Антигенна композиція, що містить антиген та ад’ювантну комбінацію з 3-о-дезацилованого монофосфорилованого ліпіду а або монофосфорилованого ліпіду а та gm-csf або il-12, та застосування вказаної ад’ювантної к

1. Антигенна композиція, що містить антиген, вибраний з групи, що включає патогенні віруси, бактерії, гриби, паразитичні організми, антигени 2 (19) 1 3 76406 4 на вказаний антиген у хребетної тварини. 15. Застосування ефективної кількості ад'ювантної 9. Застосування за п.8, де імунна відповідь визнакомбінації з 3-О-дезацилованого монофосфорилочається цитоксичними Т-лімфоцитами. ваного ліпіду А або монофосфорилованого ліпіду 10. Застосування за п.8 або 9, де вказаний антиген А у комбінації з GM-CSF або IL-12 для приготуванявляє собою антиген ВІЛ. ня антигенної композиції, яка містить вибраний 11. Застосування за п.8 або 9, де вказаний антиген алерген, причому дана ад'ювантна комбінація появляє собою антиген ВІМ. силює здатність організму хребетного послаблю12. Застосування за п.8 або 9, де вказаний антиген вати реакцію на вказаний алерген. являє собою антиген Neisseria gonorrhoeae. 16. Застосування ефективної кількості ад'ювантної 13. Застосування за п.8 або 9, де вказаний антиген комбінації з 3-О-дезацилованого монофосфорилоявляє собою антиген RSV людини. ваного ліпіду А або монофосфорилованого ліпіду 14. Застосування ефективної кількості ад'ювантної А у комбінації з GM-CSF або IL-12 для приготуванкомбінації з 3-О-дезацилованого монофосфорилоня антигенної композиції для лікування або профіваного ліпіду А або монофосфорилованого ліпіду лактики захворювання, яке характеризується відкА у комбінації з GM-CSF або IL-12 для приготуванладенням амілоїдного білка в організмі хребетного ня антигенної композиції для лікування або профіхазяїна, що містить поліпептид, пептид або фраглактики раку у хребетної тварини, що містить анмент амілоїдного білка або антитіло проти нього. тиген пухлинних клітин, в тому числі злоякісних. Даний винахід відноситься до застосування 30-дезацильованого монофосфорильованого ліпіду А або монофосфорильованого ліпіду А і їх похідних і аналогів в комбінації з цитокіном або лімфокіном, зокрема, з гранулоцитарно-макрофагальним колонієстимулюючим фактором або інтерлейкіном-12, як ад'ювантною композицією в антигенній композиції для посилення імунної відповіді у хребетного господаря на вибраний антиген. Імунна система використовує різноманітні механізми для боротьби з патогенами. Однак не всі ці механізми обов'язково активуються після імунізації. Захисний імунітет, що викликається імунізацією, залежить від здатності вакцини індукувати відповідну імунну відповідь для опору або знищення патогену. В залежності від виду патогену це може вимагати клітинної і/або гуморальної імунної відповіді. Сучасне уявлення про роль Т-хелперних клітин в імунній відповіді полягає в тому, що Тклітини можуть бути поділені на субпопуляції по цитокінам, які вони продукують, і цей індивідуальний цитокіновий профіль, що спостерігається у таких клітин, визначає їх функцію. Дана Т-клітинна модель включає дві головні субпопуляції: клітини ТН-1, які продукують інтерлейкін-2 (IL-2) і гаммаінтерферон, що посилюють як клітинну, так і гуморальну (антитільну) імунні відповіді; і клітини ТН-2, які продукують інтерлейкін-4, інтерлейкін-5 і інтерлейкін-10 (IL-4, IL-5 і IL-10, відповідно), що посилюють гуморальні імунні відповіді [бібліографічне посилання 1]. Часто бажано посилити імуногенну ефективність антигенна для отримання більш сильної імунної відповіді в імунізованому організмі і посилити стійкість господаря до агента, несучого антиген. У деяких випадках, бажано змінити імунну відповідь від переважаючої гуморальної відповіді (ТН-2) на більш збалансовану клітинну (ТН-1) і гуморальну (ТН-2) відповідь. Клітинна відповідь включає індукцію відповіді, опосередкованої CD8+CTL (цитотоксичними Тлімфоцитами). Така відповідь бажана при розробці вакцин проти внутрішньоклітинних патогенів. Захист проти різноманітних патогенів вимагає сильних імунних відповідей слизової оболонки, високих сироваткових титрів, індукції CTL і сильних клітинних відповідей. Такі відповіді не індукуються більшістю антигенних препаратів, включаючи традиційні субодиничні вакцини. Одним з таких патогенів є вірус імунодефіциту людини (ВІЛ). Таким чином, існує потреба в розробці складів антигенних композицій, які здатні індукувати як гуморальну, так і клітинну імунні відповіді у хребетного господаря. Відповідно, метою даного винаходу є використання ад'ювантних комбінованих композицій в складі антигенних композицій, що містять 3-0дезацильований монофосфорильований ліпід A (MPL™) або монофосфорильований ліпід А і їх похідні і аналоги в комбінації з цитокіном або лімфокіном, зокрема, гранулоцитарномакрофагальним колонієстимулюючим фактором (GM-CSF) або інтрелейкіном (IL-12), або агоністом або антагоністом вказаного цитокіна або лімфокіна. Ад'ювант являє собою речовину, яка посилює імунну відповідь при спільному введенні з імуногеном або антигеном. Ад'ювантна композиція по даному винаходу вводиться разом з вибраним антигеном в антигенній композиції. Антигенні композиції по даному винаходу посилюють імунну відповідь у хребетного господаря на вибраний антиген. Вибраний антиген може бути поліпептидом, пептидом або фрагментом, отриманим [1] з патогенного вірусу, бактерії, гриба або паразита, або [2] із злоякісної клітини або пухлинної клітини або [3] з алергену, який впливає на продукцію IgE, для ослаблення алергічних реакцій на алерген або [4] з амілоїдного пептидного білка для профілактики або лікування захворювання, яке характеризується відкладенням амилоїда у хребетного господаря. У першому втіленні винаходу, вибраний антиген є антигеном ВІЛ. Вибраний антиген ВІЛ може бути білком ВІЛ, поліпептидом, пептидом або фрагментом, отриманим з вказаного білка. У конкретному втіленні винаходу, антиген ВІЛ являє 5 76406 6 собою специфічний пептид. В інших втіленнях виімунізували на 0 день і повторно імунізували на 28 находу, вибраний антиген є антигеном Neisseria день. Титри пептид-специфічних IgG, IgG1 і IgG2a gonorrhoeae або респіраторного синцитіального визначали в сироватках, зібраних на 42 день з вірусу. допомогою ELISA. MPL™ може знаходитися у вигляді водного На Фіг.2 проілюстрований ефект одного СЕ, розчину або у вигляді стабілізованої емульсії "маодин MPL™ або СЕ MPL™ на посилення впливу сло у воді" (стабільна емульсія, або СЕ). У переGM-CSF на титри aнти-TlSP10MN(A)(-Cys) IgG. важному втіленні винаходу, емульсія "масло у воГрупи з п'яти самиць Balb/c імунізували 25мкг ді" містить сквален, гліцерин і фосфатидилхолін. У TISP10MN (A) (-Cys) в 0 день і повторно імунізуваСЕ композиції MPL™ є змішаним з цитокіном або ли на 28 день вказаними ад'ювантними композицілімфокіном з утворенням антигенної композиції до ями. CFA і IFA емульгували у водному розчині певведення. Цитокін або лімфокін не обов'язково птиду у відношенні 1:1. GM-CSF використали в додають в емульсію. У переважному втіленні виконцентрації 10мкг/доза. MPL™ вводили мишам у находу, MPL™ знаходиться в формі СЕ. Антигенна вигляді водної композиції в кінцевій концентрації композиція, крім того, може включати в себе роз50мкг або як компонент стабільної емульсії в конріджувач або носій. центрації 25мкг с 1% СЕ. Титри визначали через Винахід також відноситься до способів підвидві тижні після повторної імунізації. Дані являють щення здатності антигенної композиції, що містить собою окремі титри, визначені у п'яти мишей. вибраний антиген з [1] антигена патогенного віруНа Фіг.3 приведені результати аналізу вірусної су, бактерії, гриба або паразита індукувати імунну нейтралізації. Об'єднану сироватку, взяту на 42 відповідь у хребетного господаря, або з [2] антигедень у мишей, імунізованих на 0 і 28 дні вказаними на злоякісної клітини або з асоційованого з пухликомпозиціями, розбавляли (1/1600) і додавали до ною антигена злоякісної або пухлинної клітини, розведень HIVMN адаптованих Т-клітин перед довикликати терапевтичний або профілактичний даванням до клітин АА5 in vitro. Через сім днів протираковий ефект у хребетного господаря, або з культивування, супернатант клітинної культури [3] алергену, який впливає на продукцію IgE, ослааналізували на зворотну транскриптазу вірусу як бляти алергічні реакції на алерген, або з [4] антиіндикатора вірусної реплікації. гена амилоїдного білка для профілактики або лікуНа Фіг.4 проілюстрована проліферація клітин вання захворювання, що характеризується селезінки мишей, імунізованих TISP10MN (А; і; відкладенням амилоїда, у хребетного господаря, Cys) і різними ад'ювантними композиціями. Клітивведенням ефективної ад'ювантної (що посилює) ни селезінки стимулювали in vitro 3,3мкг/мл кількості в комбінації з цитокіном або лімфокіном, TISP10MN(A)(-Cys) протягом чотирьох днів. Резокрема, MPL™ з GM-CSF або IL-12, або агоністом зультати показані як зміна впровадження міченого або антагоністом вказаного цитокіна або лімфотимідину в результаті in vitro стимуляції кіна. TISP10MN(A)(-Cys) відносно впровадження при Винахід, крім того, відноситься до способів півідсутності стимуляції (різниця кількості імпульсів двищення здатності антигенної композиції, що на хвилину). містить антиген, вибраний з антигена патогенного На Фіг.5 показана активність CTL з селезінки, вірусу, бактерії, гриба або паразита, активувати виділених у мишей через сім днів після повторної цитотоксичні Т-лімфоцити у хребетного господаря імунізації. Клітини селезінки збирали у груп з трьох шляхом введення ефективної ад'ювантної (що мишей Balb/c, імунізованих на 0 і 21 дні 50мкг посилює) кількості в комбінації з цитокіном або TISP10MN(A) (-Cys) включеним в композицію з лімфокіном, зокрема, MPL™ з GM-CSF або IL-12, 50мкг MPL'™ в 1% СЕ з або без 10мкг GM-CSF. або агоністом або антагоністом вказаного цитокіна Клітини культивували з пептидом HIVMN, що місабо лімфокіна. тить епітоп CTL, протягом семи днів. Протягом На Фіг.1 зображені реципрокні кінцеві точки тиостанніх п'яти днів в культуру додавали IL-2. Ефетрувань, визначені у груп з п'яти самиць мишей кторні клітини селезінки додавали до мічених хроBalb/c, імунізованих 25мкг TISP10MN(A)(-Cys), мумом клітинам Р815, імпульсно-міченим HIVMN, інльтиепітопним пептидом з 39 амінокислот, в складі шим штамам, позначеним як HIVMN, або без з CFA або IFA (трикутники), або 50мкг 2% стабільпептиду, у вказаних пропорціях. Процент активноною емульсією (СЕ) MPL™ (квадрати). Мишей сті CTL розраховували як: специфічне випромінювання (імп / хв.) спонтанне випромінювання (імп / хв.) 100 загальний максимум (імп / хв.) спонтанне випромінювання (імп / хв.) «Е:Т» означає відношення ефекторних клітин до мічених. Ад'юванти, цитокіни і лімфокіни являють собою імуно-модулюючі сполуки, які володіють здатністю посилювати і направляти розвиток і профіль імунних відповідей на різні антигени, які самі по собі є слабими імуногенами. Правильний вибір ад'ювантів, цитокінів або лімфокінів може індукувати сильну гуморальну і клітинну імунні відповіді, які не розвинулися б за відсутності ад'юванта, ци токіна або лімфокіна. Зокрема, ад'юванти, цитокіни і лімфокіни мають значні ефекти посилення імунної відповіді на субодиничні і пептидні антигени у вакцинах. їх стимулююча активність також корисна при розвитку антигенспецифічних імунних відповідей проти білкових антигенів. Для різних антигенів, проти яких потрібне створення сильних імунних відповідей слизової оболонки, високих сироваткових титрів, індукція CTL і сильні клітинні відповіді, комбінації ад'юванта і цитокіна/лімфокіна 7 76406 8 забезпечують стимули, які не забезпечуються біляції Т-хелперних клітин у бік ТН1 цитокінового льшістю антигенних препаратів. профілю (тобто, підкласу IgG2 на моделі миші) [4У множині досліджень оцінювали різні ад'юва6]. На мишах було показано, що рекомбінантний нтні композиції на тваринних моделях, але в цей мишачій IL-12 посилює перевагу ТН-1 профілю час єдиним ад'ювантом, дозволеним для широкого імунної відповіді [3]. використання на людях, є алюм (гідроксид алюміIL-12 продукується різноманітними антигеннію або фосфат алюмінію). Одна група ад'ювантів, презентуючими клітинами, переважно макрофагастабільних емульсій, що містять різні комбінації ми і моноцитами. Він є ключовим елементом інду«вода в маслі» і «масло у воді», привернула значкції ТН1 клітин з нативних Т-клітин. Було показано, ну увагу внаслідок своєї імунопотенціювальної що продукція IL-12 або властивість відповідати на здатності. Ці композиції, як правило, включають нього є ключовими при розвитку захисних ТН1різні комбінації метаболізованих або інертних маподібних відповідей, наприклад, при паразитарних сел, чия дія полягає в стабілізації і депонуванні інвазіях, особливо при лейшманіозі [7]. Ефекти ILантигенів в місці введення. Одним з таких ад'юва12 опосередковані у великій мірі гаммантів є неповний ад'ювант Фройнда (IFA), який інтерфероном, продукованим NK-клітинами і Твключає мінеральне масло, воду і емульгатор. хелперними клітинами. Гамма-інтерферон є клюПовний ад'ювант Фройнда (CFA) являє собою IFA човим для індукції антитіл IgG2a проти Т-залежних з додаванням убитих нагріванням мікобактерій. білкових антигенів [8] і HgG3-відповідей на ТОсобливою проблемою при використанні цих типів незалежні антигени [9]. IL-12, спочатку названий як ад'ювантів є подразнення в місці введення, часто стимулюючий фактор натуральних кілерів, предв результаті інфільтрацій мононуклеарними клітиставляє собою гетеродимерний цитокін [10]. Екснами, що приводить до утворення гранулематозпресія і виділення білка IL-12 з рекомбінантних них осередків. Отже, як можливі ад'юванти досліклітин-господарів [описані в опублікованій міжнаджуються інші сполуки і композиції. родній патентній заявці WO 90/05147 (11)]. Однією з таких сполук є 3-0-дезацильований Іншим цитокіном, який є потенційним ад'юванмонофосфорильований ліпід A (MPL™), розпотом, є GM-CSF. GM-CSF являє собою особливий всюджуваний Ribi ImunoChem Research Inc. вигляд колонієстимулюючого фактора (CSF). CSF (Hamilton, MT). MPL™ [описаний в патенті США являють собою сімейство лімфокінів, які індукують №4912094 (2)], який включений сюди як посидиференціювання клітин-попередників в кістковолання. му мозку в конкретні типи зрілих клітин крові. Як Нещодавно, Ribi ImmunoChem Research Inc. [описано в патенті США №5078996 (12)], який розробила метаболізовану композицію «масло-ввключений сюди як посилання, GM-CSF активує воді», яка при об'єднанні з MPL™, приводить до макрофаги або попередники-моноцити для опосеутворення стабілізованої емульсії, позначеної як редкування неспецифічної протипухлинної активСЕ MPL™. Стабільну емульсію отримували шляності. Була описана нуклеотидна послідовність, хом мікрозріджування MPL™ маслом сквалену, що кодує ген GM-CSF людини [12]. Плазмідою, що гліцерином і фосфатидилхоліном. Ця композиція містить кДНК GM-CSF, трансформували Е.соlі і являє собою характерну мікрозріджену емульсію депонували в Американській колекції типових кукатегорії GMP. Емульсії, що містять 1 або 2% масльтур (АТСС), 10801 University Boulevard, ла описані в експериментах нижче. Manassas, VA 20110-2209, під номером 39900. Як Підшкірне або внутрішньом'язове введення СЕ [описано в патенті США №5229496 (13)], який MPL™ мишам Balb/c не приводило до тканинної включений сюди як посилання, ген GM-CSF також патології, що визначається в місці введення. У був вставлений в дріжджову експресруючу плазміпорівняльних цілях також отримували стабільну ду і депонований в АТСС під номером 53157. Крім емульсію що містить ті ж самі компоненти, але без того, як [описано в патенті США №5073627 (14)], MPL™. Конкретно, підшкірна або внутрішньом'язоякий включений сюди як посилання, послідовність ва імунізація пептидом ВІЛ TISP10MN(A)(+Cys) з ДНК, що кодує GM-CSF з видаленими сайтами 40 амінокислот або пептидом з видаленим цистеїглікозилювання, була депонована в АТСС під ноном TISP10MN(A)(-Cys) з 39 амінокислот (відсутмером 67231. ність цистеїнового залишку в положенні 17 40Показано, що GM-CSF позитивно регулює біламінокислотного пептиду (+Cys)) включеним в кові молекули на антиген-презентуючих клітинах, композицію з ад'ювантом СЕ MPL™ і GM-CSF, не що явно посилюють імунні відповіді [15] і що вплиприводила до інфільтрації, що визначається, або вають на секрецію Ig в фракційно-очищених Вдо тканинних порушень через два тижні після імуклітинах мишей (16). нізації. Показано, що інші цитокіни або лімфокіни, Також даний винахід відноситься до застосувключаючи, але не обмежуючись ними, інтерлейвання монофосфорильованого ліпіда А, попередкіни 1-альфа, 1-бета, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, ника MPL™, який також [описаний в патенті США 16, 17 і 18, альфа-, бета- і гамма-інтерферони, №4912094 (2)]. Крім того, даний винахід відногранулоцитарний колонієстимулюючий фактор і ситься до похідних і аналогів MPL™ і монофосфофактори некрозу пухлини альфа і бета, мають рильованого ліпіда А. імуномодулюючу активність. Введення цитокінів і лімфокінов у вакцинні При системному введенні будь-якого цитокіна композиції свідчить про розширення і підвищення або лімфокіна необхідно враховувати біологічні потенціалу вакцини [3]. Було показано, що цитокін наслідки, пов'язані з активністю цитокіна або лімінтерлейкін-12 (IL-12) стимулює і посилює клітинфокіна. Крім того, ефекти цитокіна або лімфокіна, ний імунітет шляхом зсуву розмноження субпопупов'язані з розвитком антигенспецифічних імунних 9 76406 10 відповідей, повинні бути посилені, при підтримці роткі пептиди, відповідні антигенним детермінанмісцевих концентрацій цитокінов або лімфокінов. там gp120 і що генерують гуморальну відповідь У попередніх дослідженнях GM-CSF і IL-12 проти gp120, яка нейтралізує вірус і індукує відпооцінювалися окремо один від одного; спостерігали віді Т-хелперів і CTL проти вірусу. посилення різних параметрів імунної відповіді. Один такий пептид являє собою пептид HIVОписаний тут винахід демонструє, що при 1MN, що містить мультіепітоп C4/V3, позначений як комбінуванні антигена, вибраного цитокінового або TISP10MN(A)(+Cys), і його варіант з видаленим лімфокінового ад'юванта і другого ад'юванта, цистеїном, TlSP10MN(A)(-Cys). Ці пептиди вклюMPL™ (переважно в стабільній метаболізованій чають епітопи ТН, TCTL і В, але не індукують антиемульсії), посилюються специфічні імунні відповіді тіла, які перешкоджають скріпленню з CD4. Раніше на антиген. було показано, що ці пептиди C4/V3 ВІЛ є можлиАнтигени, вибрані для включення в антигенні вими кандидатами для індукції імунних відповідей композиції по даному винаходу, включають пептипри спільному введенні з CFA або CFA-подібними ди або поліпептиди, отримані з білків, а також ад'ювантами [24-29]. Як попередньо було показафрагменти будь-якого з сахаридів, білків, полі- або но, ці пептиди містять епітопи, які викликають кліолігонуклеотидів або інших макромолекулярних тинні відповіді CD4+ ТН-клітин як у мишей, так і у компонентів. Термін, що використовується тут "пелюдей, і вони містять як головний нейтралізуючий птид" включає в себе ряд, принаймні, з шести аміепітоп, так і сайт пізнавання CD8+ CTL, і у мишей нокислот і містить, принаймні, одну антигенну деBalb/c, і в людей, яким є HLA В7+. Нещодавно на термінанту, в той час як "поліпептид" є більш ВІЛ-інфікованих пацієнтах була показана як імунодовгою молекулою чим пептид, але все ж не склагенність, так і безпека пептиду, що складається з дає повнорозмірний білок. Термін, що використо39 амінокислот [28]. TlSP10MN(A)(+Cys) має навується тут "фрагмент" має на увазі частину, але ступну послідовність з 40 амінокислот: меншу, цілого сахариду, білка, полі- або олігонуклеотида, або інших макромолекулярних компонентів. У випадку ВІЛ, антигенні композиції по даному винаходу, крім того, включають повнорозмірні білTlSP10MN(A)(-Cys) був синтезований без циски ВІЛ. теїну в положенні 17 і має наступну послідовність з Винахід ілюструється модельною системою, 39 амінокислот: що включає пептидні антигени, отримані з ВІЛ. Ці пептиди описані або взяті [з патентів №5013548 (17) і 5019387 (18)], які приведені тут як посилання, і тут підсумовані. Ці пептиди включають амінокисЦей залишок цистеїну розташований поза фулотні послідовності, які відповідають області білка нкціональними епітопами, розпізнаваними ТНоболонки ВІЛ, проти яких продукуються нейтраліклітинами, CTL або В-клітинами. Інші пептиди ВІЛ зуючі антитіла і Т-клітинні відповіді. з різних областей вірусного геному [описані в паВІЛ являє собою ретровірус людини, який є тенті США №5861243 (30), в патенті США етіологічним агентом синдрому набутого імуноде№5932218 (31), в патенті США №5939074 (32), в фіциту (СНІД). ВІЛ інфікує Т-лімфоцити імунної патенті США №5993819 (33), в патенті США системи шляхом приєднання свого глікопротеїну №6037135 (34), в опублікованій заявці на видачу зовнішньої оболонки до молекули CD4 (Т4) на поєвропейського патенту №671947 (35)], які також верхні Т-лімфоцитів, таким чином, використовуючи включені сюди як посилання. молекулу CD4 (Т4) як рецептор для проникнення і Антиген ВІЛ може бути білком, поліпептидом, інфікування Т-клітин. Спроби стимулювати захисну пептидом або фрагментом, отриманим з вказаного імунну відповідь, специфічну для ВІЛ-інфекції, білка. Білок може бути глікопротеїном, таким як шляхом імунізації мали дуже обмежений успіх. У gp41, gp120 або gp160. Альтернативно, білок може цей час розглядається ряд підходів з метою вибути білком, що кодується такими генами як gag, значити ефективну і захисну стратегію вакцини. роl, vif, rev, vpr, tat, nеf або env. Пептиди, отримані Вони включають використання ослабленого і рез таких білків, містять, принаймні, одну антигенну комбінантного бактерійних векторів, які експресудетермінанту (епітоп) довжиною, принаймні, в ють антигенні епітопи ВІЛ [19], рекомбінантного шість амінокислот. аденовірусу [20] або векторів на основі вірусу коІмунна відповідь на пептид ВІЛ може бути поров'ячої віспи [21], ДНК-вакцин [22] і синтетичних силена за допомогою ковалентного скріплення пептидів, які містять різні Т- і В-клітинні епітопи ВІЛ (кон'югування) пептиду з молекулою фармацевти[23]. чно прийнятного носія. Приклади відповідних моГлікопротеїн gp120 зовнішньої оболонки ВІЛ, лекул носія включають анатоксин правця, анатокяк було показано, здатний індукувати нейтралізусин дифтерії, гемоціанін морського блюдця і інші ючі антитіла у людини. Рекомбінантний білок РВl, пептиди, відповідні епітопам Т-клітини глікопротеїщо становить приблизно третю частину всієї мону gp120 ВІЛ. лекули gp120, як було показано, включає частину У цей час передбачається, що успішна стратебілка оболонки, який стимулює утворення нейтрагія вакцинації проти ВІЛ повинна викликати імунілізуючих антитіл. Однак дослідження на шимпанзе тет слизової оболонки на ВІЛ, також як і сильну показали, що ні інтактний gp120, ні РВI, не здатні відповідь CTL. У недавньому дослідженні на миіндукувати продукцію високих титрів нейтралізуюшах, використовуючи мультіепітопний пептид чих антитіл. TISP10MN(A) і холерний токсин як ад'ювант для Традиційними способами були синтезовані ковідповіді слизової оболонки було показано, що 11 76406 12 інтраназальна імунізація індукує нейтралізуючі селезінки, простимульовані в культурі пептидом, сироваткові антитіла IgGl [36]. Подальше дослісекретували підвищені кількості IL-4, IL-5 і гаммадження, також при використанні пептидів петлі V3 інтерферону. Разом ці результати свідчать про ВІЛ, виявило індукцію синтезу антитіл IgA в слизоіндукцію збалансованої відповіді типу ΤΉ-1/ТН-2. У вій і сильні клітинні відповіді, включаючи відповідь промивних рідинах піхви мишей, імунізованих СЕ пептид-специфічних CTL [37]. Функціональна роль MPL™ і GM-CSF, напрацьовувалися антитіла IgG і високих титрів системних і нейтралізуючих антитіл IgA, специфічні по відношенню до TlSP10MN(A)(в профілактиці або стабілізації ВІЛ-інфекції невіCys). Ці результати показують, що комбінація СЕ дома, хоч вважається, що високі титри вірусMPL™ і GM-CSF з пептидним антигеном ВІЛ приспецифічного антитіла важливі для запобігання водить до індукції сприятливого профілю імунної поширенню вірусу. відповіді. У переважному втіленні винаходу отримували У цьому першому експерименті, миші Balb/c, стабільну емульсію «масло у воді», утримуючу імунізовані пептидом TlSP10MN(A)(-Cys) ВІЛ і СЕMPL™, яку потім змішували з цитокінами IL-12 або утримуючою ад'ювантною композицією або GMGM-CSF. Дані, представлені нижче, демонструють, CSF, виявляли титри пептидспецифічних антитіл що ці комбінації приводять до напрацювання висоIgG (таблиця 1). Стабільна емульсія (СЕ) «масло у ких титрів ВІЛ-нейтралізуючих сироваткових антиводі», що складається з сквалену, гліцерину і емутіл. Комбінація СЕ MPL™ і GM-CSF індукує напральгатора (фосфатидилхоліну), виявляла здатність цювання високих титрів антиген-специфічних збільшувати титри пептидспецифічних IgG при антитіл IgG і IgA в зведенні піхви в імунізованих змішуванні з TISP10MN(A) (-Cys). Титри IgG, індусамиць мишей. Імунізація мишей будь-яким з пепковані імунізацією 25мкг TlSP10MN(A)(-Cys), вклютидів TISPIOMN(A), включених в композицію з СЕ ченого в композицію з СЕ, індукували титри повтоMPL™ і GM-CSF, індукувала сильну клітинну імунрної відповіді, які були рівні приблизно одній п'ятій ну відповідь, судячи з посиленої антигентаких, індукованих у мишей, імунізованих пептиспецифічної клітинної проліферації і секреції цитодом і CFA і повторно імунізованих пептидом в IFA. кінів в культурі, а також, індукції пептидРеципієнти вакцини з CFA/IFA звичайно у відпоспецифічних відповідей CTL. відь на первинну імунізацію формували Звичайно антиген/ад'ювантна композиція ТISР10МN(А)(-Суs)-специфічні титри IgG. Для поMPL™ або СЕ MPL™, комбінована з GM-CSF або рівняння, мишей імунізували тільки 25мкг пептиду IL-12, і вибраним білком або пептидом, індукує TlSP10MN(A)(-Cys). напрацювання високих титрів антиген-специфічних Водні і СЕ композиції MPL™ порівнювали по і вірус-нейтралізуючих антитіл, істотна зміна в відповідях, що індукуються при імунізації мишей з співвідношенні в підкласі IgG у бік більшої частки ад'ювантами Фройнда або цитокінами IL-12 і GMкомплемент-зв'язуючих антитіл IgG (у мишей в бік CSF. Реципієнти TISP10MN(A)(-Cys), змішаного з IgG2a), посилення продукції цитокінів і клітинної IL-12, як правило, не виявляли титри пептидспепроліферації мононуклеарних клітин у відповідь на цифічних антитіл в декількох повторних досліантигенну стимуляцію in vitro. Ці властивості не дженнях. Навпаки, реципієнти GM-CSF або СЕ спостерігалися у композицій з антигена і СЕ у відMPL™ плюс TISP10MN(A)(-Cys) виявляли низькі, сутність MPL™, або з GM-CSF або IL-12, або без але такі, що легко виявляються титри антитіл IgG. них. Композиції по даному винаходу також індукуУ відповідь на імунізацію композицією, що містить ють сильні клітинні відповіді, судячи з індукції CTL. СЕ MPL™ разом з пептидом TISP10MN(A)(-Cys), з Корисною властивістю СЕ MPL™ є те, що додаванням IL-12 або GM-CSF, індукувалися знакомпозиція не індукує гранулематозне скупчення і чно більш високі титри IgG. Дійсно, імунізація мизапалення в місці введення; такі реакції в місці шей поєднанням СЕ MPL™ і GM-CSF давала титвведення звичайно викликаються ад'ювантними ри повторної відповіді, які були відповідно композиціями «вода в маслі» або «масло у воді». більшими за такі, визначені у мишей, імунізованих Здатність індукувати посилену імунну відпобудь-якою іншою дослідженою композицією. Титри відь за допомогою стимулюючих ефектів MPL™ в пептидспецифічних IgG були вищими від таких у поєднанні з GM-CSF або IL-12 у відсутність місцемишей, імунізованих навіть 125мкг TlSP10MN(А)(вого гранулематозного запалення не повідомляCys), включених у композицію з ад'ювантами лася для інших ад'ювантних композицій, що проФройнда. понуються в цей час для лікування ВІЛ. Бажаною особливістю ВІЛ-специфічної імунної Проводилися ряд досліджень для порівняння відповіді є баланс між клітинним і гуморальним MPL™ (або з СЕ, або без неї) плюс GM-CSF або компонентами. Встановлений взаємозв'язок індиIL-12 з кожним з MPL™, CE, GM-CSF, IL-12 або відуальних підкласів ізотипів імуноглобуліну зі зсуCFA/IFA окремо або разом з пептидом ВІЛ. Ревом субпопуляції Т-хелперних клітин у бік перевазультати будуть коротко представлені з більш дожання або ТН-1, або ТН-2. Цитокіни, секретовані кладним обговоренням надалі. кожною з цих субпопуляцій Т-хелперних клітин, У першому експерименті, миші Balb/c, підшкірвиявляли активність в напрямі перемикання підкно імунізовані пептидом TlSP10MN(A)(-Cys) ВІЛ, ласів IgG. Кінцеві точки титрувань підкласу IgG що містить C4/V3, включеним в композицію з визначали з об'єднаних сироваток, зібраних через MPL™ СЕ і GM-CSF, виявляли сироваткові титри два тижні після другої імунізації (таблиця 2). ІмуніIgG вище за 107 лише після двох ін'єкцій. Гуморазація мишей тільки одним TISP10MN(A)(-Cys) або льна відповідь була ВІЛ-нейтралізуючою і харакв складі або з GM-CSF, або з IL-12, приводила до теризувалася істотним збільшенням титрів пептидвідсутності або низьких титрів підкласу IgG в декіспецифічних антитіл IgGI, IgG2a і IgG2b. Клітини лькох повторних дослідженнях. Антитіла IgG3 не 13 76406 14 були виявлені з допомогою ELISA. У групах миспецифічні титри антитіл в об'єднаних промивних шей, імунізованих TISP10MN(A)(-Cys), емульговарідинах піхви, отриманих у мишей через чотири ним в CFA, і повторно імунізованих IFА, розвиватижні після другої імунізації (таблиця 3). У мишей, лася переважно гуморальна IgGI імунна відповідь, імунізованих СЕ MPL™ плюс GM-CSF, формуваспецифічна для TISPIOMN(A) (-Cys). Композиції лися високі титри антитіл IgA і IgG. Титри антитіл у пептиду з СЕ, СЕ MPL™, СЕ MPL™+IL-12 або СЕ вагінальній промивній рідині, отриманої у мишей, MPL™+GM-CSF, також індукували високі титри імунізованих іншими композиціями, звичайно не антитіла IgGI. Реципієнти, вакциновані СЕ комповиявлялися. Оскільки відношення IgG до slgA у зицією, неодноразово демонстрували високі титри вагінальній промивній рідині зсунуте в бік IgG, і IgGI при невисоких титрах IgG2a або IgG2b. Вклюоскільки IgA не був виміряний, неможливо зробити чення MPL™ в СЕ композиції приводило до збільвисновок про те, що антитіло IgA, виявлене у вагішення TlSP10MN(A)(-Cys)-специфічних титрів аннальній промивній рідині, є локально таким, що титіл IgG2a і IgG2b. Включення або IL-12, або GMсинтезується слизовою оболонкою. Дійсно, ймовіCSF в СЕ MPL™ і TISP10MN(A)(-Cys) приводило рно, що виявлені титри IgA і IgG є результатом до зсуву відношення титрів антитіл IgGI:IgG2a. Без транссудативної імуноглобулінової секреції плазцитокінів вакцинна композиція СЕ MPL™ викликаматичних клітин, розташованих на периферії слила схожі титри IgGI і IgG2a. Як IL-12, так і GM-CSF зової оболонки піхви. збільшували відносні сироваткові концентрації Ці результати показують, що миші, імунізовані пептид-специфічного IgG2a. Крім того, комбінація пептидом ВІЛ TlSP10MN(A) (-Cys) включеним в СЕ MPL™ і GM-CSF також спричинила істотне композицію з СЕ MPL™ в комбінації з або IL-12, збільшення титрів антитіл IgG2b, специфічних для або GM-CSF, мали високі титри пептидT1SP10MN (A) (-Cys) (47-кратне в порівнянні з СЕ специфічних сироваткових антитіл. MPL™ і 74-кратне в порівнянні з СЕ). Титри, що Щоб оцінити, чи були ці титри антитіл функцінапрацьовуються у мишей, імунізованих СЕ MPL™ онально ефективними, сироватку аналізували на її і GM-CSF, разом з пептидом TISP10MN(A)(-Cys), здатність інгібувати інфекцію клітин in vitro за добули погоджено найвищими в будь-якій групі вакпомогою лабораторного штаму ВІЛ. Аналіз виміцинованих реципієнтів. рював активність зворотної транскриптази вірусу, Визначення високих титрів, виміряних в об'єдяка знижувалася в супернатанті культури клітин, наних сироватках мишей, імунізованих інфікованих відповідним штамом ВІЛ. Сироватка TISP10MN(A)(-Cys), MPL™ СЕ і GM-CSF, були мишей, імунізованих СЕ MPL™ і GM-CSF, або СЕ характерними для окремих мишей в межах групи, MPL™ і IL-12, в обох випадках значно зменшувала титри окремих мишей в межах цієї групи порівнювірусну інфективність (на Фіг.3). Максимальні одивали з такими у мишей, імунізованих пептидом з ниці зворотної транскриптази вірусу знаходилися в ад'ювантом Фройнда (на Фіг.1). Було показано, що області від 9481 до 10411. Сироватка мишей, імув середньому окремі сироваткові титри IgG, IgGl і нізованих тією ж композицією, інгібувала вірусну IgG2a були схожі з титрами, виміряними в об'єдреплікацію. Навіть при розведенні вірусу тільки наних сироватках (дані не показані). Співкомпози1/20, сироватка мишей, імунізованих СЕ MPL™ і ція TlSP10MN (A) (-Cys) з СЕ MPL™ і GM-CSF GM-CSF разом з TISP10MN(A)(-Cys), інгібувала приводить до значного збільшення титрів IgG, IgGI вірусну реплікацію приблизно на п'ятдесят процеі IgG2a в порівнянні з титрами, індукованими у нтів. Титри нейтралізуючої сироватки цієї компомишей, імунізованих CFA/IFA. Всі миші, імунізованізиції визначали як більше ніж 1600, в порівнянні з СЕ MPL™ і GM-CSF включеним в композицію з 71 для сироватки, отриманої від мишей, імунізовапептидом, індукували більш високі титри антитіл них композицією СЕ MPL™, IL-12 і пептидом ВІЛ. IgG чим, ті, які вимірювали у мишей, імунізованих Титри анти-TlSP10MN(A)(-Cys) сироватки з цих композицією CFA/IFA. Ці результати показали, що груп мишей були схожі (хоч і трохи вище) з тими, комбінація СЕ MPL™ з GM-CSF генерує відповідякі були викликані у мишей, імунізованих CFA і ний профіль гуморальної імунної відповіді, що виIFA. Сироватки мишей, імунізованих значається високими титрами пептид-специфічних TISP10MN(A)(-Cys), емульговані з CFA/IFA, не деантитіл, і відповідний розподіл підкласів IgG. Ця монстрували ВІЛ-нейтралізацію в цьому аналізі. композиція звичайно індукує самі високі Сироватки мишей, імунізованих пептидом і комбіТISР10МN(А)(-Суs)-специфічні титри будь-якої нацією СЕ MPL1M плюс GM/CSF як ад'ювант, декомпозиції вакцини, що використовується. монстрували більшу нейтралізуючу активність, Проводили порівняння титрів IgG aнтичим будь-які інші сироватки. При еквівалентному TlSP10MN(A)(-Cys) у мишей, імунізованих GMрозведенні, сироватки мишей, імунізованих СЕ CSF, включеним в композицію із водним MPL™, MPL™ плюс GM-CSF і пептидом ВІЛ, нейтралізуСЕ або СЕ MPL™, для визначення ефектів GMвали більш високі концентрації вірусу, чим сироваCSF як додаткового ад'юванта (на Фіг.2). Результки реципієнтів інших вакцинних композицій. тати показали, що в цьому окремому втіленні комПотім вимірювали ВІЛ-пептидспецифічну пробінація СЕ MPL з GM-CSF і пептидом є унікальною ліферацію в культурі клітин селезінки. Для вимідля індукції високого титру антитіл. MPL™ плюс рювання клітинної реактивності на TISP10MN(A)(GM-CSF демонстрував титри порівнянні з CFA/IFA. Cys), клітини селезінки культивували in vitro з пепТаким чином, ад'ювантні властивості MPL™ і GMтидом або контрольними білками. У аналізі виміCSF, виглядають синергічними, коли знаходяться рювали включення 3Н-тимідину в ДНК клітин, що в загальному складі, де MPL™ знаходиться або у діляться (таблиця 4). На відміну від клітин селезінводній формі, або у вигляді стабільної емульсії. ки мишей, імунізованих без ад'юванта, клітини Потім вимірювали TlSP10MN(A)(-Cys)селезінки мишей, імунізованих TISP10MN(A) (-Cys) 15 76406 16 включеним в композицію з СЕ, активно проліферутини селезінки цих двох груп реципієнтів виділяли вали у відповідь на пептид. Клітини селезінки вакпомітно більш високі концентрації гаммацинованих реципієнтів не відповідали в культурі на інтерферону в культурі супернатантів, ніж клітини нерелевантний антиген (лізозим) або на безантиселезінки мишей, імунізованій пептидом разом з генну стимуляцію. На стимуляцію мітогеном СоnА СЕ MPL™ плюс IL-12 або СЕ. всі групи відповідали однаково. У межах більшості Результати першого експерименту демонгруп проліферативна відповідь залежала від вкаструють, що введення MPL™ в стабільну емульсію заної антигенспецифічної дози. Всі три дози дава«масло у воді» і потім, поєднання емульсії з пепли саму високу міру проліферації в групах мишей, тидом ВІЛ TlSP10MN(A)(-Cys) і GM-CSF, приводиімунізованих GM-CSF, включеним в композицію з ли до індукції нейтралізуючих антитіл. Крім того, СЕ MPL™. Самі низькі проліферативні відповіді співкомпозиція GM-CSF разом з СЕ MPL™ і антибули отримані у клітин селезінки груп мишей, імугеном вакцини приводили до збільшення рівнів ILнізованих вакцинами з CFA/IFA або IL-12, включе4, IL-5 і гамма-інтерферону, що секретуються в ним в композицію з пептидом ВІЛ. Клітини селезінсупернатантах культури, і до посилення проліфеки мишей, імунізованих пептидом і або СЕ, або ративної відповіді клітин селезінки, стимульованих GM-CSF, включали в себе схожі рівні тимідину в в культурі імунізуючим антигеном. Така композиція культурі. Ці результати показали, що співкомпозитакож індукує самий високі титри IgG, IgG2a, і ції пептиду ВІЛ з СЕ MPL™ і GM-CSF забезпечуIgG2b при введенні будь-якої з перелічених вище ють саму високу проліферативну активність клітин вакцинних композицій. Тільки групи мишей, імуніселезінки мишей у відповідь на in vitro презентозовані комбінацією СЕ MPL™ і GM-CSF разом з ваний антиген. пептидом, мали титри, що виявляються IgG і IgA в Культивовані клітини селезінки досліджували промивних рідинах піхви згідно з числом повторна їх можливість секретувати цитокіни IL-4 (таблиних досліджень. Комбінація СЕ MPL™, IL-12 і пепця 5) і гамма-інтерферон (таблиця 6) в культурі тиду також призводила до збільшення рівнів титрів супернатантів. Ці цитокіни вимірювали в культурах IgGI і IgG2a, збільшенню вірусної нейтралізації, супернатантів, зібраних через три і шість днів in збільшенню проліферації клітин селезінки і секреvitro після стимуляції антигеном або мітогеном. ції IL-4 і гамма інтерферону. Вимірювання IL-4, цитокіна пов'язаного з ТІмунізація мишей будь-яким окремим ад'юванхелпером другого типу, показало, що не дивлячись том, включеним в композицію з пептидом ВІЛ, не на те, що всі групи продукували на 3 день рівні, що давала імунну відповідь з виявленням нейтралізувиявляються у відповідь на стимуляцію мітогеном ючих антитіл. СоnА, тільки миші, імунізовані MPL™ СЕ або СЕ Часто спостерігалося, що імунізація мишей MPL™ плюс GM-CSF, продукували IL-4 у відповідь TISP10MN(A)(-Cys), разом з СЕ MPL™ або MPL™ на стимуляцію пептидом. Тільки миші, імунізовані у вигляді водної композиції, індукувала високі титMPL™ СЕ плюс GM-CSF і TISP10MN(A)(-Cys), секри антитіл. Ці композиції, однак, не індукують імуретували в культуру рівні, що виявляються IL-4 з нну відповідь з титрами вагінальних антитіл, титвсіма дозами пептиду, що використовуються для рами нейтралізуючих антитіл (або сильні відповіді стимуляції клітин селезінки. На шостий день кульCTL, описані нижче в експерименті 8). Іноді, MPL™ тивування, клітини селезінки мишей, імунізованих або СЕ MPL™ в комбінації з пептидом індукували пептидом разом з СЕ MPL™ плюс GM-CSF, секревимірні титри IgA і IgG в промивних рідинах піхви. тували більш високі рівні IL-4, ніж ті, що виявляУ деяких дослідженнях, комбінація композиції вакються у мишей, імунізованих пептидом разом з СЕ цини MPL™ або з IL-12, або з GM-CSF, приводила MPL™, СЕ MPL™ плюс IL-12 або СЕ. Рівні IL-4 до титрів, які були схожі з тими, які продукувалися були навіть вищими ніж ті, що індукуються шляхом мишами, імунізованими CFA/IFA, або будь-якими з стимуляції цих клітин СоnА. Клітини селезінки микомпозицій СЕ MPL™ з або без цитокіну. Це спошей, що культивуються, імунізованих СЕ MPL™ стереження показує, що форма СЕ MPL™ не обоплюс GM-CSF, також у відповідь на стимуляцію в'язкова для високих титрів антисироватки, спеTISP10MN(A)(-Cys) протягом шести днів секретуцифічної для пептиду ВІЛ. Додавання GM-CSF в вали в культуру рівні, що виявляються IL-5 (інший СЕ носій приводило до збільшення пептидцитокін Т-хелпера другого типу (не показано)). специфічних титрів в порівнянні з мишами, імуніКлітини селезінки ні від яких інших груп не продузованими тільки СЕ або СЕ і IL-12. Звичайно, одкували IL-5, що виявляється в цих культурах. нак, індукція високих титрів антитіл IgG2a і IgG2b У відповідь на триденну стимуляцію культури залежала від композиції пептиду з СЕ MPL™ і GMСоnА, клітини селезінки всіх груп мишей секретуCSF. Цікаво помітити, що ця композиція індукувавали рівні гамма-інтерферону, що виявляються в ли титри IgG, які були сходні з титрами, індуковакультурі (таблиця 6). Тільки клітини мишей, імуніними шляхом імунізації іншими композиціями, тазованих СЕ MPL™ або СЕ MPL™ плюс GM-CSF, кими як CFA/IFA і пептид. Комбінацію СЕ MPL™ з або СЕ MPL™ плюс GM-CSF, продукували рівні GM-CSF і пептидом складали тільки для демонгамма-інтерферону, що виявляються, у відповідь страції індукції як високих титрів антитіл, що нейтна триденну стимуляцію пептидом ВІЛ. По заверралізуються, так і CTL (див. експеримент 8). Вклюшенню шестиденної стимуляції культури спостерічення IL-12 разом з СЕ MPL™ і пептидом, також галися більш високі концентрації інтерферону гаіндукувало сприятливий профіль імунної відповіді. мма у відповідь і на СоnА, і на пептид. Важливими Результати показали, що співкомпозиція СЕ були рівні гамма-інтерферону, виміряні в культурі MPL™ і цитокінів GM-CSF або IL-12 давала якісну супернатантів клітин селезінки мишей, імунізовавідмінність в гуморальній відповіді в порівнянні з них СЕ MPL™ або СЕ MPL™ плюс GM-CSF. Кліімунізацією CFA і IFA. Ця відмінність, як вважають, 17 76406 18 відноситься до підвищених рівнів IgG2a і IgG2b. ють, що ці комбінації також індукували самі високі У другому експерименті використали протокопроліферативні відповіді в клітинах селезінки в ли першого експерименту з Balb/c-пептид ВІЛ, але культурі і стимулювали популяції клітин селезінки, з невеликими змінами. MPL™ також вводили у які секретували самі високі рівні гаммаводній формі з або без цитокіну. інтерферону у відповідь на стимуляцію пептидом. Імунізація мишей Balb/c пептидом ВІЛ Результати цього другого експерименту покаTISP10MN(A)(-Cys) без ад'юванта не індукувала зують, що співкомпозиції TISP10MN(A)(-Cys) з істотних титрів антитіл. Навпаки, склад пептидного MPL™ і цитокінами GM-CSF або IL-12 індукують антигена з різноманітними композиціями ад'юпрофіль імунної відповіді, подібний викликаному у вант/цитокін приводив до індукції високих титрів мишей, імунізованих пептидом і CFA і повторно антитіл після другої імунізації. імунізованих пептидом і IFA або перевершуючий Імунізація пептидом і IL-12, або тільки СЕ прийого. водила до титрів, які були невідмітні від титрів, Гістологічна оцінка (не показана) місця ввеіндукованих композицією без ад'юванта (таблиця дення через два тижня після другої імунізації пока7). Реципієнти пептидної співкомпозиції з GM-CSF зала, що миші, імунізовані мікрозрідженим СЕ мали обмежені збільшення титрів. У порівнянні з MPL™, не розвивали або не підтримували інфільреципієнтами, що отримували вакцину, що містить трацію мононуклеарних клітин в дермі шкіри. ЗаCFA/IFA, мікрозріджена СЕ MPL™ демонструвала барвлені гематоксиліном/еозином тканини були схожі пептид-специфічні титри. У порівнянні з ретакими ж, як отримані у реципієнтів без ад'юванта. ципієнтами, що отримували вакцину CFA/IFA, СЕ Навпаки, миші Balb/c, імунізовані CFA і IFA як MPL™ індукувала високі рівні пептидад'юванти (емульсія «вода в маслі»), мали значне специфічного IgG2a. Підходи, що використовуютьскупчення мононуклеарних клітин в цій області. ся при імунізації можуть впливати на титри антиРеципієнти СЕ MPL™ з GM-CSF і пептидом покатіл, що спостерігаються. Однак, імунізація мишей зували помітне, але мінімальне збільшення моноMPL™ (водний) включеним в композицію з пептинуклеарних клітин в порівнянні з реципієнтами СЕ дом, індукувала високі титри пептид-специфічних MPL™ без GM-CSF. Тканини мишей, імунізованих антитіл. Додавання GM-CSF або IL-12 в ці компотільки GM-CSF і пептидом, не досліджувалися. зиції приводило до збільшення титрів більше ніж Протоколи другого експерименту використали 106. Таким чином, комбінація пептиду ВІЛ з MPL™ в третьому експерименті з мишами Swiss-Webster, і цитокінами, IL-12 або GM-CSF, індукувала високі що використовуються замість мишей Balb/c. Миші титри антитіл, специфічних для пептиду. Swiss-Webster використовувалися для визначення Тільки групи мишей, імунізовані пептидом і або ефектів ад'ювантов з пептидним антигеном ВІЛ, де MPL , або IL-12, або MPL™ і GM-CSF, розвивали МНС-пов'язаний Т-хелперний епітоп не впливав на відносно високі титри антитіл, що виявляються в імунну відповідь. Миші Swiss-Webster являють рідинах, отриманих з промивної рідини піхви (табсобою аутбридінговий штам мишей; і, отже, ніяких лиця 8). Дійсно, тільки та група мишей, яка була клітинних досліджень не проводили. У цьому ексімунізована MPL™ і IL-12 з пептидом, продукувала перименті вимірювали тільки реципрокні кінцеві пептид-специфічний IgA. точки титрування антитіл IgG проти пептиду ВІЛ і Проліферативну здатність клітин селезінки в кінцеві точки титрування антитіл IgG і IgA з промикультурі у відповідь на in vitro стимуляцію пептивної рідини піхви. Як видно з таблиці 12 і 13, продом визначали шляхом введення тимідину. Дані в філь відповіді був таким, що його можна зіставити таблиці 9 представлені таким способом, щоб норз виміряним в першому і другому експерименті у мувати проліферацію, стандартизувати по відномишей Balb/c. шенню до максимальної проліферації, отриманої У четвертому експерименті використовувалипри стимуляції СоnА. Клітини селезінки мишей, ся протоколи другого експерименту з невеликими імунізованих СЕ MPL™ разом або з GM-CSF, або з змінами і використовувалися миші Balb/c. Як покаIL-12, а також мишей, імунізованих тільки GM-CSF, зано в таблиці 14, ад'ювантні композиції MPL™ демонстрували низькі рівні пептид-асоційованої разом з або GM-CSF, або IL-12, викликали значно проліферації. Навпаки, клітини селезінки мишей, більш високі відповіді IgG GMT, чим один MPL™. імунізованих пептидом в комбінації з MPL™ і GMЯк показано в таблиці 15, ад'ювантна композиція CSF, демонстрували значну проліферацію. СЕ MPL™ разом з GM-CSF, викликала істотну Також вимірювали продукцію цитокіну культивідповідь підкласу IgG2b. Ад'ювантні композиції вованими in vitro клітинами селезінки. Для IL-4, MPL™ разом або з GM-CSF, або з IL-12, викликатільки миші, імунізовані СЕ MPL™ в комбінації з ли помітно більш високі відповіді підкласу IgG2a, GM-CSF і TISP10MN(A)(-Cys), секретували високі чим один MPL™, в той час як композиції СЕ MPL™ рівні IL-4 у відповідь на стимуляцію пептидом разом або з GM-CSF, або з IL-12, викликали більш (таблиця 10). Для гамма-інтерферону, миші, імунівисокі відповіді підкласу IgG2a, ніж один MPL™. Як зовані СЕ MPL™ і або GM-CSF, або IL-12, або вопоказано в таблиці 16, ад'ювантні композиції дним MPL™ з GM-CSF або з IL-12, продукували MPL™ разом або з GM-CSF, або з IL-12, викликарівні, що легко виявляються цього цитокіну в супели помітно більш високі титри IgG у вагінальній рнатанті культури (таблиця 11). промивній рідині, ніж один MPL™. Нарешті, як поТаким чином, комбінація цитокінів GM-CSF казано на Фіг.4, ад'ювантні композиції MPL™ раабо IL-12 з MPL™ або СЕ MPL™ індукувала високі зом або з GM-CSF, або з IL-12, також як і композититри антитіл, специфічних для пептидного антиції СЕ MPL™ разом або з GM-CSF, або з IL-12, гена. Титри були подібні тим, які індукувалися при демонстрували більш активну проліферацію клітин імунізації мишей пептидом і CFA/IFA. Дані показуселезінки, чим один MPL™ або одним СЕ MPL™, 19 76406 20 відповідно. вивати СНІД-подібні симптоми. У п'ятому експерименті використовувалися Це дозволяє антигенам ВІМ бути оціненим у протоколи другого експерименту з невеликими приматів (не людей). Антиген ВІМ може бути білзмінами і використовувалися миші Balb/c; IL-12 не ком, поліпептидом, пептидом або фрагментом, входив в композиції ад'юванта. Як показано в таботриманим з вказаного білка. Білок може бути глілиці 17, композиції ад'юванта, що містять як копротеїном, таким як gp41, gp120 або gp160. АльMPL™, так і GM-CSF, викликали помітно більш тернативно, білок може бути білком, що кодується високі відповіді IgG2a і IgG2b, чим один MPL™. такими генами, як gag, роl, vif, rev, vpr, tat, nef або Крім того, композиції ад'юванта, що містять як env. Пептиди, отримані з таких білків, містять, приMPL™, так і GM-CSF, викликали помітно більш наймні, одну антигенну детермінанту (епітоп) доввисокі відповіді для всіх підкласів IgG, чим один жиною, принаймні, шість амінокислот. MPL™. Аналогічно з ВІЛ, у приматів (не людей) викоУ шостому експерименті використовувалися ристовується мультіепітопні пептиди ВІМ. Вивченпротоколи другого експерименту з невеликими ня проводилося для оцінки можливості викликати змінами і використовувалися миші Balb/c; IL-12 не відповідь CTL різними пептидами в поєднанні з СЕ входив в композиції ад'юванта. Пептид ВІЛ являв MPL™ і GM-CSF. Резус макаки були підшкірно собою 40 амінокислот через присутність цистеїну в імунізовані на 0, 4, 8 і 18 тижні СЕ MPL™ і GMпозиції 17 амінокислоти. Як показано в таблиці 18, CSF, разом з будь-яким з наступних трьох пептиад'ювантні композиції, що містять як СЕ MPL™, дів (див. таблицю 20): так і GM-CSF, викликали значно більш високі від(1) Кожний пептид містив наступний епітоп повіді всіх підкласів IgG, чим один MPL™, і помітно CTL в контексті Маnu А*01: більш високі відповіді всіх підкласів, чим один СЕ MPL™. У сьомому експерименті використовувалися протоколи шостого експерименту з невеликими змінами і використовувалися миші Balb/c; IL-12 не (2) Альтернативно, кожний з цих трьох пептивходив в композиції ад'юванта. Як показане в табдів був пов'язаний зі змішаним епітопом Тлиці 19, ад'ювантні композиції, що містять як СЕ хелпера, що має наступну послідовність: MPL™, так і GM-CSF, викликали помітно більш високі відповіді для всіх підкласів IgG, чим один СЕ MPL™, і композиції ад'юванта, що містять як Таким чином, ці три пептиди мали наступні поMPL™, так і GM-CSF, викликали помітно більш слідовності: високі відповіді для всіх підкласів IgG, чим один MPL™. У восьмому експерименті для вимірювання імунітету, опосередкованого функціональними клітинами, оцінювали здатність клітин селезінки мишей, імунізованих СЕ MPL™ або СЕ MPL™ плюс GM-CSF, включеним в композицію з мультіеГепаринізовану кров збирали кожні два тижні, і пітопним пептидом TlSP10MN(A)(+Cys), генерувамононуклеарні клітини периферичної крові аналіти відповіді HIVMN-специфічних CTL. зували на CTL за допомогою тесту з вивільненням Як показано на малюнку 5, клітини селезінки 51 Сr, тетрамерного фарбування свіжих мононуклемишей, імунізованих СЕ MPL™ або СЕ MPL™ арних клітин периферичної крові (РВМС) і тетраплюс GM-CSF, демонстрували низьку активність мерного фарбування культивованих РВМС. Тетвідносно клітин-мішеней, які були або немічені, рамерне фарбування свіжого РВМС і цитолітичний або імпульсно-мічені, з епітопом lllВ CTL. Клітини лізис, визначений вивільненням 51Cr, не виявляли селезінки мишей, імунізованих ніякої активності. Однак, імунізація резус макаки в TISP10MN(A)(+Cys), включеним в композицію СЕ контексті Маmu А*01 TH/CTL пeптидними коктейMPL™ і з GM-CSF, разом індукували високу активлями включеними в композицію з СЕ MPL™ і GMність HIVMN-специфічних CTL після одиничної імуCSF, приводила до виявлення тетрамернізації. HIVMN-специфічний CTL-опосередкований позитивних CD8+ Т-клітин. Результати, представлізис клітин-мішеней був помітно збільшений при лені в таблицях 21-24, показують, що процент повимірюванні через сім днів після повторної імунізитивних, тетрамер-позитивних CD8+ (таблиці 21зації (на Фіг.5). В окремих експериментах, миші, 23) або CD4+ (таблиця 24) Т-клітин виявляється у імунізовані без ад'юванта, не стимулювали відпоРВМС, культивованих з відповідним пептидом віді CTL. Миші, імунізовані водним MPL™ і пептипротягом 11 днів. дом, генерували низькі (