) самозапилювалися, результатом чого було одержання насінин F6-38, або В) зазнавали схрещування з різновидом інбредною лінії кукурудзи з одержанням додаткових гібридних насінин F2C для додаткової агрономічної оцінки. Депоновані в Monsanto Company зразки насінин кукурудзи розкритого вище Явища LY038 були одержані шляхом самозапилювання рослин F5-38, результатом якого було одержання насінин F6-38, і самозапилювання рослин F6-38, результатом якого було одержання насінин F7-38. Депозитний номер Явища LYO38 в Американській колекції типових культур (Manassas, VA) - РТА-5623. Накопичення вільного лізину досліджувалося в динаміці по ходу одержання кукурудзяних ліній Явища LY038. Сумарні дані з накопичення лізину наведені в таблиці 1 і являють собою кількість вільного лізину в зрілому зерні в частинах на мільйон (суха вага). 93654 22 Для дослідження вмісту лізину в зрілих зернах, які містять Явище LY038, можна використати різні методи. Автори даного винаходу передбачають, що інші відомі в даній галузі методи, що дозволяють виявляти і кількісно оцінювати вміст лізину, також повинні виявляти підвищений вміст лізину в насінинах LY038. Для аналізу вмісту вільного лізину в кукурудзяних зернах Явища LY038 автори застосовували рідинну хроматографію-масспектрофотометрію/мас-спектрофотометрію (LCMS/MS). Зразки окремих зрілих зерен кукурудзи Явища LY038 зважували, розтирали в тонку гомогенну пудру та екстрагували екстракційним розчином, що містить метанол, воду та мурашину кислоту. У випадку масивних зерен брали близько 30мг розмолотого порошку. Для відділення лізину в екстракті зразка застосовували рідинну хроматографію і технологію MRM (multiple-reactionmonitoring) мас-спектрометрії. Після відділення вміст лізину визначали, виходячи з відповідного піка в масі-спектрі і стандартної калібрувальної кривої, одержаної за допомогою дейтерованого d4лізину як внутрішнього стандарту (IS). При використанні іншого способу вміст лізину в зернах кукурудзи оцінювали шляхом дослідження вільних амінокислот методом високоефективної рідинної хроматографії (HPLC). Окремі зерна кукурудзи або пули зерен Явища LY038 розтирали в тонку гомогенну пудру згідно з вищеописаним і також використовували для подальшого аналізу приблизно 30мг порошку. Амінокислоти екстрагували 5% трихлороцтовою кислотою, після чого виконували перед-колонкову модифікацію первинних аміногруп о-фтальальдегідом (ΟΡΑ). Одержані амінокислотні адукт-ізоіндоли є гідрофобними і мають прекрасні флуоресцентні характеристики, відповідно до чого можуть бути детектовані за допомогою детектора флуоресценції. При використанні хроматографії із оберненою фазою розділення досягається за рахунок гідрофобності Rгруп в кожній з амінокислот. Для стабілізації флуорофору додають тіоли, такі як 2-меркаптоетанол (SHCH2CH2OH) або 3-меркаптопропіонова кислота (SHCH2CH2COOH). 23 93654 24 25 В результаті проведення описаних експериментів було показано, що збільшення вмісту вільного лізину в зернах кукурудзи, які містять конструкт LY038, становить приблизно від 200% (наприклад, F1B) приблизно до 300% (наприклад, F1A). Спостерігали також проміжне підвищення рівня вільного лізину (наприклад, F1-28A). Приклад 3 Визначення фланкуючої послідовності Геномну ДНК виділяли з рослин кукурудзи LY038 і використовували в експериментах для визначення геномної послідовності кукурудзи, фланкуючої трансгенну ДНК-вставку. Для визначення фланкуючих послідовностей і послідовностей ділянок з'єднання геномної та трансгенної ДНК були використані три методи: «tail»-ПЛР, набір Genome WalkerTM від ClonTech (каталожний номер K1807-1, ClonTech Laboratories, Palo Alto, California) та інвертована ПЛР. «tаіl»-ПЛР являє собою метод одержання послідовності геномної ДНК, фланкуючої відому послідовність-вставку, який характеризується використанням вироджених праймерів і стадією біотинового захоплення. При проведенні первин 93654 26 ної ПЛР використовується набір, що складається з праймера, комплементарного екзогенній ДНК, і різних вироджених праймерів. У типовому випадку праймери, комплементарні екзогенній ДНК, і вироджені праймери використовуються попарно, але не у вигляді пулу. Вироджені праймери з деякою ефективністю гібридизуються з послідовністю геномної ДНК кукурудзи, фланкуючої ДНК вставки, що призводить до синтезу ПЛР-ампліконів. Первинні ПЛР-амплікони змішують і випалюють з міченим біотином праймером, комплементарним трансгенній частині амплікону. Амплікони, гібридизовані з міченими біотином праймерами, захоплюють стрептавідином, після чого відмивають амплікони, що не зв'язалися. Одержані амплікони зазнають вторинної реакції ПЛР з використанням «гніздового» праймера, комплементарного трансгенній частині ДНК амплікону, і ряду вироджених праймерів. ПЛР-амплікони, синтезовані у вторинній ПЛР, піддавали електрофорезу в агарозному гелі, смужки вирізали та ізолювали. Ізольовані ПЛР-амплікони секвенували. Послідовність 3'фланкуючої геномної ДНК Явища LY038 була іде 27 нтифікована за допомогою «tail»-ПЛР і секвенована. Метод «прогулянки по геному» (набір Genome Walker) був відтворений згідно з інструкціями і в умовах, рекомендованих виробником. Як «tаіl»ПЛР, так і набір Genome Walker були використані для ідентифікації послідовності 5'-фланкуючої ДНК Явища LY038. При використанні набору Genome Walker продукти Scal-опосередкованої рестрикції були ампліфіковані, внаслідок чого були одержані амплікони, що використовувалися для ідентифікації послідовності 5'-фланкуючої геномної ДНК Явища LY038. Використання методів «tail»-ПЛР та Genome Walker призводить до ідентифікації декількох сотень пар нуклеотидів і більше послідовності ДНК, фланкуючої сайт вставки ДНК-конструкта в Явищі LY038. Для ідентифікації додаткових фрагментів геномної ДНК, фланкуючої дані Явища, авторами були також використані інвертована ПЛР, біоінформативний аналіз і зіставлення з базами даних геномних послідовностей кукурудзи. Ідентифіковані внаслідок комбінованого використання вказаних методів фланкуючі послідовності наведені в SEQ ID NO: 1, 2, 9 та 10. Рослина кукурудзи є аспектом даного винаходу в тому випадку, якщо дана рослина кукурудзи містить в своєму геномі молекулу ДНК, яка може служити як матриця в реакції ампліфікації ДНК, що призводить до синтезу амплікону, який містить описану в даній заявці послідовність ділянки з'єднання, яка є діагностичною для кукурудзяної ДНК Явища LY038 в пробі ДНК, екстрагованій із зразка тканини кукурудзи. Приклад 4 Праймер, специфічний відносно даного Явища та інформація, що стосується аналізу на основі ДНК-зондів Для кожного з Явищ був створений дизайн ПЛР-праймерів і зондів для Taqman®-аналізy, що мають послідовності SEQ ID NO: 3 та 4. Використання в Taqman®-аналізi ПЛР-праймерів, що мають послідовності SEQ ID NO: 3 та 4, призводило до одержання амплікону, діагностичного відносно Явища LY038; амплікон має послідовність SEQ ID 93654 28 NO: 6, зонд, який може бути використаний для детектування даного амплікону, має послідовність SEQ ID NO: 5. У тому випадку, якщо праймери і зонди вводяться в реакцію ПЛР в умовах, описаних в таблиці 2, флуоресцентний сигнал вказує на синтез амплікону детектованого зондом, що успішно пройшов. При використанні підходящих контрольних зразків, наприклад, різних позитивних та негативних ДНК-контролів, було показано, що ПЛР-праймери і зонди специфічні для Явища, що описується. У доповнення до набору праймера і зонда, будь-який набір праймера і зонда, одержаних з послідовностей SEQ ID NO: 1 або 2 і специфічних для ДНК Явища LY038, які, будучи введені в реакцію ДНК-ампліфікації, призводять до синтезу ДНКамплікону, що є діагностичним для ДНК Явища LY038, складає аспект даного винаходу і може бути легко одержаний фахівцем в даній галузі. Умови ПЛР для виконання Taqman®-аналізy, діагностичного для ДНК Явища LY038, наведені в таблиці 2. При виконанні ПЛР або Таgman®-аналізу, описаних в даний заявці, фахівець в даній галузі повинен включити підходящі контрольні зразки. Включення зразків ДНК позитивних та негативних контролів, рівно як і інших контролів, є доречним і допомагає в інтерпретації результатів. Крім того, фахівець, що має базові навички в даній галузі, повинен знати, як одержати праймери і зонди для внутрішнього контролю для реакції Tagman®-ПЛР за допомогою опублікованих стандартних методів (згідно з опублікованим, наприклад, компанією Applied Biosystems, Foster City, California). Фахівець в даній галузі також повинен розуміти, що послідовності праймерів і зондів, а також умови проведення реакцій, описані в даній заявці, можуть бути модифіковані для здійснення дизайну інших аналізів, діагностичних для ДНК Явища LY038. В доповнення до цього, фахівець в даній галузі повинен знати, що продукти реакції ПЛР можуть бути проаналізовані за допомогою гельелектрофореза. 29 93654 30 31 Депозити Monsanto Company насінин кукурудзи, репрезентуючі розкрите вище Явище LY038, були одержані відповідно до Будапештського Договору в Американській колекції типових культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. Депозитний номер Явища LY038 в АТСС РТА-5623. Депозит буде зберігатися/підтримуватися в депозитарії протягом 30 років, або протягом 5 років після останнього запиту, або протягом періоду дії патенту, відповідно до найдо 93654 32 вшого з вказаних термінів, і буде при необхідності замінений протягом вказаного періоду. У контексті принципів даного винаходу, що проілюстровані та обговорюються тут, фахівцеві в даній галузі повинне бути очевидно, що даний винахід може бути будь-яким чином модифікований в рамках викладених принципів згідно з даним винаходом. Автори включають в формулу винаходу всі модифікації, що знаходяться в рамках обсягу, що охоплюється даним винаходом, згідно з нижченаведеною формулою винаходу. 33 93654 34 35 93654 36 37 93654 38 39 93654 40 41 93654 42 43 93654 44 45 93654 46 47 93654 48 49 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 93654 Підписне 50 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601