Поліоболонкова вірусна вакцина проти віл, спосіб викликання гуморальної та/або клітинної імунної реакції у ссавців на віл та біфункціональна плазміда для одержання рекомбінантних вірусів, які входять до складу

Ця робота була частково підтримана грантами NCI R01-СА57419-03 та грантом Cancer Center Support Core P30-CA21765, грантами NIH-NIAID AI-32529 та P01-AI31596-04. Згідно з цим, уряд США має певні права на цей винахід. Даний винахід відноситься до вірусних вакцин, зокрема до поліоболонкових вірусних вакцин проти вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), до способу генерації гуморальної та/або клітинної відповіді та біфункціональної плазміди. Вірус СНІД може призвести до загибелі десятків мільйонів життів до 2000 року, складаючи першочергову турботу у галузі охорони здоров'я в усьому світі [дивись De Vita та ін., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3 rd edition, J.B.Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992); Wong-Stall, у книзі Virology, pp.1529-1543; та Hirsch та ін., у книзі Virology, pp.1545-1570]. Завдання розробки ефективної вакцини проти ВІЛ кидає особливий виклик імунологам, оскільки фермент зворотної транскриптази, що бере участь у реплікації ВІЛ, має високу ступінь помилок. Це призводить до появи багатьох мутантних штамів ВІЛ, які мають білки зовнішнього покриття чи оболонки з варіантними білкових послідовностей. Ці варіантні оболонкові білки часто розпізнаються імунною системою ссавця, яка продукує щодня більше 109 нових лімфоцитів з єдиною метою боротьби з чужими антигенами, як різні антигени. В- та Т-клітини є, відповідно, гуморальними та клітинними компонентами імунної реакції. Гарний приклад кількісної сили такої імунної реакції продемонстровано у ВІЛ-інфікованих пацієнтів та SIV-ін фікованих макак. У кожному випадку відбуваються послідовні цикли інфекції, імуногенності та утворення варіантних ВІЛ чи SIV [Wrin та ін., J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 7:211-219 (1994); Burns and Desrosiers, Cur. Topics Microbiol. Immunol., 188:185-219 (1994)]. З кожним циклом різноманітність антигенних детермінант ВІЛ (і відповідних імунних реакцій) підвищується, так що ці імунні реакції нейтралізують широкий спектр варіантів SIV та ВІЛ, і суперінфекція у значній мірі інгібується. Однак у пацієнтів, які страждають на СНІД, розвиваються компромісні імунні реакції, яких вже недостатньо для того, щоб попередити перемогу вірусної інфекції ВІЛ над імунною системою пацієнта. Частково це може бути викликано утворенням варіантів ВІЛ, що мають варіантні оболонкові білки, які не розпізнаються імунною системою пацієнта, і тому уникають знищення (Sci. Amer., Aug. 1995). У таких випадках, навіть якщо імунна реакція здатна попередити інфекцію de novo, (наприклад, персистентну мутацію вірусу у привілейованих секвенованих ділянках), інфекція ВІЛ може згодом перемогти імунну реакцію пацієнта [Pantaleo та ін., Nature, 362:355-358 (1993); Embretson та ін., Nature, 362:359-362 (1993)]. Ідентифікація антигенних детермінант В- та Т-клітин у вірусів ВІЛ залишається незавершеною. Оболонковий білок ВІЛ було охарактеризовано як такий, що має варіабельну (V1-V5) та сталу (С1-С5) ділянки. Пептид, характерний для ділянки V3, було названо головною нейтралізуючою детермінантою (ГНД) (PND, principal neutralizing determinant) [Javaherian та ін., Ргос. Natl. Acad. Sci (USA), 86:6768-6772 (1989)], хоч інші ділянки оболонкового білка також можуть бути причетними до викликання імунної реакції. Повна довжина оболонкового білка ВІЛ становить від 850 до 900 амінокислот, причому варіації довжини спричинені гіпермутацією [Starcich та ін., Cell, 45:637 (1986)]. Перші вакцини проти ВІЛ, для яких було проведено клінічні випробування, були розроблені таким чином, щоб симулювати для імунної системи окремі оболонкові білки, або їх ділянки. Однак нейтралізуючі реакції щодо якогось окремого чи кількох оболонкових білків не розпізнають різні ізоляти ВІЛ, і люди не були захищені проти інфекції [Belshe та ін., J. Am. Med. Assoc, 272:431-431 (1994); патент США №5169763; публікація РСТ WO 87/06262; Zagury та ін., Nature, 332:728-731 (1988); Kieny та ін., Int. Conf. AIDS, 5:541 (1989); Eichberg, Int. Conf. AIDS, 7 :88 (1991); Cooney та ін., Ргос. Natl. Acad. Sci (USA), 90:1882-1886 (1993); Graham та ін., J. Infect. Dis., 166:244-252 (1992); J. Infect. Dis., 167:533-537 (1993); Keefer тa ін., AIDS Res. Hum. Retrovir., 10 (Suppl.2):S139-143, (1994); Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir., 10 (Suppl.2):S141-143, (1994); McElrath та ін., J. Infect. Dis., 169:41-47 (1994); Fauci, Science, 264:1072-1073 (May 1994)]. Відповідно з цим, існує довгоочікувана та нагальна потреба виявлення вакцин та способів, що викликають імунну реакцію, достатню для лікування чи попередження ВІЛ-інфекцій. Задачею винаходу є надання вірусної вакцини, здатної викликати у ссавця клітинну та/або гуморальну відповідь проти ВІЛ. Зокрема, перевагою поліоболонкової вакцини за винаходом є те, що вона викликає більш сильну імунну реакцію. Сила даного винаходу полягає у його здатності поповнювати популяцію Вклітина, хелперних Т-клітин та цитотоксичних Т-клітин, що представляють собою складові імунної реакції для забезпечення ефективного гуморального та клітинного імунітету. Наприклад, даний винахід викликає широкий спектр дій ВІЛ-специфічних антитіл. Тести на нейтралізацію ВІЛ демонструють, що одержані антитіла мають найвищу якість. Несподівано виявилося, що винахід може генерувати імунну реакцію проти "наївних" штамів ВІЛ, тобто штамів ВІЛ, оболонкові білки яких не включено до поліоболонкової вірусної вакцини. Задача винаходу вирішується поліоболонковою вакциною, що містить, принаймні, від приблизно 4 до приблизно 10000 різних рекомбінантних вірусів, кожний з яких експресує певний варіант білка оболонки (env) вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), причому вказаний варіант містить як варіабельні, так і константні ділянки білка оболонки ВІЛ, і дана вакцина здатна викликати у ссавця, принаймні, клітинну та гуморальну відповідь проти штаму ВІЛ. Згідно з переважним варіантом винаходу поліоболонкова вірусна вакцина містить від приблизно 10 до приблизно 100 різних рекомбінантних вірусів, що екс пресують певний варіант оболонки ВІЛ. Згідно з другим варіантом, якому надається перевага, рекомбінантні віруси обираються із групи, що складається з коров'ячої віспи, аденовірусу та аденоасоційованого вірусу (ААВ). Згідно з наступним варіантом втілення, якому надається перевага, вакцина рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи за винаходом вводиться підшкірно. Перевагою винаходу є те, що підшкірне введення вірусу коров'ячої віспи не призводить до утворення пошкодження, що дозволяє уникнути вивільнення інфекційної коров'ячої віспи, яка становить потенційну загрозу для імунокомпромісного населення. Бажано, поліоболонкова вакцина рекомбінантного вірусу за винаходом включає лізат інфікованих вірусом клітин росту, наприклад, клітин веро, що містять на додаток до інфекційного вірусу експресовані варіанти білків оболонки (далі: оболонкового білка). Включення лізату варіантів оболонкових білків, який сприяє імунній реакції, є особливою відзнакою даного винаходу, оскільки звичайно вірус очищають від лізату клітин росту. У вакцинах згідно з винаходом варіант білка оболонки ВІЛ належить вірусу, виділеному у хворих, інфікованих вірусом імунодефіциту людини з географічно обмеженого району або варіантами ВІЛ. Автори даного винаходу знайшли, що поліоболонкові вакцини за даним винаходом викликають несподівано підсилені імунні реакції за рахунок експресії та/або представлення багатьох варіантів оболонкового білка, кожен з яких містить як константні, так і варіабельну ділянки, бажано такого, що має структур у, яка є по суті аналогічною до структури природного оболонкового білка ВІЛ. Підсилені імунні реакції розпізнають штами ВІЛ окрім тих штамів, що експресують оболонкові білки, які представлені в поліоболонковій вакцині. Таким чином, вакцина за винаходом забезпечує підсилені імунні відповіді на широкий круг штамів ВІЛ, які придатні для лікування або попередження зараження (або тривалої інфекції внаслідок мутації) різних штамів вірусу. Даний винахід пропонує також нуклеїнову кислоту варіанту оболонки (env variant, EV), що кодує (або є комплементарним до) принаймні один антигенний детермінант варіанту оболонкового білка (ВОБ). ВОБ бажано кодується рекомбінантним вірусом, як це додатково передбачено у поліоболонковій вакцині за даним винаходом. Варіант нуклеїнової кислоти включає принаймні одну мутацію, що надає кодованому ВОБ різних антигенних властивостей, або тривимірну структур у. Даний винахід пропонує також композицію вакцини, до якої входять поліоболонкова вакцина за даним винаходом та фармацевтично прийнятний носій чи розріджувач. Композиція вакцини може додатково включати ад'ювант та/або цитокін, який підсилює імунну реакцію поліоболонкової вакцини щодо принаймні одного штаму ВІЛ у ссавця при введенні йому композиції вакцини. Поліоболонкова вакцина за даним винаходом здатна індукувати імунну реакцію, яка включає принаймні одну гуморальну імунну реакцію (наприклад, антитіла) і клітинну імунну реакцію (наприклад, активацію В-клітин, хелперних Т-клітин та цитотоксичних Т-клітин (CTL)). Даний винахід також пропонує спосіб викликання імунної реакції до ВІЛ-інфекції у ссавця, який є профілактичним щодо ВІЛ-інфекції. Спосіб включає введення ссавцю композиції вакцини, яка включає поліоболонкову вакцину за даним винаходом, яка захищає ссавця проти клінічної ВІЛ-пов'язаної патології, спричиненої інфекцією щонайменше одним штамом ВІЛ. Даний винахід також пропонує спосіб викликання імунної реакції до ВІЛ-інфекції у ссавця з метою лікування ВІЛ-інфекції. Спосіб включає введення ссавцю композиції, що включає інактивовану чи послаблену поліоболонкову вакцину за даним винаходом, яка викликає у ссавця підсилену, порівняно з контрольною групою, імунну реакцію проти клінічної вірусної патології, спричиненої щонайменше одним штамом ВІЛ. У другому варіанті здійснення винаходу профілактичний або терапевтичний спосіб викликання імунної відповіді проти ВІЛ включає введення ефективної кількості двох поліоболонкових вірусних вакцин, що містять, принаймні, від приблизно 4 до приблизно 10000 різних рекомбінантних вірусів, кожний з яких експресує певний варіант білка оболонки (env) вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), в яких рекомбінантні віруси імунодефіциту людини (ВІЛ) належать до різних типів. Специфічна до ВІЛ імунна відповідь (гуморальна та/або клітинна імунна відповідь), викликається поліоболонковою вакциною з рекомбінантних вірусів згідно з даним винаходом, може бути додатково праймований або підсилений шляхом (а) введення ефективної кількості, принаймні, одного рекомбінантного білка оболонки ВІЛ та/або (б) ефективної кількості, принаймні, одного ДНК-вектора, що забезпечує експресію рекомбінантного білка оболонки ВІЛ, причому ДНК-вектор може бути введений перед, після або одночасно з рекомбінантним білком оболонки ВІЛ. Бажано, коли рекомбінантний білок оболонки ВІЛ перед введенням змішують з ад'ювантом та/або вводять внутрішньом'язово, та/або рекомбінантний білок оболонки ВІЛ змішують з ад'ювантом та вводять внутрішньом'язово. ДНК-вектор вводять згідно з методикою «вистрілювання генів». Описані вище способи за винаходом забезпечують стимул для створення методами генної інженерії нового плазмідного вектора. Даний винахід пропонує біфункціональну плазміду, що використовується для одержання рекомбінантних вірусів, що входять до складу вакцини за винаходом, що містить ксеногенний ген, який кодує варіант білка оболонки ВІЛ, що включає як варіабельні, так і константні ділянки вказаного білка, причому даний ген знаходиться під контролем послідовностей, що регулюють експресію, двох типів, а саме, послідовності передраннього промотора цитомегаловірусу та послідовності раннього промотора вірусу коров'ячої віспи та/або пізнього промотора вірусу коров'ячої віспи. Інші об'єкти, особливості, переваги, галузі застосування та варіанти втілення даного винаходу будуть зрозумілі для кваліфікованих спеціалістів в даній галузі техніки із наведеного нижче детального опису та прикладів, що стосуються даного винаходу. Фігура 1. Схематичне зображення орієнтації гена ВІЛ-1 у геномі вірусу коров'ячої віспи. Ген оболонки ВІЛ-1 розташований між правим та лівим сегментами локусу тимідинкінази. Сайт Hindlll знаходиться на Скінці гена оболонки ВІЛ-1. Відповідна вставка дає змогу одержати фрагмент Hindlll розміром приблизно 7kb. Аналіз методом саузерн-блотінга цього набору генів підтверджує положення та точну орієнтацію гена оболонки ВІЛ-1. Фігура 2. Графічне зображення даних, що показують довгостроковість ВІЛ-специфічної реакції антитіл у моделях ссавців. Зображено результати тестування типових зразків мишачої сироватки методом ELISA на ВІЛ-специфічні антитіла. Кожен зразок розводили у співвідношенні 1:100 (суцільні стовпчики), 1:1000 (заштриховані стовпчики) та 1:10000 (незафарбовані стовпчики) перед проведенням аналізу на ELISAпланшетах з нанесеним ВІЛ-1. Зразки у підданих тестуванню мишей відбирали через різний час (1 місяць, 4 місяці та 6 місяців) після ін'єкції 107 pfu (бляшкоутворюючи х одиниць) комплексу вірусу коров'ячої віспи, який експресує один оболонковий білок ВІЛ-1. Ми шей у контрольній групі імунізували вірусом коров'ячої віспи, який не містив оболонкової послідовності. Наведено величини стандартної похибки виміру. Фігура 3. Графічне зображення даних, що показують вплив дози вірусу коров'ячої віспи на індукування принаймні однієї імунної реакції, включаючи продукування ВІЛ-специфічних антитіл. Типові зразки мишачої сироватки піддавали аналізу методом ELISA на планшетах з нанесеним ВІЛ-1. Зразки сироватки відбирали у мишей, яким було зроблено ін'єкцію 10 5, 106 та 107 pfu (бляшкоутворюючих одиниць) одного вірусу коров'ячої віспи, що експресує оболонковий білок ВІЛ-1. Тестування зразків сироватки проводили приблизно через три тижня після ін'єкції. Кожен зразок розводили у співвідношенні 1:100 (суцільні стовпчики), 1:1000 (заштриховані стовпчики) та 1:10000 (незафарбовані стовпчики) перед проведенням аналізу на ELISA-планшетах з нанесеним ВІЛ-1. Наведено величини стандартної похибки виміру. Фігура 4. Графічне зображення даних, які показують, що змішування комплексів вірусу коров'ячої віспи не компрометує вироблення ВІЛ-специфічних антитіл у ссавців, яким було зроблено ін'єкцію. Типові зразки мишачої сироватки піддавали аналізу методом ELISA приблизно через 2 місяці після ін'єкції 10 7 pfu (бляшкоутворюючих одиниць) вірусу коров'ячої віспи, що експресує оболонковий білок ВІЛ-1. Позначкою «окремий» помічено зразок від миши, яка одержала один вірус коров'ячої віспи. Позначкою «суміш» помічено зразок від миші, яка одержала суміш вірусів коров'ячої віспи, що експресують п'ять різних оболонкових білків. Кожен зразок розводили у співвідношенні 1:100 (суцільні стовпчики), 1:1000 (заштриховані стовпчики) та 1:10000 (незафарбовані стовпчики) перед проведенням аналізу на ELISAпланшетах з нанесеним ВІЛ-1. Наведено величини стандартної похибки виміру. Фігура 5. Продукування нових рекомбінацій вірусу коров'ячої віспи шляхом заміщення продуктів PCR для pEvenv4 BH10. Показано спосіб заміщення послідовностей. Продукти PCR заміщували на відповідні оболонкові послідовності ВН10 в унікальних сайтах рестрикції ферменту КрnІ і Bsml. Після розриву плазміди і лігування з продуктами PCR нові плазміди піддавали рекомбінації з W (вірусами коров'ячої віспи) дикого типу для створення векторів експресії W. Фігура 6. Визначення реакції після імунізації методом ELISA за Ебботом. Сироватку від усі х чотирьох шимпанзе піддавали клінічному аналізу за методом Еббота (дивись Матеріали та методи нижче). Результати для кожного зразка сироватки (вісь Y) наведено у залежності від дати кожного тесту (вісь X). Сильні реакції спостерігались у шимпанзе, імунізованих змішаною оболонковою вакциною вірусу коров'ячої віспи. Фігура 7. Карта біфункціональної плазміди, яка може діяти як вакцина ДНК і як рекомбінуючий вектор вірусу коров'ячої віспи. Присутність безпосереднього раннього промотора цитомегаловірусу (ЦМВ), і пізнього та раннього промоторів вірусу коров'ячої віспи (W) дозволяє експресію чужорідного гена як у клітинах ссавця, так і у клітинах, інфікованих W. Відкриття несподівано підсилених імунних реакцій на змішані поліоболонкові вакцини ВІЛ. Попередні спроби одержати вакцини проти різних штамів ВІЛ були сфокусовані на одній чи кількох варіабельних ділянках gр120 чи gр160. Очікувалось, що такі варіабельні ділянки, присутні у вакцині, забезпечать широкий спектр захисту проти інфекції ВІЛ. Однак такі вакцини були невдалими, оскільки індукована вакциною імунна реакція не розпізнавала багато різних штамів ВІЛ. Таким чином, існує нагальна потреба створення вакцин, які викликають імунні реакції на різноманітні штами ВІЛ, так щоб ці вакцини були придатними для лікування та/або попередження ВІЛ. Автори даного винаходу знайшли, що несподівано підсилені первинна та вторинна (бустінг) імунні реакції можуть бути індуковані проти кількох чи багатьох різних штамів ВІЛ шляхом використання поліоболонкових вакцин, які містять суміш від щонайменше 4 до 1000 і, можливо, до 10000 рекомбінантних вірусів, кожен з яких кодує окремий варіант оболонкового білка (ВОБ). Вакцина може також містити експресовані вірусами ВОБ, наприклад, такі, що продукуються клітинами-хазяїнами, використаними для продукування вірусу. Терміни «праймування» чи «первинний» і «повторна імунізація» чи «бустінг» використовуються у даному опису стосовно первинної та послідуючої імунізацій, відповідно, тобто у відповідності до визначень, які ці терміни звичайно мають в імунології. EPV-кодуюча н уклеїнова кислота (нуклеїнова кислота варіанту оболонки (EV)) може бути ізольованою із однієї чи різних популяцій (наприклад, географічних) людей, інфікованих ВІЛ. За іншим варіантом, різні нуклеїнові кислоти EV можуть бути одержані із будь-якого джерела і відібрані на підставі результатів пошуку у послідовностях відмінностей у кодуючих послідовностях, або шля хом оцінки відмінностей у викликаних гуморальній та/або клітинній імунних реакціях на множинні штами ВІЛ, in vitro чи in vivo, згідно з відомими методами. Первинне відкриття стосувалось вакцин рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи. Однак будь-якому фа хівцю з середнім рівнем підготовки у цій галузі зрозуміло, що будь-який рекомбінантний вірус може бути використаний для експресії поліоболонкових антигенів для вакцини за даним винаходом. Крім того, використання множинних вірусних вакцин може усун ути антивірусні імунні реакції, які можуть зменшити ефективність повторної імунізації вірусною вакциною (завдяки можливому підсиленню енергійної антивірусної реакції). Фахівцю у цій галузі зрозуміло, що автори винаходу знайшли також, що повторна імунізація оболонковим білком чи білками рекомбінантного ВІЛ, бажано білками, додатково підсилює способи імунізації за винаходом. Оболонковий білок чи білки ВІЛ можуть співпадати з оболонковими білками, ексресованими у поліоболонковій вакцині, або ж вони можуть бути іншими оболонковими білками ВІЛ. Аналогічно, кваліфікованому фа хівцю зрозуміло, що способи імунізації за даним винаходом підсилюються шляхом використання вакцини ДНК. Вакцина ДНК може використовуватись як засіб повторної імунізації, наприклад, як описано вище для білків рекомбінантного ВІЛ. За іншим варіантом, вакцина ДНК може бути використана для первинної імунізації, а рекомбінантна вірусна вакцина чи вакцини будуть використані для підсилення анти-ВІЛ амінної реакції. Як і для вакцини рекомбінантного оболонкового білка для повторної імунізації, вакцина ДНК може включати один чи кілька векторів для експресії одного чи кількох генів оболонки ВІЛ. Крім того, гени оболонки ВІЛ можуть співпадати з генами, що експресуються вакциною рекомбінантного вірусу, або можуть відрізнятись від них. За варіантом втілення, якому надається перевага, вектори готують для експресії у вакцині рекомбінантного вірусу та у ін фікованих вірусною нуклеїновою кислотою клітинах ссавця, як частину вакцини ДНК. Було знайдено, що ця імунна реакція (гуморальна та/або клітинна) є ефективною для широкого спектра штамів інфекційного вірусу, такого як ВІЛ, і не обмежена штамами вірусу, які експресують конкретні варіанти оболонкових білків (EPV), що входять до поліоболонкової вакцини. Даний винахід, таким чином, пропонує множинні варіанти оболонкових білків, кодовані рекомбінантною вірусною вакциною, які забезпечують несподівано підсилені імунні реакції на множинні штами ВІЛ. Поліоболонкові вакцини та вакцинація. Таким чином, даний винахід за одним із аспектів пропонує поліоболонкові вакцини з використанням від щонайменше 4 і до 10000 різних рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, кожен з яких експресує окремий варіант оболонкового білка або його антигенну частку. Як зрозуміло фахівцю у цій галузі, може бути використано від 4 до біля 1000, або бажано від біля 10 до біля 100 різних рекомбінантних вірусів. Навіть рядовому фа хівцю у цій галузі зрозуміло, що для вакцин можуть бути використані інші віруси. Приклади придатних вірусів, які можуть бути використані як рекомбінантні вірусні хазяїни для вакцин, включають, на додаток до коров'ячої віспи, віспу канарейок, аденовірус та аденоасоційований вірус. Запропоновані також способи виготовлення та використання таких поліоболонкових вакцин. Поліоболонкова вакцина за даним винаходом індукує принаймні одну із гуморальної та клітинної імунних реакцій у ссавця, якому було введено поліоболонкову вакцину, але реакція на вакцину є субклінічною, або ефективно підсилює принаймні одну імунну реакцію на принаймні один штам ВІЛ, так що введення вакцини є придатним з метою вакцинації. Вірусні вакцини. Для приготування поліоболонкових вірусних вакцин, призначених для введення поліоболонкових антигенів ВІЛ, можуть бути використані різні віруси-хазяїни, одержані методами генної інженерії («рекомбінантні віруси»). Особлива перевага надається вірусним вакцинам, завдяки тому, що вірусний компонент промотує сильну імунну реакцію з метою активації В-лімфоцитів, кооперуючих Тлімфоцитів та цитотоксичних Т-лімфоцитів. Чисельні види вірусів можуть бути використані як рекомбінантні вірусні хазяїни для вакцин за винаходом. Рекомбінантним вірусом для вірусної вакцини, якому надається перевага, є вірус коров'ячої віспи [Міжнародна патентна публікація WO 87/06262, 22 жовтня 1987, Moss та ін.; Соопеу та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1882-6 (1993); Graham та ін., J. Infect Dis. 166:244-52 (1992); McElrath та ін., J. Infect. Dis. 169:41-7 (1994)]. За іншим варіантом втілення, може бути використана рекомбінантна віспа канарейок [Pialoux та ін., AIDS Res Hum. Retroviruses 11:373-81 (1995), erratum in AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:875 (1995); Andersson та ін., J. Infect. Dis. 174:977-85.(1996); Fries та ін., Vaccine 14:428-34 (1996); Gonczol та ін., Vaccine 13:1080-5 (1995)]. Іншим варіантом є аденовірус, нездатний до самостійного відтворювання, або аденовірус [Gilardi-Hebenstreit та ін., J. Gen. Virol. 71:2425-31 (1990); Prevec та ін., J. Infect Dis. 161:27-30 (1990); Lubeck та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6763-7 (1989); Xiang та ін., Virology 219:220-7 (1996)]. Інші придатні вірусні вектори включають ретровіруси, що спаковані у клітинах з амфотропним рядом хазяїнів [дивись Miller, Human Gene Ther. 1:5-14 (1990); Ausubel та ін., Current Protocols in Molecular Biology, §9], та послаблений чи нездатний до самостійного відтворення вірук ДНК, такий як вірус простого герпесу (HSV), але не обмежуючись ним [дивись, наприклад., Kaplitt та ін., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], папіломавірус, вір ус Епштейна-Барра (EBV), аденоасоційований вірус (AAV) [дивись, наприклад, Samulski та ін., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski та ін., J. Virol. 63:38223828 (1989)], і т.ін. Вакцини ДНК. Альтернативний варіант до традиційної вакцини, яка містить антиген та ад'ювант, включає пряме введення до тканин суб'єкта in vivo ДНК, що кодує антиген, для експресії антигену клітинами тканини суб'єкта. Такі вакцини у даному опису називаються «вакцинами ДНК» або «вакцинами на основі нуклеїнових кислот». Вакцини ДНК описані у міжнародній патентній публікації WO 95/20660 та у міжнародній патентній публікації WO 93/19183. Здатність безпосередньо введеної ДНК, яка кодує вірусний білок, викликати захисну імунну реакцію, була продемонстрована на численних експериментальних системах [Соnrу та ін., Cancer Res., 54:1164-1168 (1994); Сох та ін., Virol., 67:5664-5667 (1993); Davis та ін., Hum. Mole. Genet, 2:1847-1851 (1993); Sedegah та ін., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:9866-9870 (1994); Montgomery та ін., DNA Cell Bio., 12:777-783 (1993); Ulmer та ін., Science, 259:1745-1749 (1993); Wang та ін., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:4156-4160 (1993); Xiang та ін., Virology, 199:132-140 (1994)]. У дослідженнях з оцінки цієї стратегії при нейтралізації вірусу грипу для індукування продукування антитіл було використано як оболонкові, так і внутрішні вірусні білки, але особлива увага була сконцентрована на вірусному білка гемаглютиніну (НА) [Fynan та ін., DNA Cell Biol., 12:785-789 (1993а); Fynan та ін., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:11478-11482 (1993b); Robinson та ін., Vaccine, 11:957, (1993); Webster та ін., Vaccine, 12:1495-1498 (1994)]. Вакцинація шляхом прямого введення ДНК, яка кодує оболонковий білок ВІЛ, для викликання захисної імунної реакції, продукує як клітина-медійовані, так і гуморальні реакції. Це аналогічно результатам, одержаним з живими вірусами [Raz та ін., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:9519-9523 (1994); Ulmer, 1993, вище; Wang, 1993, вище; Xiang, 1994, вище]. Дослідження з тхорами свідчать, що вакцини ДНК проти збережених внутрішніх вір усних білків грипу, разом з поверхневими глікопротеїнами, є більш ефективними проти антигенних варіантів вірусу грипу, ніж інактивовані вакцини чи вакцини субвіріонів [Donnelly та ін., Nat. Medicine, 6:583-587 (1995)]. Дійсно, для мишей було описано відтворювані імунні реакції на ДНК кодуючі нуклеопротеїни, що зберігались по суті протягом усього життя тварини [Yankauckas та ін., DNA Cell Biol., 12:771-776 (1993)]. Як добре відомо фахівцям у цій галузі, на ефективність експресії антигенних генів та/або імуногенність вакцин ДНК може впливати велика кількість факторів. Приклади таких факторів включають повторюваність інокуляції, конструкція плазмідного вектора, вибір промотора, використаного для збудження експресії антигенних генів і стабільність гена-вставки у плазміді. В залежності від походження, промотори відрізняються по специфічності щодо тканин та ефективності інгібування синтезу мРНК [Xiang та ін., Virology, 209:564-579 (1994); Chapman та iH.,Nucle Acids. Res., 19:3979-3986 (1991)]. Досі більшість вакцин ДНК у системах ссавців були основані на вірусних промоторах, одержаних із цитомегаловірусу (CMV). Вони виявляють добру ефективність при інокуляції м'язів та шкіри ряду видів ссавців. Іншим відомим фактором, що впливає на імунну реакцію, викликану імунізацією ДНК, є спосіб введення ДНК; парентеральні маршрути можуть дати низькі рівні переносу гена та призвести до значної варіабільності експресії гена [Montgomery, 1993, вище]. Високошвидкісна інокуляція плазмід за допомогою генного пострілу підсилює імунну реакцію у мишей [Fynan, 1993B, вище; Eisenbraun та ін., DNA Cell Віоі, 12:791-797 (1993)], гадано завдяки більшій ефективності трансфекції ДНК і більш ефективній презентації антигена дендритними клітинами. Вектори, що містять вакцину на основі нуклеїнової кислоти за винаходом, можуть також бути введені потрібному хазяїну іншими відомими фахівцям методами, наприклад, трансфекцією, електропорацією, мікроін'єкцією, трансдукцією, злиттям клітин, DEAE-декстраном, осадженням кальційфосфату, ліпофекцією (злиттям ліпосом) або векторним перенесенням ДНК [дивись, наприклад, Wu та ін., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut та ін., Канадська патентна заявка №2012311, подана 15 березня 1990p.]. Біфункціональні плазміди для вірусних вакцин та вакцин ДНК. Один із аспектів даного винаходу, якому надається перевага, стосується інженерії біфункціональних плазмід, які можуть виконувати роль вакцини ДНК та рекомбінантного вірусного вектора. Пряма ін'єкція очищеної плазмідної ДНК, тобто при її використанні як вакцини ДНК, викличе імунну реакцію до антигену, що експресується плазмідою у піддослідних суб'єктів. Плазміда буде також корисною при використанні живих рекомбінантних вірусів як носіїв імунізації. Біфункціональна плазміда за винаходом пропонує гетерологічний ген, або ділянку вставки гетерологічного гена, що знаходиться під контролем двох різних послідовностей регулювання експресії: тваринної послідовності регулювання експресії та вірусної послідовності регулювання експресії. Термін «під контролем» використовується у звичайному сенсі, тобто дієво чи оперативно зв'язаний з чимось, у тому сенсі, що послідовність регулювання експресії, така як промотор, забезпечує експресію гетерологічного гена. За варіантом втілення, якому надається перевага тваринна послідовність регулювання експресії є промотором ссавця (даний винахід розглядає також пташині промотори); за конкретним варіантом втілення, промотор є безпосереднім раннім промотором цитомегаловірусу (CMV) (дивись Фіг.7). За іншим конкретним варіантом втілення, вірусний промотор є раннім промотором вірусу коров'ячої віспи, або пізнім промотором вірусу коров'ячої віспи, або, бажано, обома (Фігура 7). Суб'єкти можуть бути вакциновані за багаторівневою схемою, коли біфункціональна плазміда вводиться як ДНК, і, іншим часом, але у будь-якому порядку, як рекомбінантна вірусна вакцина. Винахід пропонує одиничне чи багатократне введення біфункціональної плазміди як вакцини ДНК, або як рекомбінантної вірусної вакцини, обо обох. Така схема вакцинації може бути доповнена введенням вакцин рекомбінантного білка (нижче), або може бути використана з додатковими носіями вакцин. Для рядового фахівця у цій галузі зрозуміло, що біфункціональні плазміди за винаходом можуть бути використані як вектори поліоболонкової вакцини. Так, шляхом вставки до біфункціональних плазмід від щонайменше 4 до біля 10000, бажано від 4 до 1000, більш бажано від 10 до 100, різних генів оболонки ВІЛ можна одержати відповідний набір біфункціональних плазмід, придатних для використання як поліоболонкова вакцина. Вакцини рекомбінантного білка. Активний імунітет, викликаний вакцинацією оболонковим білком чи білками ВІЛ за даним винаходом може створити чи підсилити клітинну чи гуморальну імунну реакцію. Оболонковий білок чи білки ВІЛ, або їх антигенні фрагменти, можуть бути одержані у суміші з ад'ювантом для виготовлення вакцини. Термін «ад'ювант» стосується сполуки чи суміші, яка підсилює імунну реакцію на антиген. Ад'ювант може правити за тканинне депо, що повільно вивільняє антиген, а також за активатор лімфоїдної системи, який неспецифічно підсилює імунну реакцію [Hood та ін., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p.384]. Часто первинне введення самого антигену, без ад'юванта, не викликає гуморальної чи клітинної імунної реакції. Ад'юванти включають повний ад'ювант Фрейнда, неповний ад'ювант Фрейнда, сапонін, мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію, поверхневоактивні речовини, такі як лізолецитин, плюронові поліоли, поліаніони, пептиди, масляні чи вуглеводневі емульсії, гемоціаніни молюска блюдечко, динітрофенол, і потенційно придатні ад'юванти людини, такі як BCG (bacille Calmette-Guerin) та Corynebacterium раrvum. Вибір ад'юванта залежить від об'єкта вакцинації. Бажано використовується фармацевтично прийнятний ад'ювант. Наприклад, у вакцинах для людини треба уникати ад'ювантів на основі масляних чи вуглеводневих емульсій, включаючи повний та неповний ад'ювант Фрейнда. Одним з прикладів ад'юванта, придатного для використання на людях, є гель оксиду алюмінію (alum). За конкретним варіантом втілення, який описано нижче, оболонковий білок рекомбінантного ВІЛ вводять внутрішньом'язово у гелі оксиду алюмінію. За іншим варіантом, оболонковий білок рекомбінантного ВІЛ може бути введений підшкірно, інтрадермально, інтраперітонеально або іншим придатним шляхом введення вакцини. Введення вакцини. Згідно з винаходом, імунізація проти ВІЛ може бути здійснена за допомогою самої лише рекомбінантної вірусної вакцини за винаходом або у сполученні з вакциною ДНК чи рекомбінантної білкової вакцини, або обох. За конкретним варіантом втілення оболонковий білок рекомбінантного ВІЛ у гелі оксиду алюмінію вводять внутрішньом'язово для підсилення імунної реакції. Кожна доза вірусної вакцини може містити одні й ті самі від 4 до 10000, бажано від 4 до 1000, і більш бажано від 10 до 100, різних рекомбінантних вірусів, кожен з яких експресує окремий оболонковий ген ВІЛ. За іншим варіантом, віруси у наступних вакцинах можуть експресувати інші оболонкові гени ВІЛ. За ще іншим варіантом втілення наступні поліоболонкові вірусні вакцини можуть мати частину вірусів, які є спільними з попередньою вакциною, і інші віруси, що відрізняються від неї. Наприклад, праймуюча вакцина може містити віруси коров'ячої віспи, що експресують оболонкові білки ВІЛ, довільно позначені 1-10. Друга (бустерна) вакцина може містити віруси коров'ячої віспи (або бажано інший вірус, такий як вірус віспи канарейок чи аденовірус), що експресують оболонкові білки ВІЛ 6-15, або 11-20 і т.ін. Вакцина ДНК чи рекомбінантна білкова вакцина можуть мати окремий антиген оболонкового білка ВІЛ чи множинні антигени. Бажано, вакцина ДНК чи рекомбінантна білкова вакцина, призначена для використання за винаходом, включає більше одного антигена оболонкових білків ВІЛ. Як і у випадку вірусних вакцин для наступного введення, оболонковий білок ВІЛ або білок вакцини ДНК чи рекомбінантної білкової вакцини може відповідати оболонковому білка ВІЛ, що експресується поліоболонковою вірусною вакциною, або може відрізнятись від будь-якого з оболонкових білків поліоболонкової вакцини. Загалом, варіант втілення винаходу, якому надається перевага, пропонує забезпечення максимально можливої різноманітності у кожному протоколі вакцинації для того, щоб піддати реципієнта дії найбільшої кількості оболонкових білків ВІЛ і, таким чином, створити найширші можливості для нейтралізуючої рекомбінаційної здатності щодо природного ізоляту ВІЛ. Варіанти оболонкового білка Як було вказано вище, варіанти оболонкового білка, призначені для використання у вакцинах за винаходом, можуть бути одержані із географічно локалізованих ізолятів, чи кладів (clade), або із географічно різноманітних ізолятів, тобто різних кладів. Фахівцю у цій галузі зрозуміло, що одержання оболонкових нуклеотидів (тобто, генів) із природних ізолятів має численні переваги: ізоляти є легкодоступними, варіанти оболонкового білка відповідають білкам, що зустрічаються у природних умовах, імунітет до яких є бажаним, і мутації ВІЛ можуть бути швидко виявлені із нових ізолятів. Варіанти оболонкового білка включають також поліпептиди, які мають імуногенну активність, викликану амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності варіанта оболонкового білка щодо принаймні одного епітопу чи антигенного детермінанта. Ця амінокислотна послідовність по суті відповідає щонайменше одному фрагменту довжиною 10-900 амінокислот та/або узагальнюючій типовій послідовності відомого варіанта оболонкового білка ВІЛ. Такий варіант оболонкового білка може мати загальну . гомологію чи ідентичність щодо відомої амінокислотної послідовності оболонкового білка щонайменше 50%, таку як гомологію у 50-99%, або будь-який інтервал чи значення у зазначеному інтервалі, і викликає імуногенну реакцію проти принаймні одного штаму ВІЛ. Ступінь гомології у відсотках може бути визначена, наприклад, шляхом порівняння інформації про послідовності за допомогою комп'ютерної програми GAP версії 6.0, яка може бути одержана від комп'ютерної групи по генетиці університету Вісконсину (UWGCG). Програма GAP використовує спосіб вирівнювання, запропонований Needleman and Wunsch [J. МоІ. ВіоІ. 48:443 (1970)] у модифікації Smith and Waterman [Ad v. Appl. Math. 2:482 (1981)]. Стисло, програма GAP визначає подібність як відношення кількості вирівняних символів (тобто, нуклеотидів чи амінокислот), що є аналогічними, до загальної кількості символів у коротшій із двох послідовностей. Параметри за умовчанням програми GAP, яким надається перевага, включають: (1) одиничну матрицю порівняння (яка містить значення 1 для збігів та 0 для розбіжностей) і зважену матрицю порівняння за Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745 (1986), яку описано у книзі Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC (1979), pp.353-358; (2) штраф, який дорівнює 3,0 для кожного розриву, та додатковий штраф у 0,10 для кожного символу у кожному розриві; і (3) відсутність штрафів для кінцевих розривів. За варіантом втілення, якому надається перевага, варіант оболонкового білка за даним винаходом є варіантною формою принаймні одного оболонкового білка ВІЛ. Бажано, варіант оболонкового білка включає др120 і ділянку олігомеризації gр41, як gр140 [Hallenberger та ін.уігоіоду 193:510-514 (1993)]. Відомі оболонкові білки ВІЛ містять приблизно від 750 до 900 амінокислот. Приклади таких послідовностей можуть бути легко одержані із комерційних баз даних послідовностей ВІЛ та баз даних, що належать установам, таких як GENBANK, або із опублікованих збірок, таких як Myers та ін., eds., Human Retroviruses and AIDS, A Corporation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Vol.I and II, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, NM (1993). Заміни чи вставки у варіанті оболонкового білка для одержання додаткового варіанта оболонкового білка, кодованого нуклеїновою кислотою, призначеного для використання у рекомбінантній вірусній чи полі оболонковій вакцині за даним винаходом, можуть включати заміни чи вставки принаймні одного амінокислотного залишку (наприклад, 1-25 амінокислот). За іншим варіантом, принаймні одна амінокислота (наприклад, 1-25 амінокислот) може бути вилучена із послідовності варіанта оболонкового білка. Бажано, такі заміни, вставки чи делеції ідентифікують на основі визначення послідовності оболонкових білків шляхом секвенування нуклеотиду принаймні однієї нуклеїнової кислоти, кодуючої варіант оболонкового білка, одержаного від особи, інфікованої ВІЛ. Необмежуючі приклади таких замін, вставок чи делецій бажано одержують шляхом ампліфікації послідовностей оболонкових ДНК чи РНК від пацієнтів, інфікованих ВІЛ-1, які можуть бути визначені звичайним експериментуванням для забезпечення модифікованих стр уктурних тa функціональних властивостей оболонкового білка чи варіанта оболонкового білка. Одержані таким чином варіанти оболонкового білка бажано мають антигенні властивості, що відрізняються від вихідного ВІЛ. Такі антигенні відмінності можуть бути визначені за допомогою придатних методів аналізу, наприклад, шляхом тестування з набором моноклональних антитіл, специфічних до оболонкових білків ВІЛ, методом твердофазного імуносорбентного аналізу (ELISA). Може бути використані будь-які заміни, вставки чи делеції, за умови, що одержаний варіант оболонкового білка спричинює утворення антитіл, які зв'язуються з оболонковими білками ВІЛ, але має набір амінокислот, що відрізняється від антитіл, утворюваних другим варіантом оболонкового білка. Кожна із зазначених вище замін, вставок чи делецій може також включати модифіковану чи незвичайну амінокислоту, наприклад, як описано у C.F.R. §1.822(р)(2). У наведеній нижче Таблиці 1 представлено необмежуючі приклади альтернативних варіантів оболонкових білків ВІЛ, які можуть бути кодовані рекомбінантним вірусом за даним винаходом. Відповідно до цього, на основі наведених вище прикладів конкретних заміщень, альтернативні заміни можуть бути зроблені за допомогою рутинних експериментів для одержання альтернативних варіантів оболонкових білків за даним винаходом, наприклад, шляхом проведення однієї чи кількох замін, вставок чи делецій у оболонкових білках ВІЛ, які призведуть до одержання відмінних імунних реакцій. Варіації амінокислотної послідовності у варіанті оболонкового білка за даним винаходом можуть бути одержані, наприклад, шляхом мутації ДНК. Такі варіанти оболонкового білка включають, наприклад, делеції, вставки чи заміщення нуклеотидів, кодуючих різні амінокислотні залишки в амінокислотній послідовності. Очевидно, що мутації, зроблені в кодуючих варіант оболонкового білка нуклеїнових кислотах, не повинні зсувати послідовність із рамки зчитування і бажано не повинні створювати комплементарних доменів, які можуть утворювати вторинні структури мРНК [дивись наприклад, Ausubel (1995 rev.), infra; Sambrook (1989), infra]. Нуклеїнова кислота, що кодує варіант оболонкового білка за даним винаходом, може бути також одержана ампліфікацією чи сайт-специфічним мутагенезом у ДНК чи РНК, кодуючи х оболонковий білок чи варіант оболонкового білка, і наступним синтезом чи зворотною транскрипцією кодуючої ДНК для одержання ДНК чи РНК, що кодують варіант оболонкового білка [дивись, наприклад, Ausubel (1995 rev.), infra; Sambrook (1989), infra], на основі опису та посібника, які наведено тут. Рекомбінантні віруси, що експресують варіант оболонкового білка за даним винаходом, рекомбінантні варіанти оболонкового білка, або вектори нуклеїнових кислот, що кодують їх, включають обмежений набір послідовностей, що кодують варіанти оболонкового білка як заміщуючі нуклеотиди, які можуть бути одержані рядовим фахівцем у цій галузі за стандартними методиками без зайвих експериментів за допомогою наведених тут описів та інструкцій. Детальний опис хімії та структури білків дивись у. Schulz, G.E. та ін., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978), та Creighton, Т.Е., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., San Francisco, CA (1983). Про представлення заміщень у нуклеотидних послідовностях, таких як кодони, яким надається перевага, дивись Ausubel та ін. eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995) (тут та далі «Ausubel (1995 rev.)») У §§Α.1.1-Α.1.24, і Sambrook, J. та ін., molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), у Додатках С та D. Таким чином, рядовий фахівець у цій галузі, користуючись наведеними тут описами та порадами, зрозуміє, як здійснити заміщення інших амінокислотних залишків у інших положеннях оболонкової ДНК чи РНК для одержання альтернативного варіанта оболонкових білків, включаючи варіанти з заміщенням, делеціями чи вставками. Відбірні аналізи для визначення ВІЛ-активності Для визначення анти-ВІЛ активності сироватки чи клітин, одержаних від особи, імунізованої вакциною за винаходом, може бути використаний будь-який відомий та/або придатний метод відбірного,аналізу, відомий фахівцям у цій галузі. Наприклад, відомі аналізи на ВІЛ включають аналізи вірусної інфекційності [дивись, наприклад, Chesebro та ін., J. Virol., 62:3779-3788 (1988); Aldovini та ін., eds., Techniques in HIV Research, pp.71-76 (1990)]; аналізи нейтралізації [дивись, наприклад, Golding та ін., AIDS Res. Hum. Retrovir., 10:633-643 (1994); Hanson., AIDS Res Hum. Retrovir., 10:645-648 (1994); Laal ma ін., Res. Hum. Retrovir., 9:781-785 (1993); Hanson, J. Acquire. Immune Defic. Syndr., 7:211-219 (1994)]; аналізи периферійних одноядерних клітин (PMN) [дивись, наприклад, Arduino та ін., Antimicrob Agents Chemother. 37:1095-1101 (1990)]; і аналізи цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL) [дивись, наприклад, Hammond та ін., J. Exp. Med., 176:1531-1542 (1992); McElrath та ін., J. Virol. 68:5074-5083 (1994); Walker та ін., Cell Immunol., 119:470-475 (1989); Weihold та ін., AIDS Res. Hum. Retrovir., 8:1373 (1992)]. Інши придатні методи, самі чи у будь-якій комбінації, включають кількісні та/або якісні виміри транскрипції, реплікації, трансляції, включення віріонів, вірулентності, вірусного врожаю та/або морфогенезу, але не обмежуючись ними. Конкретний варіант втілення: Рекомбінантний вірус коров'ячої віспи, що кодує варіанти оболонкового білка, поліоболонкові вакцини та способи їх виготовлення та використання Огляд. Рекомбінантні віруси коров'ячої віспи (W), що експресують оболонкові білки ВІЛ (наприклад, др 41, gр120 та/або gр160, або їх частину), дозволяють одержати матеріали, придатні для виготовлення та тестування змішаних вакцин, що індукують принаймні одну із гуморальної та клітинної імунної реакції проти вірусу, а також для аналізів детермінантів В-клітин та CTL. Поліоболонкова вакцина за даним винаходом складається із суміші n разних рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, де n є цілим числом від приблизно 4 до приблизно 10000 (або будь-яким інтервалом чи значенням в зазначеному інтервалі), де кожен векторний фрагмент вірусу коров'ячої віспи експресує варіант оболонкового білка ВІЛ-1 (EPV) (наприклад, (gр41, gр120 чи gр160). Рекомбінантний вірус коров'ячої віспи функціонально кодує варіант оболонкового білка і може бути одержаний рекомбінацією вірусу коров'ячої віспи дикого типу з плазмідою. Множинні, відмінні одна від одної плазміди, що кодують варіанти оболонкового білка, можуть бути одержані шляхом заміщення однієї кодуючої послідовності варіанта оболонкового білка на іншу, наприклад, з використанням рестрикційного фрагменту чи мутагенезу. Одержання рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи. Способи одержання індивідуальних плазмід (кожна з яких експресує унікальну послідовність білка ВІЛ) можуть використовувати метод ампліфікації ДНК чи РНК для заміщення ізольованих послідовностей варіанта оболонкового білка у векторі (наприклад, pVenv4 чи pVenv1 [Hallenberg та ін.,Virology, 193:510-514 (1993)], який кодує відому послідовність оболонкового білка ВІЛ (наприклад, доступну для одержання від NIAID AIDS Research & Reference Reagent Program, Rockville, MD). Методи ампліфікації РНК чи ДНК добре відомі фахівцям і можуть бути використані згідно з даним винаходом без проведення зайвих експериментів на основі наведених тут описів та порад. Відомі методи ампліфікації ДНК чи РНК включають ланцюгову полімеразну реакцію (PCR) та споріднені процеси ампліфікації, але не обмежуються ними [дивись, наприклад, патенти США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, на ім'я Mullis та ін., 4795699 та 4921794 на ім'я Tabor та ін; 5142033 на ім'я Innis; 5122464 на ім'я Wilson та ін., 5091310 на ім'я Innis; 5066584 на ім'я Gyllensten та ін; 4889818 на ім'я Gelfand та ін; 4994370 на ім'я Silver та ін; 4766067 на ім'я Biswas; 4656134 на ім'я Ringold] та РНК-медійовану ампліфікацію, що використовує антисмислову РНК до цільової послідовності як шаблон для синтезу дволанцюгової ДНК [патент США №5130238 на ім'я Malek та ін., з торговою назвою NASBA]. Наприклад, фрагменти рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, одержані цим шляхом, можуть бути використані для імунізації та викликання ВІЛ-специфічної реакції Т-клітин та/або В-клітин. Праймери використовують збережені послідовності ВІЛ і, таким чином, успішно ампліфікують оболонкові гени із багатьох різних зразків від пацієнтів, хворих на ВІЛ-1. Аналогічно, описана тут базова методика може бути використана з PCR чи іншими типами праймерів ампліфікації для заміщення менших чи більших ділянок оболонкових послідовностей із польових ізолятів та ділянки, які були знайдені у векторах, кодуючи х оболонковий білок ВІЛ. Дивись, наприклад, Ausubel, нижче; Sambrook, нижче. Нуклеїнові кислоти, що кодують варіант оболонкового білка. Методика починається з ізоляції ДНК із інфікованих ВІЛ клітин і ампліфікації оболонкових послідовностей методом ланцюгової полімеразної реакції (PCR). Продукти PCR чи інших методів ампліфікації є найпростішим способом ізоляції послідовностей ВІЛ, але можуть бути використані будь-які інші придатні та відомі методи, такі як клонування та ізоляція нуклеїнових кислот чи білків, що кодують варіант оболонкового білка (дивись Ausubel, нижче; Sambrook, нижче). Рестрикційні ділянки ферментів бажано вводяться до PCR чи інших послідовностей праймування ампліфікації з метою сприяння клонуванню генів. Ізольована ДНК для PCR може бути одержана із численних джерел вірусу, включаючи свіжу чи заморожену цільну кров від ВІЛ-позитивних пацієнтів та клітин, які були інфіковані вірусними ізолятами in vitro. Для одержання нових оболонкових фрагментів ВІЛ бажано використовується ланцюгова полімеразна реакція (PCR) для ампліфікації 100-2700 комплементарних пар основ (bр) оболонкового гена із кожного окремого зразка від пацієнта, хворого на ВІЛ. Праймери PCR можуть представляти добре збережені послідовності ВІЛ, які є придатними для ампліфікації оболонкових генів із відомих зразків оболонкових генів, ізольованих ВІЛ чи різних зразків від хворих на ВІЛ пацієнтів. Ампліфікована ДНК бажано включає ділянку, що кодує 10-900 (наприклад, 100-400, 400-600 чи 600-900, або будь-який інтервал чи значення у цьому інтервалі) амінокислот із gp120 і gр41 (які удвох складають gр160). Продукти PCR бажано включають один чи кілька варіабельних ділянок (V1-V5) та сталих ділянок (С1-С5) оболонки, більш бажано більшу частину із ділянок V1, С1, V2, С2, V3, С3, V4, С4 та V5. Крім того, ампліфіковані послідовності можуть кодувати 1-200 амінокислот, розташованих за місцем розщеплення для gp120/gp41. Бажано, ампліфікується більша частина оболонкового гена або ген цілком. Можливо, відсутня частина послідовності, що кодує gр160, або всі послідовності, що кодують трансмембранний домен та/або домен цитоплазматичного хвоста [ди вись, наприклад, Hallenberg та ін., (1993)]. Праймери PCR можуть бути сконструйовані так, щоб сайти ферментів рестрикції розташовувались з боків послідовності оболонкового гена у плазміді коров'ячої віспи, так щоб вони були включені до ампліфікованих препаратів ДНК. Використовуючи добре відомі методики замісного клонування, можна одержати похідні плазміди коров'ячої віспи, які експресіють послідовності варіантів оболонкового білка від 1-10000 пацієнтів, шляхом заміщення ділянки кодуючої послідовності варіанта оболонкового білка пацієнта на відповідну ділянку оболонкової послідовності у плазміді коров'ячої віспи, наприклад, використовуючи для заміщенні рестрикційні фрагменти. Наприклад, плазміда pVenv4 і препарати PCR обробляють Kрnl і Bsml для одержання послідовності, що кодує амінокислоти 1-639 скороченої gр160, у якій відсутні як трансмембранний домен, так і домен цитоплазменного хвоста gр41 [дивись, наприклад, Hallenberg та ін., (1993)]. Після лігування препарату PCR та продуктів p Venv бактеріальні клітини-хазяїни піддають перетворенню з лігувальною сумішшю за будь-яким з численних методів, добре відомих фа хівцям у цій галузі, включаючи, наприклад, електропорацію, і рекомбінантні колонії збирають та аналізують секвенуванням. Фрагменти рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, що кодують оболонкові білки ВІЛ. Після цього віруси коров'ячої віспи, що кодують варіанти оболонкового білка ВІЛ, рекомбінують у клітині-хазяїні з вірусом дикого типу, і збирають та зберігають матеріал вірусних бляшок, що експресують варіант оболонкового білка. Потім вірусний матеріал у вигляді оболонок вірусів коров'ячої віспи (Wvenv), кожна з яких містить окрему послідовність, що кодує варіант оболонкового білка, змішують з використанням від щонайменше 4-40, і до приблизно 10000 різних рекомбінантних вірусів для одержання поліоболонкової вакцини за даним винаходом. Плазміди рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, що містять послідовності варіантів оболонкового білка, після цього необов'язково піддають секвенуванню чи відбірному аналізу з використанням антитіл, специфічних до оболонкового білка ВІЛ, для ідентифікації різних варіантів оболонкового білка. Бажано використовується дідезокси-метод секвенування з обривом ланцюга за Сенгером . Бажано використовується раніше описана процедура здійснення методу [Sambrook та ін., (1989), нижче; United States Biochemical, Sequence Version 2.0 - DNA Sequencing Kit, Ninth Edition, Amersham Life Science, Inc., (1994)], яка повинна зчитува ти приблизно 50-300 bp від позиції праймера. Методи продукування векторів експресії вірусу коров'ячої віспи є добре відомими фахівцям у цій галузі [дивись, наприклад, Mackett, Μ. та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79:7415-7419 (1982); Panicali, D., and Paoletti, E., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79:4927-4931 (1982); патент США №4169763; Mazzara, G.P. та ін., Methods in Enz., 217:557-581 (1993), Ausubel та ін., нижче, у §§16.15-16.19]. Бажано, раніше описаний вектор pSC11 [Chakrabarti, S. та ін., Моl. Cell. Віоl, 5:3403-3409 (1985)] може бути використаний для створення плазміди, що кодує ооблонку, такої як pVenv4. Вірус коров'ячої віспи, що використовується як вірусний вектор, має ряд корисних характеристик, включаючи здатність, яка дозволяє клонування великих фрагментів чужорідних ДНК (більше 20Kb), збереження інфекційності після вставки чужорідної ДНК, широкий діапазон хазяїв, відносно високий рівень синтезу білків і придатні транспортні, секреційні, процесингові та посттрансляційні модифікації, які визначаються первинною структурою білка, що експресується, і типом використаних клітин-хазяїв. Наприклад, безпомилково відбуваються N-O-глікозилювання, фосфорилювання, міристилювання та розщеплення, а також збірка експресованих білків. Було розроблено кілька варіантів вектора коров'ячої віспи, які є придатними для використання за даним винаходом (наприклад, дивись Ausubel та ін., нижче, §§16.15-16.19). Найбільш звичайно, після одержання вірусного матеріалу (Ausubel, нижче, §16.16) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіант оболонкового білка, ставиться під контроль промотора вірусу коров'ячої віспи і інтегрується до геному коров'ячої віспи таким чином, щоб зберегти інфекційність (Ausubel та ін., нижче, у §16.17). За іншим варіантом, експресію можна здійснити шляхом трансфекції плазміди, що містить контрольований промотором коров'ячої віспи ген, кодуючий варіант оболонкового білка, до клітини, яку було інфіковано коров'ячою віспою дикого типу. Бажано, клітина-хазяїн і вектор коров'ячої віспи є придатними та схваленими до використання у вакцинації ссавців та людей. Ці рекомбінантні віруси досліджуються потім з використанням різних відомих методів (Ausubel та ін., нижче, у §16.18). За ще іншим варіантом, ланцюг полімерази РНК бактеріофага Т7 може бути інтегрований до геному коров'ячої віспи так, щоб послідовності, що кодує варіант оболонкового білка, експресувались під контролем промотора Т7, будь то у плазмі, яку було піддано трансфекції, плазміді чи рекомбінантному вірусі коров'ячої віспи. Використанню промоторів вірусів віспи надається перевага тому, що клітинні та інші вірусні промотори звичайно не розпізнаються транскрипційним апаратом коров'ячої віспи. Для поліоболонкових вакцин у рекомбінантній коров'ячій віспі бажано використовується складний ранній/пізній промотор, оскільки бажано, щоб варіант оболонкового білка експресувався як антиген, який представлений в клітині-хазяїні, інфікованій рекомбінантним вірусом коров'ячої віспи, асоційованим з класом І чи II головної системи тканинної сумісності (МНС). Такий МНС-асоційований оболонковий білок ВІЛ утворить потім мішені цитотоксичних Тклітин і забезпечить первинну вакцинацію ссавців реакцією цитотоксичних Т-клітин та/або гуморальною реакцією проти експресованих варіантів оболонкового білка ВІЛ. Це пояснюється тим, що здатність вірусних векторів коров'ячої віспи індукувати представлення МНС у клітинах-хазяїнах для цього типу антигенів зменшується на пізніх стадіях інфекції. Транскрипти з раннім початком реплікації термінуються після послідовності TTTTTNT і призводять до неадекватної МНС-презентації. За іншим варіантом, будь-які такі термінуючі фрагменти у кодуючій послідовності гена можуть бути змінені шляхом мутагенезу, якщо використовується ранній промотор вірусу віспи для підсилення МНСпрезентації антигенів оболонкового білка у клітинах-хазяїнах (Earl та ін., нижче, 1990). Для імітації мРНК вірусу коров'ячої віспи нетрансльовані лідерну та 3'-термінальну послідовності звичайно залишають короткими, якщо вони використовуються у плазмідах коров'ячої віспи, які включають послідовності, що кодують варіанти оболонкових білків ВІЛ. Бажано, плазміда, використана для виготовлення фрагментів вірусу коров'ячої віспи за даним винаходом, була сконструйована з сайтами рестрикції ендонуклеази для вставки оболонкового гена після промотора коров'ячої віспи (Ausubel та ін., нижче, §16.17). Більш бажано, плазміда вже містить кодуючу послідовність оболонкового білка, у якій сайти рестрикції знаходяться лише біля кожного з початку та кінців кодуючої послідовності оболонкового білка. Такий само рестрикційний фрагмент кодуючої послідовності варіанта оболонкового білка може тоді замістити відповіднупослідовність у плазміді. У таких випадках, більша частина кодуючої послідовності варіанта оболонкового білка може бути вставлена після вилучення із плазміди більшості чи усі х кодуючи х послідовностей оболонкового білка. Бажано, одержаний фрагмент вірусу коров'ячої віспи (який містить кодуючу послідовність варіанта оболонкового білка і промотор коров'ячої віспи) має з боків ДНК коров'ячої віспи, що дозволяє здійснити гомологічну рекомбінацію при трансфекції плазміди до клітин, які раніше були інфіковані вірусом коров'ячої віспи дикого типу. Бокові ділянки ДНК вірусу коров'ячої віспи обирають таким чином, щоб рекомбінація не розірвала основний вірусний ген. Без проведення селекції співвідношення між рекомбінантним та батьківським вірусом коров'ячої віспи становить звичайно приблизно 1:1000. Хоч така частота є досить високою, щоб дозволити використання гібридизації у бляшках (ди вись Ausubel та ін., нижче, у §§6.3 та 6.4) чи імунологічного пошукового аналізу (Ausubel та ін., нижче, у §6.7) для відбору рекомбінантних вірусів, для сприяння ідентифікації рєкомбінантних вірусів застосовувались різноманітні методи. Необмежуючі приклади таких методик селекції чи пошукового аналізу відомі фахівцям у цій галузі (Ausubel та ін., нижче, у §16.17). Звичайно, касета експресії обмежена з боків сегментами генів тимідинкінази (ТК) коров'ячої віспи, внаслідок чого рекомбінація призводить до інактивації ТК. Після цього вірус з фенотипом ТК- можна відрізнити від вірусів з ТК+-фенотипом шляхом інфікування лінії клітин ТК- у присутності 5-бромо-дезоксіуридину (5-BrdU), який повинен бути фосфорильованим ТК для летального включення до вірусного геному. Альтернативно або додатково рекомбінантні віруси можуть бути обрані шляхом спів-експресії бактеріального антибіотикстійкого гена, такого як ампіцилін- (amр) чи гуанінфосфорибозилтрансферазою (gpt). Як додатковий приклад можна вказати, що спів-експресія гена lac Z Esterichia coli дозволяє провести спів-пошуковий аналіз бляшок рекомбінантного вірусу з Xgal (Ausubel та ін., нижче, у §16.17). Рекомбінантні віруси коров'ячої віспи, що експресують варіант оболонкового білка за даним винаходом, можуть бути необов'язково атенуйовані чи інактивовані згідно з відомими методами, такими як теплова обробка, обробка параформальдегідом, ультрафіолетове випромінювання, обробка пропіолактеном, утворення гібриду чи хімери або іншими відомими методами [дивись, наприклад, Zagury та ін., Nature, 332:728-731 (1988); Ito та ін., Cancer Res., 50:6915-6918 (1990); Wellis та ін., J. Immunol., 99:1134-9 (1967); D'Honcht, Vaccine 10 (Suppl.):548-52 (1992); Selenka та ін., Arch. H yg. Bactehol., 153:244-253 (1969); Grundwald-Bearch та ін;, J. Cancer Res. Clin. Oncol., 117:561-567 (1991)]. Наприклад, теплова інактивація при 60°С значно знижує титр вірусу. Такі методики атенуації проходять тестування на безпеку, оскільки неповна інактивація може призвести до смерті пацієнта [Dorozynsky and Anderson, Science, 252:501-502 (1991)]. Такі атенуйовані чи інактивовані рекомбінантні віруси коров'ячої віспи повинні використовуватись у тих випадках, коли пацієнт може мати компромісну імунну систему, оскільки введення живої коров'ячої віспи може призвести до ускладнень чи смерті. Фармацевтичні композиції Фармацевтичні препарати за даним винаходом, придатні для інокуляції або для парентерального чи перорального введення, включають поліоболонкову рекомбінантну вір усну вакцину, яка включає від щонайменше 4 до приблизно 10000, бажано від 4 до приблизно 1000, і більш бажано від приблизно 10 до приблизно 100 різних різних рекомбінантних вірусів у формі лізату клітин, мембранно-зв'язаної фракції, частково очищеній чи очищеній формі. Бажано, поліоболонкова вакцина включає лізат клітин (або його мембранно-зв'язану фракцію), що містить рекомбінантний вірус, який у свою чергу включає варіанти оболонкового білка, вже експресовані рекомбінантними вірусами. Як було знайдено, включення експресованих варіантів оболонкового білка підсилює первинну реакцію антитіл. Композиція поліоболонкової вакцини може мати форму стерильних водних чи неводних розчинів, суспензій або емульсій, і може також містить допоміжні агенти чи наповнювачі, що є відомими фахівцям у цій галузі. Кожен із щонайменше від приблизно 4-40 до 10000 різних вірусів кодує та експресує окремий варіант оболонкового білка, як описано у даній заявці. ДНК, що кодує варіант оболонкового білка, може бути обрана таким чином, щоб представляти варіанти оболонкового білка, існуючі у конкретній ізольованій спільності пацієнтів, хворих на ВІЛ. Наприклад, вакцина може представляти послідовності із Мемфісу (штат Теннессі), і бути призначеною для застосування у Мемфісі (шта т Теннессі). Вакцини, сконструйовані таким чином, щоб представляти географічно обмежені райони, можуть також бути придатними для використання у спільнотах, що знаходяться за межами цільової спільноти. За іншим варіантом, ДНК, що кодують варіанти оболонкового білка, можуть бути обрані таким чином, щоб представляти географічно віддалені спільності, міста чи країни, такі як клади (відособлені групи) (clades). Наприклад, в одній поліоболонковій вакцині можуть бути представлені множинні клони. Композиція поліоболонкової вакцини може додатково включати імуномодулятори, такі як цитокіни, що посилюють вибірковість імунної реакції на вірусну інфекцію. [Дивись, наприклад, Berkow та ін., Eds., The Merck Manual, Fifteenth Edition, Merck and Co., Rahway, NJ (1987); Goodman та ін., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eight Edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Third Edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987); і Katzung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992)], які, разом з наведеними у них посиланнями, відображують сучасний стан знань у цій галузі. Як зрозуміло рядовому фа хівцю у цій галузі, при введенні поліоболонкової вакцини за даним винаходом людині вона може бути у формі композиції, яка додатково може включати принаймні одну домішку із солей, буферів, ад'ювантів чи інших речовин, які є бажаними для поліпшення ефективності композиції. Ад'юванти є речовинами, які можуть бути використані для специфічного посилення принаймні однієї імунної реакції. Звичайно ад'ювант і композиція змішуються перед введенням до контакту з імунною системою, або вводяться до контакту окремо, але до одного й того самого місця особи, яку імунізують. Ад'юванти можуть бути вільно розділені на кілька груп на базі їх складу. Ці групи включають масляні ад'юванти, мінеральні солі (наприклад, AIK(SO4)2 , AINa(SO4) 2, AINH4(SO 4), оксид кремнію, каолін та хімічно чисте вугілля), полінуклеотиди (наприклад, полі-ІС та полі-АU-нуклеїнові кислоти) і деякі природні речовини (наприклад, віск D із Mycobacterium tuberculosis, речовини, знайдені у Corynebacterium parvum або Bordetella pertussis та членах роду Brucella). Серед цих речовин особливо корисними як ад'юванти є сапоніни (наприклад, Quil Α., Superfos A/S, Denmark). Приклади матеріалів, придатних для використання у композиціях вакцини, описані, наприклад, у Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), pp. 1324-1341. Фармацевтична композиція поліоболонкової вакцини за даним винаходом може далі додатково включати принаймні одну антивірусну хіміотерапевтичну сполуку. Необмежуючі приклади можуть бути обрані із принаймні однієї сполуки із групи, що складається з гаммаглобуліну, амантадину, гуанідину, гідроксибензімідазолу, інтерферону-a, інтерферону-b, інтерферону-g, інтерлейкіну-16 (IL-16; Kurth, Nature, 8 грудня 1995); тіосемикарбазонів, метизазону, рифампіну (rifampin), рибвірину (ribvirin), аналога піримідину (наприклад, AZT та/або ЗТС), аналога пурину, фоскарнету (foscarnet), фосфонооцтової кислоти, ацикловіру (acyclovir), дідезоксинуклеозидів, інгібітору протеази (наприклад, саквінавіру (saquinavir) (фірми Hoffmann-La Roche); індинавіру (indinavir) (фірми Merck); ритонавіру (ritonavir) (фірми Abbott Labs); AG1343 (фірми Agouron Pharmaceuticals); VX-2/78 (фірми Glaxo Wellcome)); хемокінів, таких як RANTES, ΜΙΡ1a чи МІР1b [Science, 270:1560-1561 (1995)] або ганцикловіру (ganciclovir). Дивись, наприклад, Richman: AIDs Res. Hum. Retroviruses, 8:1065-1071 (1992); Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 33:149-164 (1993); Antimicrob. Agents Chemother., 37:1207-1213 (1993); AIDs Res. Hum. Retroviruses, 10:901 (1994); Katzung (1992), нижче, та наведені у них посилання на сторінках 798-800 та 680-681, відповідно. Фармацевтичне застосування Введення поліоболонкової вакцини (або антисироватки, яку вироблення якої вона спричинює) може здійснюватись з «профілактичною» чи «терапевтичною» метою, бажано з профілактичною метою. При профілактичному введенні композиція живої поліоболонкової вакцини вводиться заздалегідь, до виявлення будь-яких симптомів інфекції ВІЛ чи захворювання на СНІД. Профілактичне введення сполуки (сполук) має на меті попередження чи послаблення будь-якої наступної інфекції ВІЛ. При терапевтичному застосуванні поліоболонкова вакцина вводиться при виявленні симптому дійсної інфекції. Введення живої поліоболонкової вакцини після інфекції ВІЛ здійснюється лише у ти х випадках, коли буде визначено, що імунна система пацієнта здатна відреагувати на введення живої поліоболонкової вакцини без суттєвого ризику неналежних ускладнень чи смерті, а введення живого вірусу здійснюється при дозуванні, яке потрібне для атенуації будь-якої дійсної інфекції ВІЛ. За іншим варіантом, якщо пацієнт має компромісну імунну реакцію, терапевтичне застосування бажано включає використання композиції атенуйованої чи інактивованої поліоболонкової вакцини, у якій рекомбінантні віруси є атенуйованими чи інактивованими, як було описано вище. Дивись, наприклад, Berkow (1987), нижче, Goodman (1990), нижче, Avery (1987), нижче, Katzung (1992), нижче, Dorozinsky and Anderson, Science, 252:501-502 (1991). Про композицію говориться, що вона є «фармацевтично прийнятною», якщо її введення може бути перенесено пацієнтом, який її одержує. Про такий агент говориться, що він вводиться у «терапевтично чи профілактично ефективної кількості», якщо введена кількість є фізіологічно значимою. Вакцина чи композиція за даним винаходом є фізіологічно значимою, якщо її присутність призводить до помітної зміни фізіології пацієнта, який її одержує, бажано шляхом посилення гуморальної чи клітинної імунної реакції на ВІЛ. «Захист», що забезпечується, не повинен бути абсолютним, тобто інфекція ВІЛ чи захворювання на СНІД не повинні бути повністью попереджені чи знищені, за умови, що спостерігається статистично значиме поліпшення відносно контрольної популяції. Захист може бути обмеженим зм'якшенням гостроти чи швидкості з'явлення симптомів хвороби. Фармацевтичне введення Вакцина за даним винаходом може надавати стійкість до одного чи кількох штамів ВІЛ. Таким чином, даний винахід стосується та пропонує засоби для попередження чи послаблення інфекції принаймні одним штамом ВІЛ. У даному описові про вакцину говориться, що вона попереджує чи послаблює хворобу, якщо її введення особі призводить чи до повного або часткового послаблення (тобто пригнічення) симптому чи хворобливого стану, чи до повного або часткового імунітету особи до хвороби. Для досягнення бажаної мети може бути введена принаймні одна поліоболонкова вакцина за даним винаходом за допомогою будь-яких засобів і з використанням фармацевтичної композиції, яка описана у цій заявці. Наприклад, введення такої композиції може бути здійснено різними парентеральними маршрутами, такими як підшкірно, внутрішньовенно, інтрадермально, внутрішньом'язово, інтраперитонеально, інтраназально, трансдермально чи трансбуккально. Парентеральне введення може бути здійснено шляхом ін'єкції болюса чи шляхом поступової перфузії протягом певного часу. Дивись, наприклад, Berkow (1987), нижче, Goodman (1990), нижче, Avery (1987), нижче, і Katzung (1992), нижче. Типова схема попередження, пригнічення чи лікування хвороби чи стану, які можуть бути послаблені завдяки створенню клітинної імунної реакції шляхом активної специфічної клітинної імуннотерапії, включає введення ефективної кількості композиції вакцини, як описано вище, при її введенні за один прийом або повторюваними дозами для посилення реакції чи вторинної імунізації на протязі періоду від одного тижня до приблизно 24 місяців включно. Згідно з даним винаходом, «ефективною кількістю» композиції вакцини є кількість, достатня для досягнення бажаного біологічного ефекту, у цьому випадку - викликання принаймні однієї із клітинної і гуморальної імунної реакції на ВІЛ. Зрозуміло, що ефективна доза буде залежати від віку, статі, стану здоров'я та ваги пацієнта, вида лікування, що проводиться одночасно, якщо воно є, частоти проведення лікування и характеру бажаного ефекту. Наведені нижче інтервали ефективних доз не повинні обмежувати винахід і репрезентують бажаний інтервал дозування. Однак, найбільш бажані схеми дозування будуть визначатись для кожної окремої особи фахівцем у цій галузі, який розуміється на цьому, без непотрібних експериментів. Дивись, наприклад, Berkow (1987), нижче, Goodman (1990), нижче, Avery (1987), нижче, Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, MA (1985), і Katzung (1992), нижче. Загалом кажучі, схема дозування для дорослої людини буде складати приблизно 105-109 бляшкоутворюючих одиниць (pfu)/кг чи колонієутворюючих одиниць (CFU)/кг на дозу, бажано 106-108. Будьяка доза, що застосовується, повинна бути безпечною і ефективною кількістю, що визначається відомими методами, як описано у цій заявці. Суб'єкти Реціпієнтами вакцин за даним винаходом можуть бути будь-які ссавці, що можуть набути специфічного імунітету за допомогою клітинної чи гуморальної імунної реакції на ВІЛ, у яких клітинна реакція медіюється булком МНС класу І чи класу II. Із ссавців бажаними реціпієнтами є ссавці ряду приматів (Orders Primata) (включаючи людей, шимпанзе, людиноподібних мавп та мавп). Найбільш бажаними реціпієнтами є люди. Суб'єкти бажано інфіковані ВІЛ або створюють модель інфекції ВІЛ [наприклад, Ни та ін., Nature, 328:721723 (1987)]. Після наведеного загального опису винаходу його буде легше зрозуміти з посиланнями на наступні приклади, які наведено як ілюстрацію, без наміру обмежити даний винахід. Приклади Приклад 1: Одержання векторів вірусу коров'ячої віспи для експресії оболонкового білка ВІЛ Номенклатура. При посиланнях у цій заявці комплекс рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи позначається також як Ууєлу-комплєкс, причому специфічні комплекси вірусу коров'ячої віспи позначаються відповідно до пацієнта або до депозиторію (наприклад, АТСС або GenBank як джерел оболонкової ДНК у комплексі). Наприклад, VVenv-Doe буде позначати комплекс вектора вірусу коров'ячої віспи, який має оболонкові послідовності, одержані від пацієнта на ім'я Doe, a VVenv-U28305 буде позначати вектор вірусу коров'ячої віспи, який має оболонкові послідовності, що знаходяться у GenBank за №U28305. Поліоболонкова вакцина складається із 4-100 різних рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, кожен з яких експресує окремий оболонковий білок ВІЛ-1. Задля визначеності кожен індивідуальний вірус позначається як VVenv, а готова вірусна суміш називається поліоболонковою. Для одержання кожного VVenv використовується плазміда, яку позначено pVenv4, і вірус коров'ячої віспи дикого типу, який позначено NYCDH, як описано нижче. Додаткові деталі наведено у Ryan та ін., «Preparation and Use of Vaccinia Virus for HIV Protein Expression and Immunization», у Immunology Methods Manual, Lefkovitz, ed., Academic Press (1996). Вектори і клітини-хазяїни. Описаний раніше вектор pSC11 [Chakrabarti, S. та ін., МоІ. Cell. Biol., 5:34033409 (1985)] може бути використаний длярекомбінації численних генів ВІЛ до геному коров'ячої віспи. Елементи плазміди pSC11 включають ген lacZ (ген-рипортер, по якому трансформовані бактерії і рекомбінанти вірусу коров'ячої віспи можуть бути легко ідентифіковані як такі, що мають b-галактозидазну активність), частину гена, що кодує тимідинкіназу (ТК) і ген стійкості до ампіциліну (amp). Клоновані у pSC11 гени вставляються до геному вірусу коров'ячої віспи шляхом гомологічної рекомбінації між геном ТК вірусу дикого типу і ділянками гена ТК, що входять до pSC11. Вставка ДНК плазміди до локусу вірусного ТК інактивує вір усний ген, так що рекомбінантні віруси можуть бути легко відібрани від фонових ТК+-вірусів за допомогою вирощування у бромодезоксиуридині (BUdR). Для того, щоб рекомбінантний ТК -вірус пережив цей відбір, його треба вирощувати у клітинах, що не постачають активний фермент ТК, таких як лінія клітин ТК-143, яка є ТК-позбавленим похідним лінії клітин людини R970-5 - лінії клітин остеосаркоми [Rhim, J.S. та ін., Int. J. Cancer, 15:23-29 (1975)], що підтримує ріст вірусу коров'ячої віспи [Weir та ін., нижче (1982)]. Експресія сегмента гена ВІЛ може бути здійснена шляхом вставки повного гена в сайт SmaІ вектора pSC11. Гени, що мають повну довжину, можуть бути експресовані під контролем промотора Р7.5К. Як альтернатива до клонування цілих генів ВІЛ, може здійснюватись заміщення частини генних послідовностей для генів ВІЛ, які вже були клоновані до pSC11. Наприклад, комплекс, позначений як pVenvi, був одержаний із pSC11 і експресує ген оболонкового білка (env) ВІЛ ВН10 [Hallenberger та ін., (1993); Kilpatrick та ін., J. Biol. Сhem., 262:116-1211 (1987)]. Комплекс може бути використаний як батьківський вектор для заміщення і експресії варіабельних ділянок оболонкового білка із польових ізолятів ВІЛ. Аналогічно, вектор, позначений pVenv4, був сконструйований із pSC11 для експресії оболонкового білка ВН10, скороченого з метою вилучення послідовностей gр41, що кодують трансмембранний домен та домен цитоплазменного хвоста, але при збереженом домені олігомеризації [Hallenberger та ін., (1993), нижче]. Кваліфікованому фахі вцю у цій галузі зрозуміло, що термін «домен олігомеризації» використовується функціонально, для позначення ділянки gр41, яка забезпечує олігомеризацію оболонкових білків, тобто залишається достатня структура для олігомеризації. Вектор pVenv4 кодує скорочений gр160 (також: gр160t, gр140), який, як було знайдено, утворює третинну структуру, аналогічну до структури олігомера gp41/gp120 (димер, тример чи тетрамер), яка присутня на клітинній поверхні інфікованих ВІЛ клітин. Ця третинна структура зберігається як у секретованій, так і у мембранноасоційованій формі [Hallenberger та ін., (1993), нижче]. Цей вектор бажано виколристовується як батьківській вектор для заміщення альтернативних ізольованих оболонкових послідовностей. У цьому Прикладі одержання кожного комплексу VVenv включає використання pVenv4 і вірусу коров'ячої віспи дикого типу NYCDH, а також відповідних клітин-хазяїнів, як детально описано нижче. pVenv4: Вектор pVenv4 був одержаний раніше шляхом вставки послідовності, що кодує оболонку ВІЛ-1, до рекомбінаційного вектора вірусу коров'ячої віспи pSC11 [Hallenberger та ін., Virology, 193:510-514 (1993); Chakrabarti, S. та ін., Моl. Cell. Biol., 5:3403-3409 (1985)]. Послідовність ВІЛ-1 одержували із лабораторного матеріалу живого вірусу. Послідовність було названо «ВН10» [Ratner та ін., Nature, 313:277-284 (1985)]. За допомогою методу PCR можна піддати ампліфікації унікальні оболонкові послідовності від інфікованих ВІЛ1 пацієнтів і провести їх заміщення в оболонкову послідовність ВН10 для створення нових векторів. Наприклад, для PCR можуть бути використані такі праймери: (A) Смисловий, положення 5785 (SEQ ID NO:1) (Ідентифікатор послідовності №1): AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA. (B) Антисмисловий, положення 7694 (SEQ ID NO:2): CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT. (C) Kpnl-смисловий, положення 5903 (SEQ ID NO:3): GTGGGTGACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGT. (D) Bsml-антисмисловий, положення 7659 (SEQ ID NO:4): CCAGAGATTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG. (E) (необов'язковий) Dralll-смисловий, положення 6153 (SEQ ID NO:5): CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG. (F) (необов'язковий) Вsu36І-антисмисловий, положення 6917 (SEQ ID NO:6): TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG. Ці праймери записані 5 до 3. Сайти рестрикції підкреслені (пронумеровані позиції вказано на основі послідовності ВН10 [Ratner та ін., Nature, 313:277-284 (1985)]. Стратегія PCR: Для одержання нових комплексів оболонкових білків ВІЛ-1, ланцюгова полімеразна реакція (PCR) використовується для ампліфікації 1800 комплементарних пар основ (bр) оболонкового гена із сорока різних зразків ВІЛ-1 від пацієнтів. Праймери PCR представляють добре збережені ВІЛ-1послідовності і, таким чином, успішно ампліфіковані оболонкові гени із багатьох різних пацієнтів, хворих на ВІЛ-1. Ампліфікована ДНК охоплює весь білок gр120, за винятком приблизно 10 добре збережених амінокислот з аміно-кінця білка. Продукти PCR включають всі варіабельні оболонкові ділянки (V1-V5). Крім того, ампліфіковані послідовності кодують приблизно 100 амінокислот за межою сайта розщеплення для gp120/gp141. Праймери PCR, що містять сайти рестрикції ферменту для Kрnl та Bsml, розміщені з боків послідовності оболонкового гена ВН10 у pVenv4, включаються до ампліфікованих ДНК-продуктів. Перша стадія PCR: У пробірці мікроцентрифугі ємністю 500мкл змішують: - 1мкл Праймера A (SEQ ID NO:1), 300нг/мкл; - 1мкл Праймера В (SEQ ID NO:2), 300нг/мкл; - 2,5мкл 10мМ кожного з 4 dNTP - 1мкг ДНК; - 10мкл 10Х PCR-буфера; і - хроматографічно чисту воду до 99мкл. Змішують маточний розчин у вихровій мішалці і дозують 1мкл до реакції PCR. Ретельно змішують. Зверху заливають мінеральним маслом. Обробляють у програмованому термостаті у такому режимі: - Інкубують при 95° - Виконують 40 циклів: 95°С, 1 хвилина; 45°С, 2 хвилини; 72°С, 3,5 хвилини. Друга стадія PCR: Готують реакцію PCR як описано вище, але з праймерами С та D (SEQ ID NО:3 та 4, відповідно) і без ДНК. Доводять готовий розчин до 95мкл. Зверху заливають мінеральним маслом. Закупореним наконечником вилучають 5мкл першої PCR-реакції (з-під мінерального масла). Змішують зразок з другою реакцією під шаром масла і розпочинають цикли, як і раніше. Звичайно достатньо тридцяти циклів. Може бути бажаним контролювати продукт шля хом вилучення 2мкл для аналізу на гелі після кожних 10 циклів доти, доки не буде ідентифікована чітка смуга, що відповідає приблизно 1800bр. Шляхом використання добре відомих методик заміщувального клонування було одержано похідні pVenv4, що експресують оболонкову послідовність від одного із 40 пацієнтів замість оболонкової послідовності ВН10. Коротко, плазміда pVenv4 і продукти PCR потім розрізають Kрnl та Bsml, розрізану pVenv4 розділюють на агарозному гелі і ізолюють великий фрагмент. Маленький фрагмент ВН10 (фрагмент розміром 1800bр) вилучають. Вирізаний продукт PCR також ізолюють і лігують з великим фрагментом pVenv4 для створення хімерної оболонкової послідовності, що містить тепер 1800bр варіантного оболонкового білка із ДНК пацієнта. Після лігування продукту PCR і продуктів pVenv, бактеріальні клітинихазяїни трансформують з сумішшю для лігування за допомогою будь-якого із добре відомих фахівцям методу, включаючи, наприклад, електропорацію, і рекомбінантні колонії збирають і аналізують секвенуванням. Плазміда pVenv4 чи рекомбінанти, виготовлені з використанням pVenv4, сприяють інсерції генів до геному вірусу коров'ячої віспи шляхом гомологічної рекомбінації між геном тимідинкінази (Тk) вірусу дикого типу і Tk-послідовностями в плазміді. Вставка ДНК pVenv4 до вірусного локусу Tk дозволяє одержати вірус коров'ячої віспи з оболонковим геном ВІЛ-1, експресуємим під контролем раннього/пізнього промотора Р7.5К. Активність вірусу до росту послаблюється завдяки розриву локусу Tk. Додатковим елементом pVenv4 є ген lacZ, який кодує b-галактозидазну активність. Активність lacZ може бути використана для відбору рекомбінантів вірусу коров'ячої віспи (дивись нижче). Оболонковий ген, що експресується pVenv4, є скороченим для того, щоб виключити трансмембранну/Стермінальну послідовність gр41. Вектор експресується як олігомерна структура, яка знаходиться усередині клітин у секретованій формі. Вірус коров'ячої віспи-NYCDH. Кожна нова заміщена плазміда окремо рекомбінується з вірусом коров'ячої віспи дикого типу NYCDH. Цей вірус було одержано від А.Т.С.С. (Accession No.VR-325) і піддано очищенню у бляшках перед використанням [Buck, C, and Paulino, M.S., eds., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses ans Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, 6 th Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD(1990), p.138]. Бактеріальні клітини-хазяїни. Плазміда може бути вирощена на будь-якому придатному хазяїні, як це відомо фахівцям у цій галузі [дивись, наприклад, Ausubel, нижче, (1995 rev.), §§16.15-16.19]. Необмежуючим прикладом є клітини DH5a. ТК-недостатні клітини. Трансформування та заміщення вірусу коров'ячої віспи здійснюється на лінії клітин людини Tk 143B, яка є ТК-недостатнім похідним лінії клітин людини R970-5 - лінії клітин остеосаркоми [Rhim та ін., (1975), нижче], яка підтримує ріст вірусу коров'ячої віспи [Weir та ін., (1982), нижче]. Кожен рекомбінант вірусу коров'ячої віспи, що містить унікальну послідовність оболонкового гена ВІЛ, вибирається на основі експресіє гена lacZ (на вірусні бляшки накладають шар Bluo-gal і вибирають по b-галактозидазній активності, яку визначають по появі синього кольору). Здійснюють дві стадії PCR. Приклад 2 :Одержання поліоболонкової вакцини Останньою стадією приготування є вирощування n комплексів VVenv на клітинах Vero, щойно придбаних у А.Т.С.С. (Accession No. CCL81 чи Х38) і клонованих та розмножених для вирощування вірусу. Лінія клітин Vero була схвалена Всесвітньою Організацією Охорони Здоров'я для одержання вакцин [Hay, R., та ін., eds., American Type Culture Collection Catalogue Cell Lines and Hybridomas, 7 th Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1992), p.48]. Клітини Vero вирощують з використанням середовища Ігла, модифікованому за Дульбеко (BioWhittaker), глутамінової добавки (Bio-Whittaker) та термоінактивованої сироватки плоду корови (Hyclone, Inc.). За іншим варіантом, може використовува тись середовище, що не містить сироватки. Кожен комплекс VVenv інокулюють на окремий злитий шар клітин Vero, і збирають вирощені клітини, коли вони демонструють цитопатичні ефекти внаслідок вірусної інфекції. Екстракти клітин тривалий час промивають фосфа тно-сольовим буфером (Bio-Whittaker) після збору і перед заморожуванням. Клітини потім розрушають циклічним заморожуванням-відтаюванням, озвученням чи центрифугуванням у центрифузі на малій швидкості (необов'язково). Аліквоти надосадної рідини зберігають потім при -70°С. Оболонковий білок є присутнім у лізаті в концентраціях, достатніх для одержання антитіла, специфічного до оболонкового білка ВІЛ (при визначенні методом імуноферментного твердофазного аналізу), у моделях ссавців, навіть якщо вірус коров'ячої віспи був послабленим, наприклад, шляхом нагріву препарату до 60°С протягом 1 години. Готова вакцина. Матеріал кожного вірусу (комплекс VVenv) із клітин Vero індивідуально заморожують і потім титрують і піддають випробуванням на безпеку. Після завершення тестів аліквоти кожного вірусу змішують для одержання маточної вакцини з загальним титром 10 8pfu/мл («pfu» позначає бляшкоутворюючі одиниці). Якщо було використано 40 комплексів VVenv, то кожен VVenv бажано є представленим у рівному ступеню, і кожен VVen v використовується з титром 2,5´106pfu/мл у готовій вакцині. Це повинно дати загалом 1´108pfu/мл. Оцінка поліоболонкової вакцини Миші. Миші можуть бути інфіковані за допомогою інтраперитонеальної ін'єкції 1´107pfu вірусу коров'ячої віспи, експресуючого оболонковий білок. Антитіло може бути ідентифіковано методом імуносорбентного твердофазного аналізу на ВІЛ, або методами аналізів нейтралізації, як описано вище, через три тижні після ін'єкцій вірусу коров'ячої віспи. Перед виготовленням вакцини, призначеної для застосування на людях, була одержана аналогічная група,вірусів з метою випробування вакцини на мишах. Ці віруси вводились мишам інтраперитонеальним чи підшкірним шляхом. Потім ми здійснювали тестування активності ВІЛ-1-специфічних антитіл сироватки методом імуносорбентного твердофазного аналізу (ELISA). Аналіз включає висіювання цілих розрушених ВІЛ-1 на планшетах для (HTLVIIIB) і блокування планшетів альбуміном бичачої сироватки. Потім додавали зразки сироватки при розведенні 1:100, 1:1000 і 1:10000 у фосфатно-сольовому буфері. Проби проявляли кон'югованим з лужною фосфатазою антитілом козлиного-анти-мишачого імуноглобуліну і пнітрофенілфосфатом. Кольорову реакцію припиняли розчином гідроксидом натрію, і оптичну густину вимірювали за допомогою пристрою для вимірювання оптичної густини планшетів ELISA при 405нм. Як зображено на Фігурі 2, однократна інокуляція препаратом лізату клітин з 106-107pfu вірусу коров'ячої віспи (який містить одну кодуючу послідовність оболонкового білка ВІЛ-1 і мембранно-зв'язаний експресований оболонковий білок) викликає сильну реакцію антитіл проти ВІЛ-1, яка зберігалась на протязі шести місяців проведення експерименту. Така реакція антитіл була значно вищою за описані раніше для інших методів імунізації. Ця сильна реакція антитіл може бути приписана до присутності у препараті вакцини мембранно-зв'язаного оболонкового білка. Як зображено на Фігурі 3, ці реакції залежали від дози. У ссавців, які одержали дозу 106pfu, спостерігались слабші реакції, ніж у ссавців, які одержали 107pfu. Були також одержані суміші вірусів коров'ячої віспи, що експресують різні оболонкові білки ВІЛ-1. Коли миші одержували 107pfu суміші п'я ти вірусів, їх реакції були по суті ідентичними по силі до реакцій, що генеруються проти 107pfu одного рекомбінанта вірусу коров'ячої віспи (Фігура 4). Змішування великої кількості вірусів коров'ячої віспи, експресуючих оболонкові білки, описано не було, але очікується, що воно створить широкий спектр нейтралізуючих антитіл. Люди. Перед клінічними випробуваннями проводились тести змішаного вірусного матеріалу, метою першого з ниж була ескалація доз і тестування на безпеку. Клінічні випробуваня будуть дослідженнями ескалації дози, які включають набір чотирьох груп добровольців. Кожна група одержує одну із таких доз вакцини: (1) 2´104pfu (2) 2´105pfu (3) 2´106pfu (4) 2´107pfu Кожен доброволець одержує змішану вірусн у вакцину у 0,5мл сольвого розчину, яка вводиться шляхом підшкірної ін'єкції. Приклад 3: Індукування первинного ізолят-нейтралізуючого імунітету за допомогою поліоболонкової вакцини ВІЛ-1 на основі вірусу коров'ячої віспи у шимпанзе Популяція ізолятів ВІЛ-1 озброєна складним набором оболонкових білків. Оболонкові білкі є єдинимі вірусно-кодуємими зовнішнімi білками і цілями для активності нейтралізуючих антитіл, але антитіла, що виробляються проти одного ізоляту, не будуть обов'язково нейтралізувати інший. Внаслідок цього ми одержали вакцину-коктейль ВІЛ-1 - поліоболонкову вакцину, яка експресує численні оболонкові білкі. Виготовлення вакцини почалось з одержання тридцяти різних рекомбінантів вірусу коров'ячої віспи, кожен з яких експресував окремий оболонковий білок. Після цього були проведені випробування VVenv, як окремих, так і у сполученні (PolyEnv), на моделі шимпанзе. Чотирьох шимпанзе імунізували підшкірно трьома ін'єкціями окремого оболонкового білка (VVenv) (Шимпанзе 1 та 2) або PolyEnv (Шимпанзе 3 та 4), після чого робили одну внутрішньом'язову ін'єкцію рекомбінантного білка gp120/gp141 у суспензії оксиду алюмінію. Для усіх чотирьох тварин було продемонстровано безпеку, лише у однієї спостерігались ознаки ульцерації у місці ін'єкції. Зразки сироватки контролювали за допомогою численних тестів на зв'язування та нейтралізацію ВІЛ. Найвищу якість активності антитіл продемонстрували антитіла шимпанзе 3 та 4. Нейтралізуюча функція була продемонстрована як до лабораторного ізоляту, так і до первинного ізоляту ВІЛ-1, жоден з яких не був специфічно представлений у вакцині. Таким чином, праймування лімфоцитів з використанням змішаних оболонкових білків є перспективним методом, за яким можна виробити високоякісні антитіла проти різних ВІЛ-1. Матеріали та методи pVenv4, вектор рекомбінації вірусу коров'ячої віспи. pVenv4 був одержаний раніше шляхом введення стопового кодону до оболонкової послідовності ВН10 і вставки модифікованого оболонкового гена ВН10 (env) до pSC11. pVenv4 експресував продукт оболонкового білка, який був обірваний на амінокислоті 640 і був здатний як до секреції, так і до олігомеризації. Продукування рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, VVenv4, що експресує цей скорочений оболонковий білок ВН10, було описано раніше [Hallenberger та ін., Virology, 193:510-514(1993)]. PCR для ампліфікації оболонкових послідовностей від інфікованих ВІЛ-1 осіб. Для ампліфікації оболонкових послідовностей ВІЛ було використано ланцюгову полімеразну реакцію (PCR). Загалом, це були зразки, одержані із крові осіб, інфікованих на ВІЛ-1, узяті при першому встановленні діагнозу ВІЛ. Інші зразки були одержані від осіб з клінічними симптомами СНІД, або із продуктів, наданих AIDS Research and Reference Reagent Repository (Сховищем еталонів та реагентів для досліджень СНІД). Для зразків крові ДНК спочатку одержували шляхом додавання по краплям крові чи інфікованих клітин до лізисного буферу на основі ДСН і інкубування при 65°С протягом 30 хвилин. Додавали проназу у концентрації 0,5мг/мл і лізат продовжували інкубувати при 45°С протягом ночі. Після двох екстракцій фенолом продукт висаджували етанолом і ресуспендували ДНК у воді. Здійснювали два раунди PCR для усіх зразків ДНК стандартними методами. Праймерні послідовності обирали на основі опублікованої послідовності ВН10 [Ratner та ін., Nature, 313:277-284 (1985)]. Для одержання фрагментів, які включають послідовності зі всіх варіабельних ділянок і частину gр41, використовували праймери PCR, як описано у Прикладі 1. Продукти PCR потім піддавали клонуванню шляхом заміщення до вектору pVenv4 за стандартними методами. Секвенування нових плазмід здійснювали з використанням методу Сенгера і праймера ccatgtgtaaaattaaccccactctgtg (SEQ ID NO:5). Одержання VVenv. Нові рекомбінанти вірусу коров'ячої віспи (VVen v) було одержано шляхом трансфекції клітин, інфікованих вірусом коров'ячої віспи (NYCDH, АТСС), новими заміщеними рекомбінантними плазмідами (дивись вище). Для сприяння трансфекції використовували препарати Transfectam (Promega) та Lipofectamine (Gibco, BRL) згідно з рекомендаціями виробника. Віруси коров'ячої віспи піддавали очищенню у бляшках. Імунізації. Лізати VVen v-інфікованих клітин вводили шимпанзе шляхом підшкірних ін'єкцій. VVenv використовувались окремо або у комбінаціях. Загальна кількість вірусу коров'ячої віспи у перерахунку на pfu (бляшкоутворюючі одиниці) були близькими для кожної ін'єкції (приблизно 107pfu), що робилась тваринам. Для внутрішньом'язових ін'єкцій використовувались суміші приблизно 40 мікрограм gр120 (номер за каталогом 12101, Intracel, Cambridge, MA), 20 мікрограм gр41 (номер за каталогом 036001, Intracel) і 500 мікрограм гелю гідроксиду алюмінію (Rehsorptar Aluminum hydroxide Adsorptive Gel, Intergen Co., Purchase, N.Y.) на інокулят. Імуноферментні твердофазні аналізи (ELISA). П'ять аналізів ELISA було зроьлено таким чином: ELISA №1 - набір для клінічного аналізу ELISA фірми Abbott було придбано у Abbott Laboratories і використано згідно з рекомендаціями виробників (HIVAB HIV-1/HIV-2 (rDNA) EIA, Abbott Laboratories, Abbott Park, I.L.). ELISA №2: Аналізи методом ELISA здійснювали шляхом висівання рекомбінантного Mn-gp160 (Quality Biological, Inc., Gaithersburg, MD) у концентрації 1мкг/мл. Планшети блокували і аналізи проводили при трикратному послідовному розведенні сироваткою. Планшети потім промивали і підрахунки проводили з використанням анти-людського IgG, кон'югованого з лужною фосфатазою. ELISA №3: Планшети для аналізів ELISA покривали LAI/gp120 (вуглеводневий дериват білка, CHO-derived protein, Intracel) з концентрацією один мікрограм/мл. Зразки сироватки висівали після розведення 1:100 і підраховували з використанням анти-людського lgG1, кон'югованого з лужною фосфатазою (мишачий анти-людський lgG1AP, номер за каталогом 9050-04, Southern biological Associates, Inc., Birmingham, A.L.), і nнітрофенілфосфатази. Оптичну густин у вимірювали при 405нм. ELISA №4: Аналіз ELISA здійснювали як за методикою №3, за винятком того, що планшети покривали ІІІВ-gр120 (дериват білка бациловірусу, Intracel, номер за каталогом 12001, Cambridge, MA) у концентрації один мікрограм/мл. ELISA №5: Аналіз ELISA здійснювали як за методикою №3, за винятком того, що планшети покривали лізатом вірусу 1MB (Organon Teknika Co., Durham, N.Y.) у концентрації один мікрограм/мл. Аналізи нейтралізації. Аналізи нейтралізації проводили з лабораторними чи первинними ізолятами [Montefiory та ін., J. Clin. Microbiol., 26:231-237 (1988); Montefiori та ін., Journal of Infectious Diseases, 173:6067 (1996)]. Лабораторні ізоляти: Вірус змішували при розведенні 1:20 з кодним зразком сироватки і висівали на планшети на клітини МТ-2 чи CEM-X174. Для оцінки життєздатності клітин використовували фарбування нейтральним червоним. Позитивне відхилення було визначено як зменшення смертності клітин на 35-40% порівняно з контрольними культурами. Первинні ізоляти: Вірус змішували при розведенні 1:4 з кожним зразком сироватки і висівали на периферійних моноядерних клітинах крові (РВМС), стимульованих фітогемаглютиніном (РНА). Підраховували р24. Позитивним результатом вважалось зменшення інфіційності щонайменше на 75% порівняно з контрольними культурами. Результати Одержання нових рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи VVenv. З метою одержання нових рекомбінантів вірусу коров'ячої віспи (VVenv), кожен з яких окремий оболонковий білок ВІЛ-1, спочатку ізолювали ДНК із зразків ВІЛ-1. Більшість ДНК було одержано із крові осіб, які не виявляли зовнішніх ознак хвороби, і яким, вірогідно, вперше було поставлено діагноз інфекції ВІЛ-1. Додаткові ДНК було одержано від пацієнтів, хворих на СНІД, або із вірусів, наданих AIDS Research and Reference Reagent Repository (Сховищем еталонів та реагентів для досліджень СНІД). Здійснювали PCR з використанням пар праймерів, які охоплюють сайти рестрикції Kрnl і Bsml. Після цього проводили заміщення фрагментів у векторі pVenv4, зображеном на Фігурі 5 (pVenv4 спочатку експресував скорочений білок ВІЛ-1, ВН10), по сайтам рестрикції Kрnl і Bsml. У такий спосіб послідовності gp120 (V1-V5) і др41 із ВН10 заміщували на відповідні послідовності у продуктах PCR. З кожною із заміщених плазмід готували новий рекомбінантний вірус коров'ячої віспи (VVenv). Цей метод забезпечує простий засіб, з використанням якого можна впровадити широкий спектр оболонкових послідовностей до унікальних рекомбінантів вірусу коров'ячої віспи (VVen v). Цікаво, що більшість послідовностей була продуктивною, дозволяючи припустити, що оболонкові послідовності у провірусних геномах (із яких було одежано більшість продуктів PCR) рідко були дефектними. Існує величезна різноманітність у VVen v, використаних у змішаній вакцині. Імунізація шимпанзе окремим чи змішаним VVen v. Чотири шимпанзе було використано для тестування окремих і змішаних рекомбінантних вакцин вірусу коров'ячої віспи. Схема імунізацій наведена у Таблиці 2. Перші три ін'єкції містили вірус коров'ячої віспи, а остання ін'єкція містила комбінацію gр120, gр41 і гелю гідроксиду алюмінію, при внутрішньом'язовом введенні. Шимпанзе 1 і 2 одержували лише один вірус коров'ячої віспи і відповідний оболонковий білок, які вводили у кожній із перших трьох ін'єкцій. Шимпанзе 3 і 4 одержували суміш 10 рекомбінантних вірусів віспи (і відповідні оболонкові білки у першій ін'єкції), десять додаткових оболонкових білків у другій ін'єкції, і 10 додаткових, унікальних оболонкових білків, у останній імунізації, що загалом склало 30 окремих векторів перед повторною білковою імунізацією. Всі шимпанзе одержали близькі кількості загального вірусу коров'ячої віспи у перерахунку на бляшкоутворюючі одиниці і близькі кількості загальних рекомбінантних білків. Таблиця 2 Схема імунізації шимпанзе змішаними рекомбінантами вірусу коров'ячої віспи Шимпанзе 1 і 2: Шимпанзе 3 і 4: Дата 1/9/96 4/16/96 6/11/96 7/30/96 1/9/96 4/16/96 6/11/96 7/30/96 Ін'єкція Вірус коров'ячої віспи (оболонковий білок №1) Вірус коров'ячої віспи (оболонковий білок №1) Вірус коров'ячої віспи (оболонковий білок №1) рекомбінантний gр120 і рекомбінантний gр41 + гель гідроксиду алюмінію Вірус коров'ячої віспи (оболонкові білкі №1-10) Вірус коров'ячої віспи (оболонкові білкі №11-20) Вірус коров'ячої віспи (оболонкові білкі №21-30) рекомбінантний gр120 і рекомбінантний gр41 + гель гідроксиду алюмінію Рекомбінантні VVen v можуть бути введені без виникнення уражень. Усіх чотирьох шимпанзе контролювали на виявлення ознак системної хвороби і утворення уражень у місці інфекції. Тварин щоденно аналізували для виявлення проносу, ринореї, кашлю, чихання, прискореного дихання, летаргії, обмеженої рухової здатності і втрати апетиту. Жодна з цих ознак не спостерігалась у жодної із тварин у будь-який час. Фотографії місць ін'єкції, зроблені через регулярні проміжки часу після першої імунізації вірусом коров'ячої віспи показують помітне напухання для усіх чотирьох тварин. Слабкі вогнища ураження з'являлись у місці ін'єкції для шимпанзе 1 і 3, типові для вакцинації віспи, тоді як у шимпанзе 2 і 4 помітних вогнищ ураження не спостерігалось. Ніяких ознак хвороби, напухань чи вогнищ ураження не спостерігалось після другої, третьої чи четвертої ін'єкцій у жодної тварини, що свідчить про створення специфічного до вірусу коров'ячої віспи імунітету першим щепленням. Ін'єкції VVen v з послідуючою білковою бустерною імунізацією призводили до вироблення ELISAпозитивного антитіла. ВІЛ-специфічні антитіла контролювали під час проведення схеми імунізації за допомогою п'яти різних методів імуносорбентного твердофазного аналізу (ELISA). Аналізи ELISA використовували для вимірювання відносної, а не абсолютної, кількості антитіл у кожної тварини. У більшості випадків, для тестів використовували вірусні фрагменти, яким бракувало тривимірної і олігомерної структури, типової для нативних оболонкових білків. У цих випадках очікується, що ELISA буде зв'язувати лише підгрупу ВlЛ-специфічних білків. Результати, одержані для Abbott ELISA, зображено на Фігурі 6. Шимпанзе 3 перевищив порогове значення на позитивність після першої імунізації вірусом коров'ячої віспи, тоді як шимпанзе 4 перевищив порогове значення після другої імунізації VVenv. Реакції шимпанзе 3 і 4 наприкінці схеми імунізації значно перевищували показники шимпанзе 1 і 2. Для ELISA №2 з використанням MN gр160 сильна реакція спостерігалась лише для шимпанзе 3. Цю реакцію було одержано до проведення повторної білкової імунізації, і бустерна ін'єкція не вплинула на неї. Реакція на CHO-LAI, зв'язаний на ELISA планшетах (ELISA №3) з використанням того ж самого антигена, який було використано для повторної імунізації очищеним білком, показала, що лише шимпанзе 3 мав сильну реакцію. Для ELISA №4 зі зв'язаним на планшеті ІІІВ-gр120 у шимпанзе 2 спостерігався високий фон і, можливо, завдяки високому фонові, найвищий показник реакції з усіх тварин. Реакції на п'ятий аналіз ELISA - вірусний лізат Organon Teknika lllB - були позитивними для сироватки від усіх чотирьох тванин. Реакції нейтралізації щодо первинних і лабораторних ізолятів. Аналізи нейтралізації здійснювали з сироваткою, одержаною від кожної тварини, по відношенню до лабораторних і первинних ізолятів. Першій аналіз проводили на лінії Т-клітин, а останній - на сироватка-негативних РНА-стимульованих РВМС. В усі х випадках, ізоляти не співпадали з матеріалами, представленими у вакцинах ВІЛ-1. Як показано у Таблиці 3, зразки від шимпанзе 2, шимпанзе 3 і шимпанзе 4 мали позитивне відхилення (35-40% інгібування росту вірусів) порівняно з MN лабораторним ізолятом у Т-клітинах. Аналізи з двома іншими лабораторними вірусами (один із ІІІВ [Lockey та ін., Aids Res. Hum. Retroviruses, 12:1297-1299 (1996)], і другий із SF2 матеріалу) не дали позитивних результатів для будь-якого із зразків. Наведено результати аналізів нейтралізації [Montefiori та ін., 1988, вище; Montefiori та ін., 1996, вище] з чотирма первинними ізолятами, проведених з РНА-стимульованими РВМС. У цих аналізах вірус вважається таким, що важко нейтралізується, оскільки сироватка пацієнтів часто дає негативні результати, навіть при використанні розведення 1:2 [Fenyo та ін., AIDS, 10:S97-S106 (1996); Moore and Ho, AIDS, 9:S117-S136 (1995); Montefiori та ін., 1996, вище]. Цікаво, що сироватка шимпанзе 4 у розведенні 1:4 була здатна нейтралізувати один із тестових первинних ізолятів. Ця ситуація відрізняється від результатів інших досліджень оболонкових вакцин, оскільки у більшості попередніх випадків сироватка від імунізованих оболонковими вакцинами осіб давала негативні результати при проведенні аналізів нейтралізації первинних ізолятів [Steele, Journal of NIH Research, 6:40-42 (1994); Moore, Nature, 376:115(1995)]. Таблиця 3 Нейтралізація вірусів, не представлених специфічно у вакцині, антисироваткою шимпанзе Ізолят Шимпанзе 1 Шимпанзе 2 Шимпанзе 3 Шимпанзе 4 Лабораторний штам MN Позитивне відхилення Позитивне відхилення Позитивне відхилення Первинний №1 Первинний №2 Первинний №3 Позитивне Первинний №4 Змішані VVen v викликає більш високу якість ВІЛ-1-специфічних антитіл, ніж окремий VVen v. Результати ELISA і аналізів нейтралізації зведено у Таблиці 4, де вказані шимпанзе, сироватка яких давала найсильнішу реакцію у семи описаних вище теста х. Як можна побачити із таблиці, шимпанзе 3 і 4 мали позитивні результати загалом у п'яти із семи тестів, тоді як шимпанзе 1 і 2 мали позитивні результати лише у трьох із семи тестів. Цей результат може відібражати більш високу якість антитіл, викликаних поліоболонковою вакциною порівняно з вакцинами, що містять один оболонковий білок. Таблиця 4 Зведені результати аналізів ELISA та нейтралізації Аналіз Більш сильні реакції у шимпанзе, яким було введено один вірус коров'ячої віспи Abbott (IIIB-gp41) - ELISA №1 MNgp160BAC ELISA №2 IIIB-gp120-BAC-ELISA №3 Шимпанзе 2 LAI-gp120-CHO-ELISA №4 Лізат вірусу ІІІb ELISA №5 Шимпанзе 1 і Шимпанзе 2 Лабораторний ізолят Шимпанзе 2 нейтралізація (відхилення) Первинний ізолят -нейтралізація Більш сильні реакції у шимпанзе, яким було введено змішані віруси коров'ячої віспи Шимпанзе 3 і Шимпанзе 4 Шимпанзе 3 Шимпанзе 3 Шимпанзе 3 і Шимпанзе 4 Шимпанзе 3 і 4 Шимпанзе 4 Обговорення Експерименти, описані у цьому Прикладі, були призначені для тестування безпеки вакцини ВІЛ-1 на основі вірусу коров'ячої віспи та порівняння ефективності праймування оболонковими коктейлями і окремими оболонковими вакцинами. Результати продемонстрували, по-перше, що вірус коров'ячої віспи може бути використаний як імуноген, не утворюючи при цьому відкритого ушкодження, і по-друге, що оболонковий коктейль може викликати дуже широкий спектр ВІЛ-1-специфічної активності. Модель шимпанзе дозволила нам дослідити безпеку поліоболонкових вакцин на приматах. Зокрема, нам цікаво було визначити ступінь утворення відкритих ушкоджень, оскільки щеплення вірусу коров'ячої віспи могло становити загрозу передачи живого вірусу неімунізованим особам. У випадку ВІЛ існує серйозне занепокоєння щодо того, що хворий на СНІД пацієнт може не мати змоги заблокувати інфекцію вірусом коров'ячої віспи. Для вирішення цієї проблеми ми протестували використання підшкірної вакцинації на шимпанзе з метою вияснити, чи можна уникнути утворення відкритого ушкодження. Дійсно, відкриті ушкодження спостерігались лише у дво х з чотирьох шимпанзе. Аналогічні результати спостерігались при використанні матеріалу вірусу коров'ячої віспи NYCDH у клінічних випробуваннях підшкірних ін'єкцій вакцини віспи [Connor та ін., Journal of Infectious Diseases, 135:167-175 (1977); Benenson та ін., Journal of Infectious Diseases, 135:135-144(1977)]. Імовірно, що при додатковій увазі до процедури ін'єкції та післяпроцедурному спостереженні за місцем ін'єкції відкритих ушкоджень можна уникнути в усіх випадках. Ці результати демонструють, що проблеми безпеки не повинні перешкоджати використанню вірусу коров'ячої віспи як вектора вакцини ВІЛ-1. Було проведено тестування оболонкових коктейлей в експериментах на мишах (Приклад 2) та кролях. В експериментах на мишах контролювали анти-ВІЛ антитіла після однієї ін'єкції VVenv, тоді як у кролей VVenv було використано для підсилення реакції, створеної вакциною на основі ДНК. Експерименти засвідчили, що ВІЛ-1-специфічні антитіла можуть бути створені чи посилені за допомогою VVenv, і що первинні ізоляти можуть бути нейтралізовані реакцією антитіл. Для вивчення потенціалу змішаних VVenv (PolyEnv), шимпанзе були розділені на дві групи. Перші два шимпанзе одержали лише одну VVenv, тоді як шимпанзе 3 і 4 одержали коктейль, який складався загалом із тридцяти різних VVen v. Після проведення імунізації вірусом коров'ячої віспи усім чотирьом шимпанзе робили бустерну імунізацію сумішшю одного gp120/gp141 білка з гелем гідроксиду алюмінію. Сироватку від кожного з чотирьох шимпанзе тестували п'ятьма різними аналізами ELISA, у кожному з яких використовувався інший фрагмент та/або конфігурація оболонкового білка. Цікаво, що обидва шимпанзе 1 і 2 дали сильну реакцію лише в одному з цих аналізів ELISA, тоді як сироватка від обох шимпанзе 3 і 4 дала сильну реакцію у 4 таких аналізах. Оскільки кожен аналіз вимірював лише частину ВІЛ-1 - специфічних антитіл у кожної тварини, ці результати імовірно відібражають значно ширший спектр зв'язуючої активності антитіл, утворених змішаною вакциною. Були також зроблені аналізи нейтралізації для лабораторних та первинних ізолятів. Цікаво, що позитивна реакція проти первинного ізоляту спостерігалась у шимпанзе 4, незважаючи на те, що первинний ізолят не був специфічно представлений у вакцинній суміші. Ці результати знов продемонстрували ширший спектр антитіл, створюваних вакциною-коктейлем PolyEnv. Можна очікувати, що підвищення антигенної складності вакцини призведе до підвищеної різноманітності лімфоцитів і відповідних реакцій антитіл. Той факт, що можуть бути утворені нейтралізуючі антитіла проти первинного ізоляту, який не був представлений у вакцині, свідчить, що білкі, які розрізняються за лінійною структурою, мають спільну конформаційну структур у. Це спостереження підтверджується також імунними реакціями пацієнтів, інфікованих ВІЛ-1, коли будь-які дві особи, що зазнають дії безлічі вірусів, які взаємно виключають один одного, є загалом захищеними від суперінфекції при перехресній експозиції. Використання поліоболонкової вакцини є першою спробою імітувати стан пацієнтів, інфікованих ВІЛ-1, у системі шимпанзе. Тобто, створюються нейтралізуючі антитіла з широким спектром оболонкових білків, а не з одним білком. Підсумовуючи, ми протестували на моделі шимпанзе вакцину-коктейль ВIЛ-1 на основі вірусу коров'ячої віспи, яку було названо поліоболонковою (PolyEnv). Цей приклад продемонстрував: 1) Вірус коров'ячої віспи може бути використаний без утворення відкритих ушкоджень шкіри. 2) ця вакцина дозволяє одержати широкий спектр активності ВІЛ-1-специфічних антитіл; і 3) коктейль комплексів оболонкових білків (PolyEnv) забезпечив вищу якість ВІЛ-специфічних антитіл порівняно з окремим комплексом оболонкового білка. Вірус коров'ячої віспи вже давно відомий як сильна вакцина, як у формі вірусу дикого типу, так і в рекомбінантній формі. Сила вірусу коров'ячої віспи полягає у його здатності активізувати складові імунної реакції, пов'язані як з В-, так і з цитотоксичними Т-лімфоцитами. Вірус коров'ячої віспи є єдиною вакциною, яка була здатна винищити хворобу (віспу) у населення. Дані в цьому Прикладі показують, що рекомбінантні вектори вірусу коров'ячої віспи зроблять свій внесок до наступної боротьби з ВІЛ-1. Приклад 4: Одержання біфункціональної плазміди Було показано, що вакцини ДНК створюють сильні реакції антитіл та CTL у кількох різних системах (грип, ВІЛ-1 і т.ін.). Вакцини грипу та ВІЛ-1 на основі ДНК вже проходять клінічні випробування на здорових дорослих добровольцях. Вірус коров'ячої віспи також є важливою основою програм вакцинації. До речі, вірус коров'ячої віспи був єдиною вакциною, яка виявилась здатною викоренити хворобу (віспу) у населення. Численні рекомбінантні віруси коров'ячої віспи викликали захисні імунні реакції, як було продемонстровано на тваринних моделях. Наведені вище дані демонструють ефективність поліоболонкової вакцини і стратегій об'єднання вірусів, наприклад, вакцин ДНК і вірусних вакцин. Було сконструйовано біфункціональну плазміду, яка може діяти як вакцина ДНК і як рекомбінантний вектор вірусної віспи. Фігура 7 зображує карту цієї плазміди, яка включає промотор цитомегаловірусу для експресії у клітинах ссавця, і ранній та пізній промотори коров'ячої віспи для приготування рекомбінантної коров'ячої віспи. Пряма ін'єкція очищеної ДНК плазміди може бути використана для створення імунних реакцій проти оболонкового білка ВІЛ у піддослідних суб'єктів. Плазміда може також бути використана для одержання і тестування живих рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи як носіїв імунізації оболонковим білком ВІЛ. Суб'єкти потенційно можуть бути вакциновані за багатоярусною схемою, що включає вакцинацію (вакцинації) ДНК та імунізацію (імунізації) рекомбінантним вірусом коров'ячої віспи у будь-якому порядку, одиничними чи багатократними ін'єкціями та/або у сполученні з додатковими носіями вакцини. Даний винахід не обмежений за обсягом конкретними варіантами втілення, описаними у даній заявці. Дійсно, різні модифікації винаходу на додаток до описаних у цій заявці будуть очевидними кваліфікованим фа хівцям у цій галузі із наведеного опису і супровідних фігур. Такі модифікації повинні вважатись такими, що попадають до обсягу прикладеної формули винаходу. Слід розуміти, що всі розміри, вказані в кількості пар основ чи амінокислотних залишків, і всі значення молекулярної ваги чи молекулярної маси, вказані для нуклеїнових кислот чи поліпептидів, є приблизними, і наведені з метою опису. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (1) ЗАГ АЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ: (і) ЗАЯВНИК: St.Jude Children's Research Hospital 332 North Lauderdale PO Box 318 Memphis, TN 38101-0318 United States of America ЗАЯВНИКИ/ВИНАХІДНИКИ: Hurwitz, Julia L Coleclough, Christopher Owens, Randall J. Slobod, Karen (ii) НАЗВА ВИНАХОДУ: ОДЕРЖАННЯ ТА ВИКОРИСТАННЯ ВІРУСНИХ ВЕКТОРІВ ДЛЯ ВАКЦИН ЗМІШАНИХ ОБОЛОНКОВИ Х БІЛКІВ ПРОТИ ВІРУСУ ІМУНОДЕФІЦИТУ ЛЮДИНИ (ііі) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 7 (iv) АДРЕС А ДЛЯ ЛИСТУВАННЯ: (A) АДРЕСАТ: KL AUBER & JACKSON (B) ВУЛИЦЯ: 411 HACKENSACK AVENUE (C) МІСТО: H ACKENSACK (D) ШТАТ: NJ (Ε) КРАЇНА: USA (F) ZIP: 07601 (v) ФОРМА, ПРИДАТН А ДЛЯ КОМП'ЮТЕРНОГО ЗЧИТУВАННЯ: (A) ТИП СЕРЕДОВИЩА: Дискета (B) КОМП'ЮТЕР: IBM РС-сумісний (C) ОПЕРАЦІЙН А СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (D) ПРИКЛАДНА ПРОГРАМА: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) ДАНІ ПРО ЗАЯВКУ НА ТЕПЕРІШНІЙ ЧАС: (A) НОМЕР ЗАЯВКИ: Надання очікується (B) ДАТА РЕЄСТРАЦІЇ: При цьому (C) КЛАСИФІКАЦІЯ: (vii) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОВІРЕНОГО/АГЕНТА: (A) ІМ'Я: Paul F. Fehlner (B) РЕЄСТРАЦІЙНИЙ НОМЕР: 35135 (C) НОМЕР ДІЛА: 13401011/РСТ (viii) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ЗАСОБИ ЗВ'ЯЗКУ: (A) ТЕЛЕФОН: 201-487-5800 (B) ТЕЛЕФАКС: 201-343-1684 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ №1 (SEQ ID #1): (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 27 пар основ (B) ТИП: нуклеїнова кислота (C) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: кДНК (ііі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID #1 AGC AGAAGAC AGTGGC AATG AGAGTGA (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ №2 (SEQ ID #2): (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 30 пар основ (B) ТИП: нуклеїнова кислота (C) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: кДНК (ііі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID #2 ССАСТССАТС C AGGTCATGTTATTCC AAAT (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ №3 (SEQ ID #3): (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 32 пари основ (B) ТИП: нуклеїнова кислота (C) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: кДНК (ііі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID #3 GTGGGTC ACA GTCTATTATG GGGTACCTGT GT (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ №4 (SEQ ID #4): (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 34 пари основ (B) ТИП: нуклеїнова кислота (C) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: кДНК (ііі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID #4 CCAGAGATTT АТТАСТССАА CTAGC ATTCC AAGG (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ №5 (SEQ ID #5): (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 28 пар основ (B) ТИП: нуклеїнова кислота (C) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: кДНК (ііі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID #5 CCATGTGTAA ААТТААСССС ACTCTGTG (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ №6 (SEQ ID #6): (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 26 пар основ (B) ТИП: нуклеїнова кислота (C) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: кДНК (ііі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID #6: ТАС ААТТТСТ GGGTCCCCTC CTGAGG (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ №7 (SEQ ID #7): (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 880 амінокислот (B) ТИП: амінокислота (C) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: обидві (D) ТОПОЛОГІЯ: обидві (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: білок В опису процитовані різні публікації, які цілком включено сюди за посиланням. Список літератури 1. Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995). 2. Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeuncs, Third Edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987). 3. Belshe. R.B. et al., J. Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994). 3. Berkow et al., eds., The Merck Manual, Fifteenth Edition, Merck and Co., Rahway. NJ (1987). 4. Birnboim, H.C. and Doly, J., Nucleic Acids Res. 7:1513-1523 (1979). 5. Buck, C, and Paulino. M.S., eds., American Type Culture Colleaion Catalogue of Animal Viruses and Antisera. Chlamydiae and Rickeasiae, 6th Ed., American Type Culture Collection, Rockville. MD (1990). 6. Burns, D.P.W. and Desrosiers, R.C., Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188:115-219 (1994). 7. Chakrabani. S. et al., МоI. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985). 8. Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1882-1886 (1993). 9. Creighton. Т.Е., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, СА (1983). 10. DeVita Jr., V.T. et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3rd edition, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992). 11. D'Honcht, Vaccine 10 Suppl.:548-52 (1992). 12. Dorozynski and Anderson, Science 252:501-502 (1991). 12. Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston. MA (1985). 13. Eichberg, Int. Conf. AIDS 7 :88 (1991). 14. Embretson, J.aed., Nature 362:359-362 (1993). 15. Enami et al., J. Virol. 65:2711-2713 (1991). 16. Enami etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:3802-3805 (1990). 17. Fauci, Science 264:1072-1073 (1994). 18. Goodman et al., eds., Goodman and Cilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990) Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2): 141-143 (1994). 19. Gribskov and Burgess, Mid. Acids Res. 14:6745 (1986). 20. Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167:533-537 (1993). 21. Grundwald-Bearch et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117:561-567 (1991)/ 22. Hallenberger et al., Virology 795:510-514 (1993). 23. Hay, R., et al., eds., American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7th Ed., American Type Culture Collection, Rockville. MD (1992). 24. Hirsch. M.S., and Curran. J. "Human immunodeficiency viruses, biology and medical aspects" in Virology, Fields and Knipe, eds., Raven Press, Ltd., New York, N Y (1990), pp.1545-1570. 25. Hu et al., Nature 328:721-723 (1987). 26. Ish-Horowicz, D. and Burke, J.F., Nucleic Acids Res. 9:2989-2998 (1981). 27. Ito et al., J. Virol. 65:5491-5498 (1991). 28. Ito et al., Cancer Res. 50:6915-6918 (1990). 29. Javaherian. K. etal., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 56:6768-6772 (1989). 29. Katzung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992). 30. Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir.10 (Suppl. 2):S139-143 (1994). 31. Kieny et al., Int. Conf. АIDS 5:5Л1 (1989). 32. Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262:116-121(1987). 33. Luytjes et al., Cell 59:1107-1113 (1989). 34. Mackett, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419 (1982). 35. Ma zzara, G.P. et al., Methods in Enz. 277:557-581 (1993). 36. McElrath et al., J. Infect. Dis·. 169:41-47 (1994). 37. Needleman and Wunsch, J. Моl. Biol. 48:443 (1970). 38. Osol, Α., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), pp.1324-1341. 39. Panicali, D., and Paoletti, E., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:4927-4931 (1982). 40. Pantaleo, G. et al., Nature 362:355-358 (1993). 41. Rhim, J.S. et al., Int. J. Cancer 15:23-29 (1975). 42. Richman, AIDs Res. Hum. Retroviruses 8: 1065-1071 (1992). 43. Richman , Annu Rev Pharmacol Tonco 33: 149-164 (1993). 44. Richman, Antimicrob Agents Chemother 37: 1207-1213 (1993). 45. Richman , AIDs Res. Hum. Retroviruses 10: 901 (1994). 46. Richmond and McKinney. eds. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 3rd Edition. U.S. Dept. of Health & Human Services. Washington DC (1993). 47. Sambrook, J. et al., Molecular Goning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). 48. Schulz. G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978). 49. Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, [Washington. DC ?-wp] (1979). pp.353-358. 50. Selenka et al., Arch. Hyg. Bakteriol. 153:244-253 (1969). 51. Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981). 52. Starcich et al., Cell 45:631 (1986). 53. Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sd. (USA) 76:4350 (1979). 54. United States Biochemical, Sequenase Version 2.0 - DNA Sequencing Kit, Ninth Edition, Amersham Life Science, Inc., Boise, Idaho (1994). 55. Weir et al., Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A. 79:1210-1214 (1982)/ 56. Wellis et al., J. Immunol. 99:1134-9 (1967). 57. Wong-Staal. F., "Human immunodeficiency viruses and their replication", in Virology, Fields and Knipe. eds., Raven Press. Ltd., New York, NY (1990), pp.1529-1543. 58. Wrin et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994). 59. Wu et al., Prog. Nucl. Add. Res. Molec. Biol. 27:101-141 (1978). 60. Zagury et al., Nature552:728-731 (1988).