Спосіб захисту від ефектів іонізуючого випромінювання за допомогою флагеліну

1. Спосіб захисту ссавця від ефектів іонізуючого випромінювання, який включає введення ссавцю, що потребує такого захисту, композиції, яка містить флагелін. 2. Спосіб за п. 1, де вказану композицію вводять в комбінації з радіопротектором. 3. Спосіб за п. 2, де вказаним радіопротектором є антиоксидант. 4. Спосіб за п. 3, де вказаний антиоксидант вибраний з групи, що складається з аміфостину і вітаміну Е. 5. Спосіб за п. 2, де вказаним радіопротектором є цитокін. 6. Спосіб за п. 5, де вказаний цитокін являє собою фактор стовбурових клітин. 7. Спосіб за п. 1, де вказану композицію вводять до, після або одночасно з дією радіації. 8. Спосіб за п. 1, де вказану композицію вводять в комбінації з фактором росту. 9. Спосіб за п. 8, де фактором росту є фактор росту кератиноцитів. 10. Спосіб за п. 1, де композицію вводять в комбінації із стероїдом. 11. Спосіб за п. 10, де стероїд являє собою 5андростендіол. 12. Спосіб за п. 1, де композицію вводять в комбінації з амоній трихлор(діоксоетиленО,О')телуратом. 13. Спосіб за будь-яким із пп. 1-12, де ссавець є людиною. UA (21) a200607304 (22) 02.12.2004 (86) PCT/US2004/040753, 02.12.2004 (31) 60/526,460 (32) 02.12.2003 (33) US (31) 60/526,461 (32) 02.12.2003 (33) US (31) 60/526,496 (32) 02.12.2003 (33) US (31) 60/526,666 (32) 02.12.2003 (33) US (46) 25.06.2008, Бюл.№ 12, 2008 р. (72) ГУДКОВ АНДРЕЙ В. (73) КЛЕВЕЛЕНД КЛІНІК ФАУНДЕЙШН (56) EAVES-PYLES T ET AL: "Flagellin, a novel mediator of Salmonella-induced epithelial activation and systemic inflammation: I kappa B alpha degradation, induction of nitric oxide synthase, induction of proinflammatory mediators, and cardiovascular dysfunction" JOURNAL OF IMMUNOLOGY, WILLIAMS & WILKINS CO, US, vol. 166, no. 2, 15 January 2001 (2001-01-15), pages 1248-1260, XP002210841 EAVES-PYLES T D ET AL: "Salmonella flagellindependent proinflammatory responses are localized to the conserved amino and carboxyl regions of the protein." JOURNAL OF IMMUNOLOGY (BALTIMORE, MD. : 1950) 15 DEC 2001, vol. 167, C2 2 (19) 1 3 83272 4 здорових тканин, що виникло у результаті терапії терапія раку, що використовує радіоактивне опрорака, яка включає введення ссавцю композиції, що мінення або застосування цитотоксичних ліків, містить фармацевтично прийнятну кількість агензаснована на розходженнях у регуляції росту нормальних і ракових клітин. та, який індукує активність NF-kΒ. Агентом може При традиційній терапії раку клітини піддаютьбути флагелін або TGFb, що, у свою чергу, може ся сильному генотоксичному стресу. У цих умовах бути латентним TGFb. Агент можна вводити до, розподіл більшості нормальних клітин блокується, під час або після терапії раку. Терапією може бути і тому вони виживають, у той час як пухлинні кліхіміотерапія або опромінення. тини продовжують ділитися і гинуть. Даний винахід також відноситься до способу Однак, природа традиційної стратегії терапії лікування ссавця, що страждає від ушкодження рака така, що при проведенні такої терапії ризику здорових тканин, пов'язаного зі стресом, що вклюпіддаються і звичайні тканини, у яких відбувається чає введення ссавцю композиції, яка містить фаршвидка проліферація або апоптоз. Ушкодження мацевтично прийнятну кількість агента, що індукує цих клітин, що у нормі швидко діляться, є причиактивність NF-kΒ. Таким агентом може бути фланою добре відомих побічних ефектів терапії рака гелін або TGFb, що, у свою чергу, може бути лате(чуттєвими тканинами є кровотворні органи, тонка нтним TGFb. Агент можна вводити до, під час або кишка, волосяні фолікули). До природної чутливопісля терапії захворювання, на яке страждає ссасті таких тканин додається те, що в ракових клітивець. нах найчастіше з'являються дефекти механізмів Даний винахід відноситься також до способу апоптозу, і ті терапевтичні процедури, що приворегуляції старіння клітин у ссавців, що включає дять до загибелі клітин у нормальних чуттєвих введення ссавцю композиції, яка містить фарматканинах, можуть не бути настільки ж згубними цевтично прийнятну кількість агента, що індукує для ракових клітин. Звичайно застосовувані спроактивність NF-kΒ. Таким агентом може бути флаби звести до мінімуму побічні ефекти при лікуванні гелін або TGFb, що, у свою чергу, може бути латераку засновані на (а) наданні клітинам пухлини нтним TGFb. Агент можна вводити до, під час або більшої сприйнятливості до впливу, (б) наданні після терапії захворювання, на яке страждає ссаметодам лікування раку більшої селективності вець. стосовно клітин пухлини, або (с) стимулюванні Даний винахід також відноситься до фармацерегенерації нормальних тканин після лікування втичної композиції, що містить агент, що індукує (наприклад, з використанням еритропоетину, факактивність NF-kΒ, хіміотерапевтичні ліки, а також, тора, що стимулює ріст колоній гранулоцитівможливо, фармацевтично прийнятну допоміжна макрофагів (GM-CSF - granulocyte macrophage речовина, розріджувач або носій. Агентом може colony stimulation factor), і фактора росту кератибути флагелін або TGFb, що, у свою чергу, може ноцитів (KGF - keratinocyte growth factor)). бути латентним TGFb. На даний момент існує гостра необхідність Даний винахід відноситься також до способу створення терапевтичних агентів, здатних зменвиявлення індукторів NF-kΒ, що включає додаваншити побічні ефекти, що викликані хіміотерапією і ня передбачуваного індуктора до системи експрепроменевою терапією при лікуванні раку. Даний сії, що відображає активність NF-kΒ, і окреме довинахід заповнює цю необхідність і надає інші педавання контролю до системи експресії, що реваги при рішенні близьких проблем. відображає активність NF-kΒ, при цьому індуктор Даний винахід відноситься до способу захисту пацієнта при одному або декількох видах терапії, NF-kΒ визначається за здатністю збільшувати ріщо викликає апоптоз, що включає введення пацієвень експресії, що відображає активність NF-kB. нту композиції, що містить фармацевтично прийнДаний винахід також відноситься до способу ятну кількість агента, що індукує активність NF-kΒ захисту ссавця від впливу радіоактивного опромінення, що включає введення вказаному ссавцю (nuclear factor kВ - ядерний транскрипційний факкомпозиції, яка містить фармацевтично прийнятну тор каппа В). Таким агентом може бути флагелін кількість агента, що індукує активність NF-kΒ. Таабо TGFb (transforming growth factor b - трансфорким агентом може бути флагелін, що може бути муючий фактор росту b), що, у свою чергу, може виділений з якого або виду Salmonella. Композиція бути латентним TGFb. Терапією може бути терапія може вводитися в комбінації з радіопротектором. раку, що може являти собою хіміотерапію або Радіопротектором може бути антіоксидант, яким променеву терапію. може бути аміфостин або вітамін Е. РадіопротекВинахід також відноситься до способу лікувантором також може бути цитокін, що, у свою чергу, ня ссавця, що страждає від раку, що супроводжуможе бути фактором стовбурних клітин. ється конститутивною активністю NF-kΒ, що вклюДаний винахід відноситься до способу захисту чає введення ссавцю композиції, яка містить пацієнта при одному або декількох видах терапії фармацевтично прийнятну кількість агенту, що або стану, які викликають апоптоз, що включає індукує активність NF-kΒ. Таким агентом може введення зазначеному пацієнту композиції, яка бути флагелін або TGFb, що, у свою чергу, може містить фармацевтично ефективну кількість агенбути латентним TGFb. Цей агент можна вводити та, що індукує NF-kΒ. Таким агентом може бути до, під час або після терапії раку. Терапія може флагелін, виділений з якого-небудь виду являти собою хіміотерапію або променеву тераSalmonella. Терапія може бути терапією раку, що, пію. у свою чергу, може являти собою хіміотерапію або Даний винахід також відноситься до способу променеву терапію. Станом може бути стрес, що, лікування ссавця, що страждає від ушкодження у свою чергу, може являти собою радіоактивне 5 83272 6 тоз. Один або декілька видів лікування можуть опромінення, рану, отруєння, інфекцію і темпераявляти собою терапію раку. Терапія раку, у свою турний шок. чергу, може являти собою хіміотерапію або проДаний винахід також відноситься до способу меневу терапію. виявлення модуляторів апоптоза, що включає доНа Фіг.1 показано, що інфекція Salmonella давання передбачуваного модулятора до апоптотичної клітинної системи, і окреме додавання конприводить до локалізації NF-kΒ у ядрах навіть тролю до апоптотичної клітинної системи, при неінфікованих клітин. Клітини НТ29 вирощували на цьому модулятор апоптоза визначається за здатпокривних стеклах, причому клітини або неправиністю змінювати апоптотичний індекс, причому льно інфікували, або не піддавали обробці, або передбачуваний модулятор виділяють з паразита інфікували Salmonella typhimurium, або обробляли ссавця. фактором некрозу пухлини a (TNFa - tumor Даний винахід відноситься також до способу necrosis factor a) (10нг/мл). виявлення модуляторів NF-kΒ, щовключає додаA: HT29 клітини штучно інфікували при мновання передбачуваного модулятора до системи жинності інфекції (МІ) 100 штамом Salmonella експресії, що відображає активність NF-kΒ, і окреtyphirium SJW 1103G, що експресує зелений флуме додавання контролю до системи експресії, що оресцентний білок (GFP -green fluorescent protein) відображає активність NF-kΒ, при цьому модуляпід промотором ssaH, що є єдиним активним промотором в інфікованій клітині-хазяїні. Клітини фотор NF-kΒ визначають за здатністю змінювати рітографували за допомогою мікроскопії за методом вень експресії, що відображає активність NF-kΒ, світлого поля (МСП), і детектували за допомогою причому передбачуваний модулятор одержують з імунофлуоресценції фарбування GFP або 6паразитів ссавців. Паразит належить до видів, що диамідіно-2-феніліндол дигідрохлоридом (DAPI включають Salmonella, Mycoplasma, і Chlamydia, 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochloride). Для виале не обмежуються ними. явлення заражених клітин зображення поєднували Даний винахід відноситься також до способу накладенням. Б: Клітини НТ29 залишали неоправиявлення модулятора TGFb, що включає додацьованими, інфікували штамом 1103 Salmonella вання передбачуваного модулятора до системи typhimurium або обробляли TNFa. Як указанно, експресії, що відображає активність TGFb, і окрелокалізацію субодиниці р65 NF-κΒ (Rel) при різних ме додавання контролю до системи експресії, що умовах контролювали за допомогою непрямої імувідображає активність NF-kΒ, при цьому модулянофлуоресценції. Візуалізацію клітин здійснювали тор TGFb визначають за здатністю змінювати різа допомогою мікроскопії за методом світлого поля вень експресії, що відображає активність TGFb, (МСП), ядра клітин фарбували за допомогою причому передбачуваний модулятор одержують з DAPI, а субодиницю р65 (Rel) візуалізували за допаразитів ссавців. TGFb може бути латентним помогою флуоресцеїн ізотіоционата (FITC TGFb. Паразит може належати до видів, що вклюfluorescein isothiocyanate). Колір фарбування DAPI чають Salmonella, Mycoplasma, і Chlamydia, але не штучно змінений на червоний, щоб зробити візуаобмежуються ними. лізацію цього фарбування такою, що пізнається Даний винахід відноситься також до способу краще при накладенні. виявлення модулятора р53, що включає додаванНа Фіг.2 показано, що білковий фактор у кульня передбачуваного модулятора до системи екстуральній рідини Salmonella приводить до активапресії, що відображає активність р53, і окреме доції NF-kB. давання контролю до системи експресії, що А: 100-кратно концентровану культуральну рівідображає активність р53, при цьому модулятор дина Salmonella dublin, обробляли, як зазначено р53 визначають за здатністю змінювати рівень вище, або проводили, як зазначено, стимуляцію експресії, що відображає активність р53, причому клітин НТ29 інфекційними бактеріями. ДНКпередбачуваний модулятор одержують з паразитів єднальну активність NF- kΒ визначали методом ссавців. Паразит може належати до видів, що аналізу затримки в гелі (EMSA - electrophoretic включають Salmonella, Mycoplasma, і Chlamydia, mobility shift assay) на екстрактах цілих клітин, приале не обмежуються ними. готовлених через 45хв після обробки. АвтентичДаний винахід відноситься також до модуляність NF-kΒ ДНК-білкового комплексу визначали, тора, виявленого за допомогою описаних тут сповикористовуючи суперзрушення р65 (Rеl)собів. Також даний винахід відноситься до компоспецифічних і р50-специфічних антитіл. Б: концензиції, що включає описаний тут модулятор. тровану культуральну рідину Salmonella dublin (IN) Композиція може бути фармацевтичною композививчали за допомогою гель-проникаючої хроматоцією, що містить фармацевтично прийнятну кільграфії на колонку з гелем "Супероуз 12" (Superose кість описаного тут модулятора. 12). Ельюіровані білкові фракції аналізували фраДаний винахід відноситься також до способу кціонуванням і методом електрофорезу в 10% полікування рака, що включає введення об'єкту, що ліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію потребує такого лікування, фармацевтичній ком(10% SDS-PAGE - 10% sodium dodecyl sulfate позиції, що містить модулятор, який підсилює апоpolyacryl amide gel electrophoresis) і візуалізували птоз. за допомогою фарбування кумаси блакитним (КБ). Даний винахід відноситься також до способу Відзначено маркери молекулярної ваги для гельзахисту пацієнта при одному або декількох видах проникаючої хроматографії. Аліквоти кожної фраклікування, які викликають апоптоз, що включає ції використовували, як зазначено, для стимулювведення зазначеному пацієнту фармацевтичної вання клітин НТ29 і аналізували за допомогою композиції, яка містить модулятор, що ігібує апоп 7 83272 8 відповідних субстратах ІkВa 1-54 і cJun 1-79, мічеEMSA ДНК-єднальну активність NF-kΒ в отриманих GST (glutation-S-transferase -глютатіон-Sних у результаті екстрактах цілих клітин (ЕЦК). трансфераза) (як зазначено). Імунноблот-аналіз В: концентровану культуральну рідину (ІБА) еквівалентних кількостей (40мкг) білка з кожSalmonella dublin (IN) аналізували іонообмінною ного екстракту розділяли на фракції на SDS-PAGE хроматографією на матриці POROS HQ. Білки гелі і переносили на полівініледенфторидні (PVDFельюірували в зростаючому градієнті NaCl, як заpolyvinilidene fluoride) мембрани, потім осаджували значено, і аналізували за допомогою 10% SDSз зазначеними антитілами з виявленням основної PAGE, а потім візуалізували фарбуванням Кумаси маси ІKK, JNK, ERK (extracellular signal regulated блакитним (КБ). Витрата й аліквоти кожної фракції kinase - кіназа, регульована позаклітинним сигнавикористовували, як зазначено, для стимуляції лом) а також субодиниці р38, як зазначено. У імунклітин НТ29, і отримані у результаті ЕЦК аналізуноблот-аналізах використовували фосфоспецифївали за допомогою EMS А на ДНК-єднальну актичні антитіла на ERK і субодиницю р38 для вність NF-kΒ. Ельюірований матеріал, що відповівиявлення активованих ERK і р38. Б: Дані імунодає білковим смугам У1-У6, і порожня ділянка флуоресценції, які показують, що мутант гелю, виділена з дубліката 10% SDS-PAGE гелю, Salmonella за флагеліном не інфікує клітини НТ29, разом зі зразками буфера з початку і кінця буфері що стимуляція клітин НТ29 очищеним флагеліного градієнта NaCl використовували для стимуном приводить до локалізації NF-kΒ субодиниці лювання клітин НТ29, потім отримані в результаті р65 (Rel) у ядрах, що встановлено за допомогою ЕЦК аналізували за допомогою EMS А на ДНК непрямий імуннофлуоресценции. Зображення відєднальну активність NF-kB. значених оброблених НТ29 клітин, вирощених на На Фіг.3 показано, що фактор, який активує покривному склі, точно такі ж, як на Фіг.1А i В. NF-kΒ у культуральної рідини Salmonella, являє Штучна зміна кольору мітки DAPI використано для собою флагелін, що виявлено за допомогою метопосилення візуалізації як пофарбованих ядер ду мас-спектрометрії. На Фіг.3 показані результати DAPI, так і ядерної локалізації субодиниці р65. тандемної мас-спектрометрії у поєднанні з мікроНа Фіг.6 показано, що очищений флагелін аккапілярною ВЕРХ (високоефективною рідинною тивує сигнальні шляхи й експресію протизапальхроматографією) В2, перевареної трипсіном. Піки, них генів у клітинах епітелію кишечника, що імітує що відповідають білкам Salmonella, пронумеровані ефект інфекції диким типом Salmonella. НТ29 зай ідентифіковані відповідно до номерів пептидних лишали неопрацьованими або обробляли TNFa ланцюжків праворуч. (10нг/мл) або сироваткою анізоміцитіну На Фіг.4 показано, що мутантні форми флаге(20мкг/мл)/РМА (12,5нг/мл) протягом 10хв, або ліну не викликають активації NF-kB. A: EMSA анафлагеліном (1мкг/мл) за такий же час. ЕЦК готуваліз на ДНК-єднальну активність NF-kΒ у ЕЦК, ли й аналізували методом EMSA, визначаючи отриманих через 45хв із неінфікованих клітин (UN) ДНК-єднальну активність NF-kΒ, методами імунноі після прямого інфікування клітин НТ29 диким тикіназного аналізу (ІКА) і імунноблот-аналіза (ІБА) з пом Е.соlі DH5a, диким типом Salmonella dublin використанням фосфо-специфічних антитіл на або мутантом SopE-, мутантом SopB-, подвійним ERK або р38, виявляючи в такий спосіб їхню актимутантом SopE-/SopB-, диким типом Salmonella вацію, і за допомогою кіназа-специфічних антитіл, typhimurium, штам 1103, мутантом fliC- (fliC-::Tn10), як описано на Фіг.5А, визначаючи загальну кільподвійним мутантом fliC-/fljB-, як зазначено, при МІ кість кіназ. A: EMSA аналіз, що визначає ДНК50. Б: EMSA аналіз на ДНК єднальну активність єднальну активність NF-kB. Б: імунноблот-аналіз і NF-kΒ на ЕЦК, отриманих через 45хв посля контаналіз кіназної активності, що виявляє кіназну акрольного зараження клітин НТ29 з незаражених тивність ІKK, JNK, ERK і р38, а також загальну кіклітин (UN) або на стерильно фільтрованих концелькість білка, як на Фіг.5. В: напівкількісна RT-PCR нтрованих культуральних рідинах бактерій дикого (reverse transcriptase polymerase chain reaction типу і мутантних бактерій. полімеразна ланцюгова реакція зі зворотньою На Фіг.5 показано, що флагелін необхідний транскриптазою), що виявляє експресію протизадля активації багатьох сигнальних шляхів при інпальних генів у необроблених, оброблених диким фекції Salmonella і приводить до локалізації в ядрі типом, подвійним мутантом за флагеліном NF-kB. А: Клітини НТ29 не піддавалися обробці Salmonella typhimurium і стимульованих TNFa або стимулювалися TNFa (10нг/мл) або сумішшю (10нг/мл) або флагеліном (1мкг/мл) клітин. Клітини анізоміцитину (20мг/мл)/форболмірістат ацетату НТ29 були зібрані в зазначений час після описаної (РМА - phorbol myristate acetate) (12,5нг/мл) протявище обробки, і виділена РНК використовувалася гом 15хв, або інфікувалися диким типом (ДТ) як матриця для першого ланцюга комплементарSalmonella typhimurium, штам 1103, або Salmonella ної ДНК, що потім використовували в RT-PCR з typhimurium, подвійним мутантом fliC-/fljB-, штам ген-специфічними праймерами для інтерлейкіна 134. ЕЦК виготовляли через зазначений час або 1a (IL1a), інтерлейкіна 1b (IL1 b), інтерлейкіна 8 через 10хв у випадку клітин, оброблених TNF, або (IL-8), фактора некрозу пухлини a (TNFa), білкачерез 15хв у випадку клітин, оброблених анізоміціхемоатрактанта макрофагів 1 (МСР 1 ном/РМА; далі зазначені ЕЦК використовували macrophage chemoattractant protein) і b-актину. bдля аналізу ДНК єднальної активності NF-kΒ, або актин використовувався як контроль для нормалів імунно-кіназному аналізі (ІКА), з використанням зації патернов експресії. Кінцеві продукти RT-PCR анти ІKK (ІkВ kinase - кіназа ІkВ) або анти JNK (cрозділяли на фракції в 2% агарозному гелі і виявJun N-terminal kinase - с-Jun N-кінцева кіназа) анляли фарбуванням бромистим етидієм. титіл для виміру ІKK і JNK кіназної активності на 9 83272 10 На Фіг.11 показано, що недолік р53 прискорює На Фіг.7 показано, що активація NF-kΒ, опосерозвиток синдрому гамма-опромінення у мишей. редкована флагеліном, залежить від MyD88. ІнфеА: Внутріошньочеревинна ін'єкція PFTa (pifitprin кційний дикий тип Salmonella dublin (MI 100), ІLalpha - піфітрин альфа) (10мг/кг) захищає мишей 1(20нг/мл), очищений флагелін (1мкг/мл) (як відлінії C57B1/6J (якщо не відзначено інакше, тут і значено), стерильно-профільтрований і сконцентнижче використовували самців мишей 6-8 тижнерований через фільтр 100кДа ультраконцентрат вого віку) при однократному опроміненні дозою 9 надосадової рідини культури дикого типу Грей і серії опромінень загальною дозою 12,5 Грей Salmonella dublin і SopE-/SopB- подвійний мутант Salmonella dublin штаму SE1SB2 (як відзначено (5 разів по 2,5 Грей). PFTa не впливав на вижиS2), використовувалися для стимулювання дикого вання мишей, яких піддавали однократному вплитипу (ДТ), MyD88-/- нокаутів і TLR27-/-TLR47-/- пову іонізуючого випромінювання дозою 12,5 і 25 двійних нокаутів ембріональних мишачих фібробГрей: (приведені результати показових експериластів (MEF - mouse embryo fibroblast). ЕЦК готументів, використовували джерело Shepherd вали через 45хв після обробки й аналізували 4000Кюрі, Цезій 137, потужність дози 4 Грей на методом EMSA на ДНК-єднальну активність NFхвилину). Б: Миші дикого типу і р53-нульові мутанkΒ. IL-1 (20нг/мл) використовували як позитивний ти лінії C57B1/6J відрізняються за відносною чутливістю до низьких (10 Грей) і високих (15 Грей) контроль при дослідженні функції MyD88. доз гамма-випромінювання: миші дикого типу були На Фіг.8 показано, що TLR5 (toll-like receptor 5 більш чуттєвими до опромінення дозою 10 Грей, toll-подібний рецептор 5) інгібує флагелінале більш стійкі до опромінення дозою 15 Грей, у опосередковану активність репортерного гену NFпорівнянні з р53-нульовими мутантами. В: Мишам, kΒ. Проводили трансфекцію клітин НТ29 на 6усе тіло яких опромінювали гаммалунковому планшеті тричі, використовуючи зазнавипромінюванням дозою 11 Грей, через 12год пісчені доминантно-негативні експресивні вектори ля опромінення іньетували 1,5*107 клітини кісткоTLR ссавців (DN-TLR вектори), або антизначеннєвого мозку (ККМ) мишей дикого або типу сіннгенву РНК TLR5 (AS TLR5) (2мкг/лунка), ген-репортер них р53-нульових мутантів лінії C57B1/6J. (Дана 2xNF-kB Luc (100нг/лунка), pRL-TK люциферазу доза викликає стовідсотковий летальний резульРенілу для нормалізації (50нг/лунка), доведену до тат у контрольній групі мишей, що не піддавалася загальної кількості 4мкг ДНК/лунка за допомогою ін'єкції). Через два місяці, після повного відновДНК порожнього вектора плазмідної кДНК 3.1. лення гемопоезу, тварин опромінювали по всьому (pcDNA3.1) А: дворазове індукування NF-kB Lucтілу гамма-випромінюванням дозою 15 Грей, і при репортерного гену в нестимульованих клітинах цьому знайшли відсутність різниці в показнику (світле штрихування) і оброблених TNFa (10нг/мл) смертності між двома групами, що розрізняються клітинах (темне штрихування). Лізат готували чеза статусом активності р53 клітинах кісткового морез 12год. після стимуляції. Приведено результати зку. Г: Порівняння динаміки поразки тонкої кишки показових експериментів. Б: проводили трансфекмишей дикого типу і р53-нульових мутантів у зацію клітин НТ29 як на Фіг.8А, потім обробляли їх значені точки часу після впливу гаммафлагеліном (1мкг/мл) і одержували й аналізували випромінюванням дозою 15 Грей показало збільклітинний лізат. Приведено результати показових шення ушкоджень у р53-нульових мутантів (параекспериментів. фіновий зріз, пофарбований гематоксиліНа Фіг.9 показано, що стимуляція флагеліном ном/еозином; 125-кратне збільшення). Приведені клітин епітелію кишечника приводить до активації фотографії, зроблені через 24 години, зрізів крипт, підсистеми генів TLR. Клітини НТ29 стимулювали пофарбованих методом TUNEL (Terminal флагеліном (1мкг/мл) і через 3год. виділяли РНК, deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End використовуючи Тризол. Цю РНК потім використоLabeling - мічення dUTP біотином кінців однонивували для одержання першої нитки комплементьових розривів за допомогою термінальної дезотарної ДНК. У RT-PCR використовували геніксінуклеотиділ трансферази), на яких очевидні специфічні праймери для кожного TLR. Як станзначні обсяги апоптозу дикого типу, але не в р53дарт для нормалізаціїзразків експресії використодефіцитному епітелії. вували b-актин. На Фіг.12 показана динаміка проліферації і На Фіг.10 показано, що TLR5 експресується в тривалості життя клітин у тонкій кишці мишей дибагатьох типах клітин і виявляє різну відповідь на кого типу і р53-нульових мутантів. А: порівняння флагелін. А: Екстракт цілих клітин одержували з швидкості проліферації в кишечнику мишей дикого нестимульованих клітин Т84, НТ29, А549, 293Т и типу і р53-нульових мутантів після впливу іонізуюT98G і розділяли на фракції на 8% SDS-PAGE гелі, чого випромінювання (Ліворуч). Радіоаутограми білки переносили на полівінілдифторидну мемзрізів усього тіла (1,7-кратне збільшення) 4брану і брали проби для імунноблот-аналізу (ІБА) тижневих мишей дикого типу і р53-нульових мутаз анти-ТLR5 антитілами. Загальну кількість білка нтів, яким ін'єктували внутрішньочеревинно 14Свиявляли антитілами на актин. Б: Клітини НТ29, тимідин (10мкКі на тварину) і впливали гаммаА549, HeLa, 293T и T98G залишали неопрацьовавипромінюванням дозою 15 Грей, або не піддаваними (--), обробляли флагеліном (F), або TNFa (Τ), ли впливу (по Westphal і ін. 1997). Стрілками попотім, через 45хв, готували ЕЦК і використовували значений кишечник. (Праворуч) порівняння вклюїх у EMSA для визначення ДНК єднальної активчення Brd (bromodeoxiuridine - бромдеоксиурідин) ності NF-kΒ. Автентичність зрушення смуги NF-kΒ клітинами тонкої кишки мишей дикого типу і р53визначали, використовуючи суперзрушення р65 нульових мутантів у різні проміжки часу після (RеI)-специфічних антитіл. опромінення дозою в 15 Грей. Brd (50мг/кг) ін'єкту 11 83272 12 позиції і регіони різних структурних рис послідоввали за 2год до умертвіння тварини і проводили ності амінокислот флагеліну. На малюнку привеімуннохімічне фарбування відповідно до процедудені (зверху вниз): фрагмент F41 - блакитний, три ри, описаної раніше (Watson і Pritchard 2000). Фотографії 96-годинних досвідів приведені в більшоскладки b-листа - коричневий, розподіл вторинної му збільшенні (у 400 разів). Б: Порівняння кількості структури a-спіралей - жовтий, b-структура - зелеBrd позитивних клітин на крипту в тонкому кишечний, і b-поворот - фіолетовий; мітка на кожному 50 нику мишей дикого типу і р53-нульових мутантів у залишку - блакитний; домени D0, D1, D2, і D3; рерізні моменти часу після впливу гаммагіон контакту з осьовою субодиницею у протоелевипромінюванням дозою 15 Грей. На кожен моменті - бірюзовий; високо консервативна амінокимент часу аналізували трьох тварин, з кожної тваслотна послідовність - червоний, і варіабельний рини робили п'ять поперечних зрізів клубової кишрегіон - ліловий; крапкові мутації в F41, продукуючі ки і вивчали їх під мікроскопом з метою установити елементи різних суперспіралей. Літери вказують число крипт і ворсинок. Кількість BrdU-позитивних морфологію мутантних елементів: L (D107E, клітин у криптах підраховували в п'ятьох областях R124A, R124S, G426A), лінія L-типу; R (A449V), розміром 100-300крипт, обраних випадковим чилінія R-типу; З (D313Y, A414V, A427V, N433D), ном при 200-кратному збільшенні, і загальне число виток 33. (Samatey et al, Nature 2001). Brd позитивних клітин наносили на діаграму. В: Даний винахід заснований на захисті нормаВизначення кількості BrdU-мічених клітин у тонкольних клітин і тканин від апоптозу, викликаного му кишечнику мишей дикого типу і р53-нульових стресом, що включає хіміотерапію, променеву темутантів у різні моменти часу після впливу гаммарапію й опромінення, але не обмежуються ними. Є випромінюванням дозою 15 Грей. Brd ін'єктували два основних механізми контролю апоптоза в кліза 30хв. до опромінення й умертвляли мишей у тині: шлях р53 (про-апоптичний) і NF-kΒ шлях (анзазначені моменти часу. Була виявлена підвищена ти-апоптичний). Регуляція обох шляхів у пухлинах міграція з крипт у ворсинки, за якої пішла швидка часто порушується: р53 звичайно втрачається, у загибель мічених клітин. той час як NF-kΒ стає конститутивно активним. На Фіг.13 показано, що рекомбінантний флаТак, інгібування р53 і активація NF-kΒ у нормальгелін здатний активувати NF-kB. них клітинах може забезпечити захист клітин від На Фіг.14 показані результати експериментів, смерті, викликаної стресом, таким як терапія раку, спрямованих на визначення здатності флагеліну але клітини пухлини не стануть більш стійкими до захищати мишей від радіації. Мишам лінії C56BL6 терапевтичних впливів, оскільки в них ці механізми (самці шестинедільного віку, по 10 тварин у групі) контролю нерегульовані. Ці дані спростовують ін'єктували внугрішьочеревинно 2,0мкг (0,1мг/кг) традиційний погляд на р53 і NF-kΒ, що розглядаабо 5,0мкг (0,25мг/кг) флагеліну в PBS. Через чоються як мішені для активації і репресії відповідно. тири години мишей піддавали опроміненню дозою Даний винахід відноситься до індукування ак15 Грей і щодня відслідковували виживання митивності NF-kΒ з метою захисту нормальних клітин шей. від апоптозу. Індукуючи NF-kΒ активність у ссавНа Фіг.15 показані гістологічні зрізи (фарбуців, можна захистити нормальні клітини від апопвання гематоксилін/еозин) епітелію тонкої кишки тозу, пов'язаного з клітинним стресом, що виникає мишей, опромінених дозою 15 Грей, яких ін'єктупри терапії раку, гіпертермії, опроміненні небезпевали внугрішьочеревинно 0,25мг/кг флагеліну, і не чними дозами випромінювання, ризику якого у піддавалися ін'єкції. У контрольних мишей спостевисокому ступені піддані, наприклад, солдати, рорігалося повне руйнування крипт і ворсинок, на бочі на атомних станціях, оборонній промисловості відміну від тварин, оброблених флагеліном, у яких або при радіаційно-небезпечному виробництві спостерігалася нормальна морфологія тканин. фармпрепаратів, а також запобігти клітинне стаНа Фіг.16 показаний вплив флагеліну на чутріння. Оскільки NF-kΒ конститутивно активний у ливість мишей до впливу на все тіло гаммабільшості пухлинних клітин, шляхом індукції активвипромінюванням дозою 10 Грей. ності NF-kΒ можна захистити нормальні клітини На Фіг.17 показаний вплив флагеліну, ін'єктовід апоптозу, не роблячи небажаного позитивного ваного внутрішьочеревинно в зазначені моменти впливу на клітини пухлини. Як тільки нормальні часу до опромінення, на чутливість мишей до клітини відновляться, можна відновити нормальвпливу на все тіло гамма-випромінюванням дозою ний рівень NF-kΒ активності. Активність NF-kΒ 13Грій (ліворуч) і 10 Грей (праворуч). можна індукувати для захисту тканин, сприйнятлиНа Фіг.18 показаний вплив флагеліну на чутвих до опромінення і хіміотерапії, до яких відноливість мишей до впливу на все тіло гаммасяться, наприклад, тканини кровотворної системи випромінюванням дозами 10, 13 і 15 Грей. (включаючи імунну систему), тканини епітелію киНа Фіг.19 показана доменна структура бактешечнику, і волосяні фолікули. ріального флагеліну. Показано обриси Са кістяка, Індуктори активності NF-kΒ можуть застосовурозподіл гідрофобних ядер і структурна інформаватися також за різними іншими призначеннями. ція про F41. Чотири окремих гідрофобних ядра Патології і смерть, що є наслідком дії на ссавців являють собою домени D1, D2, D2b і D3. Разом із різних факторів, що включають радіацію, пораненСа кістяком показані всі гідрофобні атоми бічного ня, отруєння, інфекції, старіння, а також темпераланцюга. Групи в бічному ланцюзі маркіровані котурний шок, але не обмежувані зазначеним, мольором: Ala (аланин) - жовтий; Leu (лейцин), IIе жуть бути наслідком дії нормальних фізіологічних (ізолейцин) або Val (валін) - жовтогарячий; Phe механізмів відповіді на стрес, таких як індукція (фенілаланін) і Туr (тірозін) - фіолетовий (атоми вуглецю) і червоний (атоми кисню), (с) позначає 13 83272 14 чні паттерни експресії TLR спостерігаються в інпрограмувальної смерті клітин (апоптоз) чи видіших лімфоїдних органах і субпопуляціях лейкоцилення биоактивних білків, цитокінів. тів. Однак TLR також експресуються й в інших Звичайною функцією апоптозу є «чищення» тканинах і органах тіла, наприклад, TLR 1 експретканин від ушкоджених, у тому числі, генетичних суєтся усюди, TLR5 виявлений також у шлунковоклітин, у той час як цитокіни служать для мобілізакишковому епітелії і ендотелії, а також відомо, що ції захисних механізмів організму проти патогенTLR 2, 6, 7 і 8 експресуються в легенях. них впливів. Однак, в умовах сильної травми, самі 1. Визначення механізми відповіді на стрес можуть викликати Варто розуміти, що використовувана тут терсмерть. Наприклад, смерть від опромінення може мінологія застосовується тільки для опису конкребути наслідком великого апоптозу, опосередковатних утілень, і не обмежує обсяг винаходу. Слід ного р53, що відбувається в кровотворній, імунній і зазначити, що використовувані в описі і прикладетравній системах. Доцільна фармакологічна регуній формулі винаходу форми однини також мають ляція NF-kB може підвищити виживаність в умовах на увазі і форми множини, якщо в контексті чітко сильного стресу. Керування цими факторами може не обмовляється інше. також уможливити контроль як над протизапальВикористовуваний тут термін «введення», що ною системою, так і над вибором між життям і використовується для опису дози агента, який інсмертю в клітинах ураженого органу. дукує активність NF-kΒ, означає одноразову дозу Захисна роль NF-kB опосередкована активаціабо багаторазові дози збудника. єю транскрипції безлічі генів, що кодують: (а) антиВикористовуваний тут термін «аналог», що заапоптичні білки, що блокують обоє головні шляхи стосовується при описі пептидів або поліпептидів, апоптозу, (б) цитокіни і фактори росту, що індукуозначає пептид або поліпептид, що містить одну ють проліферацію і підтримку життя гемопоетичабо більше нестандартних амінокислот або інших них і інших стовбурних клітин, і (в) білки, що є моструктурних варіацій звичайного набору амінокисгутніми антіоксидантами, що утилізують активні лот. форми кисню, наприклад MnSOD (manganese Використовуваний тут термін «антитіло» ознаsuperoxide dismutase 2 - дисмутаза супероксиди чає антитіло, що належить до якому або з класів марганцю 2). Таким чином, тимчасово активуючи імуноглобулінів IgG, IgM, IgA, IgD, або IgE, або NF-kB для захисту від випромінювання, можна його фрагменти або похідні, включаючи Fab, досягти не тільки придушення апоптозу в хворих F(ab')2, Fd, а також одноланцюгові антитіла, димераком, але і зменшити ймовірність вторинного вирні антитіла, біспецифічні антитіла, біфункціонаникнення раку завдяки одночасному імунностимульні антитіла та їхні похідні. Антитіло може являти люючому ефекту, якого можна досягти, якщо актисобою моноклональне антитіло, поліклональне вувати NF-kB через активацію Toll-рецепторів. антитіло, афіно-очищене антитіло, або їхні суміші, Іншою вигідною особливістю використання NFщо виявляють достатню специфічність зв'язування kB як мішені є можливість його активації за допостосовно бажаного епітопу або отриманої з нього могою багатьох природних факторів, які можна послідовності. Антитіло також може являти собою розглядати як можливі радіопротектори. Серед химерне антитіло. Антитіло може бути похідним, них можна відзначити різні пов'язані з патогенами отриманим шляхом приєднання одного або декільмолекулярні паттерни (ПМП). ПМП є молекулами, кох хімічних речовин, або пептидів поліпептидних відсутніми в організмі хазяїна, вони характерні для компонентів, відомих з рівня техніки. Антитіло мовеликих груп хвороботворних організмів, і мало жна кон'югувати з хімічним компонентом. піддаються мутаціям. Вони розпізнаються Toll Використовуваний тут термін «апоптоз» відноподібними рецепторами (TLR), що є ключовими ситися до форми клітинної смерті, що включає чуттєвими елементами уродженого імунітету. TLR прогресуючий стиск клітини зі збереженням цілісдіють як перший попереджуючий механізм імунної ності цитоплазматичних органел; конденсацію системи, індукуючи міграцію й активацію імуннохроматину (тобто конденсацію ядра), що виявлякомпетентих клітин або безпосередньо через виється методами світлової або електронної мікроділення цитокіну. TLR являють собою мембранні скопії; і/або розщеплення ДНК на фрагменти розрецептори І типу, про які відомо, що вони діють як міром з нуклеосому, що виявляється методами гомо- і гетеродимери. Пов'язуючи ліганди, TLR осадження при центрифугуванні. Смерть клітин активують білки MyD88, що є необхіднимм адапвідбувається, коли порушується цілісність клітинтерамм сигналінгу для більшості TLR. Наступний ної мембрани (тобто блебінг мембрани) а інтактні шлях активації сигналу приводить до ефекту, що клітинні фрагменти (апоптозні тіла) поглинаються включає: (1) активацію шляху NF-kB, і (2) активафагоцитами. цію МАРКО (mitogen activated protein kinases - кінаВикористовуваний тут термін «рак» означає зи, що активуються мітогенами), включаючи Nбудь-який стан, що характеризується стійкістю до кінцеву кіназу Jun (JNK). Активація шляху NF-kB апоптотичних стимулів. лігандами TLR, дає вигідну можливість використоВикористовуваний тут термін «терапія рака» вувати ці ліганди як радіопротектори. На відміну означає будь-який вид лікування рака, відомий з від цитокінів, ефекти більшості ПМП, інші ніж актирівня техніки, включаючи хіміотерапію і променеву вація TLR, незначні, тобто, зважаючи на все, вони терапію, але не обмежуючись ними. майже не мають побічної дії. Більш того, багато Використовуваний тут термін «у сполученні з», ПМП присутні в організмі людини. при описі введення агента, що індукує активність У відповідності зі своєю функцією активації NF-kΒ, і додаткового лікування, означає, що агент імунноцитів, усі TLR експресуються в селезінці і лейкоцитах периферичної крові, а більш специфі 15 83272 16 можна вводити до, разом або після додаткового TGFb, включаючи TGFb1, TGFb2, TGFb3, TGFb4, лікування, або комбінуючи ці способи. або TGFb5, а також їхньої комбінації, але не обВикористовуваний тут при описі пептиду або межуючись ними. Також конкретно розглядаються поліпептиду термін «похідна» означає пептид або фрагменти, варіанти, аналоги, гомологи, або похіполіпептид що відрізняється чим-небудь, крім пердні зазначеної ізоформи TGFb, а також їхньої комвинної структури (амінокислоти або аналоги амінобінації. Різноманітні фрагменти, варіанти, аналоги, кислот). Як ілюстрацію, похідними можуть бути гомологи або похідні, описані тут можуть бути ідегліколізовані білки (одна з форм пострансляційної нтичними ізоформі TGFb на 50%, 55%, 60%, 65%, модифікації). Наприклад, пептиди або поліпептиди 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, або можуть має паттерни гліколізування, обумовлені 99%. експресією в гетерологічних системах. Якщо при Використовувані тут терміни «лікувати», «лікуцьому зберігається хоча б один вид біологічної вання» або «терапія», що відносяться до захисту активності, такі пептиди або поліпептиди, відповіссавця від станів, означають запобігання, придудно до винаходу, є похідними. Інші похідні вклюшення, зупинку або усунення стану. Запобігання чають, але не обмежуються ними, рекомбінантні стану припускає введення ссавцю композиції за пептиди або поліпептиди, що мають ковалентно винаходом до виникнення стану. Придушення стамодифіковані N- або С-кінці, подіетиленглікольну припускає введення ссавцю композиції за винакон'юговані пептиди або поліпептиди, пептиди або ходом після виникнення стану, але до його клінічполіпептиди, асоційовані з ліпідними компонентаного прояву. Зупинка стану припускає введення ми, алкіловані пептиди або поліпептиди, пептиди ссавцю композиції за винаходом після клінічного або поліпептиди, по'єднані через функціональні прояву стану для того, щоб послабити стан або не групи бічних амінокислот з іншими пептидами, дати йому прогресувати. Усунення стану припусполіпептидами або хімікатами, і інші модифікації, кає введення ссавцю композиції за винаходом відомі з рівня техніки. після клінічного прояву стану для того, щоб ссаВикористовуваний тут термін «флагелін» вець позбувся від цього стану. означає флагелін, отриманий з будь-якого джереВикористовуваний тут термін «ракова клітина» ла, включаючи будь-які штами бактерій, але не означає будь-яку клітину, що характеризується обмежуючись ними. Флагелін може бути отримастійкістю до апоптотичних стимулів. ний зі штамів Salmonella. Також конкретно розгляВикористовуваний тут для опису пептиду або даються фрагменти, варіанти, аналоги, гомологи поліпептиду термін «варіант», означає пептид або або похідні зазначеного флагеліну, а також їхньої поліпептид, що відрізняється послідовністю амінокомбінації. Різні фрагменти, варіанти, аналоги, кислот, а саме наявністю вставок, делецій, або гомологи або похідні описані тут можуть бути іденконсервативним заміщенням амінокислот, але що тичними флагеліну дикого типу на 50%, 55%, 60%, зберігає, щонайменше, один вид біологічної акти65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, вності. У контексті задач даного винаходу «біологіабо 99%. чна активність» включає здатність зв'язуватися зі Застосовуваний тут при описі пептиду або поспецифічними антитілами, але не обмежується ліпептиду термін «фрагмент» означає пептиди, що нею. Консервативне заміщення амінокислоти, тобскладаються приблизно з 8-50 амінокислот. Фрагто заміщення амінокислоти іншою амінокислотою з ментом може бути ланцюжок з 8, 9, 10, 11, 12, 13, подібними властивостями (наприклад, гідрофільні14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, стю, ступенем зарядженості і розподілом зарядже28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, них областей) розуміється в даній області техніки 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, або 50 амінокислот. як звичайна другорядна заміна. Такі другорядні Використовуваний тут при описі пептиду або заміни можна визначити, зокрема, за допомогою поліпептиду термін «гомолог» означає пептид або індексу гідрофобності амінокислот, як це відомо з поліпептид, що має загальний еволюційний поперівня техніки. [Kyte et al, J.Mol.Biol., 157:105-132 редник з розглянутим пептидом або поліпептидом. (1982)]. Розрахунок індексу гідрофобності амінокиВикористовуваний тут термін «латентний слоти заснований на визначенні її гідрофобності і TGFb» означає попередник TGFb, що перебуває в заряду. З рівня техніки відомо, що амінокислоти з неактивній формі. Латентним TGFb може бути пооднаковим індексом гідрофобності можуть взаємпередник TGFb, що містить активний TGFb і пепно заміщатися зі збереженням функцій білка. Вітид, асоційований з латентністю (LAP - latency домо, що амінокислоти, що мають індекс гідрофоassociated peptide). Латентний TGFb може також бності " 2, є взаємозаміщеними. Визначення включати LAP, приєднаний до білка, що зв'язує гідрофільності амінокислот також дозволяє знайти латентний TGFb. Латентий TGFb може також явзаміщення, які можна робити зі збереженням біологічної функції білка. Аналіз гідрофільності аміноляти собою великий латентний комплекс. Також кислот при вивченні пептидів дозволяє розрахувалатентний TGFb може являти собою латентний ти найбільше локальне середнє значення TGFb, модифікований так, що швидкість його пегідрофільності цього пептиду, що, як було описано, ретворення в активну форму TGFb або здатність є критерієм, який добре корелює з антигенними й до такого перетворення є зниженою. Модифіковаімуногенними властивостями. [Патент США ним латентним TGFb може бути, наприклад TGFb, №4554101 включений тут за допомогою посиланщо несе мутацію, що запобігає або сповільнює ня]. Заміщення амінокислот, що мають однакові перетворення TGFb в активну форму. значення гідрофільності, приводить у результаті Використовуваний тут термін «TGFb» означає до збереження біологічної активності пептидів, будь-яку ізоформу активного або латентного наприклад імунногенності, як це зрозуміло з рівня 17 83272 18 техніки. Відомо, що таке заміщення можна робити Класи сполук, які можна використовувати в з амінокислотами, індекс гідрофільності яких розякості цитотоксичних агентів включають наступні: різняється на ±2 для кожної амінокислоти. Як на алкілуючі агенти (включаючи, але не обмежуючись індекс гідрофобності, так і на значение гідрофільзазначеним, азотисті іприти, похідні етиленіміну, ності амінокислот впливають визначені бічні групи алкілсульфонати, нітромочевини і тріазени): урацих амінокислот. Відповідно до цих спостережень, мустин, хлорметан, циклофосфамід (CytoxanÒ), можливість заміщення амінокислот, що не привоіфосфамід, мелфалан, хлорамбуцил, піпоброман, дить до втрати бажаної біологічної функції, залетриетилен-меламін, триетилентіофосфорамін, жить від відносної подібності амінокислот, а також бусульфан, кармустин, ломустин, стрептозоцин, конкретних бічних груп цих амінокислот, що визнадакарбазин, і темозоломід; антиметаболіки (включається за гідрофобністю, гідрофільністю, заряду, чаючи, але не обмежуючись зазначеним, антагонірозмірам, і іншим властивостями цих груп і аміности фолієвої кислоти, аналоги піримідину, аналоги кислот. пурину й інгібітори аденозин деамїнази): метотре2. Способи лікування ксат, 5-фторурацил, флоксуридин, цитарабін, 6а. Пухлини з конститутивно активним NF-kB меркаптопурин, 6-тіогуанін, флударабіна фосфат, Даний винахід відноситися до способів лікупентостатин і гемцитабін, натуральні продукти й вання ссавця, що страждає від раку, асоційованоїхні похідні (наприклад, алкалоїди барвінку, протипухлинні антибіотики, ферменти, лімфокіни й епіго з конститутивно активним NF-kB, що включає подофілотоксини): вінбластин, вінкристин, віндевведення ссавцю композиції, що містить терапевсин, блеоміцин, дактиноміцин, даунорубіцин, тично ефективна кількість агента, що індукує актидоксорубіцинн, епирубіцинн, ідарубіцин, цитозинвність NF-kB. Агент, що індукує активність NF-kB арабінозид, паклітаксел (паклітаксел є у продажу можна вводити разом з іншими видами терапії під торговим найменуванням ТаксолÒ), мітрамірака. цин, дезоксікоформіцин, мітоміцин-ц, 1Зазначений агент можна вводити одночасно аспарагіназа, інтерферони (переважно aабо по черзі із застосуванням інших видів протиінтерферон), етопозид, і теніпозид. ракової терапії, наприклад хіміотерапії або промеІншими цитотоксичними агентами, що вплиневої терапії. Термін «одночасний» або «одночасвають на проліферацію, є навелбен, СРТ-11 (ірино», використовуваний тут, означає, що проміжок нотекан), анастразол, летразол, капецитабін, речасу між застосуванням інших видів протиракової локсафен, циклофосфамід, іфосамід, та терапії і введенням сполуки за винаходом складає дролоксафен. 48 годин, переважно 24 години, більш переважно Агенти, що діють на мікротрубочки, які добре 12 годин, ще більш переважно 6 годин, і найбільвідомі з рівня техніки, перешкоджають мітозу заше переважно в 3 години і менше. Термін «по червдяки цитотоксичній активності. Агенти, що діють зі», використовуваний тут, означає введення спона мікротрубочки, що застосовуються у винаході, лук в інший момент часу, ніж час проведення включають, не обмежуючись зазначеним, алоколхіміотерапії, з визначеною частотою щодо повторхіцин (NSC 406042), халіхондрин В (NSC 609395), ного введення і/або режиму хіміотерапії. колхіцин (NSC 757), похідні колхіцину (наприклад, Зазначений агент можна вводити в будь-який NSC 33410), доластатин 10 (NSC 376128), майтанчас до проведення терапії раку, наприклад, але не син (NSC 153858), ризоксин (NSC 332598), пакліобмежуючись цим, приблизно за 48 годин, 46 готаксел (Таксол1, (NSC 125973), похідні Таксолу дин, 44 години, 42 години, 40 годин, 38 годин, 36 (наприклад, NSC 608832), тіоколхіцин (NSC годин, 34 години, 32 години, 30 годин, 28 годин, 26 361792), тритил цистеїн (NSC 83265), вінбластин годин, 24 годин, 22 години, 20 годин, 18 годин, 16 сульфат (NSC 49842), вінкристин сульфат (NSC годин, 14 годин, 12 годин, 10 годин, 8 годин, 6 го67574), натуральні і синтетичні епотілони, вклюдин, 4 години, 3 години, 2 години, або 1 годину. чаючи, але не обмежуючись зазначеним, епотілон Агент можна вводити в будь-який момент після А, епоптілон В, а також дискодермолід [див. проведення терапії раку, наприклад, але не обмеService, (1996) Science, 274:2009] естрамустин, жуючись цим, через приблизно 1 годину, 2 години, нокодазол, МАР4, і т.п. Приклади таких агентів 3 години, 4 години, 6 годин, 8 годин, 10 годин, 12 також описані в [Bulinski (1997) J.Cell Sci. 110:3055 годин, 14 годин, 16 годин, 18 годин, 20 годин, 22 3064; Panda (1997) Proc. Natl.Acad.Sci.USA години, 24 години, 26 годин, 28 годин, 30 годин, 32 94:10560-10564; Muhlradt (1997) Cancer Res. годин, 34 годин, 36 годин, 38 годин, 40 годин, 42 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387:268-272; години, 44 годин, 46 годин, 48 годин після провеVasquez (1997) Mol.Biol.Cell. 8:973-985; а також дення терапії. Panda (1996) J.Biol.Chem 271:29807-29812]. Терапія раку може включати введення цитотоТакож підходять цитотоксичні агенти, такі як ксичних агентів або цитостатичних агентів, або епідофілотоксин, протипухлинний фермент; інгібіїхню комбінацію. Цитотоксичні агенти перешкотор топоізомерази, прокарбазин, мітоксантрон, джають розмноженню ракових клітин за допомокоординаційні комплекси з платиною, наприклад, гою: (1) придушення здатності клітин до реплікації цисплатин і карбоплатин, модифікатори біологічДНК і (2) індукції клітинної загибелі і/або апоптозу ної відповіді, інгібітори росту, антигормональні в ракових клітинах. Цитостатичні агенти діють, терапевтичні агенти, лейковорин, тегафур, а також модулюючи, перешкоджаючи або придушуючи гемопоетичні фактори росту. процеси передачі сигналу в клітинах, що регулюЦитостатичні агенти, які можна використовують клітинну проліферацію, у тому числі підтривати, включають гормони і стероїди (включаючи муючі її на безупинному низькому рівні. синтетичні аналоги): 17-альфа-етинілестрадіол, 19 83272 20 меланому, пігментну ксеродерму, кератоактантому діетилстилбестрол, тестостерон, преднизон, флу(keratoactanthoma), семіному, фолікулярний рак оксиместерон, дромостанолон пропіонат, тестолащитовидної залози, тератокарциному, але не обктон, мегестролацетат, метилпреднізолон, метилмежуючись ними. У кращому втіленні, даний винатестостерон, преднізолон, триаміцинолон, хід використовується для лікування раку шлункохлортрианізен, гідроксипрогестерон, аміноглютево-кишкового тракту. тимід, естрамустин, медроксипрогестеронацетат, б. Лікування побічних ефектів, що виникають леупролід, флутамід, тореміфен, золадекс, але не при терапії раку обмежуються ними. Даний винахід також відноситься до способу Також в обсяг даного винаходу включені інші лікування ссавця, який страждає від ушкодження цитостатичні агенти, що перешкоджають росту нормальних тканин, що виникає внаслідок лікусудин, такі як інгібітори металопротеаз матриксу, а вання раку, асоційованого з конститутивною актитакож інші інгібітори VEGF (vascular endothelium growth factor - фактор росту ендотелію судин), такі вністю NF-kΒ. Агент, що індукує активність NF-kΒ, як антитіла до VEGF і мікромолекули, наприклад можна застосовувати разом з іншими видами теZD6474 і SU 6668 (інгібітори кіназної активності рапії рака, описаними вище. рецептора VEGF типу 2). Також можна використов. Модулювання клітинного старіння вувати антитіла на Her-2 (human epidermal growth Даний винахід також відноситься до способу factor receptor 2 - рецептор людського епідермальмодулювання клітинного старіння у ссавців, що ного фактора росту типу 2) від Джінтек. Придатнивключає введення ссавцю терапевтично ефективми інгібіторами EGFR (epidermal growth factor ної кількості агента, що індукує активність NF-kΒ. receptor - рецептор епідермального фактора росАгент, що індукує активність NF-kΒ, можна застоту) є ЕKВ-569 (необоротний інгібітор). Також вклюсовувати разом з іншими видами лікування. чені антитіла С225, специфічні до EGFR, і інгібітоАгент можна вводити в будь-який проміжок чари Src-кіназ. су до проведення іншого виду лікування, включаТакож підходить для використання в якості циючи проміжки часу близько 48 годин, 46 годин, 44 тостатичного агента Касодекс® (бікалутамід, Астгодини, 42 години, 40 годин, 38 годин, 36 годин, 34 ра Зенека), що забороняє проліферацію андрогенгодини, 32 години, 30 годин, 28 годин,26 годин, 24 залежних карцином. Ще одним прикладом цитосгодини, 22 години, 20 годин, 18 годин, 16 годин, 14 татичного агента є антиестроген Тамоксифен®, годин, 12 годин, 10 годин, 8 годин, 6 годин, 4 годищо ігібує проліферацію і ріст естроген-залежних ни, 3 години, 2 години або 1 годину до проведення пухлин молочної залози. Інгібітори передачі проіншого виду лікування, але не обмежуючись цим ліферативних сигналів у клітині є цитостатичними часом. Зазначений агент також можна вводити в агентами. Ілюстративні приклади включають інгібібудь-який проміжок часу після проведення іншого тори епідермальних факторів росту, інгібітори Herвиду лікування, включаючи проміжки часу близько 2, інгібітори МЕК-1 кіназ, інгібітори МАРКО кіназ, 1 години, 2 годин, 3 годин, 4 годин, 6 годин, 8 гоінгібітори РІ3 (phosphatidyl inositol 3-phosphate дин, 10 годин, 12 годин, 14 годин, 16 годин, 18 гофосфатиділ-інозитол 3-фосфат), інгібітори Srcдин, 20 годин, 22 годин, 24 годин, 26 годин, 28 гокіназ, а також інгібітори PDGF (platelet derived дин, 30 годин, 32 годин, 34 годин, 36 годин, 38 growth factor - фактор росту тромбоцитів). годин, 40 годин, 42 годин, 44 годин, 46 годин, 48 Відповідно до даного винаходу, можна лікувагодин після проведення іншого виду лікування, але ти багато видів раку, включаючи наступні: карцине обмежуючись цим часом. нома, включаючи карциному сечового міхура (у г. Лікування стресу тому числі прискорений і метастатичний рак сечоДаний винахід відноситься також до способу вого міхура), грудей, товстої кишки (у тому числі лікування ссавця, що страждає від ушкодження рак прямої кишки), нирок, печінки, легень (у тому нормальних тканин, обумовленого стресом, що числі дрібноклітинний і недрібноклітинний рак левключає введення ссавцю терапевтично ефективгені й аденокарциному легені), яєчників, простати, ної кількості агента, що індукує активність NF-kΒ. яєчків, сечостатевого тракту, лімфатичної систеАгент, що індукує активність NF-kΒ, можна вводими, прямої кишки, гортані, підшлункової залози ти разом із застосуванням інших видій лікування. (включаючи ациноцитарну карциному), стравохоСтрес може викликатися опроміненням, пораненду, жовчного міхура, шиї, щитовидної залози і шкіням, отруєнням, інфекцією або температурним ри (включаючи плоскоклітинну карциному); гемашоком, а також іншими видами впливів. топоетичні пухлини лімфоїдного типу, включаючи Композицію, що містить індуктор активності лейкемію, гострий лімфолейкоз, гострий лімфобNF-kΒ, можна вводити за будь-яку кількість часу ластний лейкоз, В-клітинну лімфому, Т-клітинну до впливу факторів стресу, включаючи проміжки лімфому, лімфому Ходжкіна, неходжкінску лімфочасу близько 48 годин, 46 годин, 44 години, 42 му, гістіоцитарну лімфому, лімфому Буркета; гегодини, 40 годин, 38 годин, 36 годин, 34 години, 32 матопоетичні пухлини мієлоїдного типу, включаюгодини, 30 годин, 28 годин, 26 годин, 24 години, 22 чи гострі і хронічні мієлоїдні лейкемії, години, 20 годин, 18 годин, 16 годин, 14 годин, 12 мієлодіспластичний синдром, мієлоїдную лейкегодин, 10 годин, 8 годин, 6 годин, 4 години, 3 годимію, а також промієлоцитару лейкемію; пухлини ни, 2 години, або за 1 годину до впливу стресу, центральної і периферичної нервової системи, але не обмежуючись цим часом. Композицію, що включаючи астроцитому, нейробластому, гліому, містить індуктор NF-kΒ, можна вводити в будьневриному; пухлини мезенхімального походження який проміжок часу після впливу стресових наванвключаючи фібросаркому, рабдоміосаркому й остажень, включаючи проміжки часу близько 1 годитеосаркому, а також інші види пухлин, включаючи ни, 2 годин, 3 годин, 4 годин, 6 годин, 8 годин, 10 21 83272 22 канцерогенного впливу при невеликих дозах, і загодин, 12 годин, 14 годин, 16 годин, 18 годин, 20 кінчуючи смертельним результатом при високих годин, 22 годин, 24 годин, 26 годин, 28 годин, 30 дозах. Загальна радіочутливість організму визнагодин, 32 годин, 34 годин, 36 годин, 38 годин, 40 чається патологічними порушеннями, що виникагодин, 42 годин, 44 годин, 46 годин, 48 годин після ють у декількох чуттєвих тканинах, у числі яких впливу, але не обмежуючись цим часом. гемопоетична система, статева система і різні епід. Опромінення теліальні тканини з високою швидкістю клітинного Даний винахід також відноситься до захисту циклу. клітин від ефектів, викликаних радіоактивним Ступінь виразності патологічних наслідків, виопроміненням. Ураження і смерть клітин у резулькликаних гамма-випромінюванням і приводять до таті дії іонізуючого випромінювання є сукупністю смерті, залежить від дози і визначається ураженуражень, викликаних безпосередньо опроміненням ням конкретних органів, що визначають поріг чутнезахищених клітин і активністю генетично обумоливості організму до кожної визначеної дози. Так, влених механізмів відповіді клітини на стрес, вилетальний результат при низькій дозі виникає від кликаний дією радіації, що приводить у результаті аплазії кісткового мозку, у той час як смерть при до "самогубства клітини" або до апоптозу. Апоптоз помірних дозах настає швидше внаслідок гастроінвідіграє ключову роль у масовій загибелі клітин, тестинального синдрому. Дуже високі дози випрощо відбувається в деяких чуттєвих до випромінюмінювання практично у всіх випадках приводять до вання органах (наприклад, кровотворна й імунна негайної смерті, викликаної дегенерацією нейросистеми, епітелій травного тракту і т.д.), і нестійнів. кість цих органів до випромінювання визначає заОрганізм, що пережив період гострої токсичгальну чутливість організму до впливу випромінюності, викликаної радіацією, може протягом тривавання. лого часу страждати від пізніх наслідків, серед Вплив іонізуючого випромінювання (IB) може яких викликані радіацією канцерогенез і фіброз, бути коротким або довгим, його можна робити одщо розвиваються в опромінених органах (напринократно або кілька разів, піддавати йому все тіло клад, нирки, печінка або легені) протягом декільабо тільки окремі ділянки. Так, ядерні аварії або кох місяців або років після опромінення. воєнні дії можуть приводити до опромінення всьоКлітинна ДНК є головною мішенню для іонізуго тіла одиночною дозою високої потужності (іноді ючого випромінювання, що викликає різні види за цим випливає тривале отруєння радіоактивниушкоджень ДНК (генотоксичний шок), діючи прямо ми ізотопами). Те ж саме відбувається (але під або опосередкованою (наприклад, за допомогою строгим контролем потужності дози випромінювільних радикалів). У всіх організмах функціонують вання) при попередній терапії, що проводиться системи репарації ДНК, що здатні ефективно відперед трансплантацією кісткового мозку, у випадновлювати ушкоджену радіоактивним випромінюках, коли це необхідно для підготовки кровотворванням ДНК; порушення процесу репарації ДНК них органів реципієнта для пересадження донорможуть приводити до мутацій. ського кісткового мозку шляхом «очищення» їх від Пухлини звичайно є найбільш чуттєвими до клітин-попередників крові реципієнта. Лікування гамма-випромінювання, і їх можна лікувати декільраку може утягувати використання декількох доз кома місцевими дозами, що викликають відносно місцевого опромінення, причому загальна сума невеликі ушкодження нормальних тканин. Однак у цих доз, якби опроміненню піддавалося все тіло, деяких випадках можливість ушкодження норманабагато перевершувала б летальну дозу. Або льних тканин обмежує застосування гаммаотруєння лікування радіоактивними ізотопами випромінювання при лікуванні раку. Використання приводить до тривалого опромінення органівпри раковій терапії звичайного тривимірного конмішеней (наприклад, щитовидної залози, при інгаформного опромінення або навіть більш сфокусоляції 125І). Нарешті, існує багато фізичних форм ваного опромінення за допомогою системи іонізуючого випромінювання, що істотно розрізняBeamCath також має дозові обмеження, пов'язані з ються по силі біологічної дії. токсичністю, обумовленої кумулятивним ефектом На молекулярному і клітинному рівні радіоаквипромінювання й індукуванням ушкоджень стовтивні частки здатні викликати розрив і утворення бурних клітин у нормі швидко відновлюючих ткапоперечних зв'язків у ДНК, білках, клітинних мемнин, таких як тканини кісткового мозку і шлунковобранах і інших макромолекулярних структурах. кишкового тракту. Іонізуюче випромінювання також викликає вторинВисокі дози опромінення викликають летальні ушкодження клітинних компонентів, створюючи ний результат, пов'язаний з так називаними гемовільні радикали й активні форми кисню. Багато поетичним і гастроінтестинальним синдромами. систем репарації борються з такими ушкодженняГемопоетичний синдром характеризується втрами, так, кілька шляхів репарації ДНК відновлюють тою кровотворних клітин й їхніх попередників, що цілісність ДНК і правильну послідовність нуклеоробить неможливим відновлення крові і лімфатичтидів, антіоксиданти хімічної і ферментативної ної системи. Смерть, як правило, настає внаслідок природи утилізують вільні радикали і зменшують інфекції (результат імунносупресії), крововтрати кількість окислених білків і ліпідів. Системи точок і/або анемії. Гастроінтестинальний синдром виниконтролю клітинного циклу виявляють дефекти кає внаслідок масової смерті клітин епітелію кишеДНК і припиняють клітинний цикл доти, поки ушкочнику, в основному тонкого кишечнику, за яким дження не будуть усунуті, або блокують ріст клівипливає руйнування стінок кишечнику і смерть у тин, або направляють клітину на шлях апоптозу. результаті бактеріємії і сепсису. Гематопоетичний Випромінювання може заподіяти шкоду органісиндром частіше виникає при менших дозах визму ссавця, починаючи від помірного мутагенного і 23 83272 24 сполук. Антиапоптичні фармпрепарата з більш промінювання і приводить до більш повільної смешироким спектром активності є найбільш необхідрті, ніж при гастроінтестинальному синдромі. ними. Раніше в якості радіопротекторів як правило використовувалися антіоксиданти - як синтетичні, Індуктори NF-kΒ можна використовувати як так і натуральні. Зовсім недавно в список радіоагенти, що захищають від випромінювання, у репротекторів були додані цитокіни і фактори росту; зультаті чого можна розширити діапазон прийнятвважається, що механізм їхньої радіопротективної них доз опромінення, підсилюючи стійкість людсьдії є результатом впливу на чуттєві тканини, що кого організму до опромінення до рівня більшого, полегшує їхнє відновлення. Однак немає чіткого ніж доступний на сьогоднішній день, що досягафункціонального розмежування між обома групається з допомогою, засобів (екранування або зами радіопротекторів, оскільки деякі цитокіни індустосування існуючих біопротекторів), і значно збікують експресію клітинних антіоксидантів, таких як льшити шанси на порятунок персоналу у випадку дисмутаза супероксиду марганцю (MnSOD ядерних аварій на підприємствах, або при широmanganese superoxide dismutase) і металотіонеїн. комасштабній дії сонячних часток високої енергії. Ступінь протективної дії кожного конкретного Притому що середній ФМД (30 днів) флагеліну агента виражається у факторі модифікації дози більше 1,5, цей індуктор NF-kΒ більш ефективний, або факторі зменшення дози (ФМД або ФЗД). ФМД ніж будь-які інші відомі нині природні сполуки. визначається впливом на об'єкти, що одержують Індуктори NF-kΒ також придатні для лікування радіопротектор, і контрольні об'єкти, що не одервтрати непоновлюваних клітин, викликаної випрожують радіопротектор, декількома дозами опромімінюванням невеликої потужності, наприклад, у нення і наступним порівнянням кількості виживших центральній нервовій системі і репродуктивних або інших критеріїв. ФМД звичайно розраховуєтьорганах. Індуктори NF-kΒ можна також застосовуся при спостереженні за виживанням об'єктів провати під час хіміотерапії раку для лікування побічтягом 30 днів (обчислюється відношення кількості них ефектів, пов'язаних з хіміотерапією, включаютих, що вижили у групі, яка одержала ЛД (летальчи облисіння. ну дозу) 50/30 і тих, що приймали ліки, до кількості В одному із втілень, ссавця піддають терапії тих, що вижили, у групі, що одержала ЛД 50/30 і проти дії випромінювання, що включає введення тих, що приймали "порожній" наповнювач) і кількіссавцю композиції, що містить терапевтично ефесно визначає захисну дію досліджуваної речовини ктивну кількість індуктора NF-kΒ. Композицію, що на гемопоетичну систему. Оцінюючи захисну дію містить індуктор NF-kΒ, можна вводити в комбінана гастроінтестинальну систему, розраховують ЛД ції з одним або більше радіопротектором. Одним 50 і ФМД при спостереженні за виживанням протяабо більше радіопротектором може бути будь-який гом 6 або 7 днів. Величини ФМД приведені тут, агент, який застосовують при лікуванні від наслідрозраховані при 30-денному спостереженні, якщо ків дії випромінювання, включаючи антіоксиданти, не зазначено інакше. пастки вільних радикалів і цитокіни, але не обмеАгенти, що індукують активність NF-kΒ, діють, жуючись зазначеним. значною мірою сприяючи виживанню клітин і всьоІндуктори NF-kΒ можуть інгібувати апоптоз, го організму. У відповідь на понадлетальну дозу викликаний дією випромінювання, що ушкоджує випромінювання індуктори NF-kΒ інгібують гастроДНК й інші клітинні структури, однак вони не моінтестинальний і гематопоетичний синдром, що є жуть виправляти клітинні ушкодження і запобігати головними причинами виникнення смерті при симутації. Вільні радикали й активні форми кисню є льному випромінюванні. Завдяки цим властивосголовною причиною мутацій й інших внутрішньотям, агентів, що індукують NF-κΒ, можна викорисклітинних ушкоджень. Антіоксиданти та пастки товувати для лікування наслідків опромінення, що вільних радикалів ефективно запобігають ушковідбулося в результаті природних причин або ядедженням, викликаних вільними радикалами. Комрних аварій. Більш того, оскільки індуктори NF-kΒ бінація індуктора NF-kΒ і антіоксидантів або пастки діють по механізмах, інших, ніж усі відомі в даний вільних радикалів може приводити до зменшення час радіопротектори, їх можна використовувати в сили поразки, більшій виживаності і поліпшенню комбінації з іншими радіопротекторами, таким чиздоров'я опромінених ссавців. Антіоксиданти і пасном, значно підвищуючи ступінь захисту від іонітки вільних радикалів, які можна застосовувати зуючого випромінювання. при практичному використанні винаходу, включаНа відміну від традиційних агентівють тіоли, такі як цистеїн, цистеамін, глутатіон і радіопротектрів (наприклад, пастки вільних радибілірубін; аміфостин (WR-2721); вітамін А, вітамін калів), антиапоптичні агенти можуть не зменшуваС, вітамін Е; флавоноїди, такі як Індійський васити первинні ушкодження, викликані випромінюванльок священний (Ocimum sanctum), орієнтин і віням, але вони діють проти вторинних явищ, що ценін, але не обмежуються ними. включають активну реакцію клітин на первинні Індуктори NF-kΒ можна також застосовувати в ушкодження, таким чином, доповнюючи існуючі комбінації з деякими цитокінами і факторами росспособи захисту. Піфітрин-альфа, фармакологічту, що забезпечують захист від випромінювання за ний інгібітор р53 (ключовий медіатор відповіді клідопомогою відновлення і/або захисту популяцій тин ссавців на опромінення), являє приклад нового стовбурних клітин, чуттєвих до випромінювання. класу радіопротекторів. Однак активність інгібітоЗахист від випромінювання з мінімальними побічрів р53 обмежена захистом гемопоетичної систеними ефектами може бути досягнута при викорисми, і не робить захисної дії на кишковий тракт (не танні фактора стовбурних клітин (SCF - stem cell захищає від гастроінтестинального синдрому), що ligand, c-kit ліганд), Flt-3 ліганд, а також фрагмент знижує лікувально-профілактичне значення цих 25 83272 26 години, 2 годин, З годин, 4 годин, 6 годин, 8 годин, інтерлейкіна-1 IL-1b-rd. Також захисний ефект спо10 годин, 12 годин, 14 годин, 16 годин, 18 годин, 20 стерігається при індукуванні проліферації стовбугодин, 22 годин, 24 годин, 26 годин, 28 годин, 30 рних клітин (усі відзначені цитокіни) і запобіганні їх годин, 32 годин, 34 годин, 36 годин, 38 годин, 40 апоптозу (SCF). Зазначені види терапії уможливгодин, 42 годин, 44 годин, 46 годин, 48 годин після люють нагромадження лейкоцитів та їхніх попереопромінення, але не обмежуючись цим часом. дників до опромінення, завдяки чому після опромі3. Агенти нення відбувається більш швидке відновлення Даний винахід також відноситься до агентів, імунної системи. SCF ефективно рятує мишей, опромінених летальною дозою, причому значення що індукують активність NF-kB. Агент може бути ФМД знаходиться в інтервалі 1,3-1,35. Також він штучно синтезованою сполукою або сполукою, що ефективний при терапії гастроінтестинального зустрічається в природі. Агентами також можуть синдрому. Flt-3 ліганд також виявляє виражений бути сполуки з малою молекулярною вагою, полізахисний ефект при впливі на мишей (70-80% 30пептиди або пептиди, або їхні фрагменти, аналоги, денне виживання при ЛД100/30, еквівалентної гомологи, варіанти або похідні. ФМД>1,2) і кроликів (15, 16). Агентами також можуть бути цитокіни, що інКілька факторів не цитокінової природи стимудукують активність NF-kB, включаючи IL2 (інтерлюють проліферацію імуноцитів і можуть викорислейкін 2), JL6 (інтерлейкін 6), TNF (фактор некрозу товуватися в комбінації з індукторами NF-kΒ. 5пухлини) і TGFb (трансформуючий фактор росту AED (5-androstenediol - 5-андростендіол) являє b), але не обмежуючись ними. Збудником може собою стероїд, що стимулює експресію цитокінов і бути також простагландін. Агентами також можуть підвищує стійкість до бактеріальних і вірусних інбути фактори росту, включаючи KGF (фактор росфекцій. Підшкірна ін'єкція 5-AED мишам за 24год ту кератиноцитів) і PDGF (фактор росту тромбоцидо опромінення підвищує виживаність із тів), але не обмежуючись ними. Агентом може таФМД>1,26. Синтетичні сполуки, такі як трихкож бути антитіло, що індукує активність NF-kB. лор(діоксоетилен-O,O'-)телурат амонію (AS-101), а. Флагелін також дозволяють індукувати секрецію деяких циВ одному з втілень агентом є флагелін, що токінів, та їх також можна використовувати в комможе бути отриманий з бактерій, включаючи види бінації зі збудниками NF-kB. роду Salmonella, такі як S. typhimurium, але не обФактори росту і цитокіни також можна викоримежуючись ними. Як показано в Прикладах нижче, стовувати для забезпечення захисту від гастроінфлагелін має сильну активність, що стимулює витестинального синдрому. Фактор росту кератиноживання як на клітинному рівні, так і на рівні цілого цитів (KGF - keratinocyte growth factor) сприяє організму. проліферації і диференціації клітин слизистої обоФрагмент, варіант, аналог, гомолог або похідлонки кишки, а також збільшує виживаність стовну індуктора NF-kB, такого як флагелін, з бажанибурних клітин у криптах кишечнику після опроміми властивостями можна одержати, ґрунтуючись нення. Гемопоетичні цитокіни і радіопротектори, на доменній структурі флагеліну. Доменна структакі як фактор стовбурних клітин, також можуть тура флагеліну Salmonella описана в літературі підвищувати виживаність стовбурних клітин кише(Фіг.19). Флагелін має консервативні домени (D1 і чнику і пов'язане з нею короткочасне виживання D2) на N-кінці і С-кінці і проміжний гіперваріабельорганізму. ний домен (D3) [Samatey, et al 2001, Eaves-Pyles T, Індуктори NF-kB можуть також охороняти як et al, 2001a]. Результати досліджень рекомбинанвід гастроінтестинального, так і від гемопоетичнотого білка, що містить N-кінцеві D1 і D2, і С-кінцеві го синдрому. Тому що миші, яких опромінювали по D1 і D2, розділені ділянкою білку Escherichia coli всьому тілу летальною дозою 15 Грей, вмирали в (ND1-2/ECH/CD2) показують, що D1 і D2 є біологіосновному від гастроінтестинального синдрому, чно активними при злитті з ЕСН елементом. Даний композиція, що містить індуктори NF-kB у поєдхимерний білок, але не елемент ДНК E.coli окремо, нанні з одним або декількома інгібіторами гастроііндукує деградацію І kВa, активацію NF-kB, а також нтестинального синдрому може бути більш ефекутворення NO і IL-8 (інтерлейкіна 8) у лініях клітин тивною. Інгібітори гастроінтестинального кишкового епітелію. Неконсервативний D3 домен синдрому, які можна використовувати при практизнаходиться на поверхні джгутикової нитки і місчному здійсненні винаходу, включають цитокіни, тить основні антигенні епітопи. Сильна протизапатакі як фактор стовбурних клітин (SCF) і фактор льна активність флагеліну, швидше за все, пов'яросту кератиноцитів (KGF), але не обмежуються зана з надзвичайно консервативними N і Сними. кінцевими D1 і D2 доменами. Композицію, що містить індуктори NF-kB, можб. Індуктори NF-kB з паразитів на вводити в будь-який проміжок часу до опроміВластивості флагеліну дозволяють припусканення, включаючи проміжки часу близько 48 годин, ти, що в паразитичних організмів можна знайти 46 годин, 44 години, 42 години, 40 годин, 38 годин, додаткові модулятори NF-kB. Існують паразити, 36 годин, 34 години, 32 години, 30 годин, 28 годин, життєдіяльність яких вимагає придушення апопто26 годин, 24 години, 22 години, 20 годин, 18 годин, зу, оскільки вони не можуть вижити без клітин ха16 годин, 14 годин, 12 годин, 10 годин, 8 годин, 6 зяїна. Ці організми повинні бути адаптовані до годин, 4 години, 3 години, 2 години або 1 годину до ефективного виживання в організмі хазяїна і видіопромінення, але не обмежуючись цим часом. ляти антиапоптотичні фактори. Подібно пухлинам Композицію, що містить збудники NF-kB, можна на пізніх стадіях розвитку, ці організми виділяють також вводити в будь-який проміжок часу після фактори, здатні збільшувати їхню виживаність і опромінення, включаючи проміжки часу близько 1 27 83272 28 Сполучні агенти включають сироп, камедь, желавирішувати конфлікт із захисними механізмами тин, сорбітол, трагакант, крохмальний клейстер і відповіді хазяїна на стрес. полівінілпіролідон, але не обмежуються ними. НаАнтиапоптичні фактори паразитуючих або сиповнювачі включають лактозу, цукор, мікрокристамбіотичних організмів пройшли мільйони років лічну целюлозу, кукурудзяний крохмаль, фосфат адаптації для зведення до мінімуму збитку органікальцію і сорбітол, але не обмежуються ними. Козму хазяїна, що впливає на його життєздатність. У взаючі речовини включають стеарат магнію, стеарезультаті, ці фактори якщо і вимагають додаткоринову кислоту, тальк, поліетиленгліколь і окис вих модифікацій, то невеликих, і їх можна викорискремнію, але не обмежуються ними. Дезінтегруючі товувати безпосередньо в їхній природній формі агенти включають картопляний крохмаль і натрієабо з невеликими модифікаціями. Такі фактори вий гліколат крохмалю, але не обмежуються ними. можуть бути придатними для лікування апоптозу, Зволожувачі включають лаурилсульфат натрію, викликаного стресом, наприклад, побічними ефекале не обмежуються ним. Таблетки можуть бути тами, пов'язаними з хіміотерапією і променевою покриті оболонкою, як це відомо з рівня техніки. терапією. Композиції за винаходом можуть також являти Даний винахід також відноситься до способів собою рідкі лікарські форми, включаючи водяні скринінгу паразитів для виявлення модуляторів або масляні суспензії, розчини, емульсії, сиропи й NF-kΒ. Передбачувані модулятори можуть бути еліксири, але не обмежуючись ними. Композиція отримані з паразитів людини або інших приматів. може бути представлена у вигляді сухого продукту Кращі позаклітинні паразити організму-хазяїна. для розведення водою або іншими придатними Паразитами можуть також бути симбіонти. Парарозріджувачами перед використанням. Подібні зити, з яких можна виділити модулятори за винарідкі препарати можуть містити добавки, включаюходом, включають Mycoplasma, Chlamydia і чи суспендуючі агенти, емульгатори, неводні розSalmonella, але не обмежуються ними. Ці модуляріджувачі і консерванти, але не обмежуючись нитори можна виявити, використовуючи методи ми. Суспендуючі агенти включають сироп скринінгу описані тут, а також способи біохімічної і сорбітолу, метилцелюлозу, сироп глюкози/цукру, генетичної селекції, тестування in vitro, агенти, що желатин, гідроксицелюлозу, карбоксиметилцелюзахищають від смерті клітин, і in vivo. лозу, гель стеарата алюмінію, а також гідрогенізо4. Композиція. вані харчові жири, але не обмежуються ними. Даний винахід також відноситься до композиЕмульгуючі агенти включають лецитін, сорбітола ції, що містить терапевтично ефективну кількість моноолеат і камедь, але не обмежуються ними. індуктора NF-kΒ. Композиція може бути фармацеНеводні розріджувачі включають харчові олії, мигвтичною композицією, яку можна одержати, викодальну олія, фракціоновану кокосову олію, масляристовуючи способи, добре відомі з області техніні ефіри, пропіленгліколь і етиловий спирт, але не ки. Як описано вище, композицію, що містить обмежуються ними. Консерванти включають меіндуктор NF-kΒ, можна вводити ссавцю для лікутил або пропіл n-гідроксибензоат і сорбінову кисвання станів, пов'язаних з апоптозом, що включалоту, але не обмежуються ними. ють опромінення, побічні ефекти, викликані тераКомпозиції згідно із даним винаходом можуть пією раку, стрес і старіння клітин, але не представлені бути у формі супозиторіїв, що мообмежуються ними. Композиція може також містижуть містити основу для супозиторія, включаючи ти додаткові агенти, що включають радіопротектоолію кокосу або гліцериди, але не обмежуючись ри або ліки для хіміотерапії, але не обмежуються ними. Композиції згідно із даним винаходом моними. жуть бути представлені у формах, придатних для а. Застосування інгаляції, що включають, але не обмежують зазнаКомпозиції за винаходом можна застосовувати ченим, суспензії або емульсії, які можна застособудь-яким способом, включаючи оральне, паренвувати у вигляді сухого порошку або у вигляді аетеральне, сублінгвальне, підшкірне, ректальне розолю, і речовин, що розпорошують, такі як введення, введення через слизисту, локальне дихлордифторметан або трихлорфторметан. Комвведення, інгаляцію, введення через рот, або їхню позиції за винаходом можуть також бути у формі комбінацію, але не обмежуючись цим. Парентераскладових для шкіри, що містять водяні або невольне введення включає внутрішньовенне, внутріадні розріджувачі, включаючи креми, мазі, лосьйортеріальне, внутріочеревинне, підшкірне, внутріни, пасти, лікарські пластири, накладки або мемм'язове, інтратекальне і внутрішньосуглобове брани, але не обмежуючись ними. введення, але не обмежується ними. При ветериКомпозиції за винаходом можуть бути також нарному використанні композицію можна вводити складені для парентерального введення, включав придатній лікарській формі, відповідно до звиючи ін'єкції або тривалу інфузію. Препарати для чайної ветеринарної практики. Ветеринари можуть ін'єкції можуть бути у вигляді суспензій, розчинів легко визначити режим дозування і спосіб введенабо емульсій у масляних або водяних розріджуваня, найбільш придатний для даної тварини. чах, а також можуть містити додаткові агенти, б. Склад включаючи суспендуючі, що стабілізують, дисперКомпозиції за винаходом можуть бути предгуючі агенти, але не обмежуючись ними. Композиставлені у формі таблеток або пастилок, складеції можуть бути також представлені у вигляді поних звичайним чином. Наприклад, таблетки і капрошку для розведення з придатним сули для орального застосування можуть містити розріджувачем, включаючи стерильну воду, що не придатні наповнювачі, включаючи сполучні агенти, містить пірогенних речовин, але не обмежуючись наповнювачі, ковзаючі речовини, дезінтегруючі та нею. зволожуючі агенти, але не обмежуючись ними. 29 83272 30 нанні встановлених методів можна одержати різКомпозиції за винаходом також можуть бути в ний набір таких бібліотек, і елементи бібліотеки представлені формі препарату з уповільненим підозрюваних збудників можна піддавати скринінгу вивільненням, який можна вводити шляхом імабо одночасно послідовно у відповідності до опиплантації або внутрішньом'язової ін'єкції. Компосаного тут способа. зиції можуть бути складені з придатними полімерСкринінг можна проводити різними способами, ними або гідрофобними матеріалами (такими як, включаючи in-vitro, клітинний і in vivo аналіз. Для наприклад, емульсії в придатній олії), іонообмінклітинного аналізу можна використовувати будьними смолами, або у вигляді похідних, що постуякі клітини. Відповідно до даного винаходу, перепово розчиняються, (таких як, наприклад, сіль, що важно використовувати клітини ссавця, більш пепоступово розчиняється). реважно - клітини людини й інших приматів. Скрив. Дозування нінг із використанням клітинного аналізу можна Терапевтично ефективна кількість агента, непроводити, використовуючи генетично модифікообхідна для використання в різних видах терапії, вані клітини пухлини, експресуючі сурогатні марзмінюється в залежності від природи стану, що будуть лікувати, тривалості часу, протягом якого кери активації NF-kΒ. Такі маркери включають бактеріальну бета-галактозидазу, бактеріальну потрібна індукція активності NF-kΒ, віку і стану люциферазу і поліпшений зелений флуоресціююпацієнта, і в кінцевому рахунку визначається лікучий білок (enhanced green fluorescent protein ючим лікарем. В основному, однак, дози, що заEGFP), але не обмежуються ними. Рівень експрестосовують для лікування дорослої людини, звисії сурогатних маркерів можна вимірювати, викочайно знаходяться в діапазоні від 0,001мг/кг до, ристовуючи методи, стандартні для даної області приблизно, 200мг/кг у день. Доза може складати техніки, включаючи колориметрію, люмінеметрію й приблизно від 1мкг/кг до 10мкг/кг у день. Необхідну флуориметрію, але не обмежуючись ними. дозу можна вводити однократно, або за кілька Умови, при яких передбачувані модулятори разів через відповідні інтервали часу, наприклад, додають у клітину, наприклад, шляхом змішувандва, три, чотири або більше разів на день. Мноня, являють собою умови, при яких клітина може жинне введення частіше є більш бажаним, або перетерпіти апоптоз або сигналчнг, якщо інші ренавіть потрібним, оскільки активність NF-kΒ у норгуляторні речовини, що перешкоджають апоптозу мальних клітинах може знижуватися протягом деабо сигналінгу, власне кажучи, відсутні. Ефективні якого часу з моменту введення індуктора. умови включають придатне середовище, темпераДозування індуктора NF-kΒ може бути будьтуру, рівень рН і присутність кисню, що дозволяяким, включаючи приблизно 1мкг/кг, 25мкг/кг, ють клітинам рости, але не обмежуються ними. 50мкг/кг, 75мкг/кг, 100мкг/кг, 125мкг/кг, 150мкг/кг, Придатним середовищем звичайно є тверде або 175мкг/кг, 200мкг/кг, 225мкг/кг, 250мкг/кг, 275мкг/кг, рідке середовище, що містить фактори росту і 300мкг/кг, 325мкг/кг, 350мкг/кг, 375мкг/кг, 400мкг/кг, джерела асимілюємого вуглецю, азоту і фосфору, 425мкг/кг, 450мкг/кг, 475мкг/кг, 500мкг/кг, 525мкг/кг, а також придатні солі, мінерали, метали й інші жи550мкг/кг, 575мкг/кг, 600мкг/кг, 625мкг/кг, 650мкг/кг, вильні речовини, такі як вітаміни, наприклад, це 675мкг/кг, 700мкг/кг, 725мкг/кг, 750мкг/кг, 775мкг/кг, може бути ефективне середовище, у якому клітину 800мкг/кг, 825мкг/кг, 850мкг/кг, 875мкг/кг, 900мкг/кг, можна бути культивувати таким чином, що вона 925мкг/кг, 950мкг/кг, 975мкг/кг, або 1мг/кг. буде здатна до апоптозу або сигналінгу. Напри5. Способи виявлення клад, у випадку клітин ссавця, середовище може Даний винахід також відноситься до способів включати середовище Дульбеко-Ігла, що містить виявлення агентів, що індукують активність NF-kΒ. 10% фетальної телячої сироватки. Агенти, що індукують активність NF-kΒ, можна Клітини можна культивувати в різних контейвизначати способом, що включає додавання пенерах, включаючи флакони для культур тканин, редбачуваного активатора NF-kΒ до системи екстестові пробірки, мікротитровальний посуд і чашки пресії, що відображає активність NF-kΒ, і порівПетрі, але не обмежуючись ними. Клітини культиняння рівня експресії, що відображає активність вують при придатних температурі, рівні рН і вмісті NF-kВ, з контролем, де активатор NF-kΒ визначадиоксиду вуглецю. Такі умови культивування тається за здатністю підвищувати рівень експресії в кож відомі фахівцям у даній області. системі, що відображає активність NF-kB. Способи введення передбачуваних модулятоПередбачувані агенти можуть бути присутніми рів у клітину включають електропорацію, мікроін'єу бібліотеці (тобто колекції сполук). Такі агенти кції, клітинну експресію (тобто, використання сисможуть, наприклад, кодуватися ДНК експресивних тем експресії, таких як молекули бібліотек. Передбачувані сполуки можуть бути депротеїнізованих нуклеїнових кислот, рекомбінаприсутніми у кондиціонованому середовищу або нтні віруси, ретровирусні вектори експресії й адеклітинному екстракті. Інші подібні агенти включановірусну експресію), використання агентів для ють сполуки, відомі з рівня техніки як «малі молеутворення пари іонів, а також використання детеркули», що мають молекулярну масу менше 105 гентів для поліпшення проникності мембрани. 4 Дальтон, переважно менше 10 Дальтон, більш Даний винахід має безліч аспектів, що ілюстпереважно менше 103 Дальтон. Такі передбачувані руються приведеними нижче прикладами, не обзбудники можуть бути елементами комбінованої межують обсяг даного винаходу. бібліотеки, що включає синтетичні агенти (наприПриклад 1 клад, білки), отримані в результаті визначених Прискорений розвиток гастроінтестинального багатоступінчастих хімічних реакцій. Будь-який синдрому у мишей, обумовлений недостатністю фахівець у даній області зрозуміє, що при викор53 31 83272 32 смерті. Смерть може наступити як прямий насліОсновна причина смерті ссавців від дії іонізудок ушкодження клітин крипт епітелію і наступного ючого випромінювання (IB) може бути різною в оголення ворсинок, що приводить до рідинного й залежності від дози опромінення. При дозах вище електролітичного дисбалансу, бактеріемії та ендо9-10 Грей, миші вмирають через 12-20 днів, в остоксикозу. Крім запального і стромального відгуків, новному, від смертельного гемопоетичного синддисфункція ендотелію, ймовірно, є важливим чинрому/синдрому виснаження кісткового мозку. ником виникнення летального результату [Potten Опромінених такими дозами мишей можна врятуet al 1997, Somosy et al 2002]. Підводячи підсумок вати від смерті шляхом пересадження кісткового вищесказаному, фармакологічне гальмування р53, мозку. Тварини, що одержали дозу вище 15 Грей, що, як було показано, є дуже ефективним методом вмирали протягом 7-12 днів після опромінення захисту від гемопоетичного синдрому, викликаного (тобто до того, як вони могли б умерти від гемопоIB, виявляється непридатним (якщо не шкідливим) етичного синдрому - ГПС) від ускладнень гастроіндля захисту від ГІС. Тому необхідно розробити тестинального синдрому (ГІС) (Гудков і Комарова, альтернативні підходи для захисту епітелію тонкої 2003). Як у випадку ГПС, так і ГІС, ушкодження кишки від дії випромінювання, засновані на іншому тканин, що приводить до смерті, починається з масового р53-залежного апоптозу [Potten 1992, механізмі, наприклад, на активації NF-kΒ і наступMerritt 1994, Cui et 1 1995, Potten et al 1994], і це ному інгібуванні смерті клітин. спостереження дозволило нам раніше припустити, Приклад 2 що р53 може бути чинником, що визначає настанІнфекція Salmonella активує NF-kB ня смерті при опроміненні. Зокрема, миші з недоІнфекція Salmonella приводить до сильної акстатньою експресією р53 стійкі до доз опромінентивації ІKK і NF-kB, а також до активації протизаня, що викликає смерть від ГПС [Westphal et al пальної генетичної програми (Elewaut et al 1999). 1997, Komarov et al 1999]; також можна зменшити Попередні дослідження дозволяють припустити, смертність тварин дикого типу, що одержали дозу що при типовій інфекції Salmonella у культивовагамма-випромінювання потужністю 6-11 Грей, за них клітинах епітелію кишечнику приблизно 30допомогою тимчасового фармакологічного інгібу40% клітин кишкового епітелію виявляються заравання р53 за допомогою низькомолекулярного женими (Valdivia et al 1996). Тут ми б хотіли розінгібітору р53 піфітрину-альфа (ПФА) (Комаров та глянути питання про те, яким чином бактеріальна ін. 1999). Те, що р53 є чинником, що визначає чутінфекція приблизно 30% клітин хазяїна може збіливість тканин до генотоксичного стресу, було далі льшувати ДНК єднальну активність NF-kB, до вепідтверджене демонстрацією залежності втрати личини, еквівалентної тій, котра спостерігається волосся (облисіння), що виникає в результаті експри активації NF-kB практично у всіх стовбурних периментальної хіміотерапії або опромінення, від клітинах, як це відбувається при терапії TNFa. р53 (Бочкарьов та ін., 2000). Отже, ґрунтуючись на Для того, щоб детально вивчити цей феномен, отриманих раніше результатах, можна припустити, клітини НТ29 або інфікували, або піддавали общо р53 продовжує відігравативажливу роль у розманній інфекції при МІ (множинності інфекції) 50 витку летального ГІС після опромінення високими протягом однієї години диким типом S. дозами IB. Зненацька виявилося, що дефіцит р53 typhimurium, трансформованим плазмідою робить мишей чуттєвими до високих доз IB, що pFM10.1, що кодує зелений флуоресціюючий білок викликають летальний ГІС (Фіг.11). Тривала про(GFP) під промотором гену ssa Salmonella і функліферація клітин у криптах епітелію з дефіцитом ціонує, тільки коли бактерія вразила клітину хазяїр53 після впливу IB корелює з прискоренням загина (Valdivia et al. 1997). Клітини, вражені белі ушкоджених клітин крипти і швидким руйнуSalmonella, виявляли по експресії GFP, що безпованням ворсинок. р53 продовжує життя, індукуючи середньо виявляли флуоресцентною мікроскопіблокаду росту в криптах тонкого кишечнику і заєю. Локалізацію субодиниці p65(Rel) визначали за хищаючи в такий спосіб цілісність травного каналу допомогою непрямої імунофлуоресценції кролячих (Фіг.12). Таким чином, проапоптична функція р53 антитіл до р65, що виявляються за допомогою активізує гемопоетичний синдром, у той час як FITC-конъюгованих антитіл теляти. Для фарбуйого функція блокування росту затримує розвиток вання ядер використовували DAPI. гастроінтестинального синдрому. Як можна побачити на Фіг.1А, експресія GFP Кінетику клітинної популяції в тонкій кишці дуспостерігається приблизно в 40% клітин. Далі ми же ретельно аналізували. Проліферація клітин в вивчили локалізацію р65 субодиниці NF-kB у неепітелії травного каналу обмежена криптами, де опрацьованих (обманно інфікованих) клітинах і розташовані стовбурні клітини і ранні проліферуюклітинах, інфікованих Salmonella або стимульовачі клітини-попередники. Після декількох розподілів них TNFa (10нг/мл). Субодиниця р65 (Rel) була уже диференційовані нащадки стовбурних клітин локалізована в цитоплазмі неопрацьованих клітин, піднімаються по ворсинках і злущуються з їхніх у той час як у клітинах, інфікованих Salmonella або кінчиків. У тонкому кишечнику мишей повне «пеTNFa, субодиниця р65 (Rel) була локалізована в реміщення» клітин (від проліферативного компарядрах (Фіг.1Б). Ці результати показують, що інфетмента до кінчика ворсинки) звичайно займає від 3 кція Salmonella активує експресію NF-kB практично до 5 днів [Potten 1992, Potten et al 1997, Booth et al у всіх клітинах, хоча інфікованою є тільки невелика 2002, Somosy et al 2002]. Хоча реакція тонкого частина клітин. кишечника на гамма-випромінювання добре виПриклад 3 вчена на патоморфологічному рівні, дотепер заФлагелін активує NF-kB лишається неясним, що саме є причиною летального ефекту ГІС, у тому числі і першопричина 33 83272 34 цих клітин аналізували на ДНК-єднальну і індукуюОскільки при інфікуванні Salmonella клітин епітелію кишечника спостерігається інфікування личу активність NF-kΒ за допомогою аналізу затримки в гелі (EMSA), і установили, що тільки смуга 2 ше приблизно 30% клітин, а активація NF-kΒ, на(У2), що відповідає білку з масою 55кДа (Фіг.2В, впроти, відбувається практично у всіх клітинах, ми низ), здатна активувати ДНК-єднальну активність припустили, що активація NF-kΒ відбувається у NF-kΒ, у той час як буфер з кінця і початку сольовідповідь на розпізнавання клітинами хазяїна струвого градієнта не знайшов здатності активувати ктурних компонентів бактерій або продуктів, вироблених бактеріями, і не пов'язана з процесом інваДНК-єднальну активність NF-kB. зії. Було показано, що інвазія сама по собі не Білки, що відповідають смугам У1-У6 і порожні потрібна для активації генетичної програми захисобласті гелю далі використовували для секвенуту від запалення, як це думали раніше (16). Для вання пептидів. Обробка трипсином білкової фратого щоб перевірити це припущення, стерильно кції смуги В2 і аналіз за допомогою рідинної хрофільтровану культуральну рідину S. dublin або не матографії/мас-спектрометрії за методом піддавали обробці, або кип'ятили протягом дваелектророзпорошування з іонною пасткою дозводцяти хвилин, і використовували для контрольного лили ідентифікувати амінокислотні послідовності зараження клітин епітелію кишечнику НТ29, а подвадцяти одного пептиду. Флагелін (75% охоплентім вивчали ДНК-єднальну активність NF-kΒ за ня двадцятьма одним пептидом) був однозначно визначений як білок, що індукує ДНК-єднальну допомогою аналізу затримки в гелі (EMSA) цілого клітинного екстракту (ЦКЕ), приготовленого через активність NF-kВ (Фіг.3). 45 хвилин після опромінення (3, 40). В обох випадПриклад 4 ках була виявлена сильна активація NF-kΒ у відФлагелін потрібно для активації NF-kΒ у клітиповідь на внесення культуральної рідини, що поканах епітелію кишечника. зує стійкість активуючого фактора до нагрівання. Щоб визначити, чи дійсно флагелін є чинниНативну стерильно фільтровану концентроваком, що відповідає за ініціацію NF-kΒ у клітинах ну культуральну рідину потім обробляли ДНКазою, епітелію кишечнику, що піддається безпосередрибонуклеазою, протеїназою К, або виконували ньої бактеріальної інфекції або дії фільтрованої грубе фракціонування через 100кДа фільтри культуральної рідини патогенної Salmonella, ми Центрікон. Культуральні середовища, що піддаваприготували інфекційні бактерії, прокип'ятили й лися різній обробці, потім використовували для відфільтрували культуральну рідину із безджгутиконтрольного зараження НТ29 клітин епітелію кикового штаму Е. coli DH5a, патогенного штаму S. шечнику, через 45 хвилин готували ЕЦК, і потім dublin 2229, ізогенного мутанта S. dublin 2229 аналізували ДНК-єднальну активність NF-kΒ з доSopE-, ізогенного мутанта S. dublin 2229 SopB-, помогою EMSА (Фіг.2А). Пряме інфікування НТ29 подвійного ізогенного мутанта S. dublin 2229 S. typhimurium 1103 або вплив культурального SopEVSopB- (штам SE1SB2), штаму S. typhimurium середовища, як відзначалося, індукувало NF-kВ 1103, иізогенного інсерціонного мутанта S. єднальну активність, причому було виявлено, що typhimurium fliC::Τn10 (штам 86) і ізогенного пофактор, що ініціює активність, чуттєвий до розщедвійного мутанта S. typhimurium 1103 fliC-/fljB-. плення протеазами й утримується фільтром SopE є білком, що кодується патогенним стосовно 100кДа (Фіг.2А). Далі, щоб точно установити приSalmonella бактеріофагом, що вводиться в клітину хазяїна, діє як фактор обміну для малих Rho роду активності, що індукує NF-kВ, стерильно фіГТФаз Rac1 і Cd42 та ініціює перебудову цитоскельтроване концентроване культуральне середолету й остаточну активацію шляхів МАРК (mitogen вище розділяли за допомогою гельпроникаючої activated protein kinase - кіназа, що активується хроматографії в гелі "Супероуз 12" (Superose 12) мітогенами), SAPK (stress activated protein kinase (Фіг.2Б) і аніонообмінной хроматографії (Фіг.2В). Відбирали аліквоти хроматографічних фракцій і кіназа, що активується стресом) і NF-kΒ (7, 15), у той час як SopB є білком Salmonella, що діє як іноаналізували їхню здатність активувати NF-kΒ у зитолфосфат фосфатаза і бере участь у перебуклітинах НТ29, а потім аналізували за допомогою дові цитоскелету, а також стимулює секрецію хлоаналізу затримки в гелі (EMSA). Як показує фарридів клітинами хазяїна (44). Бактерії і бування гелю барвником Кумасі блакитним (Фіг.2Б, культуральну рідину використовували для контроверх), зростання ДНК-єднальної активності NF-kΒ льного зараження клітин НТ29 епітелію кишечнику, (Фіг.2Б, низ, криві 4-6) відповідає збільшенню зачерез 45 хвилин виготовили ЦКЕ і провели аналіз гальної маси білка приблизно до 55кДа. АніонообДНК-єднальної активності NF-kΒ до за допомогою мінна хроматографія на матриці POROS HQ і елюEMSA. Штами Salmonella були здатні активувати іровання пов'язаних білків за допомогою зростаючого сольового градієнту, як зазначено NF-kΒ, тоді як штами Salmonella (мутанти fliC і fliC(Фіг.2В), показує, що ДНК-єднальна і індукуюча /fljB-, як зазначено) виявилися не здатні продукуактивність NF-kΒ відповідає хроматографічним вати флагелін і активувати NF-kΒ (Фіг.4А i Б). фракціям, що містять збільшену до 55кДа загальну Штам Е. coli DH5a не має джгутиків і не продукує масу білка (Фіг.2В, верх, а також результати, що флагелін, унаслідок чого він не здатний активуватут не приводяться). Елюіровані фракції, показані ти NF-kΒ. У ході численних експериментів ми тана Фіг.2В, концентрували і фракціонували на прекож відзначили, що пряме інфікування S. dublin паративному 12% SDS-PAGE гелі, смуги, що відзавжди активує NF-kВ у більшому ступені, ніж S. повідають У1-У6 вирізували з гелю, потім білки typhimurium, як відзначено на Фіг.4А, тоді як кульельюірували, осаджували, ренатуровали і викоритуральні рідини обох видів активують NF-kΒ пракстовували для стимулювання клітин НТ29. ЕЦК із тично в однаковому ступені (Фіг.4Б). Ми думаємо, 35 83272 36 45 хвилин, тоді як активність р38, JNK і IKK протящо ця різниця може бути викликана тим, що S. гом наступної години збільшується. Як можна поdublin виділяє більше флагеліну в культуральнє бачити на Фіг.4, подвійний мутант Salmonella fliCсередовище в порівнянні S. typhimurium при пря/fljB- також нездатний індукувати активність IKK і мій інфекції, оскільки внесення флагеліну, виділеного з культури S. dublin і S. typhimurium і еквіваNF-kВ (як показано на Фіг.5). Зненацька виявилолентних кількостей хроматографічно очищеного ся, що подвійний мутант Salmonella fliC-/fljB- нездатний індукувати SAPKs p38 і JNK і активує МАРК флагеліну дає схожий профіль активації NF-kB. лише на короткий час (п'ятнадцять хвилин). Цей Примітно, що загальна нездатність подвійних мурезультат складно інтерпертувати, оскільки інші тантів по гену флагеліну активувати NF-kВ у порібілки Salmonella, такі як SopE і SopE2 можуть аквнянні з дуже невеликою здатністю до його актитивувати малі ГТФази Rac і Cd42, і ці ГТФази Rho вації, що спостерігається в одиночного сімейства, будучи пов'язаними з активацією JNK і інсерціонного мутанта за флагеліном фази І р38 (7, 8, 14, 15), як з'ясувалося, не працюють у fliС::Тn10 (передостання крива на Фіг.4А i Б), імовіштамі, негативного за флагеліном. рно, є наслідком дуже сильно обмеженої експресії Подвійний мутант Salmonella fliC-/fljB- нездатфлагеліну фази II (у fljB), хоча штами Salmonella, ний заражати НТ29 клітини на відміну від штаму використовувані тут, або генетично нездатні до дикого типу Salmonella, як було встановлено за зміни фаз експресії флагеліну, або виявляють таку допомогою аналізу методом гентаміцинового заздатність вкрай рідко. Оскільки виявилося, що хисту/інвазії. Подвійний мутант за флагеліном fliCфлагелін необхідно для активації шляху NF-kΒ при /fljB- продемонстрував здатність заражати НТ29 прямому інфікуванні клітин епітелію кишечнику, клітини, що відрізняється на 4 порядки. Для того виявляється можливим, що флагелін є також осщоб перевірити це спостереження, ми інфікували новною детермінантою інших головних мітогенних клітини НТ29 диким типом Salmonella і подвійним і активуємих стресом шляхів сигналінгу, активуємутантом Salmonella fliC-/fljB- (штам 134), причому мих при інфекції патогенним штамом Salmonella обидва штами трансформували плазмідою клітин епітелію кишечнику. Пряме інфікування pFM10.1, що кодує GFP під контролем промотору Salmonella клітин епітелію кишечнику приводить ssa Salmonella і функціонує, тільки коли бактерія до активації JNK (8) і також активації NF-kΒ за довразила клітину хазяїна (10, 36). Здатність дикого помогою ІKK кіназного шляху (3). типу Salmonella інфікувати клітини НТ29 була очеПриклад 5 видною (GFP, Фіг.5Б), тоді як мутант за флагеліФлагелін запускає активацію активіруемої міном цієї бактерії, як виявилося, не здатний вражатогеннами протеінкінази (ΜΑΡКΟ), активіруємої ти клітини НТ29, що було з очевидністю показано стресом протеінкінази (SAPK) і шляхів ІkВ кіназнопо відсутності експресії GFP (Фіг.5Б). Щоб визнаго (ІKK) сигналінгу чити, чи досить присутності флагеліну для того, Клітини епітелію кишечнику виступають як інщоб відбулась інвазія, або для цього необхідні дикатори інвазії поверхні просвіту кишечнику і також які-небудь інші білки, що продукується бакздійснюють залучення імуноцитів-ефекторів до теріями, ми вносили очищений флагелін, або стеобласті інфекції, продукуючи хемокіни, такі як інрильно фільтровану культуральну рідину або їхню терлейкін-8 (IL-8) і білок хемоатрактант макрофагів комбінацію в клітини НТ29, що контрольно інфіку1 (МСР 1), і протизапальні цитокіни, такі як фактор вали подвійним мутантом Salmonella fliC-/fljB-, а некрозу пухлини a (TNFa), інтерлейкін-1 (IL-1) і потім досліджували ступінь їхньої інвазії бактеріяінтерлейкін-6 (IL-6) (1,4-6). Експресія цих генів зами. Жодна з тестуємих комбінацій - ні очищений лежить від активності транскрипційних факторів, флагелін, ні культуральна рідина - не сприяла інщо активуються у відповідь на передачу сигналів фікуванню бактерій штамом з подвійною мутацією через МАРК, SAPK і IKK сигнальні шляхи. Оскільки fliC-/fljB-. Передбачається, що прямий зв'язок між NF-kΒ вважається головним регулятогенами флагеліну й ефективністю доставки систером/активатором протизапальних генетичних промою секреції типу III білків, що продукуються бакграм, ми вирішили досліджувати ефект, що мутантеріями, таких як SopE і Sip, а також інших Sipтний штам Salmonella, який не продукує флагелін, білків (7, 14, 15, 45, 46), що відіграють важливу впливає на активацію МАРК, SAPK і IKK шляхів роль в ініціюванні бактеріальної інтерналізації, сигналінгу, і порівняти його з ефектом, що спостевідсутній. Більш того, для оцінки ефективності рігається при інфікуванні клітин епітелію кишечнистимулювання флагеліном локалізації субодиниці ку диким типом Salmonella, або при впливі на клір65 (Rel) у ядрах клітин епітелію кишечнику, ми тини епітелію кишечнику очищеного флагеліну. провели контрольне зараження клітин НТ29 очиІнфікування клітин НТ29 диким типом S. щеним флагеліном і досліджували локалізацію typhimurium приводить до активації МАРК, ERK субодиниці р65 (Rel), використовуючи непряму (кінази, регульовані позаклітинними сигналами) імуннофлуоресценцяю, і знайшли локалізацію р65 1&2, SAPK, субодиницю р38 і JNK (Jun N-кінцева (Rel) у ядрах майже всіх клітин (як показано на кіназа), а також IKK (Фіг.5), що було показано з Фіг.5). використанням фосфоспецифічних антитіл, що Очищений флагелін (0,5мкг/мл) у значній мірі виявляють активацію, методом імунноблот-аналізу активує NF-kΒ у клітинах НТ29, подібно тому, як це (ІБ), і методом антитіло-специфічного імунноспостерігається в оброблених фактором некрозу кіназного аналізу (КА) для JNK і IKK з використанпухлинах (TNF) (10нг/мл) НТ29 клітин, причому ням відповідних їм субстратів cJun 1-79 і GST-Ika активація залежить від часу. Це показано в серії 1-54, мічених глутатіон-8-трансферазою (GST). експериментів (Фіг.6А), де через різний час після Цікаво, що стимуляція МАРК має тимчасову привпливу, як зазначено, готували ЕЦК і аналізували роду, причому спад активності починається через 37 83272 38 на усі види контрольного зараження НТ29 клітин ДНК-єднальну активність NF-kΒ за допомогою спостерігалася стимуляція IL-1, що не є геномEMSA. Результати аналізу МАРК, SAPK і IKK шлямішенню NF-kΒ. Очевидно, подвійний мутант хів (Фіг.6Б) у тих же ЕЦК із використанням активаSalmonella fliC-/fljB- може активувати інші невідомі ційно-специфічних фосфо-антитіл для моніторингу активації МАРКО і р38 кіназ і аналізу JNK і IKK сигнальні шляхи, що приводять до експресії IL-1a. активності методом антитіл-специфічної імуннокіПриклад 6 назної преципітації показують, що активність JNK і Флагелін активує зв'язування NF-kΒ із ДНК чеIKK збільшується через одну година, у той час як рез МуР88-залежний шлях активність р38 і МАРКО (ERK1 і 2) досягає піку Оскільки флагелін, як виявилося, здатний акчерез тридцять хвилин і потім починає знижуватитивувати необхідні для активації протизапальних ся, досягаючи значно більш низького рівня через генів сигнальні шляхи, і ця активність схожа з дією годину (як показує Фіг.6Б). Криві активації МАРК, цитокінів, подібних TNFa, що активують усі клітиSAPK і IKK сигнальних молекул ERK1&2, р38, JNK ни, які мають на поверхні відповідні функціональні і IKK у клітинах епітелію кишечнику у відповідь на рецептори (див. Фіг.1 і Фіг.5В, де видна локалізація вплив очищеного флагеліну в значній мірі схожі на р65 [RelA] у ядрах), ми вирішили вивчити здатність криві активації в клітинах кишкового епітелію, інфіToll-подібних рецепторів, відомих рецепторів, що кованих диким типом Salmonella (Фіг.5А). З отрирозпізнають зв'язаний з патогеном паттерн, актиманих даних ми зробили висновок, що тимчасова вувати NF-kΒ шлях у відповідь на дію флагеліну. активація сигнальних шляхів (МАРК, SAPK і IKK), Для того щоб перевірити це припущення, ми довивчена тут, що відображає ранні події, що відбусліджували дію аденовірусу, що експресує домінаваються при інфікуванні Salmonella, визначається нтно-негативний MyD88 (aa 152-296) (47) на опомайже винятково розпізнаванням флагеліну і відсередковану флагеліном активацію NF-kΒ у повіддю на нього з боку клітин епітелію кишечнику. клітинах НТ29. MyD88 є адаптерним білком, що Далі нам було потрібно вивчити вплив очищеутилізується рецептором IL-1 і усіма відомими ного флагеліну і флагеліну, що є присутнім у кліTLR, що мають цитоплазмені сигнальні домени, тинах Salmonella на часовий характер експресії гомологичні таким IL-1, і необхідні для негайної протизапальних цитокінів у клітинах епітелію киактивації NF-kΒ шляхів. Щоб перевірити це пришечнику, для того щоб відокремити вплив флагепущення, ми спочатку використовували ембріоналіну в чистому вигляді від інших впливів, що відбульні мишачі фібробласти (ЕМФ) дикого типу і муваються при інфекції джгутиковими або танти MyD88-/- і TLR2-/-/TLR4-/- (подарунок С Акіра, безджгутиковими штамами Salmonella. Клітини Університет Осака, Японія) для уточнення ролі НТ29 залишали неопрацьованими, стимулювали MyD88 і для вивчення потенційної ролі двох TLR TNFa (10нг/мл), або стимулювали флагеліном при відповіді на дію флагеліну або на пряме інфі(0,5ультраграм/мл), або інфікували диким типом кування диким типом Salmonella, і при активації Salmonella tuphimurium або подвійним мутантом NF-kΒ (Фіг.7). Інфекція диким типом Salmonella Salmonella fliC/fljB при множинності інфекції (МІ) приводила до значної активації NF-kΒ як у дикого 50. Через визначений час після обробки або інфетипу, так і у мутантів, дефектних за TLR (смуги 2 і кції, клітини НТ29 збирали в охолоджений до 0°С 15), але в ЕМФ, дефектних за MyD88, ця активація фосфатний буфер і лизували дебріс у Тризолі, була трохи неповноцінною (смуга 10). Контрольне потім РНК очищали і використовували для одерінфікування всіх трьох типів клітин концентроважання першої нитки комплементарної ДНК (див. ною стерильно фільтрованою рідиною з культури опис експерименту). Аліквоти кДНК використовудикого типу S. dublin або подвійного ізогенного вали в напівкількісної RT-PCR з використанням мутанта SopE-/SopB- штаму SE1SB2 S. dublin приспецифічних праймерів для генів ІL1а, IL-1b, IL-8, водила до активації NF-kΒ у ЕМФ дикого типу і TNFa, MCP1 і b-актину (відомості про послідовклітинах подвійних мутантів по TLR2/4, але не акність даються за вимогою), потім продукти фракцітивувала NF-kΒ у клітинах, позбавлених MyD88 онували в агарозному гелі, що містить 1,2%. бро(порівняння смуг 11 і 12 зі смугами 3, 4, 6, 7, 16 і мистого етидію. Експресія відомих генів-мішеней 17). У ЕМФ дикого типу під дією очищеного флагеNF-kΒ, таких як IL-1b, IL-8, TNFa і МСР1, збільшуліну (0,5мкг/мл) спостерігалася значна активація валася у відповідь на TNFa або вплив очищеним NF-kΒ, і тому можливість того, що в активації NFфлагеліном (Фіг.6В). Інфікування диким типом kΒ у цих експериментах відіграють роль ліпополіSalmonella також приводило до активації цих генів, сахариди, була виключена. Виключення ліпополіоднак, у порівнянні з результатами згаданих вище сахаридів з основних причин активації NF-kΒ таекспериментів, експресія TNFa і МСР1 була тимкож підтверджується значним рівнем його часовою і виникала відразу після інфікування. Поактивації в ЕМФ, що несуть подвійну мутацію по двійний мутант Salmonella fliC /fljB , як виявилося, TLR2/4 (смуги 16 і 17), тому що TLR 2 і 4 відповіне здатний індукувати експресію IL-1b, IL-8, TNFa, дають на бактеріальні ліпопептиди, пептидоглікаоднак індукує експресію МСР 1, хоча рівні цієї ексни, деякі ліпополісахариди, у тому числі ліпополіпресії нижче в порівнянні з експресією, що індукусахариди грамнегативних бактерій (50-52). ється диким типом Salmonella. До того ж, експреСтимуляція IL-1 підтвердила функціональну необсія, що індукується подвійним мутантом МСР 1, не хідність наявності MyD88 для передачі сигналів, була тимчасовою, а продовжувалася протягом опосередкованих IL-1 і флагеліном. усього часу спостереження (9год) (Фіг.6В). Як внуЗ метою далі досліджувати роль TLR рецептотрішній стандарт для порівняння використовуваврів у розпізнаванні флагеліну ми проаналізували ся рівень експресії b-актину. Цікаво, що у відповідь здатність NF-kΒ бути активованим при гіперексп 39 83272 40 деякий невідомий білок-адаптор. У будь-якому ресії TLR у клітинах, що звичайно слабко реагують випадку, результати, представлені на Фіг.7 покана дію флагеліну. Вибираючи клітини, що слабко зують, що TLR2 і TLR4 не вимагаються для актиреагували на очищений флагелін, підтвердили те, що сигнальні компоненти й адаптери, що викорисвації NF-kΒ, опосередкованої флагеліном. товуються у відповіді на флагелін, присутні в цих Приклад 7 клітинах і є функціональними, а також те, що ліміОпосередкована флагеліном активація NF-kΒ, туючим фактором ймовірно, є тільки рецептор, що приводить до збільшення експресії генів підродини відповідає на флагелін. Знайшовши, що клітини TLR HeLa і НЕК293Т стимулюють ДНК-єднальну активСтимуляція клітин епітелію кишечнику S. ність NF-kΒ у відповідь на стимуляцію IL-1, але typhimirium або очищеним флагеліном приводить погано реагують на дію флагеліну, ми вибрали до активації програми протизапальних генів клітини НЕК293Т для подальшого використання (Фіг.6С). Нам було потрібно перевірити, чи може завдяки тому, що їх можна більш ефективно експресія генів TLR також змінюватися в клітинах, трансфецирувати. У клітинах НЕК293Т в результастимульованих флагеліном. НТ29 клітини обробті тимчасової трансфекції досягали гіперекспресії ляли очищеним флагеліном (0,5мгк/мл) і з неопрагенів TLR 1-9, мічених епітопом FLAG за N-кінцем, цьованих і оброблених клітин, через третю годину (подарунок Р. Меджитова, Єльск Університет і Р. після стимуляції виділяли тотальну фракцію РНК і Улевича, Науково-Дослідний Інститут Скріпса) (42, використовували її для одержання першої нитки 43) а також репортерного гена люциферази, керокомплементарної ДНК. Напівкількісну RT-PCR з ваного 2х-NF-kВ-залежним промотором, і при використанням ген-специфічних праймерів для кожного TLR і першої нитки кДНК, отриманої з нецьому виявили експресію люциферази у відповідь стимульованих або стимульованих флагеліном на вплив флагеліну (0,5мкг/мл) або TNFa клітин, використовували для генерації ДНК, що (10нг/мл). TLR5 був єдиним представником рецепрозділяли в 1,2% агарозному гелі, що містить броторів групи TLR, експресія якого викликала значну мистий етидій. Експресія TLR 2, 3 і 7 збільшувалавідповідь клітин на імунізацію флагеліном (Таблися після стимуляції флагеліном (Фіг.9). Патерн ця 1). експресії інших TLR залишався незмінним. У якості Для подальшої перевірки того, чи дійсно активнутрішнього кількісного контролю використовувавація NF-kΒ флагеліном проходить саме при учасвся b-актин. ті TLR5, ми внесли в ген TLR домінантно-негативні TLR5 експресуєтся в клітинах, що не показусигнальні мутації, що являли собою делеції карбоють значної відповіді на флагелін. У ході даного ксильного кінця кожного з TLR до консервативного дослідження, а також ряду інших (22, 33), було триптофану в TIR домені. Подібна мутація в рецепоказано, що флагелін активує NF-kΒ саме через пторі IL-1 робить його нездатним активувати NFTLR5. У попередніх повідомленнях не вказувалася kB (54,55). Усі доминантно негативні TLR разом із точно наявність і кількісний вміст TLR у клітинах, клонованим із кДНК TLR5 (antisense(AS)-TLR5 що використовувалися для визначення функції антизначеннєвий TLR5) клонували в експресивнофлагеліну (22, 33). Нам було потрібно встановити, му векторі ссавців pCDNa3.1 (Invitrogen). Усі мутачи зменшується кількість TLR5 і чи присутній він нтні білки добре експресувались. Кожен вектор взагалі в клітинах, що показують дуже слабку відекспресії домінантно-негативного TLR і порожній повідь, або повну його відсутність, на контрольне вектор експресії разом з 2-х NF-kΒ Luc використоінфікування флвгеліном. Кількість TLR5 у декільвували, як описано вище (3), для трансформації кох клітинних лініях досліджували імуноблотклітин НТ29, що дуже добре реагували на флагеаналізом (ІБА) з використанням TLR5-специфічних лін. Трансфеційовані клітини були залишені неантитіл і порівнювали зі здатністю очищеного флаопрацьованими, або стимулювали TNFa (10нг/мл) геліну індукувати ДНК-єднальну активність NF-kΒ у або очищеним флагеліном (0,5мкг/мл). Було виявЕЦК, отриманих з цих клітин. Використовували лено, що експресія домінантно-негативних TLR не клітинні лінії епітелію кишечнику Т84 і НТ29, а тавпливає на експресію репортерних генів у відпокож клітинну лінію аденокарциноми легені А549, відь на стимуляцію трансфецшованих TNFa клітин клітинну лінію HeLa шийної аденокарциноми лю(Фіг.8А); однак, тільки експресія як доминантнодини, клітинну лінію нирки людського ембріону, що негативного TLR5, так і антизначеннєвої конструкекспресує великий Т-антиген НЕК293Т, а також ції TLR5 приводить, відповідно, приблизно до 50%клітинну лінію гліобластоми T98G. Білок TLR5 ного і 25%-ного інгібування опосередкованої флазнайшли у всіх клітинних лініях, вивчених за допогеліном активації репортерного гену (Фіг.8В), у той могою імуноблот аналізу з антитілами, специфіччас як доминнано-негативний TLR2 також показав ними до TLR5 (Фіг.10А). У клітинах Т84 спостерігапомірне інгібування експресії генів репортерів, лася найбільша кількість TLR5, тоді як в інших викликаної флагеліном. Ці результати означають, клітинних лініях рівні експресії розрізнялися не що TLR5 бере участь у розпізнаванні флагеліну більше ніж у 2 рази (Фіг.10А). ДНК-єднальну актиклітинною поверхнею й ініціює шлях сигналінгу, що вність NF-kΒ у не стимульованих, стимульованих приводять до активації NF-kΒ. Вплив домінантноTNFa і стимульованих флагеліном клітинах аналінегативного TLR2 на залежну від NF-kΒ активацію зували на ЕЦК, отриманих з кожного типу клітин, репортерного гену, можливо, є неспецифічним, методом EMSА (Фіг.10В). НТ29 і А549 клітини сиоскільки його експресія також інгібує опосередкрльно реагували на стимуляцію флагеліном і TNFa, вану TNFa активацію репортера як і експресія інтоді як HeLa, 293T и T98G клітини слабко (HeLa, ших домінантно-негативних TLR. Доминантно не293T) або зовсім (T98G) не реагували на стимулягативний TLR2 може також конкурувати з TLR5 за 41 83272 42 довжувалося їхнє життя, корелював з дозою флацію флагеліном. Автентичність комплексу NF-kΒ і геліну. Патоморфологічний аналіз, проведений на ДНК визначали, використовуючи р65-специфічні 7 день після опромінення, виявив значну різницю антитіла для суперзрушення NF-kΒ і ДНКміж тонким кишечником мишей, оброблених флабілкового комплексу. Цікаво те, що деякі клітини, геліном, і мишей з контрольної групи (Фіг.15). Внущо експресують TLR5, або виявляли дуже слабку трішньовенні, інтраперитонеальні й підшкірні ін'єквідповідь, або взагалі ніякої. Такий результат може ції 0,2мг/кг флагеліну, за якими виходило бути наслідком або недостатньої присутності реопромінення дозою 13 Грей, подібним чином збіцепторів на плазматичній мембрані й усередині льшували час життя приблизно 85-90% мишей на клітини, інактиваціонної або субвітальної мутації в 30 днів (дані не приводяться). Експерименти прогені TLR5 у цих клітинних лініях, або відсутності водили, у цілому, також, як і експерименти з оптиневеликої кількості необхідних рецепторів або мальною дозою, описані вище, але використовуадапторних білків (як це має місце в деяких клітивали дозу опромінення 13 Грей і змінювали нах для TLR4 і його ко-рецепторів/адапторів MD2 способи введення. (30, 56, 57). Інтерлейкін-1 може стимулювати ДНКПриклад 10 єднальну активність NF-kΒ у всіх вивчених клітинФлагелін запобігає смерті мишей від гемопоених лініях, з чого випливає, що механізми, що петичного синдрому, викликаного іонізуючим випроредають сигнал від MyD88 до NF-kΒ залишаються мінюванням неушкодженими. Далі ми вивчали вплив флагеліну на смерть Приклад 8 мишей від гемопоетичного синдрому, викликаного Ізолювання рекомбінантного флагеліну IB, що експериментально індукували за допомогою Для того щоб підтвердити здатність рекомбінизьких доз випромінювання (звичайно до 11 нантного флагеліну індукувати NF-kB, провели Грей), що не здатні викликати смертельний ГІС. тест на активність флагеліну, використовуючи реЕксперименти проводили так само, як і описані портерні клітини, що несуть NF-kВ-чуттєву люцивище (Фіг.14 і 15), однак замість дози 15 Грей, миферазу (Luc). Описана конструкція містила три NFші одержали дозу 10 Грей, що викликала 100% kВ-єднальні сайта з промотору Е-селектину, зкомлетальний результат у контрольній групі до 13 дня бінованого з мінімальним промотором Hsp70, що (Фіг.16). Група, якій вводили флагелін (5мкг/миша), звичайно використовують для детекції NF-kΒ. Лювиявилася повністю захищеною від такої дози IB, циферазну активність вимірювали в клітинному що доводить, що флагелін захищає від дії випролізаті через 6 годин після додавання флагеліну в мінювання, охороняючи не тільки від гастроінтессередовище. Як позитивний контроль використотинального, але і гемопоетичного синдромів, вивували TNFa. Результати репрезентативного екскликуваних IB. перименту представлені на Фіг.13, і показують, що Приклад 11 рекомбінантний флагелін здатний активувати NFЗалежність захисної дії флагеліну від часу kB. Для того щоб установити, як радіопротективна Приклад 9 активність флагеліну залежить від часу впливу, Флагелін сповільнює смерть мишей від ГІС вимишам ін'єктували флагелін за різні проміжки часу кликаного іонізуючим випромінюванням до впливу гамма-випромінюванням дозою 13 Грей. Як відзначено вище, флагелін є могутнім актиРезультати одного з таких експериментів привеватором NF-kΒ і ймовірно може діяти як інгібітор дені на Фіг.17. Ці результати показують, що флаклітинної загибелі по механізму апоптоза. Оскільки гелін робить ефективну радіопротекивну дію, охоцитокіни, здатні індукувати NF-kΒ діють як радіороняючи від випромінювання дозою 13 Грей, якщо протектори, ми перевірили, чи може флагелін тайого вводити за 1-4 години до опромінення, але не кож виступати як радіопротектор. є ефективною, якщо його вводити за 24 години до Миші, усе тіло яких піддають гаммаопромінення. випромінюванню дозою 15 Грей, гинуть протягом 8 Для того щоб установити залежність радіопроднів від гастроінтестинального синдрому. Такі екстективної активності флагеліну від часу, мишей перименти являють собою стандартну модель для піддавали ін'єкції в різні проміжки часу відносно вивчення ушкоджень шлунково-кишкового (ШК) моменту гамма-опромінення. Експерименти протракту, викликаних IB (див. вище). Для вивчення водили відповідно до описаного вище, проводячи здатності флагеліну захищати епітелій ЖК тракту внутріочеревинну ін'єкцію CBLB-501 у кількості від IB, ми протестували вплив внутрішньовенної 5мкг/миша (0,2мг/кг), а мишам контрольної групи ін'єкції флагеліну на динаміку смертності мишей ін'єктували бактеріальну РНК полімерази в кількопісля опромінення дозою 15 Грей. Ми використості 5мкг/миша (0,2мг/кг). Експерименти проводили вували різні дози флагеліну, кожна з який була з лінією мишей NDi-Swiss. Результати цих експезначно нижче, ніж найбільш висока толерантна риментів демонструють, що флагелін-501 забездоза, відома з літературних джерел (300мкг/миша, печує виживання 90% тварин після опромінення Eaves-Pyles Τ, et al 2001b). Опромінення робили дозою 13 Грей, якщо вводити флагелін за 1 або 2 через 4 години після обробки. Результати репрегодини до опромінення (Фіг.17). Для ясності призентативних експериментів приведені на Фіг.14. Як ведений тільки графік, що відповідає 1 години до ми й очікували, опромінені контрольні миші (які опромінення, однак миші, яким проводили ін'єкцію одержали розчин хлориду натрію, забуференного за 2 години до опромінення, демонстрували такий фосфатом) загинули через 5-8 днів після опроміже ступінь і динаміку виживання. При введенні нення, тоді як тварини, що одержали флагелін, флагеліну за чотири години до опромінення захижили значно довше; причому термін, на який просний ефект виявляється в трохи меншому ступені. 43 83272 44 пи, що одержала дозу 10 Грей, з чого можна зроФлагелін, введений за 24 години до опромінення, бити висновок, що причиною смерті був гемопоене робить захисного ефекту при опроміненні дотичний синдром. Виходячи з представлених зою 13 Грей, що викликає смерть. результатів, можна зробити висновок, що смертеЦікаво, що введення флагеліну за 24год. до льна доза 50/30 для флагеліну складає близько впливу гамма-випромінюванням дозою 10 Грей 13,5-14 Грей і фактор модулювання дози 30 склазабезпечує 100% захист. У той час як опромінення дає близько 1,75-1,8. Такий рівень радіопротекції мишей дозою 13 Грей викликає смерть від ГІС, істотно вище, ніж відомі для будь-яких інших присмерть, викликана опроміненням дозою 10 Грей, родних сполук рівні. обумовлена гемопоетичним синдромом. ВідповідТаблиця но, такий тривалий захист від опромінення дозою TLR5 демонструє відповідь на флагелін і акти10 Грей може бути обумовлений посиленою проліферацією або виживанням кровотворних стовбувірує NF-kB рних клітин, індукованих флагеліном і/або довгоКлітини 293 Τ трансфецирували порожнім векживучими вторинними цитокінами. тором (pCDNA3.1) або індивідуально перераховаПриклад 12 ними алелями дикого типу TLR тричі на 6Визначення летальної дози 50/30, летальної луночному планшеті (1мкг/мл). Репортерна активдози 50/7 і фактора модулювання дози для фланість NF-kB була відрегульована нормалізацією геліну експресією до контрольного рівня активності люМи зробили оцінку здатності флагеліну захициферази Реніла, і кратність індукування розрахощати від опромінення в залежності від дози. Як вувалась як відношення активності гена-репортера показано вище (Фіг.17), обробка флагеліном була в оброблених клітинах до активності генадостатньою, щоб забезпечити 100% захист від дії репортера в нестимульованих клітинах (але - не гамма-випромінюванням дозою 10 Грей (така доза визначено). викликає смерть від гемопоетичного синдрому) і виживання протягом 30 днів у 90% випадків при Таблиця одержанні дози 13 Грей (гемопоетичний і гастроінтестинальний синдром). Експерименти виконуванестимульовані TNF FliCC ли, як описано вище, використовуючи дозу флагеВектор 1 13,5 4,9 ліну 5мкг/миша (0,2мг/кг), що вводиться TLR1 1,7 але 5,1 внутрішьочеревинно за 1год до опромінення. TLR2 1,6 але 5,3 Проте, при опроміненні дозою 15 Грей, за 7TLR3 1,5 але 5,0 денним виживанням пішла смерть, і до 13 дня TLR4 1,8 але 5,4 100% тварини були мертві (30-денне виживання в TLR5 1,6 але 9,2* 0% випадків), тоді як у контрольній групі протягом TLR7 1,5 але 5,2 7 днів усі миші загинули від гастроінтестинального TLR8 1,4 але 5,0 синдрому. (Фіг.18) Кінетика смертності групи, обTLR9 1,5 але 5,1 робленої CBLB-501 після опромінення дозою 15 Грей, нагадує кінетику смертності контрольної гру 45 83272 46 47 83272 48 49 83272 50 51 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 83272 Підписне 52 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601