Композиція для індукції імунної реакції проти вірусу bluetongue (втv) у тварини

Реферат: Винахід належить до композиції для індукції імунної реакції проти вірусу Bluetongue (BTV) у тварини, яка містить двічі інактивований вірус Bluetongue та біологічно прийнятний ад'ювант, що являє собою комбінацію гідроксиду алюмінію та Quil-A сапоніну. Винахід також належить до способу посилення імунної реакції у тварин на вірус Bluetongue, способу запобігання або UA 100710 C2 (12) UA 100710 C2 послаблення спалаху вірусу Bluetongue, способу отримання інактивованого цілісного вірусу Bluetongue. UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід стосується вакцини або імуногенної композиції для імунізування жуйних проти патогенних штамів або серотипів вірусу Віuеtоnguе (ВТV) та способу створення вакцини та імунізування жуйних цими композиціями. Віuеtоnguе, артропонозна вірусна хвороба, відбувається у великої рогатої худоби, овець, кіз та диких жуйних, ураження Віuеtоnguе у вражених тварин мають схожість з інфекційним вірусом діареї корів, вірусом везикулярного стоматиту, злоякісною катаральною лихоманкою, мікозним стоматитом, чумою рогатої худоби, фотосенсибілізацією, та хворобою лап та рота. Вірус Віuеtоnguе (ВТV) обвинувачено як причину гідроаненцефалії у великої рогатої худоби та безплідності, передчасного припинення вагітності та народження дефектного потомства у великої рогатої худоби та овець. Двадцять чотири серотипи відомі з літератури як причини проблем від неочевидної інфекції до гострої вибухової інфекції. Хронічний, стійкий вірус, що губить велику рогату худобу також розпізнано. При ВТV помічено втрату стану організму та продаж забитих тварин може бути відстроченим. У ВТV-інфікованих овець ріст вовни може бути погіршеним розвитком ламкості вовни, що дає дефектну або низькопружинисту шерсть. Помічена кволість після ВТV-інфекції може призводити до зниження протидії до вторинної бактеріальної або хламідної інфекції та інших грабіжницьких факторів. Репродуктивність інфікованих тварин є також несприятливо враженою. Передчасні припинення вагітності та дефектне потомство спостерігають у інфікованих тварин, та деякі тварини можуть бути безплідними протягом одного або більше сезонів розмноження. Найбільш значні збитки нанесені інфекцією Віuеtоnguе є економічні втрати внаслідок ембарго та обов'язкове тестування нормативів, накладених на виробників, хто експортують велику рогату худобу, сперму великої рогатої худоби та овець із ендемічних зон Віuеtоnguе. У природних умовах, передача вірусу відбувається через укуси принаймні чотирьох видів Сulісоіdеs, як-то мошки, комахи. Біологічна передача ВТV проміж великою рогатою худобою та вівцями тими ж кровосисними переносниками інфекції продемонстровано експериментально (Luеdkе еt аl, 28 АJVR 457 (1967)). Велика рогата худоба, вівці та багато видів диких жуйних можуть діяти як резервуар ВТV. Стійка ВТV-вірусемія, котра може тривати до трьох років, ідентифіковано у великої рогатої худоби (Ноurrіgаn, 51 Аust Vеt J 170 (1975)). Як тільки ВТV стає встановленим у країні, вірус є фактично неможливо викорінити (Еrаsmus, 51 Аust Vеt J 209). Етіологічний агент Віuеtоnguе належить до родини Rеоvіrіdае, роду Оrbіvіrus. Вірусну етіологію Віuеtоnguе установив Тhеіlеr у 1906, (Еrаsmus, 51 Аust V е t J 165 (1975)). Оскільки тоді декілька повідомлень були у літературі, що (а) підтверджують виділення вірусу Віuеtоnguе з великої рогатої худоби, овець, кіз та ряду диких жуйних та (b) клінічні та патологічні особливості хвороб Віuеtоnguе, та (с) описують інфекції внаслідок відмінних серотипів ВТV. Для прикладу дивись Оndеrstерооrt (J Vеt Sсі Аnіm Іndus 7 (1944); Коmаrоv та Gоldsmіt, Rеfuаh Vеt 96 (1951); Рrісе та Наrdу, 124 J Аm Меd Аssn 255 (1954); Shоре еt 1, 111 J Ехр Меd 155 (1960); Lіvіngstоn та Наrdу, 25 АJVR 1958 (1964); Luеdkе еt аl 30 АJVR 511 (1969); Ноurrіgаn еt аl, 51 Аust Vеt J 170 (1975), Імунологічний контроль Віuеtоnguе у США спершу спробував МсКеrсhеr еt аl 118 АJVR 310 (19 75), з ВТV-серотипом 10 вакцин, вирощуваних у курячих яйцях. Цей продукт відповідав продукту, отриманому Аlехаndеr, (J V еt Sсі Іndus 231 (1947)), хто першим розмножив вірус Віuеtоnguе у курячих ембріонах. Ранні протоколи вакцинації регулярно проводили у південній Африці та Ізраїлі, застосовуючи послаблену у яйцях полівалентну живу вірусну вакцину, що містить ряд штамів Віuеtоnguе. Вакцину, адаптовану у яйцях, вироблену Сuttеr Lаbоrаtоrіеs та застосовувану у США, зняли з продажу внаслідок суворих реакцій у вакцинованих овець. Пізніше, Кеmеnу та Drеhlе, 22 АJVR 921 (1961), адаптували тип 10 ВТV з яєць до культури клітин нирок корів. Ця модифікована жива вірусна вакцина, вироблена Соlоrаdо Sеrum Соmраnу, є застосовуваною для овець у США. Є необхідність поліпшень у розробці вакцини для застосування у імунізуванні жуйних, зокрема, овець та баранів проти вірусу Віuеtоnguе. Заявлений винахід спрямовано на цю необхідність. Цитування тут будь-якого посилання не слід вважати як прототип стосовно заявленого винаходу. Згідно із заявленим винаходом, виявлено, що віруси Віuеtоnguе можна двічі інактивувати, застосовуючи способи, описані тут, та ці двічі інактивовані віруси можна застосовувати при отриманні вакцин та імуногенних композицій для імунізування жуйних проти різноманітних штамів та патогенних серотипів ВТV. Більш того, визначено, що певні комбінації ад'ювантів та наповнювачів є ефективними для застосування у композиції винаходу для виявлення ефективної імунної реакції у жуйних при застосуванні композиції. 1 UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відповідно, один аспект винаходу стосується композиції для виявлення імунної реакції проти вірусу Віuеtоnguе (ВТV) у тварини, композиція містить імуногенно ефективну кількість принаймні одного штаму двічі інактивованого вірусу Віuеtоnguе та біологічно прийнятний ад'ювант. В одному втіленні двічі інактивований ВТV, застосовуваний у композиції, інактивують спершу інактивувальним агентом при концентрації приблизно 10 мМ та інактивують по-друге інактивувальним агентом при концентрації приблизно 5 мМ. В одному втіленні інактивувальний агент, застосовуваний для лікування ВТV для застосування у композиції є бінарним етиленіміном (ВЕІ). В одному втіленні композиція містить штам ВТV, що є серотипом 4. В одному втіленні композиція є композицією вакцини або імуногенною композицією. В одному втіленні тварина для лікування композицією є жуйною твариною, вибраною з групи, що складається з овець, баранів, кіз, великої рогатої худоби та оленів. В одному втіленні твариною для лікування композицією є вівця або баран. В одному втіленні біологічно прийнятний ад'ювант для застосування з композицією, є вибраним з групи, що складається з одного або більше з групи: алюміній гідроксид, сапонін, SLСD, Карбопол та SР-олива. В одному втіленні біологічно прийнятний ад'ювант для застосування композицією містить суміш алюміній гідроксиду та сапоніну. В одному втіленні алюміній гідроксид є при концентрації приблизно 1 - 10 %. В одному втіленні алюміній гідроксид є при концентрації приблизно 2 - 5 %. В одному втіленні алюміній гідроксид є при концентрації приблизно 3 %. В одному втіленні імунна реакція, виявлена композиціями винаходу, захищає тварин проти інфекції або зменшує суворість принаймні одного симптому, асоційованого з інфекцією патогенним штамом вірусу Віuеtоnguе. Другий аспект винаходу стосується способу посилення імунної реакції у тварини до вірусу Віuеtоnguе, або для відвернення чи зменшення принаймні одного симптому, асоційованого з хворобою, спосіб має етап застосування одиничної чи кількох доз композиції винаходу, як вищеописано. В одному втіленні способи посилення імунної реакції у тварини до вірусу Віuеtоnguе, або для відвернення чи зменшення принаймні одного симптому, асоційованого з хворобою є корисними для досягнення такої дії у жуйних, вибраних з групи, що складається з овець, баранів, кіз, великої рогатої худоби та оленів. В одному втіленні жуйною твариною є вівця або баран. В одному втіленні способи посилення імунної реакції у тварини до вірусу Віuеtоnguе, або для відвернення чи зменшення принаймні одного симптому, асоційованого з хворобою, мають етап застосування композиції парентеральним шляхом. Парентерального застосування можна досягти внутрішньом'язовою ін'єкцією. В одному втіленні способи посилення імунної реакції у тварини до вірусу Віuеtоnguе, або для відвернення чи зменшення принаймні одного симптому, асоційованого з хворобою, мають етап застосування композиції пероральним шляхом. Третій аспект винаходу стосується способу відвернення або поліпшення спалаху вірусу Віuеtоnguе, що має етап застосування до тварин композиції винаходу. В одному втіленні спосіб відвернення або поліпшення спалаху вірусу Віuеtоnguе стосується лікування тварини, що є жуйною твариною, вибраною з групи, що складається з овець, баранів, кіз, великої рогатої худоби та оленів. В одному втіленні жуйною твариною є вівця або баран. В одному втіленні спосіб відвернення або поліпшення спалаху вірусу Віuеtоnguе має етап застосування композиції винаходу парентеральним шляхом. Парентерального застосування можна досягти внутрішньом'язовою ін'єкцією. В одному втіленні спосіб відвернення або поліпшення спалаху вірусу Віuеtоnguе має етап застосування композиції винаходу пероральним шляхом. Четвертий аспект винаходу стосується способу отримання інактивованого цілого вірусу Віuеtоnguе (ВТV), спосіб має етапи: а) обробка ВТV інактивувальним агентом, застосовуючи співвідношення 1:10 інактивувального агенту стосовно ВТV; b) гомогенізування суміші інактивувального агенту/ВТV з етапу а) протягом принаймні 15 хвилин; c) декантування суміші з етапу b) у стерильну посудину та збовтування суміші протягом приблизно 24 годин; d) обробка ВТV другий раз інактивувальним агентом, застосовуючи співвідношення 1:20 інактивувального агенту стосовно ВТV; 2 UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 e) гомогенізування суміші інактивувального агенту/ВТV з етапу d) протягом принаймні 15 хвилин; f) декантування суміші з етапу е) у стерильну посудину та збовтування суміші протягом приблизно 48 годин; та g) нейтралізування інактивувального агенту до кінцевого рН 7,2; де спосіб призводить до інактивування ВТV, підтримуючи тим імуногенність ВТV. В одному втіленні спосіб отримання двічі інактивованого ВТV, як вищеописано, стосується застосування бінарного етиленіміну (ВЕІ) як інактивувального агенту. В одному втіленні кінцева концентрація інактивувального агенту на етапі а), як вищезазначено, є приблизно 10 мМ. В одному втіленні кінцева концентрація інактивувального агенту на етапі d), як вищезазначено, є приблизно 5 мМ. В одному втіленні вищеописаний спосіб отримання двічі інактивованого цілісного ВТV застосовує вірус Віuеtоnguе, що є серотипом 4. П'ятий аспект винаходу стосується застосування принаймні одного двічі інактивованого штаму ВТV для отримання медикаменту для імунізування жуйних проти різноманітних штамів та серотипів ВТV. В одному втіленні принаймні однин двічі інактивований штам ВТV для застосування при отриманні медикаменту є серотипом 4. Ясно, що цей винахід не обмежено певними способами та описаними експериментальними умовами, оскільки такі способи та умови можуть варіювати. Також ясно, що застосовувана тут термінологія призначена для описання тільки певних втілень, та не є обмеженням. Відповідно, у цій заявці можуть бути застосовуваними звичайні відомі способи молекулярної біології, мікробіології та рекомбінантної ДНК. Такі способи є у літературі. Дивись, наприклад, Sаmbrооk, Frіtsсh & Маnіаtіs, Моlесulаr Сlоnіng: А Lаbоrаtоrу Маnuаl, Sесоnd Еdіtіоn (1989) Соld Sрrіng Наrbоr Lаbоrаtоrу Рrеss, Соld Sрrіng Наrbоr, Nеw Yоrk (hеrеіn "Sаmbrооk еt аl., 1989"); DNА Сlоnіng: А Рrасtіс Аррrоасh, Vоlumеs І аnd ІІ (D.N. Glоvеr еd. 1985); Оlіgоnuсlеоtіdе Sуnthеsіs (М.J. Gаіt еd. 1984); Nuсlеіс Асіd Нуbrіdіzаtіоn (В.D. Наmеs & S.J. Ніggіns еds. (1985)); Тrаnsсrірtіоn Аnd Тrаnslаtіоn (В.D. Наmеs & S.J. Ніggіns, еds. (1984)); Аnіmаl Сеll Сulturе (R.І. Frеshnеу, еd. (1986)); Іmmоbіlіzеd Сеlls Аnd Еnzуmеs (!RL Рrеss, (1986)); В. Реrbаl, А Практичн Guіdе То Моlесulаr Сlоnіng (1984); F.М. Аusubе! еt аl. (еds.), Сurrеnt Рrоtосоls іn Моlесulаr Віоlоgу, Jоhn Wіlеу & Sоns, Іnс. (1994). Хоча будь-які способи та матеріали, подібні або еквівалентні описаним тут, можна застосовувати у практиці або тестуванні винаходу, тут описані переважні способи та матеріали. Усі публікації тут уведені як посилання. Визначення "Ад'ювант " означає композицію, що містить одну або більше речовин, що посилює імуногенність антигену у композиції, звичайно композиції вакцини. Ад'ювант може бути тканинним депо, що повільно вивільняє антиген, та також активатором лімфоїдної системи, що неспецифічно посилює імунну реакцію (Нооd, еt аl., Іmmunоlоgу, Sесоnd Еd., Меnlо Раrk, СА: Веnjаmіn/Сummіngs, 1984. р. 384), Часто, первинна вакцинація тільки антигеном, у відсутності ад'юванту, неспроможна до виявлення гуморальної або клітинної імунної реакції. Ад'юванти охоплюють, але без обмеження, повний ад'ювант Фрейнда, неповний ад'ювант Фрейнда, мінеральні гелі, як-то алюміній гідроксид, поверхнево-активні речовини, як-то лізолектин, плюронові поліоли, поліаніони, пептиди, оливні або вуглеводневі емульсії, гемоціаніни, та потенційно корисні ад'юванти людини, як-то N-ацетил-мураміл-L-треоніл-D-ізоглутамін (thrМDР), N-ацетил-нор-мураміл-L-аланіл-D-ізоглутамін, N-ацетилмураміл-L-аланіл-D-ізоглутамінілL-аланін-2-(1'-2'-дипальмітоїл-sn--гліцеро-3-гідроксифосфорилокси)-етиламін, ВСG (bасіllе Саlmеttе-Guеrіn) та Соrуnеbасtеrіum раrvum. Переважно, ад'ювант є біологічно прийнятним. В одному втіленні винаходу композицію застосовують з комбінацією двох ад'ювантів, алюміній гідроксиду та сапоніну. Ад'юванти, застосовувані у композиціях, описаних тут, є звичайно "біологічно прийнятними ад'ювантами", та тому їх можна застосовувати у комбінації з інактивованим ВТV так, щоб утворені композиції можна було застосовувати до тварин іn vіvо без супровідної токсичності. Взірцевими тут є композиції, що містять двічі інактивований ВТV у комбінації з одним або більше біологічно прийнятними ад'ювантами вибраними з групи, що складається з нижченаведеного: алюміній гідроксид, сапонін, SР-олива, SL-СD, або Карбопол. У певних втіленнях два ад'юванти застосовують для виявлення переважної імунної реакції на ВТV. В інших втіленнях суміш перетворюваної при обміні оливи, як-то один або більше ненасичених терпенових вуглеводнів, можна розглядати стосовно застосування, наприклад, сквален або сквалан, та поліоксиетилен-поліпропілен блок-кополімер, як-то Рlurоnіс®. 3 UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Інактивований штам ВТV або похідна з нього молекула є "антигенними", коли вони здатні специфічно взаємодіяти з молекулою розпізнавання антигену імунної системи, як-то імуноглобулін (антитіло) або антигенний рецептор Т клітин. Звичайно, антигенною молекулою є поліпептид, або його варіант, що містить "епітоп" принаймні приблизно з 5 та звичайно принаймні приблизно 10 амінокислот. Антигенна частина поліпептиду, також названа тут "епітоп, " може бути частиною, що є імунодомінантною для антитіла або рецептора розпізнавання Т клітин, або вона може бути частиною, застосовуваною для створення антитіл до молекули кон'югуванням антигенної частини з поліпептидом-носієм для імунізування. Молекула, що є антигенною, не потребує бути імуногенною, тобто, здатною викликати імунну реакцію без носія. "Імунна реакція" на вакцину або імуногенну композицію є розвитком у суб'єкта гуморальної та/або опосередкованої клітинами імунної реакції на молекули в антигені або композиції вакцини. Для заявленого винаходу, "гуморальна імунна реакція" є опосередкованою антитілами імунною реакцією та охоплює створення антитіл з афінністю стосовно антигену/вакцини винаходу, тоді як "опосередкованою клітинами імунною реакцією" є реакція, опосередкована Тлімфоцитами та/або іншими клітинами білої крові. "Опосередковану клітинами імунну реакцію" викликають представленням антигенних епітопів в асоціації з молекулами класу І або класу ІІ головного комплексу гістосумісності (МНС). Це активує антиген-специфічні СD4+ Т хелперні клітини або СD8+ цитотоксичні Т лімфоцити ("СТL"). СТL мають специфічність стосовно пептидних антигенів, що є в асоціації з білками, кодованими головним комплексом гістосумісності (МНС) та експресованими на поверхні клітин. СТL допомагають індукувати та промотувати внутрішньоклітинне руйнування внутрішньоклітинних мікробів, або лізисних клітин, інфікованих такими мікробами. Ще один аспект клітинного імунітету охоплює антигенспецифічну реакцію хелперних Т-клітин. Хелперні Т-клітини допомагають стимулювати функцію, та фокусувати активність неспецифічних ефекторних клітин проти клітин, відображаючих пептидні антигени в асоціації із молекулами МНС на їх поверхні. "Опосередкована клітинами імунна реакція" також стосується отримання цитокінів, хемокінів та інших молекул, вироблених активованими Т-клітинами та/або іншими клітинами білої крові, що містять молекули, похідні від СD4+ та СD8+ Т-клітин. Здатність певного антигену або композиції стимулювати опосередковану клітинами імунологічну реакцію можна визначати рядом аналізів, як-то аналізи лімфопроліферації {активування лімфоцитів), Аналізи СТL-цитотоксичних клітин, аналізуванням Т-лімфоцитів, специфічних стосовно антигену у сенсибілізованого суб'єкту, або вимірюванням продукування цитокінів Т клітинами у реакції на рестимуляцію антигеном. Такі аналізи є добре відомими. Дивись, наприклад, Еrісksоn еt аl., J. Іmmunоl. (1993) 151:4189-4199; Dое еt аl., Еur. J. Іmmunоl. (1994) 24:2369-2376. "Імуногенно ефективна кількість" є кількістю цілісного інактивованого ВТV, що викликатиме у здорової тварини імунну реакцію. Ця кількість залежатиме від виду, породи, віку, розмір, стану здоров'я тварини та залежатиме від попереднього контакту тварини з одним або більше штамами ВТV чи того, що один або більше штамів є вірулентним штамом або авірулентним штамом. Як застосовувано тут, імуногенно ефективна кількість цілісного інактивованого ВТV при застосуванні у комбінації з одним або більше придатними ад'ювантами є кількістю ВТV, що є достатньою для посилення імуногенності ВТV та тому стосується захисного імунітету проти контрольного зараження патогенним або вірулентним штамом або серотипом ВТV. Термін "імуногенний" стосується здатності антигену або вакцини до виклику імунної реакції, гуморальної або опосередкованої клітинами. Як застосовувано тут, термін "імуногенний" означає, що ВТV є здатним викликати гуморальну та/або клітинну імунну реакцію. Імуногенний штам є також антигенним. Імуногенна композиція є композицією,що викликає гуморальну та/або клітинну імунну реакцію, при застосуванні до тварин. Термін "імуногенна композиція" стосується будь-якої фармацевтичної композиції, що містить антиген, наприклад, мікроорганізм, цю композицію можна застосовувати для виклику імунної реакції у ссавця. Імунна реакція може охоплювати Т клітинну реакцію, В клітинну реакцію, або обидві. Композиція може сенсибілізувати ссавця представленням антигену в асоціації з молекулами МНС на поверхні клітин. На додаток, антиген-специфічні Т-лімфоцити або антитіла можна створювати для захисту імунізованого хазяїна. "Імуногенна композиція" може містити жива, послаблена або вбита/інактивована вакцина, що містить цілісні мікроорганізми або їх імуногенні частини, що індукують будь-як опосередковану клітинами імунну реакцію (Т клітин) або опосередковану антитілами імунну реакцію (В клітин), або обидві, та може захищати тварину від одного або більше симптомів, асоційованих з інфекцією, або може захищати тварину від загибелі внаслідок інфекції мікроорганізмом. 4 UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "інактивований" стосується неінфекційної природи мікроорганізмів для застосування у вакцині або імуногенній композиції винаходу. У заявленому винаході, певні способи також розроблені для приведення вірусу Віuеtоnguе до неінфекційного певного стану, але ці способи також розроблені із певним акцентом на збереження імуногенності препарату вакцини, у той же час даючи повне інактивування препарату вірусу. Як застосовувано тут, термін "виділений" означає, що базовий матеріал є виділеним з його природного оточення. Тому, виділений біологічний матеріал може бути позбавленим деяких або усіх компонентів клітин, тобто, компонентів клітин, у котрих природний матеріал існує природно (наприклад, цитоплазматичний або мембранний компонент). Матеріал виділяють, якщо він наявний в екстракті чи супернатанті клітин. Виділений білок може бути асоційованим з іншими білками або нуклеїновими кислоти, з котрими він асоціюється у клітині, або з клітинними мембранами, якщо він є асоційованим з мембранами білком. Виділені органелла, клітина або тканина є виділеними з анатомічної ділянки, у котрій вони є виявленими в організмі. Виділений матеріал може бути, але не обов'язково, очищеним. Термін "парентеральне застосування", як застосовувано тут, означає застосування не через шлунково-кишковий тракт, особливо для уведення речовин в організм внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньом'язово або інтрамедулярною ін'єкцією, але також іншими непероральними та неназальними шляхи застосування, як-то інтраперитонеальна ін'єкція або місцеве застосування. Термін "патогенний" стосується здатності будь-якого інфекційного агенту, як-то бактерія або вірус, спричинювати хворобу. У заявленому винаході термін "патогенний" стосується здатності вірусу Віuеtоnguе (ВТV), спричинювати хворобу у жуйних, особливо овець або баранів. "Непатогенний" мікроорганізм стосується мікроорганізму, що втрачає вищезазначені характеристики для "патогенних" штамів ВТV. Хвороба, спричинена ВТV, часто характеризується ураженнями інфікованих тварин, що мають схожість з інфекційним вірусом діареї корів, вірусом везикулярного стоматиту, злоякісною катаральною лихоманкою, мікозним стоматитом, чумою рогатої худоби, фотосенсибілізацією, та хворобою лап та рота. Вірус Віuеtоnguе (ВТV) обвинувачено як причину гідроаненцефалії у великої рогатої худоби та безплідності, передчасного припинення вагітності та народження дефектного потомства у великої рогатої худоби та овець. Термін "фармацевтично прийнятний носій" означає носій, затверджений регулятивним органом, або перелікований у U.S. Рhаrmасореіа для застосування до тварин, що охоплюють людей, а також інших ссавців. Термін "носій" стосується розріджувачу, ад'юванту, наповнювачу або середовищ, із котрим застосовують фармацевтичну композицію. Такі фармацевтичні носії можуть бути стерильними рідинами, як-то вода та оливи, тваринного, рослинного або синтетичного походження, як-то олія арахісу, олія сої, мінеральна олива, олія кунжуту тощо. Вода є переважним носієм при застосуванні фармацевтичної композиції внутрішньовенно. Розчини солей та водні розчини декстрози та гліцерин можуть також бути застосовуваним як рідкі носії. Придатні фармацевтичні наповнювачі охоплюють вибране з групи: крохмаль, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, крейда, силікагель, натрій стеарат, гліцерин моностеарат, тальк, натрій хлорид, сухе молоко, гліцерин, пропіленгліколь, вода, етанол тощо. Композиція, за бажанням, може також містити незначні кількості зволожувачів або емульгаторів, або рНбуферів. Ці композиції можуть мати форму розчинів, суспензій, емульсій, таблеток, капсул, порошків, композицій з безперервним вивільненням тощо. Композицію можна формувати як супозиторій. Пероральні композиції можуть охоплювати стандартні носії, як-то манітол, лактоза, крохмаль, магній стеарат, натрій сахарин, целюлоза, магній карбонат, тощо. Приклади придатних фармацевтичних носіїв є описаними у " Rеmіngtоn's Рhаrmасеutісаl Sсіеnсеs" Е. W. Маrtіn, Тhе fоrmulаtіоn shоuld suіt thе mоdе оf аdmіnіstrаtіоn. Термін "захисний" стосується захисту, наприклад, ссавця, зокрема, жуйних, наприклад, овець, баранів, кіз або корів, від інфекції або хвороби, індукуванням імунної реакції на певні патогени, наприклад, вірус Віuеtоnguе. Такого захисту загалом досягають після лікування ссавця композиціями вакцин, описаними тут. Термін "очищений", як застосовувано тут, стосується матеріалу, що виділено в умовах, що зменшують присутність невідповідних матеріалів, тобто, забрудювачів, охоплюючи природні матеріали, з котрих матеріал отримано. Для прикладу, очищені бактерії або білки є звичайно по суті позбавлені клітин або компонентів культур хазяїна, охоплюючи культури тканин або білки яєць, неспецифічні патогени, тощо. Як застосовувано тут, термін "по суті позбавлений" застосовують, у контексті аналітичного тестування матеріалу. Звичайно, очищений матеріал, по суті позбавлений забрудювачів, є принаймні на 50 % чистим; більш звичайно принаймні на 90 % чистим, та більш звичайно принаймні на 99 % чистим. Чистота може бути оцінена 5 UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 хроматографією, гель-електрофорезом, імуноаналізом, аналізом складу, біологічним аналізом та іншими способами, відомими у рівні техніки. Способи очищення є добре відомими. Термін "по суті чистий" вказує на найвищий ступінь чистоти, що можна досягти, застосовуючи звичайні способи очищення, відомі у рівні техніки. "Сапоніни" описані у: Lасаіllе-Dubоіs, М та Wаgnеr Н. (1996. А rеvіеw оf thе bіоlоgісаl аnd рhаrmасоlоgісаl асtіvіtіеs оf sароnіns. Рhуtоmеdісіnе vоl 2 рр 363-386). Сапоніни є стероїдними або тритерпеновими глікозидами. Сапоніни є згаданими стосовно утворення колоїдних розчинів у воді, що спінюються при струшуванні, та для осадження холестерину. Коли сапоніни є поблизу клітинної мембрани вони створюють пороподібні структури у мембран, котрі спричинюють розрив мембрани. Гемоліз еритроцитів є прикладом цього, що є властивістю деяких, але не усіх сапонінів. Сапоніни є відомими як ад'юванти у вакцинах для системного застосування. Ад'ювантна та гемолітична активність індивідуальних сапонінів досліджена у рівні техніки (Lасаіllе-Dubоіs та Wаgnеr, вище). Для прикладу "Quіl А" (похідний від кори південноамериканського дерева Quіllаjа Sароnаrіа Моlіnа), та його фракції, є описаними у патенті США № 5,057,540 та "Sароnіns аs vассіnе аdjuvаnts", Кеnsіl, С. R., Сrtt Rеv Тhеr Drug Саrrіеr Sуst, 1996, 12 (1-2): 1-55, та ЕР 0 362 279 В1. а також (Моrеіn, В., ЕР 0 109 942 В1). Ці структури, як відомо, мають ад'ювантну активність (ЕР 0 109 942 В1; WО 96/11711). Гемолітичні сапоніни QS21 та QS17 (очищені ВЕРХ фракції Quіl А) описані як потужні системні ад'юванти, а спосіб їх отримання розкрито у патентах США № 5,057,540 та ЕР 0 362 279 В1. Також описане у цих посиланнях є застосування QS7 (негемолітична фракція Quіl-А), що діє як потужний ад'ювант для системних вакцин. Застосування QS21 описано у Кеnsіl еt аl. (1991, J. Іmmunоlоgу vоl 146, 431-437). Комбінації QS21 та полісорбату або циклодекстрину є також відомими (WО 99/10008). Частинкові ад'ювантні системи, що містять фракції QuіlА, як-то QS21 та QS7, є описаними у WО 96/33739 та WО 96/11711. Інші сапоніни, що застосовувані у дослідженнях системної вакцинації охоплюють похідні від інших рослин, як-то Gурsорhііа та Sароnаrіа (Воmfоrd еt аl., Vассіnе, 10(9):572-577, 1992). Сапоніни є також відомими як застосовувані у дослідженнях вакцинації через слизову. Як раніше показано, сапонін Quіl-А не мають впливу на індукування імунної реакції, коли антиген застосовують інтраназально (Gіzurаrsоn еt аl. 1994 Vассіnе Rеsеаrсh 3, 23-29), тоді як інші автори застосували цей ад'ювант з успіхом (Маhаrаj еt аl., Саn. J. Місrоbіоl, 1986, 32(5):414-20. Сhаvаlі та Саmрbеll, Іmmunоbіоlоgу, 174(3);347-59). ІSСОМ, що містять сапонін Quіl А застосовувані у внутрішньошлункових та інтраназальних композиціях вакцин, виявили ад'ювантну активність (Меl Моwаt еt аl, 1991, Іmmunоlоgу, 72, 317322; Меl Моwаt та Dоnасhіе, Іmmunоlоgу Тоdау, 12, 383-385). QS21, thе nоn-tохіс frасtіоn оf Quіl А, hаs аlsо bееn dеsсrіbеd аs аn оrаl оr іntrаnаsаl аdjuvаnt (Sumіnо еt аl., J. Vіrоl., 1998, 72(6):4931-9, WО 98/56415). Застосування інших сапонінів у дослідженнях інтраназальної вакцинації описано. Для прикладу Сhеnороdіum quіnоа sароnіns hаvе bееn usеd іn bоth іntrаnаsаl аnd іntrаgаstrіс vассіnеs (Еstrаdа еt аl., Соtr. Іmmunоl. Місrоbіоl. Іnfесt, Dіs., 1998, 21(3):225-36). Термін "SL-СD" стосується сульфоліпо-циклодекстрину, що є у родині циклодекстринових ад'ювантів, описаних у патентах США №№ 6,610,310 та 6,165,995. Звичайно, SL-СD формують у суміш з перетворюваною при обміні оливою, як-то один або більше ненасичених терпенових вуглеводні, як-то, сквалан та переважно з неіонним сурфактантом, як-то поліоксіетиленсорбітан-моноолеат. Термін "SР-олива" стосується ад'юванту, що є емульсією оливи, що містить: 1-3 об% блоккополімеру поліоксіетилен-поліоксипропілен; 2-6 об% сквалану; 0,1-0,5 об% поліоксіетиленсорбітан-моноолеату; та буферований розчин солі. Термін "жуйні" стосується копитних ссавців, що типово мають шлунки, поділені на чотири відділи, охоплюючи корів, овець, жирафів, кіз та оленів. Як застосовувано тут, "лікування" стосується одного або більше з нижченаведеного: (і) відвернення інфекції або повторної інфекції, як для традиційної вакцини, (іі) зменшення суворості, або, усунення симптомів, та (ііі) суттєве або повне усунення патогену або розладу. Звідси, лікування може бути профілактичним (перед інфекцією) або терапевтичним (після інфекції). У заявленому винаході, профілактичне лікування є переважним. Згідно з певним втіленням заявленого винаходу запропоновані композиції та способи лікування, охоплюючи профілактичну та/або терапевтичну імунізацію, тварини-хазяїна проти вірусної інфекції. Способи заявленого винаходу є корисними для надавання профілактичного та/або терапевтичного імунітету ссавцям, переважно жуйним, як-то вівцям, баранам, козам або коровам. Способи заявленого винаходу можна також застосовувати для біомедичних досліджень ссавців. 6 UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "двічі інактивований" стосується застосування певних способів, як описано у заявленому винаході, для надавання ВТV неінфекційності, при збереженні імуногенності вірусу. Більш конкретно, ВТV заявленого винаходу є двічі інактивованим застосуванням двох циклів інкубування ВТV ВЕІ, де перший етап інактивування завершують інкубуванням ВТV ВЕІ при концентрації 10 мМ протягом 24 годин, а другий цикл інактивування завершують інкубуванням ВТV ВЕІ при концентрації 5 мМ протягом 48 годин. Терміни "вакцина" або "композиція вакцини", що застосовують рівнозначно, стосуються фармацевтичних композицій, що містять принаймні одну імуногенну композицію, що індукує імунну реакцію у тварини. Вакцина або композиція вакцини може захищати тварин від хвороби або можливої загибелі внаслідок інфекції, та може або ні містити один або більше додаткових компонентів, що посилюють імунологічну активність активного компоненту. Вакцина або композиція вакцини може додатково містити наступні компоненти, типові для фармацевтичних композицій. Вакцина або композиція вакцини може додатково містити наступні компоненти, типові для вакцини або композиції вакцини, що містять, наприклад, ад'ювант або імуномодулятор. Імуногенно активний компонент вакцини може містити живі організми у їх первісній формі або як послаблені організми у модифікованій живій вакцині, або організми інактивовані прийнятними способами у вбитій або інактивованій вакцині, або субодиниці вакцини, що містить один або більше імуногенних компонентів вірусу, або генетично створених, мутованих або клонованих вакцинах, отриманих способами, відомими фахівцям. Вакцина або композиція вакцини може містити один або одночасно більше, ніж один з вищеописаних елементів. Внаслідок потенційного впливу на товарне тваринництво, розробка вакцини проти вірусу Віuеtоnguе є особливо важливою, особливо для тваринництва великої рогатої худоби та овець. Патогенні штами, навіть послаблені, ймовірно мають обмежене значення внаслідок звичайної тенденції живого вірусу повертатися до його вірулентного стан. Більш того, є наказ, що якщо інактивована вакцина є для комерційного застосування, вірус повинен бути повністю інактивованим для гарантії адекватного профілю безпеки для тварин. Більш того, також важливо, щоб інактивування не мало шкідливої дії на імуногенність вірусу або компоненти вірусу, відповідні за індукування імунної реакції. Відповідно, заявлений винахід стосується композицій та способів імунізування тварин, зокрема жуйних, як-то овець, баранів або корів, проти інфекції вірусом Віuеtоnguе (ВТV), або для зменшення суворості принаймні одного симптому хвороби. Композиція містить принаймні один двічі інактивований штам ВТV та біологічно прийнятний ад'ювант. У певних втіленнях застосовують комбінацію принаймні з двома біологічно прийнятними ад'ювантами. В одному втіленні заявленого винаходу, запропоновано способи імунізування жуйних проти патогенного ВТV та захисту тварин проти такої інфекції. Зокрема, способи заявленого винаходу запропоновано для застосування вакцини або імуногенної композиції, що містить принаймні один цілісний та двічі інактивований штам ВТV для імунізування жуйних проти інфекції ВТV. В одному втіленні способи заявленого винаходу запропоновано для застосування вакцини або імуногенної композиції, що містить серотип 4 ВТV для імунізування жуйних проти інфекції ВТV. Вірус Віuеtоnguе для застосування у композиціях та способах винаходу можна отримувати з будь-якого відомого джерела, як-то АТСС. Для прикладу АТСС тримає декілька відмінних штамів ВТV, що переліковані під номерами: VR-187 (серотип 10), VR-872 (серотип 11), VR-873 (серотип 13), VR-875 (серотип 17), VR-983 (серотип 2), VR-1231 (серотип 10), VR-1231АF (серотип 10) та VR-1231САF (серотип мишей 10). Більш того, серотип 4 описано Меrtеns еt аl. (Меrtеns, РР, еt аl. (Vіrоlоgу, 161(2): 438-447, (1987)) та Вrеаrd еt аl. (Вrеаrd, Е. еt аl. Vіrus Rеs., 125(2): 191-197, (2007)). Способи інактивування Інактивовані вірусні вакцини або імуногенні композиції можуть бути отримані обробкою ВТV інактивувальними агентами, як-то формалін або гідрофобні розчинники, кислоти, тощо, опромінюванням ультафіолетом чи рентгенопроменями, нагріванням, тощо. Інактивування проводять як у рівні техніки. Для прикладу, у хімічному інактивуванні придатні вірусні зразки або зразки сироватки, що містять вірус обробляють протягом достатнього часу достатньою кількістю або концентрацією інактивувального агенту при достатньо високій (або низькій, залежно від інактивувального агенту) температурі або рН для інактивування вірусу, інактивування нагріванням проводять при температурі та протягом достатнього часу для інактивування вірусу. Інактивування опромінюванням проводять, застосовуючи світло або інше джерело енергії протягом достатнього часу для інактивування вірусу. Вірус розглядають інактивованим, якщо він 7 UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 є нездатним інфікувати сприйнятливу до інфекції клітину. В одному певному втіленні застосовують для інактивування бінарний етиленімін (ВЕІ). У деяких аспектах винаходу, запропоновано спосіб отримання двічі інактивованої форми принаймні одного цілісного ВТV. Спосіб має етапи: a) обробка ВТV інактивувальним агентом, застосовуючи співвідношення 1:10 інактивувального агенту стосовно ВТV; b) гомогенізування суміші інактивувального агенту/ВТV з етапу а) протягом принаймні 15 хвилин; c) декантування суміші з етапу b) у стерильну посудину та збовтування суміші протягом приблизно 24 годин; d) обробка ВТV другий раз інактивувальним агентом, застосовуючи співвідношення 1:20 інактивувального агенту стосовно ВТV; e) гомогенізування суміші інактивувального агенту/ВТV з етапу d) протягом принаймні 15 хвилин; f) декантування суміші з етапу е) у стерильну посудину та збовтування суміші протягом приблизно 48 годин; та g) нейтралізування інактивувального агенту до кінцевого рН 7,2; де спосіб призводить до інактивування ВТV, підтримуючи тим імуногенність ВТV. В одному втіленні спосіб отримання двічі інактивованого ВТV, як вищеописано, стосується застосування бінарного етиленіміну (ВЕІ) як інактивувального агенту. В одному втіленні кінцева концентрація інактивувального агенту на етапі а), як вищезазначено, є приблизно 10 мМ. В одному втіленні кінцева концентрація інактивувального агенту на етапі d), як вищезазначено, є приблизно 5 мМ. В одному втіленні вищеописаний для отримання двічі інактивованого цілісного ВТV спосіб застосовує вірус Віuеtоnguе, що є серотипом 4. Вакцина або імуногенні композиції та способи застосування Імуногенно ефективну кількість вакцин заявленого винаходу застосовують до жуйних при необхідності захисту проти інфекції вірусом Віuеtоnguе (ВТV). Імуногенно ефективну кількість або імуногенну кількість, що робить запобіжне щеплення жуйних, можна легко визначити узвичаєним тестуванням. Ефективна кількість є кількістю, у котрій досягають достатню імунологічну реакцію на вакцину для захисту тварин, підданих дії вірусу. Переважно, тварина є захищеними до ступеню, у котрому несприятливі фізіологічні симптоми або дія вірусної хвороби є значно зменшеними, поліпшеними або загалом відверненими. Вакцину або імуногенну композицію можна застосовувати одиничною дозою або повторними дозами. Способи для визначення придатної дози активного антигенного агенту є відомими на основі маси тварини, концентрації антигену та інших типових факторів. За бажанням, вакцину або імуногенну композицію застосовують до жуйних ще не підданих дії вірусу. Вакцину, що містить цілісний та двічі інактивований вірус або інші його антигенні форми, можна зручно застосовувати інтраназально, трансдермально, парентерально, тощо. Парентеральний шлях застосування охоплює, але без обмеження, внутрішньом'язовий, внутрішньовенний, інтраперитонеальний, інтрадермальний шляхи тощо. Оскільки внутрішньом'язові та інтрадермальні шляхи інокулювання є успішними в інших дослідженнях, застосовуючи ДНК вірусних інфекційних клонів (Е. Е. Sраrgеr еt аl., °F саts bу іnjесtіоn wіth DNА оf fеlіnе іmmunоdеfісіеnсу vіrus mоlесulаr сlоnе, " Vіrоlоgу 238:157-160 (1997); L. Wіllеms еt аl., "Іn vіvо trаnsfесtіоn оf bоvіnе lеukеmіа рrоvіrus іntо shеер, " Vіrоlоgу 189:775-777 (1992)), ці шляхи є найбільш переважними, на додаток до практичного інтраназального шляху застосування. При застосуванні як рідини, наявна вакцин можна отримувати у формі водного розчину, сиропу тощо. Такі композиції є відомими та їх звичайно отримують розчиненням антигену та інших адитивів у прийнятних системах носія або розчиннику. Придатні "фізіологічно прийнятні" носії або розчинники охоплюють, але без обмеження, воду, фізіологічний розчин, етанол, етиленгліколь, гліцерин, тощо. Типовими адитивами є, наприклад, барвники, підсолоджувачі та антимікробні консерванти, як-то тимеросал (натрій етилмеркуритіосаліцилат). Такі розчини можна стабілізувати, наприклад, додаванням частково гідролізованого желатину, сорбітолу або середовища для культур клітин, та можна буферувати звичайними способами, застосовуючи реагенти, відомі у рівні техніки, як-то натрій гідроген фосфат, натрій дигідроген фосфат, калій гідроген фосфат, калій дигідроген фосфат, їх суміш, тощо. Рідкі композиції також можуть охоплювати суспензії та емульсії, що містять суспендувальні засоби або емульгатори у комбінації з іншими стандартними складовими. Ці типи рідких композицій можна отримувати звичайними способами. 8 UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Парентеральні композиції для ін'єкції у рідинні системи організму потребують належной ізотонічності та рН-буферування до відповідних рівнів рідин організму свині. Ізотонічність можна доводити натрій хлоридом та іншими солями за потребою. Придатні розчинники, як-то етанол або пропіленгліколь, можна застосовувати для збільшення розчинності інгредієнтів у композиції та стабільності рідкого препарату. Наступні адитиви, що можна застосовувати у вакцині, охоплюють, але без обмеження, декстрозу, звичайні антіоксиданти та звичайні хелатори, як-то етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТА). Парентеральні форми доз повинні також бути стерилізованими перед застосуванням. Ад'юванти Двічі інактивований вірус Віuеtоnguе можна постачати з ад'ювантом. В одному втіленні у вакцині є цілісний та двічі вбитий/інактивований ВТV, що застосовують з ад'ювантом. Ад'ювантом є речовина, що збільшує імунологічну реакцію тварини на вакцину. Ад'ювант можна застосовувати у той же час та на тій же ділянці, як вакцину, або у відмінний час, наприклад, як бустер. Ад'юванти також можна переважно застосовувати до жуйних на відмінній ділянці. Придатні ад'юванти охоплюють, але без обмеження, алюміній гідроксид, Аlhуdrоgеl® (Вrеnntаg Віоsесtоr, Frеdеrіkssund, Dеnmаrk), комплекси імуностимулювання (ІSСОМS), неіонні блокполімери або кополімери, цитокіни (ІL-1, lL-2, ІL-7, ІFN-α, ІFN-β, ІFN-γ, тощо.), сапоніни (Quіllаіа А, або QusІ А ((Вrеnntаg Віоsесtоr, Frеdеrіkssund, Dеnmаrk), монофосфорилліпід А (МLА), мураміл дипептиди (МDР) тощо. Інші придатні ад'юванти охоплюють, наприклад, алюміній-калій сульфат, ентеротоксин, виділений з Еsсhеrісhіа соlі, токсин холери або його В-субодиниця, токсин дифтерії, токсин стовбняку, токсин коклюшу, неповний або повний ад'ювант Фрейнда, тощо. Ад'юванти на основі токсину, як-то токсин дифтерії, токсин стовбняку, токсин коклюшу, можна інактивувати перед застосуванням, наприклад, обробкою формальдегідом. В одному втіленні композицію вакцини постачають з комбінацією принаймні двох ад'ювантів. В одному втіленні композицію вакцини постачають з комбінацією алюміній гідроксиду (Аlhуdrоgеl®) та сапонін (Quіl А). Аналізи для вимірювання імунної реакції Функціональні наслідки вакцинування жуйних проти ВТV можна оцінювати придатними аналізами індукування клітинного або гуморального імунітету або активності Т клітин. Ці аналізи є відомими фахівцю, але можуть охоплювати вимірювання цитолітичної активності Т клітин, застосовуючи, наприклад, аналіз вивільнення хрому. Альтернативно, проліферативні аналізи Т клітин можна застосовувати як вказівку на імунну реактивність. На додаток, іn vіvо дослідження можна робити для оцінювання рівня захисту у вакцинованого проти патогену ссавця, застосовуючи способи заявленого винаходу. Типові іn vіvо аналізи можуть охоплювати вакцинування тварин антигеном, як-то описаний тут вірус. Після часу, достатнього для індукування антитіла або реакції Т клітин на відбуття, загалом приблизно 1-2 тижні після ін'єкції, тварин слід контрольно заражати антигеном, як-то будь-який вірус, та відстежують поліпшення одного або більше симптомів, асоційованих з вірусною інфекцією, або виживання тварин. Успішний режим вакцинації проти ВТV призводитиме до значного зменшення в одного або більше симптомів, асоційованих з вірусною інфекцією, або зменшення вірусемії, або зменшення числа або суворості уражень, асоційованих з вірусною інфекцією, або виживання, при порівнянні з невакцинованими контролями. Сироватку можна також збирати для відстеження рівнів антитіл, створених у реакції на ін'єкції вакцини, що вимірюють способами, відомими фахівцям. ПРИКЛАДИ Нижченаведені приклади показують деякі аспекти заявленого винаходу. Однак, ясно, що ці приклади тільки ілюструють винахід. Ясно, що коли надані типові умови реакцій (наприклад, температура, час реакцій, тощо.), умови вище та нижче точно визначених меж можна також застосовувати. ПРИКЛАД 1: СПОСІБ ВИРОБЛЕННЯ Процес вироблення проводять в умовах стерильності, стандартним способом вироблення, описаним нижче. Перед початком операцій, визначених як асептичні, у стандартному способі вироблення підтверджують, що застосовувані у процесі матеріали є належно стерилізованими. Асептичні операції проводять встановленими способами стерильної маніпуляції. ОПИС КОЖНОГО ЕТАПУ ПРОЦЕСУ ВИРОБЛЕННЯ СПОСІБ ВИРОБЛЕННЯ КІНЦЕВОГО АНТИГЕНУ (ПАСАЖ 3) Отримання культур клітин ВНК-21 Клітини ВНК-21 зберігають замороженими у рідкому азоті. Кріотуби WСS розморожують швидким розмороженням до +37 °C та тоді це інокулюють у склянку для культур, що містить культиваційне середовище (МЕМ-Glаsgоw + опромінена сироватка зародка теляти). 9 UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Склянку для культур інкубують при +37+1 °C. Через принаймні 5 годин після інокулювання середовище видаляють зі склянки та додають нове культиваційне середовище. Культуру спостерігають періодично, та реєструють її розвиток та морфологію клітин З цієї склянки для культур до необхідної склянки для отримання, потрібні субкультури виробляють при інтервалах 3-5 діб. Субкультури виробляють трипсинізацією культур розчином трипсину; підрахунок суспензії клітин роблять фарбуванням (Тrураn Вluе). Суспензію клітин тоді розбавляють стерильним культиваційним середовищем у склянках за допомогою магнітного перемішування, та розподіляють у склянки для культур. Культиваційне середовищ доводять до рН 7,2±0,2 на початку культивування в обертових склянках. Як тільки останню культуру трипсинізували та центрифугували, суспензію клітин постачають туди, де виробляються антигени. ВИРОБЛЕННЯ КІНЦЕВОГО АНТИГЕНУ (ПАСАЖ 3) Отримання пасажу 2 антиген (інокулят) Для отримання партії кінцевого антигену (пасаж 3), інокулят (пасаж 2 антигену) отримують нижченаведеним способом: Робочий засівальний вірус (WSV) зберігають замороженим при -70+10 °C. З WSV роблять 2 пасажі для отримання інокуляту. При першому пасажі проводять контроль потужності, а при другому пасажі стерильності, та роблять контролі потужності після заморожування. Пасаж 1 антигену (Попередній інокулят) В одній склянці з клітинами ВНК-21 на 2-3 доби культивації, культиваційне середовище видаляють та замінюють середовищем з інфекцією (суспензія WSV у середовищі МЕМGlаsgоw). Культуру інкубують при +37±1 °C. Коли цитопатична дія (СРЕ) є більше 60 %, склянку перемішують для полегшення розділення моношару клітин, та тоді заморожують при -70+10 °C. Пасаж 2 антигену (Інокулят) Пасаж 1 антигену розбавляють середовищем МЕМ-Glаsgоw. Культиваційне середовище з необхідних для росту склянок з клітинами ВНК-21 на 2-3 доби культивування видаляють та замінюють отриманою суспензією вірусу, та тоді поміщають у інкубатор при +37±1 °C. Коли СРЕ є більше 60 %, склянки перемішують для полегшення розділення моношару клітин, та тоді заморожують при -70±10 °C, Інокулювання культури, інфекція та збирання кінцевого антигену (пасаж 3) Культиваційне середовище МЕМ-Glаsgоw, суспензію клітин ВНК-21 зі склянок для культур та опромінену сироватку зародка теляти змішують та гомогенізують у стерильній посудині при перемішуванні. Як тільки суспензію гомогенізують, роблять підрахунок клітин. Разом з цим суспензією у склянках необхідно інокулювати та інкубувати при +37±1 °C. На 2-3 доби культивації культиваційне середовище видаляють з кожної склянки та замінюють середовищем з інфекцією; МЕМ-Glаsgоw + пасаж 2 антигену (інокулят). Інфіковані склянки тоді інкубують при +37+1 °C. Коли СРЕ є більше 60 %, склянки перемішують для полегшення розділення моношару клітин, культури збирають та гомогенізують, та рН перевіряють, якщо необхідно, доводячи хлоридною кислотою до рН 7,2+0,2, та збирають кінцевий антиген (пасаж 3) тоді інактивують. Характеристики процесу культивування - Культивування роблять в обертових склянках. - Підрахунок клітин роблять у камері Nеubаuеr, після розбавлення зразку 1/2 барвником Тrураn Вluе. - Культури інкубують при +37±1 °C, 12-14 разів на годину. - Стан та розвиток культивації спостерігають періодично, та морфологію клітин спостерігають з інвертованим мікроскопом. - Протягом процесу вироблення кінцевого антигену (пасаж 3), контролі природного оточення проводять засобами відбору зразків повітря протягом періодів спокою та періодів вироблення, та також плями експозиції та контакту аналізують для контролю обладнання. ЗБИРАННЯ ЗРАЗКІВ Пасаж 1 антигену: Зразки беруть з пасажу 1 антигену для контролю ефективності відділом технічного контролю. Пасаж 2 антигену: Зразки беруть з пасажу 2 антигену для контролю ефективності та стерильності відділом технічного контролю. 10 UA 100710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Пасаж 3 антигену: Зразки беруть з пасажу 3 антигену для контролю ефективності, стерильності та ідентичності відділом технічного контролю. ВИРОБЛЕННЯ ІНАКТИВОВАНОГО АНТИГЕНУ Процес інактивування кінцевого антигену триває протягом загалом 72 годин, та концентрація застосовуваного ВЕІ є 15 мМ. Кінцевий антиген інактивують додаванням ВЕІ 0,1М у пропорції 100 мл/л інактивованого антигену (кінцева концентрація 10 мМ). Після додавання ВЕІ, суміш гомогенізують протягом принаймні 15 хвилин та перевіряють рН. Після гомогенізування суміш декантують у стерильну посудину, де її тримають при перемішуванні при 37±1 °C протягом 24 годин. Через 24 години друге інактивування кінцевого антигену проводять додаванням ВЕІ 0,1М у пропорції 50 мл/л інактивованого антигену (кінцева концентрація 5 мМ). Після другого додавання ВЕІ, процес повторюють як вищеописано для першого додавання, але перемішуючи суміш протягом 48 годин. НЕЙТРАЛІЗУВАННЯ ЗАЛИШКОВОГО ВЕІ НЕЙТРАЛІЗУВАННЯ Як тільки завершено процес інактивування, 1М розчин натрій тіосульфату додають у пропорції 5 мл/л інактивованого антигену (кінцева концентрація 5 мМ), для нейтралізування ВЕІ. Після гомогенізування суміші перевіряють рН. Якщо необхідно, доведення роблять хлоридною кислотою для отримання рН 7,2±0,2. РОЗРАХУНОК ТЕОРЕТИЧНОГО ТИТРУ ІНАКТИВОВАНОГО ТА НЕЙТРАЛІЗОВАНОГО АНТИГЕНУ Для розрахунку теоретичного титру інактивованого та нейтралізованого антигену, беруть до уваги титр антигену до фактору інактивування та розбавлення, що представляють додавання ВЕІ у процесі інактивування та натрій тіосульфату у процесі нейтралізування. Для кожного літру антигену додають 100 мл розчину ВЕІ 0,1 М до першого інактивування, та додатково 55 мл до другого інактивування. Цим шляхом 1000 мл кінцевого антигену стають 1155 мл інактивованого антигену. Негайно, у процесі нейтралізування, 5 мл розчину 1М натрій тіосульфату додають на літр інактивованого антигену. Цим шляхом 1155 мл інактивованого антигену стають 1161 мл інактивованого та нейтралізованого антигену. Інактивування та нейтралізування представляють сукупне розбавлення кінцевого антигену 1/1,16 (1000 мл кінцевого антигену стають 1161 мл інактивованого та нейтралізованого антигену). Для цього вважають, що антиген зі стандартним титром, попереднім до 7,2 інактивування 10 ТСlD50/мл, має теоретичний титр після інактивування та нейтралізування 7,2 10 /1,16. ЗБИРАННЯ ЗРАЗКІВ Зразки інактивованого та нейтралізованого антигену для відділу технічного контролю збирають для контролю стерильності та інактивування. ПРИКЛАД 2: ВИБІР АД'ЮВАНТУ ЗГІДНО З ДІЄЮ НА ЗМЕНШЕННЯ ВІРУСЕМІЇ ПІСЛЯ КОНТРОЛЬНОГО ЗАРАЖЕННЯ ЕКСПЕРИМЕНТ ПОПЕРЕДНЬОЇ ІМУНОГЕННОСТІ НА БАРАНАХ ВІКОМ 2 МІСЯЦІ Тварини були вакцинованими підшкірним шляхом (2 мл) та ревакцинованими через 3 тижні. Тварини, вакциновані вакцинами А-3, В-3 та С-3, були контрольно зараженими 7-8 тижнів 7 після ревакцинації (доза контрольного зараження = 10 ТСlD50 живого вірусу / тварину). Жодна з контрольно заражених тварин не була захищена. Однак, зменшення вірусемії спостерігали тільки у тварин, вакцинованих алгідрогелем (алюміній гідроксид) та Quіl-А (сапонін) як ад'ювантами. 11 UA 100710 C2 Таблиця 1 КОМПОЗИЦІЯ ПОПЕРЕДНЬОЇ ІМУНОВАКЦИНИ ВТV Інактивований ВТV (ТСlD50/ мл) 6 10 6,7 6 10 (5 × 10 ) 7 10 6 10 6,7 6 10 (5 × 10 ) 7 10 6 10 6,7 6 10 (5 × 10 ) 7 10 Ад'ювант Партія А-1 А-2 А-3 В-1 В-2 В-3 С-1 С-2 С-3 2+ Алгідрогель/Quіl-А (2 мг АІ /доз) SL-СD ад'ювант 20 % SР-олива 5 % *Супернатант культур клітин. Сукупний процес інактивування 144 години [(10 мМ ВЕІ х 72 години) х 2] РЕАКЦІЯ АНТИТІЛ ПІСЛЯ ВАКЦИНАЦІ Таблиця 2 ПРОЦЕНТ ПОЗИТИВНИХ ТВАРИНИ (ТЕСТ ЕLІSА) ГРУП ЧИСЛО ТВАРИН D+3 WРV D+1 WРRV D+2 WРRV D+3 WРRV D+4 WРRV А1 А2 А3 В1 В2 В3 С1 С2 С3 Контроль 11 11 11 10 11 11 11 9 11 11 0% 82 % 55 % 64 % 27 % 27 % 73 % 64 % 82 % 45 % 0% 100 % 82 % 100 % 73 % 10 % 40 % 30 % 10 % 40 % 9% 64 % 36 % 45 % 27 % 0% 82 % 27 % 36 % 27 % 0% 9% 9% 9% 9% 0% 44 % 22 % 33 % 13 % 0% 64 % 55 % 64 % 30 % 0% 0% 0% 0% 0% *Блокування ЕLІSА, застосовуючи VР7-специфічний МАb WРV = Тижнів після вакцинації WРRV = Тижнів після ревакцинації 5 10 15 РЕЗУЛЬТАТИ КОНТРОЛЬНОГО ЗАРАЖЕННЯ Тварини, вакциновані партіями А-3, В-3 та С-3, були контрольно заражені (5 тварин кожної групи) на 7-8 тижні після ревакцинації. Два невакцинованих контролі були також контрольно зараженими. Вірус Віuеtоnguе (ВТV) визначали у зразках крові зворотною транскрипційно-полімеразною ланцюговою реакцією в реальному часі (RТ-РСR) у Lаbоrаtоrіо Сеntrаl dе Vеtеrіnаrіа (Аlgеtе, Sраіn). (Міguеl Аngеl Jіmеnеz-Сlаvеrо еt аl. (2006). J Vеt Dіаgn Іnvеst 18:7-17). Зразки крові брали на 4 та 7 доби після інфекції (D+4 р.і. та D+7 р.і). Обробку зразків крові, екстрагування сукупної нуклеїнової кислоти 96-лунковим способом екстрагування нуклеїнових кислот та RТ-РСR в реальному часі, проводили як описано Міguеl Аngеl Jіmеnеz-Сlаvеrо еt аl, 2006 (J. Vеt. Dіаgn. Іnvеst. 18:7-17). Для РСR-аналізу було запропоновано пороговий цикл (Сt). Зразки розглядали як позитивні для ВТV, якщо вони дали Сt-значення нижче, ніж 36. Зразки, що дали Сt-значення між 36 та 40, розглядали як ненадійні. 12 UA 100710 C2 Сt = Пороговий цикл SD = Стандартне відхилення СV%= Коефіцієнт варіації Група А3 Група В3 Група С3 Група Контр Інтерпретація Сt-результатів: ТС