Радіоімунокон’югати та їх застосування

Реферат: (72) Винахідник(и): Ларсен Рой Г. (NO), Дале Йостейн (NO), Брюленд Ойвінд С. (NO) (73) Власник(и): НОРДІК НАНОВЕКТОР АС, Kjelsasveien 163 B, N-0884 Oslo, Norway (NO) (74) Представник: Крилова Надiя Iванiвна, реєстр. №30 (56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою: GJERMUND HENRIKSEN ET AL: "Bi-labelled antibody and Bi-labelled streptavidin. Comparison of targeting efficiacy of a lymphoma cell line in vitro", JOURNAL OF LABELLED COMPOUNDS AND RADIOPHARMACEUTICALS, vol. 34, no. 12, 1 January 1997 (1997-01-01), pages 10391046, XP55007261 E. SMELAND ET AL: "Characterization of Two Murine Monoclonal Antibodies Reactive with Human B Cells", SCANDINAVIAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 21, 1 January 1985 (1985-01-01), pages 205-214, XP55007334 PRESS O W ET AL: "RADIOLABELEDANTIBODY THERAPY OF B-CELL LYMPHOMA WITH AUTOLOGOUS BONE MARROW SUPPORT", NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, THE, MASSACHUSETTS MEDICAL SOCIETY, WALTHAM, MA, US, vol. 329, no. 17, 21 October 1993 (1993-10-21), pages 1219-1224, XP008075157 KAMINSKI MARK S ET AL: "Imaging, dosimetry, and radioimmunotherapy with iodine-131-labeled anti-CD37 antibody in Bcell lymphoma", JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF CLINICAL ONCOLOGY, US, vol. 10, no. 11, 1 November 1992 (1992-11-01), pages 16961711, XP009121992 WO 2009/019312 A2, 12.02.2009 UA 108631 C2 (12) UA 108631 C2 Заявлений винахід стосується радіоімунокон'югата, що зв'язує CD37 людини, фармацевтичної композиції, яка включає такий радіоімунокон'югат, та їх застосування для лікування В-клітинних злоякісних захворювань. UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявлений винахід стосується радіоімунотерапії гематологічного раку з міченими радіоактивним ізотопом моноклональними антитілами з неочікуване високою цитотоксичністю. Терапія з міченими радіоактивним ізотопом антитілами, що застосовують проти неходжкінської лімфоми (NHL) сьогодні є затвердженим методом. На ринку є два продукти під торговельними марками Zevalin™ та Bexxar™ та обидва спрямовані до антигену CD20 (Jacene et al., 2007). Імунотерапевтичний агент ритуксимаб (Rituxan™/Mabthera™) також спрямований до антигену D20. Однією проблемою у лікуванні проти такої цілі є можливість імунофенотипного дрейфу під час перебігу хвороби (Ngo et al., 2009), що може привести до зменшення результатів терапії CD20, що повторюють протягом часу у вигляді терапії ритуксимабом або при застосуванні радіоімунотерапії (RIT) на основі CD20 після тривалої терапії ритуксимабом. Багато пацієнтів, що отримують спрямовану до CD20 терапію, в кінцевому рахунку зазнають рецидив (Buchegger et al., 2006; Gordon et al 2004). Отже, існує суттєва потреба у радіоімунотерапії (далі RIT) пацієнтів з NHL, що буде спрямована до іншого антигену, ніж CD20. На початку розвитку RIT, у якості мішеней було обрано два антигени, CD37 та CD20 (Press et al., 2001). Був зроблений висновок, що орієнтована на CD20 RIT є більш доречною, отже від розвитку спрямованої до CD37 радіоімунотерапії відмовилися. Таким чином, відомо, що моноклональні антитіла є прийнятними для застосування у RIT проти лімфоми, але спрямований до CD20 радіоімунокон'югат (RIC) значно перевершує радіоімунокон'югат, спрямований до CD37. (Press et al., 2001). В останні роки до CD37 знову привернули увагу (Heider et al., 2009;Grosmaire, 2007), головним чином розглядаючи його в якості мішені для імунотерапії з застосуванням химерних або гуманізованих констрактів антитіл. Ці роботи вчать відмовитися від застосування звичайних мишачих моноклональних антитіл IgG, оскільки мишачі антитіла можуть викликати продукування анти-мишачих антитіл людини (HAMA) у пацієнтів, що може викликати дискомфорт та зниження ефективності імунотерапії. Для RIT, звичайні мишачі моноклональні антитіла, як і раніше, вважаються цікавими, оскільки загальні застосовані дози білка є нижчими та нема потреби у повторному лікуванні в тій же мірі, як у імунотерапії. Також, очищення мишачих IgG, як правило, проходить трохи швидше, ніж гуманізованих або химерних версій тих же саме IgG, що може бути більш прийнятним в умовах опромінення всього тіла при застосуванні RIT, принаймні у деяких параметрах. Слід зазначити, що обидва препарати, Bexxar та Zevalin отримані на основі мишачих антитіл. Заявлений винахід стосується анти-CD37 мишачого антитіла HHl у якості носія для радіоізотопу. Перший клон гібридоми, що продукує мишачі анти-CD37 антитіла HHl розробили у 1980'х роках (Smeland et al., 1985) та антитіла HHl протягом декількох років були у продажу для застосування in vitro у імуногістохімії. Раніше не розглядали прийнятність антитіл HHl для радіоімунотерапії з точки зору біорозподілення та клітинної цитотоксичності, отже ця робота була розпочата для оцінки прийнятності HHl у радіоімунотерапії. На відміну від попередніх клінічних та доклінічних досліджень з анти-CD37 RIC, де застосовували безпосереднє мічення радіоактивним ізотопом 131 I тирозинових залишків з застосуванням хлорамінT/ йодогенового способів, HHl мітили радіоактивним ізотопом через хелатор з застосуванням металічного радіонукліду замість галогену. Застосування металічного радіонукліду, міченого через хелатор-лінкер може бути корисним, 131 оскільки застосування I -міченого антитіла пов'язано з опроміненням щитовидної залози різною кількістю йоду, що вивільняється від RIC. У попередньому дослідженні для оцінки прийнятності HHl для продукування 205 206 радіоімунокон'югату, CHX-A-DTPA кон'югували з HHl та кон'югат мітили ' Bi для моделювання in vitro (Henriksen et al., 1997). Поглинання у клітинній лінії Raji порівнювали з вісмутом, кон'югованим до HHl або зі стрептавідином. У останньому випадку, клітини попередньо насичували біотінільованими -HHl. Знайдено, що обмежуючим фактором був ряд хелаторів, необхідний для забезпечення 212 213 функціональної RIC при застосуванні Bi або Bi мічення. Тому було запропоновано застосування біотінільованих HHl замість RIC на основі HHl. Після зв'язування з клітинами, біотінільовані HHl можуть бути мішенню для міченого радіоактивним ізотопом стрептавідину. Отже, дослідження передбачає, що HHl, мічені радіонуклідом з альфа-випромінюванням будуть менш корисними через недостатню специфічну активність концентрацій хелатора, що вважаються прийнятними для збереження достатній зв'язувальній здатності HHl. Також в дослідженні було зазначено, що бета - випромінювач буде ще менш прийнятним для отримання функціональної RIC порівняно з альфа - випромінювачем (Henriksen et al, 1997), 1 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 оскільки автори встановили, що, для хвороби, що поширюється, для отримання достатнього результату необхідно глибинно - сфокусоване опромінення пухлини, отже, цільова радіотерапія з бета - випромінювачем повинна бути зниженою. Таким чином, вищезазначене дослідження радить відмовитися від застосування безпосередньо хелатованих HHl у радіоімунотерапії та також від застосування HHl у RIC на основі бета-випромінювача. Заявлений винахід стосується радіоімунокон'югата, що зв'язує CD37 людини, що складається з мишачого моноклонального антитіла HHl, лінкера та радіонукліда, вибраного з 211 213 212 212 225 227 90 186 188 199 194 166 159 групи, що охоплює At, Bi, Bi, Pb, Ac, Th, Y, Re, Re, Au, Ir, Ho, Gd, 153 149 142 111 109 77 67 47 177 Sm, Pm, Pr, Ag, Pd, As, Cu, Sc та Lu. У одному втіленні заявленого винаходу, лінкер є хелатуючим лінкером та радіонуклід є 177 Lu. Один аспект заявленого винаходу стосується фармацевтичної композиції, що містить радіоімунокон'югат заявленого винаходу та фармацевтично прийнятний носій. У одному втіленні заявленого винаходу, фармацевтична композиція заявленого винаходу містить одне або декілька додаткових антитіл або радіоімунокон'югатів. У іншому втіленні заявленого винаходу, одне або декілька додаткових антитіл або радіоімунокон'югатів спрямоване до CD20. Ще одне втілення заявленого винаходу стосується фармацевтичної композиції заявленого винаходу для лікування злоякісних В - клітин, що експресують антиген CD37 У одному втіленні заявленого винаходу фармацевтична композиція призначена для лікування неходжкінської лімфоми та хронічного лімфолейкозу. Один аспект заявленого винаходу стосується застосування радіоімунокон'югату заявленого винаходу для лікування В- клітинних злоякісних новоутворень. Одне втілення заявленого винаходу стосується застосування радіоімунокон'югату заявленого винаходу, що вводять у комбінації з або на додаток до іншої терапії. У одному втіленні заявленого винаходу, терапія є вибраною з групи, що охоплює попереднє лікування, хіміотерапію, терапію з моноклональними антитілами, хірургію, радіотерапію, та/або фотодинамічну терапію. У іншому втіленні заявленого винаходу терапія охоплює попереднє лікування з застосуванням анти-CD20 та/або анти-CD37 моноклональних антитіл перед лікуванням з радіоімунокон'югатом заявленого винаходу. Один аспект заявленого винаходу стосується способу лікування В- клітинних злоякісних пухлин, вибраних з неходжкінської лімфоми та хронічного лімфолейкозу, що полягає у введенні ефективної кількості фармацевтичної композиції заявленого винаходу. Інший аспект заявленого винаходу стосується набору для отримання радіоімунокон'югату заявленого винаходу, що складається з двох або декількох флаконів, де один флакон містить кон'югат, що містить хелатор, зв'язаний з мишачими моноклональними антитілами HH1; та другий флакон містить радіонуклід. Одне втілення заявленого винаходу стосується набору заявленого винаходу, де зміст одного або декількох флаконів є або ліофілізованим або знаходиться у розчині. У іншому втіленні заявленого винаходу радіоімунокон'югат отримують перемішуванням змісту двох флаконів. Стислий опис фігур. Фіг. 1 Клітинні антитіла, отримані негайно (A) та через 96 годин (B) після промивання для 111 111 125 125 інкубування клітин Raji, Rael та Daudi з In-HHl, In – ритуксимаб, I-HH1 та I -ритуксимаб. Фіг. 2 177 177 Активність зв'язування з клітинами Daudi після інкубування з Lu-HHl або Lu-ритуксимаб протягом 2 год. (A) та 18 год. (B). Блоковані клітини блокували зі 100 г/мл немічених антитіл. Фіг. 3 177 177 Зростання клітин Daudi, інкубованих з Lu-HHl (A) або Lu-ритуксимаб (B) протягом 2 год. перед промиванням. Фіг. 4 177 177 Зростання клітин Daudi, інкубованих з Lu-HHl (A) або Lu-ритуксимаб (B) протягом 18 год. перед промиванням. Фіг. 5 111 Біорозподілення In – мітки крізь хелатор до HH1 у мишах з ксенотрансплантатами Daudi. Фіг. 6 2 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 FITC- гістограми немічених клітин Daudi, клітин Daudi, мічених тільки з вторинними антитілами або мічених з HHl, ON.108, IPO.24 або 6D263. Фіг. 7 177 Біорозподілення Lu - у голих мишей жіночої статі з пухлиною Daudi. Фіг. 8 Терапія мишей з внутрішньовенно введеними клітинами Daudi. Виживання мишей, що 177 отримали 50 та 100 MБк / кг Lu-HHl, “ холодний “ (той, що не містить радіоактивних речовин) HHl, "холодний ” ритуксимаб та NaCI. Заявлений винахід стосується застосування антитіл HHl у радіоімунотерапії. Комбінація металу радіонукліду, лінкеру та анти-CD37 моноклональних антитіл несподівано показала, що мічені радіоактивним ізотопом HHl мають прийнятне біорозподілення та поглинання пухлиною у ксенотрансплантаті/моделі голої миші. Це важлива інформація, що свідчить про прийнятність для застосування у радіоімунотерапії. 177 Заявлений винахід неочікуване показав, що радіоімунокон'югат Lu-HH1 показав суттєву 177 цитотоксичність у клітинах пухлин, що поширюються та що Lu-HH1 був більш цитотоксичним 177 для пухлинних клітин при даній дозі, ніж Lu -ритуксимаб. Це відкриття було несподіваним, оскільки більша радіоактивність зв'язувалася з клітиною та 177 збереження зв'язаних радіонуклідів було подібним або кращим для Lu -ритуксимаб. Це свідчить проти загальноприйнятної думки про те, що анти-CD20 антитіла є більш кращими для радіоімунотерапії, ніж анти-CD37 антитіла. Крім того, справжня робота відрізняється від попередньої точки зору тим, що бетавипромінювач та глибинно-сфокусоване опромінювання, що неприйнятні у дисемінованих клітинах, можуть мати важливе значення для отримання задовільного результату (Henriksen et al., 1997). Причина спостереженого явища досі не ясна. Дані експериментів з різними дозуваннями немічених HHl та ритуксимабу не дають жодних результатів з неміченими антитілами у застосованому аналізі зростання. Одним з можливих пояснень може бути те, що серед CD37 існує менше число клітин з дуже низької щільністю антигену, ніж серед CD20, хоча CD20 в середньому проявляють сильнішу експресію у застосованій клітинній лінії. Дані по утримуванню не надають кращого утримування через інтерналізацію CD37, що може бути можливим поясненням, оскільки було повідомлено про наявність деякої інтерналізації з антигеном CD37 (Press et al, 2001). Отже, заявлений винахід стосується a радіоімунокон'югату, що зв'язує CD37 людини, що містить мишаче моноклональне антитіло HHl, лінкер та радіонуклід, вибраний з групи, що 211 213 212 212 225 227 90 186 188 199 194 166 159 153 149 охоплює At, Bi, Bi, Pb, Ac, Th, Y, Re, Re, Au, Ir, Ho, Gd, Sm, Pm, 142 111 109 77 67 47 177 Pr, Ag, Pd, As, Cu, Sc та Lu. У одному втіленні заявленого винаходу, лінкер є хелатуючим лінкером. 177 У іншому втіленні заявленого винаходу, радіонуклід є Lu. У іншому втіленні, радіонуклід є іншим бета- або альфа - випромінювачем. Заявлений винахід припускає, з даними in vitro, що мічені радіоактивним ізотопом HHl більш ефективно зв'язуються з CD37 антигеном, ніж мічений радіоактивним ізотопом ритуксимаб зв'язуюється з CD20 антигеном, тобто, вони досягають максимального зв'язування з антигеном з меншою потрібною кількістю циркулюючих антитіл (Таблиця 2, Фіг. 2). Потрібно також менше часу для досягнення максимального зв'язування (Фіг. 2). Ці особливості можуть бути важливими in vivo також тому, що це означає, що пухлинні клітини можуть захоплювати RIC навіть при низької концентрації циркулюючих антитіл, відтворюючи ситуацію, що може траплятися у менш прийнятних ділянках твердих пухлин та для одиничних пухлинних клітин та мікрометастазів, розташованих у віддалених ділянках нормальних тканин. Це значно відрізняється від попередніх даних, що свідчили про те, що підвищена концентрація антитіл потребує інших анти-CD37 антитіл, ніж HHl (Bernstein et al., 1990), також у порівнянні з анти-CD20 антитілами (Press et al., 1993), для насичення антигену та отримання бажаного біорозподілення. Додатково, заявлений винахід показує, що HHl має деякі інші антиген-зв'язувальні властивості порівняно з групою трьох інших анти-CD37 антитіл, незважаючи на те, що всі антитіла по суті зв'язуються з тим же епітопом. Блокуючі експерименти, тобто експерименти з застосуванням клітин, попередньо насичених неміченими антитілами, показали те, що HHl блокуватиме CD37 на живих клітинах від зв'язування з міченими радіоактивним ізотопом HHl значно краще, ніж три інших анти-CD37 антитіла. 3 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У клітинному аналізі порівняння мічених радіоактивним ізотопом антитіл, HHl показав значно кращу імунореактивну фракцію у порівнянні з трьома іншими антитілами. Під імунореактивною фракцією мається на увазі фракція антитіл, що може зв'язувати антиген, якщо є необмежене перевищення антигенів. Різні антитіла можуть мати різну здатність до збереження імунорeактивності після проведення процедури мічення. Результати, наведені у Прикладі 6, Експерименті IV, Таблиці 5 показують, що імунорeактивність HHl краще зберігалася, ніж імунорeактивність трьох комерційно доступних антитіл. З іншого боку, імуногістохімічні аналізи показали, що три антитіла дають забарвлення зрізів тканин з зафіксованих у парафіні зразків пухлин у той час, як HHl його не дають. Відмінності у взаємодіях антитіло - антиген не виявляються за допомогою проточної цитометрії. Гістограми проточної цитометрії для HHl та трьох інших анти-CD37 антитіл (Фіг. 6) були схожими. В цілому, ці дані показують, що HHl мають значну індивідуальну взаємодію з антигеном, що у деяких аспектах не може бути передбаченою у дослідженнях з іншими антиCD37 антитілами. Описаний тут новий анти-CD37 радіоімунокон'югат з сильними цитотоксичними властивостями складається з мишачих моноклональних антитіл HHl, хелатуючого лінкера та 177 бета-випромінювача Lu. Радіонуклід може бути прикріпленим до антитіла шляхом першої реакції біфункціонального хелатора, наприклад p-SCN-bn-DOTA (Macrocyclics, Tx, USA), з антитілом, після чого слідує очищення з метою видалення некон'югованого хелатора та реакція кон'югату хелатора з антитілом з радіонуклідом, після чого слідує ще одне очищення для видалення будь-якого некон'югованого радіонукліда. Альтернативно, хелатор та радіонуклід можуть спочатку бути об'єднані та потім кон'юговані з антитілами. Хелатуючі лінкери, як то, наприклад p-SCN-bn-DOTA, можуть бути застосованими для 177 кон'югації інших металічних радіонуклідів з HHl шляхом, аналогічним наведеному для Lu. Може бути застосований будь-який тип лінкера з достатньою здатністю до утворювання комплексів та з функціональною групою, що дозволяє пряму або непряму кон'югацію з білком або пептидом. Приклади таких лінкерів описано у літературі (наприклад Brechbiel, 2008; Liu, 2008). Деякі корисні приклади являють собою біфункціональні циклічні хелатори, подібні до pSCN-bn-DOTA, DOTA-NHS-естер; біфункціональні лінійні хелатори, подібні до p-SCN-Bn-DTPA та CHX-A"-DTPA. Радіонукліди у заявленому винаході переважно кон'югують з цільовою молекулою з застосуванням біфункціональних хелаторів, що можуть бути циклічними, лінійними або розгалуженими. Особливу увагу можна зробити на поліаміно-полікислі хелатори, що містять циклічний, лінійний або розгалужений поліазаалкіновий каркас з кислими (наприклад карбоксиалкільними) групами, приєднаними до нітрогенів каркасу. Приклади прийнятних хелаторів охоплюють похідні DOTA, як то p-5 ізотіоцианатобензил 1,4,7, 10 - тетраазациклододекан - 1,4,7, 10- тетраоцтову кислоту (p-SCN-Bz-DOTA) та похідні DTPA, як то p - ізотіоцианатобензил – діетилентриамінпентаоцтову кислоту (p-SCN-Bz-DTPA), перші з яких є циклічними хелаторами, а останні - лінійними хелаторами. Металування комплексоутворюючої частини може бути здійснено перед або після кон'югації комплексоутворюючої частини з цільовою групою. Взагалі, процедура мічення радіоактивним ізотопом є більш зручною з точки зору витраченого часу тощо, якщо хелатор є кон'югованим з антитілом перед початком мічення радіоактивним ізотопом. Принципи отримання мічених радіоактивним ізотопом кон'югатів з застосуванням прикріплених до антитіл хелаторів більш докладно описані, наприклад у Liu, 2008. Отже, HHl можна застосувати для отримання радіоімунокон'югатів з відмінностями у 20 властивостях опромінювання та з ефективними періодами напіврозпаду. Наприклад, радіоімунокон'югат анти-CD37, що складається з мишачого моноклонального антитіла HHl, хелатуючого лінкера радіонукліда, що є альфа- або бета- випромінювачем, що 177 211 213 212 212 225 227 90 186 188 199 охоплює, але без обмеження, Lu, At, Bi, Bi, Pb, Ac, Th, Y, Re, Re, Au, 194 166 159 153 149 142 111 109 77 67 47 Ir, Ho, Gd, Sm, Pm, Pr, Ag, Pd, As, Cu, Sc може бути отриманим та застосованим для отримання фармацевтичних препаратів та з терапевтичною метою. Радіоімунотерапевтичний продукт на основі HHl звичайно може бути наданий у вигляді фармацевтичної композиції, що складається з радіонукліду відповідно до вищезазначеного опису, пов'язаного через хелатор до мишачого моноклонального антитіла HHl, що розчинений у буферному розчині, що у значній мірі підтримує хімічну цілісність радіоімунокон'югату та буде фізіологічно прийнятним для інфузії пацієнтам. 4 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Отже, аспект заявленого винаходу стосується фармацевтичної композиції, що містить a радіоімунокон'югат заявленого винаходу та фармацевтично прийнятний носій та/або наповнювач. Фармацевтично прийнятні носії охоплюють, але без обмеження, нетоксичні буфери, наповнювачі, ізотонічні розчини тощо. Зокрема, фармацевтичний носій може бути, але без обмеження, нормальним фізіологічним розчином (0.9 %), напівнормальним фізіологічним розчином, лактатом Рингера, 5 % декстрозою, розчином 3.3 % декстрози / 0.3 % фізіологічного розчину. Фізіологічно прийнятний носій може містити радіолітичний стабілізатор, наприклад аскорбінову кислоту, що захищає цілісність радіофармацевтичного препарату протягом зберігання та відвантаження. Одне втілення заявленого винаходу стосується фармацевтичної композиції заявленого винаходу та одного або декількох додаткових антитіл або радіоімунокон'югатів. Антитіла охоплюють, але без обмеження, Ритуксимаб, Епратузимаб, L19, F8, F16, Галіксимаб, Торалізумаб, Алемтузумаб, Офатумумаб, Велтузумаб, Афутузумаб, Тозітумомаб, Редітукс та Ібрітумомаб. Радіоімунокон'югати охоплюють, але без обмеження, Зевалін та Бексар. У іншому втіленні заявленого винаходу, одне або декілька додаткових антитіл або радіоімунокон'югатів спрямоване до CD20. Антитіла охоплюють, але без обмеження, Ритуксимаб, Велтузумаб, Офатумумаб, Афутузумаб, Тозітумомаб, Редітукс та Радіоімунокон'югати охоплюють, але без обмеження, Зевалін та Бексар. Подальше втілення заявленого винаходу стосується фармацевтичної композиції заявленого винаходу для лікування злоякісних В - клітин, що експресують антиген CD37. Одне втілення заявленого винаходу стосується фармацевтичної композиції для лікування неходжкінської лімфоми та хронічного лімфолейкозу. Як звичайно визначено, під " тотожністю " тут мається на увазі тотожність послідовностей серед генів або білків на нуклеотидному або амінокислотному рівні, відповідно. Отже, в даному контексті " тотожність послідовностей " є мірою тотожності між білками на рівні амінокислот та мірою тотожності між нуклеїновими кислотами на нуклеотидної рівні. Тотожність послідовності білка може бути визначена порівнянням амінокислотної послідовності у вибраній позиції у кожній послідовності при вирівнюванні послідовностей. Так само, тотожність послідовності нуклеїнової кислоти може бути визначена порівнянням нуклеотидної послідовності у вибраній позиції у кожній послідовності при вирівнюванні послідовностей. Для визначення відсотка тотожності двох послідовностей нуклеїнової кислоти або двох амінокислот, для оптимального порівняння послідовності вирівнюють (наприклад для оптимального вирівнювання з другою амінокислотною або нуклеотидною послідовністю у першу амінокислотну або нуклеотидну послідовність можуть бути введені пробіли). Потім порівнюють амінокислотні залишки або нуклеотиди у відповідних амінокислотних або нуклеотидних позиціях. Коли позиція у першій послідовності зайнята таким саме амінокислотним залишком або нуклеотидом, як у відповідній позиції у другій послідовності, тоді молекули вважаються ідентичними по цій позиції. Відсоток тотожності між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних позицій, що мають послідовності (наприклад % тотожності = # ідентичних позицій / загальний # позицій (наприклад позиції, що перекриваються) x 100). У одному втіленні, дві послідовності мають однакову довжину. Будь-хто може вирівняти послідовності та підрахувати кількість ідентичних нуклеїнових кислот або амінокислот вручну. Альтернативно, вирівнювання двох послідовностей для визначення відсотка тотожності може бути здійснено з застосуванням математичного алгоритму, як то алгоритм, включений у програми NBLAST та XBLAST. Пошук нуклеотидів BLAST для отримання нуклеотидних послідовностей, гомологічних молекулам нуклеїнової кислоти винаходу може бути проведений з застосуванням програми NBLAST, сума балів = 100, довжина слова = 12,. Пошук білків BLAST для отримання амінокислотних послідовностей, гомологічних білковим молекулам винаходу може бути проведений з застосуванням програми XBLAST, сума балів = 50, довжина слова = 3. Для отримання вирівнювань з пробілами з порівняльною метою можна застосувати програму Gapped BLAST. Альтернативно, для здійснення повторного пошуку, що визначає віддалені відносини між молекулами може бути застосована програма PSI-Blast. При застосування програм NBLAST, XBLAST та Gapped BLAST можуть бути застосовані параметри відповідних програм по замовчуванню, див. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Альтернативно, 5 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 тотожність послідовності можна обчислити після вирівнювання послідовностей, наприклад за допомогою програми BLAST у базі даних EMBL (www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST). Звичайно, для вирівнювання можуть бути застосовані параметри по замовчуванню щодо, наприклад " матриці заміщень " та " штрафу за внесення пробілу ". У контексті заявленого винаходу, прийнятими будуть параметри по замовчуванню BLASTN та PSI BLAST. Відсоток тотожності між двома послідовностями можна визначити з застосуванням способів, подібних до вищезазначених, зі створенням пробілів або без них. При підрахуванні відсотку тотожності беруться на увагу тільки точні збіги. У одному втіленні, винахід стосується виділеної нуклеїнової кислоти, що містить послідовність, що має 80 % тотожності з послідовністю VH антитіла HH 1 (SEQ ID NO: 1) та/або з послідовністю VL (SEQ ID NO: 3). У одному втіленні, винахід стосується виділеної нуклеїнової кислоти, що містить VH послідовність антитіла HH 1 (SEQ ID NO: 1) та/або VL послідовність (SEQ ID NO: 3). У іншому втіленні, винахід стосується виділеної нуклеїнової кислоти, що містить послідовність, що має принаймні 90 % тотожності з послідовністю VH антитіла HH 1 (SEQ ID NO: 1) та/або з послідовністю VL (SEQ ID NO: 3), як то 90 % тотожності, 91 % тотожності, 92 % тотожності, 93 % тотожності, 94 % тотожності, 95 % тотожності, 96 % тотожності, 97 % тотожності, 98 % тотожності або 99 % тотожності. У іншому втіленні, винахід стосується антитіла, що містить поліпептидну послідовність, що має 80 % тотожності з послідовністю VH антитіла HHl (SEQ ID NO: 2) та/або з послідовністю VL (SEQ ID NO: 4). У іншому втіленні, винахід стосується антитіла, що містить поліпептидну послідовність VH антитіла HHl (SEQ ID NO: 2) та/або послідовність VL (SEQ ID NO: 4). У іншому втіленні заявленого винаходу, антитіло містить послідовність, що має принаймні 90 % тотожності з послідовністю VH антитіла HHl (SEQ ID NO: 2) та/або з послідовністю VL (SEQ ID NO: 4), як то 90 % тотожності, 91 % тотожності, 92 % тотожності, 93 % тотожності, 94 % тотожності, 95 % тотожності, 96 % тотожності, 97 % тотожності, 98 % тотожності або 99 % тотожності. Генетична мінливість спричинена мінливістю у порядку основ у нуклеотидах у генах. Ця мінливість викликає мутації в генах та потім в білках, що ці гени кодують. Ці мутації можуть бути або сенс- або місенс- мутаціями або заміщеннями. Одне втілення заявленого винаходу стосується виділеної послідовності нуклеїнового VH ланцюга моноклонального антитіла HHl (SEQ ID NO: 1) та/або VL ланцюга (SEQ ID NO: 3) що містить принаймні 50, наприклад 20, наприклад 10, наприклад 5, наприклад 4, наприклад 3, наприклад 2, наприклад 1 сенс- мутацію. Інше втілення заявленого винаходу стосується виділеної послідовності нуклеїнової кислоти VH ланцюга моноклонального антитіла HHl (SEQ ID NO: 1) та/або VL ланцюга (SEQ ID NO: 3), що містить 0-50, наприклад 1-50, наприклад 0-20, наприклад 1-20, наприклад 0-10, наприклад 110, наприклад 0-5, наприклад 1-5, наприклад 3, наприклад 1 сенс- мутацію. Місенс- мутація (тип несинонімічної мутації) є точковою мутацією зі зміненням одиничного нуклеотиду, що веде до кодування кодоном іншої амінокислоти (мутації, що змінюють амінокислоту на стоп-кодон вважаються не місенс- мутаціями, а нонсенс- мутаціями). Місенсмутація може зробити отриманий білок нефункціональним. Однак, не всі місенс- мутації призводять до помітних змінень білка. Якщо одну амінокислоту може бути заміщено на другу з дуже схожими хімічними властивостями, то у такому разі білок може нормально функціонувати. Це має назву нейтральної, " тихої " або консервативної мутації. Альтернативно, амінокислотні заміщення можуть траплятися у такій ділянці білка, що не має значної дії на його вторинну структуру або функцію. При кодуванні амінокислоти більш ніж одним кодоном (так зване " дегенеративне кодування "), де мутація у кодоні може не викликати будь-якого змінення у трансляції; це буде вважатися синонімічною мутацією (вид тихої мутації), а не місенс-мутацією. Одне втілення заявленого винаходу стосується антитіла, що містить поліпептидну послідовність VH ланцюга моноклонального антитіла HHl (SEQ ID NO: 1) та/або VL ланцюга (SEQ ID NO: 3) що містить принаймні 50, наприклад 20, наприклад 10, наприклад 5, наприклад 4, наприклад 3, наприклад 2, наприклад 1 місенс- мутацію. Одне втілення заявленого винаходу стосується антитіла, що містить поліпептидну послідовність VH ланцюга моноклонального антитіла HHl (SEQ ID NO: 1) та/або VL ланцюга (SEQ ID NO: 3) що містить 0-50, наприклад 1-50, наприклад 0-20, наприклад 1-20, наприклад 010, наприклад 1-10, наприклад 0-5, наприклад 1-5, наприклад 3, наприклад 1 місенс- мутацію. 6 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Консервативним заміщенням є заміщення однієї амінокислоти на іншу зі, звичайно, подібними властивостями, таким чином, що загальне функціонування, швидше за все, не буде серйозно змінено. У іншому втіленні заявленого винаходу місенс- мутації є консервативними мутаціями або заміщеннями. Подальше втілення заявленого винаходу стосується виділеної послідовності нуклеїнової кислоти або поліпептидної послідовності з 80 % тотожністю до послідовності змінного важкого ланцюга (SEQ ID NO: 2) та/або змінного легкого ланцюга (SEQ ID NO: 4) HHl, де мінливість послідовності є у вигляді консервативних заміщень. Інше втілення заявленого винаходу стосується послідовності з тотожністю у 80 %, з тотожністю у 90 %, з тотожністю у 91 %, з тотожністю у 92 %, з тотожністю у 93 %, з тотожністю у 94 %, з тотожністю у 95 %, з тотожністю у 96 %, з тотожністю у 97 %, з тотожністю у 98 % або з тотожністю у 99 %, де мінливість послідовності є у вигляді консервативних заміщень. З метою покращення стадії мічення радіоактивним ізотопом може бути бажаним вводити екстра лізину у, наприклад Fc частку HHl. Це може зменшити ймовірність приєднання хелаторів зв'язування лізину до сайтів об'єднання антигену з антитілом, тим самим скорочуючи ризик виникнення зниженої імунорeактивності під час мічення радіоактивним ізотопом. Способи введення лізину у, наприклад Fc частку HHl, є добре відомими, наприклад, див. Hemminki et al., 1995. Одне втілення заявленого винаходу стосується радіоімунокон'югату заявленого винаходу, модифікованого 10 Lys у Fc частці HHl, як то 8 Lys, як то 6 Lys, як то 5 Lys, як то 4 Lys, як то 3 Lys, як то 2 Lys, як то 1 Lys. Фармацевтичний розчин відповідно до заявленого винаходу може бути терапевтично застосований проти злоякісних клітин, що експресують антиген CD37, в тому числі, але без обмеження, для лікування не-ходжкінської лімфоми та хронічного лімфолейкозу. Іншим застосуванням може бути лікування аутоімунних захворювань та лікування шкідливих дій, пов'язаних з трансплантацією. Може бути застосована терапія на основі, але без обмеження, бета- випромінювання або альфа- випромінювання або їх комбінації. Може бути застосована терапія або у вигляді монотерапії або у комбінації з іншими терапіями, переважно зі стандартними способами лікування. Такими іншими терапіями може бути попереднє лікування, хірургія, хіміотерапія, імунотерапія, фотодинамічна терапія, радіоімунотерапія або комбінація двох або декількох цих терапій. Під введенням мається на увазі внутрішньовенне вливання або внутрішньовенна ін'єкція. Зокрема, радіоімунокон'югат заявленого винаходу може бути безпосередньо введено у вену за допомогою периферичній канюлі, приєднаній до крапельній камері, що запобігає створення повітряній емболії та дозволяє оцінити швидкість потоку до пацієнта. У одному втіленні радіоімунокон'югат може бути введено декілька разів. У іншому втіленні заявленого винаходу, радіоімунокон'югат може бути введено декілька разів, але з різними радіонуклідами, наприклад, після бета- радіоімунотерапії може слідувати альфа- радіоімунотерапія або навпаки. Один аспект заявленого винаходу стосується застосування радіоімунокон'югату заявленого винаходу у лікуванні В- клітинних злоякісних пухлин. Одне втілення заявленого винаходу стосується застосування радіоімунокон'югату заявленого винаходу, введеного у комбінації з або на додачу до іншої терапії. У одному втіленні заявленого винаходу інші види терапії вибрані від попереднього лікування, хіміотерапії, терапії моноклональними антитілами, хірургії, радіотерапії, та/або фотодинамічної терапії. У іншому втіленні заявленого винаходу інші види терапії являють собою трансплантацію кісткового мозку або трансплантацію стовбурових клітин та/або терапію. Інше втілення заявленого винаходу стосується терапевтичного попереднього лікування з застосуванням моноклональних антитіл анти-CD20 та/або анти-CD37 перед лікуванням з радіоімунокон'югатом заявленого винаходу. Один аспект заявленого винаходу стосується способу лікування В-клітинного злоякісного захворювання, вибраного з не-ходжкінської лімфоми та хронічного лімфолейкозу, що полягає у введенні ефективної кількості фармацевтичної композиції заявленого винаходу. У втіленні заявленого винаходу, дозування антитіл дорівнює 1-1000 мг на пацієнта, більш 177 бажано 5-50 мг на пацієнта та Lu, що дорівнює 1-200 МБк/кг, більш переважно 10-100 МБк/кг маси тіла. Один аспект заявленого винаходу стосується набору для отримання радіоімунокон'югату заявленого винаходу, що складається з двох або декількох флаконів, де один флакон містить 7 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кон'югат, що містить хелатор, зв'язаний з мишачими моноклональними антитілами HH1; та другий флакон містить радіонуклід. Для набору може знадобитися проведення деяких процедур, наприклад мічення радіоактивним ізотопом та/або очищення перед вливанням. Одне втілення заявленого винаходу стосується набору заявленого винаходу, де зміст одного або декількох флаконів знаходиться або у ліофілізованому стані або у розчині. Кінцевий продукт отримують перемішуванням вмісту двох флаконів з отриманням радіоімунокон'югату. Отже, у іншому втіленні заявленого винаходу радіоімунокон'югат отримують перемішуванням вмісту двох флаконів. Цей продукт може потребувати очищення перед застосуванням. Приклад 1. Мічення HH1 радіоактивним ізотопом. 125 Йодування: антитіла мітили I непрямим йодуванням з застосуванням IODOGEN pre-coated iodination tubes (Pierce, Rockford, IL) відповідно з інструкціями виробника. 111 177 Мічення In та Lu: антитіла спочатку вступили у реакцію з хелатором (p-SCN-Bn-DTPA або p-SCN-Bn-DOTA). Хелатор DTPA або DOTA розчинили у 0.05 M HCI, після чого додали до антитіл, pH яких відрегульовали до 8 шляхом промивання з карбонатним буфером у співвідношенні 5: 1. Потім pH знову перевірили та у разі необхідності відрегульовали. Розчин струшували протягом 60 хв. при кімнатній температурі, після чого реакцію зупинили додаванням 50 мкл 200 мМ розчину гліцина (на мг антитіл). Для видалення вільного хелатора, кон'юговані антитіла промили 4-5 разів з PBS (PAA) та потім відрегульовали pH до 5 промиванням з ацетатом амонію. Далі до 0.5 111 177 мг DOTA-Ab додали In або Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma, USA) та суміш струшували протягом години при 42 °C. Зрештою, продукт очистили елююванням на гель-фільтраційній колонці, наприклад Sephadex G-25 PD10 (GE health) або подібній. Загальний вихід мічення був у діапазоні 17 % - 63 %. Якість радіоімунокон'югатів вимірювали з застосуванням клітин лімфоми та модифікованого 111 способу Ліндмо. Для компенсування незначної специфічної активності In - кон'югатів 125 застосували концентрації клітин до 108 клітин на мл. Для I (що мав найвищу специфічну 7 активність) було достатнім застосування концентрацій клітин до 4 × 10 клітин на мл. Імунорeактивність та специфічну активність для радіоімунокон'югатів можна побачити у Таблиці 1. Приклад 2. Параметри зв'язування. Постійну швидкості асоціації, ka, рівноважну постійну дисоціації, Kd та середню кількість сайтів зв'язування, Bmax, визначили за допомогою одноетапного способу підбору кривих (Dahle et al. 2007). Параметри зв'язування вимірювали для HHl та ритуксимабу а також для трьох різних клітинних ліній лімфоми: клітин Raji, Rael та Daudi (Таблиця 2). Специфічність зв'язування вимірювали у якості функції часу та концентрації антитіл та рішення диференціального рівняння, що описує чистий коефіцієнт утворювання комплексу антиген антитіло було пристосоване до точок експериментальних даних з застосуванням в якості параметрів постійної швидкості асоціації, ka, рівноважної постійної дисоціації, Kd та середньої кількості сайтів зв'язування, Bmax. Було застосовано п'ять мільйонів клітин на мл, чотири 125 концентрації I - мічених антитіл (100 нг/мл, 1000 нг/мл, 5000 нг/мл та 10000 нг/мл) та 7 моментів часу інкубування (5 хв, 10 хв, 20 хв, 30 хв, 1 год., 1.5 год. та 2 год.). Після інкубування, клітини двічі промили з PBS та потім підрахували у гамма-лічильнику. Приклад 3. Утримування клітинно-фіксованих антитіл. Утримування клітинно-фіксованих антитіл безпосередньо та через 96 годин після 111 111 промивання вимірювали після інкубування клітин Raji, Rael та Daudi з In-HHl, In 125 125 ритуксимаб, I-HHl та I - ритуксимаб (Фіг. 1). Один мільйон клітин у 1 мл середовища RPMI 1640 з 10 % ембріональної телячої сироватки, 125 111 1 % L- глютаміном та 1 % пеніцилін/стрептоміцином інкубували з 1 г/мл I - або In - міченими HHl або ритуксимабом протягом однієї години, двічі промили середовищем та потім ще інкубували протягом 5 днів. Активність клітинного зв'язування визначили безпосередньо після промивання (Фіг. 1A) та після 4 днів інкубування (Фіг. I B) шляхом вимірювання кількості клітин (Vi Cell Viability Analyzer, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) та дози радіоактивності на відкаліброваному гамма-детекторі (Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA). 177 177 Приклад 4. Лікування клітин лімфоми in vitro Lu-HHl або Lu - ритуксимаб. 177 Експеримент I: Приєднання Lu-HHl до клітин Daudi. 1 мл суспензії клітин Daudi (один мільйон клітин у 1 мл) засіяли у 24 пробірки, половину з них блокували 100 г/мл або HHl або ритуксимаб та інкубували протягом 30 хв. при 37 °C. Потім, 177 177 у кожну пробірку додали або Lu-HHl або Lu - ритуксимаб до кінцевої концентрації у 0, 1, 2.5, 8 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5, 10 або 20 мкг/мл та інкубували далі при 37 °C. Питома активність дорівнювала 91.6 кБк / г для 177 177 Lu-HHl та 136.6 кБк/ мг для Lu -ритуксимаб. Значення доданої активності вимірювали протягом періоду інкубування за допомогою гамма - детектора (Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company). Через дві години, половину клітин промили та виміряли активність клітинного зв'язування (Фіг. 2A) у той час, як іншу половину клітин інкубували протягом ночі (18 год.) перед промиванням та вимірюванням активності клітинного зв'язування (Фіг. 2B). Після двох годин інкубування не було відмічено різниці між клітинами, що інкубували з HHl та клітинами, що інкубували з ритуксимаб, тим часом, як через 18 годин інкубування, активність клітинного зв'язування була двічі вищою для клітин, інкубованих з ритуксимаб, ніж для клітин, інкубованих з HHl (Фіг. 2). Таблиці 3 та 4 вказують на те, що мічені радіоактивним ізотопом HHl насичають антиген швидче та при більш низької концентрації антитіл, ніж ритуксимаб. Неспецифічне зв'язування, схоже, є подібним для двох радіоімунокон'югатів (IC), та підвищується з підвищенням концентрації RIC у середовищі. 177 Максимальна кількість специфічно пов'язаного Lu була приблизно вдвічі вищою для ритуксимабу, ніж для HHl. Однак, при дозуванні у 1 г/мл, не було майже ніяких відмінностей у кількості специфічно прив'язаних радіоактивних атомів. 177 Експеримент II: Двохгодинне інкубування з Lu-IgG: результати зростання клітин. Клітини Daudi інкубували з радіоімунокон'югатами, як у Експерименті I (Фіг. 2 A). 177 177 Зростання клітин Daudi після 2 годин інкубування з Lu-HHl або Lu - ритуксимаб вимірювали засіванням 50.000 клітин з кожної пробірки у три лунки шести 12- лункових планшетів. Наступні 14 днів кількість клітин вимірювали впродовж декількох моментів часу з застосуванням автоматичної системи візуалізації (Clone Select Imager, Gentix Ltd, Hampshire, UK). Не спостерігалося жодного впливу окремих немічених антитіл на зростання клітин. Однак, 177 блоковані клітини, оброблені Lu - антитілами, явно зростали не так швидко, як необроблені 177 контрольні клітини, що свідчить про дію на клітини незв'язаних Lu - антитіл або неспецифічно 177 зв'язаних Lu - антитіл (Фіг. 3). 177 Обробка неблокованих клітин Lu - антитілами призвела до збільшення затримки 177 зростання на 44 % для клітин, оброблених 10 мкг/мл Lu-HHl (Фіг. 3 A) та на 31 % для клітин, 177 оброблених 10 г/мл Lu -ритуксимаб (Фіг. 3 B). При обробці кількістю у 20 г/мл різниця між двома антитілами була навіть більшою, оскільки 177 відновлення зростання клітин, оброблених Lu-HHl було відсутнім. Цей результат був неочікуваним, оскільки клітини помітили тією ж кількістю антитіл (Фіг.2 A). 177 Експеримент III: 18 - годинне інкубування з Lu-IgG: результати зростання клітин. Клітини Daudi інкубували з радіоімунокон'югатами подібно до Експерименту I (Фіг. 2 B). 177 177 Зростання клітин Daudi після 18 годин інкубування з Lu-HHl або Lu -ритуксимаб вимірювали засіюванням 50.000 клітин у три лунки шести 12- лункових планшетів. Наступні 14 днів кількість клітин вимірювали впродовж декількох моментів часу з застосуванням автоматичної системи візуалізації (Clone Select Imager, Gentix Ltd, Hampshire, UK). Впливу окремо взятих немічених антитіл на зростання клітин відмічено не було. 177 Інгібування зростання клітин у блокованих клітинах, оброблених Lu - антитілами у цьому експерименті було вищім (Фіг. 4), ніж у Експерименті II (Фіг. 3) завдяки 16 годинному підвищенню часу інкубування з радіоімунокон'югатом у середовищі. 177 Обробка неблокованих клітин Lu – антитілами призвела до збільшення затримки 177 зростання на 107 % для клітин, оброблених 2.5 мг/мл Lu-HHl (Фіг. 4 A) та на 52 % для клітин, 177 оброблених 2.5 мкг/мл Lu - ритуксимаб (Фіг. 4 B). Цей результат був неочікуваним, оскільки 177 після 18 - годинного інкубування, клітини, мічені Lu -ритуксимаб мали вдвічі більшу додану 177 активність клітинного зв'язування, ніж клітини, мічені Lu-HH1 (Фіг. 2 B). Приклад 5. Біорозподілення HH1. 111 Біорозподілення In - мічених HH1 досліджували на BALB/c-nude (nu/nu) мишах з 3 ксенотрансплантатами Daudi, що мали розмір на початку досліджувань у 32-256 мм . Мічення радіоактивним ізотопом проводили з застосуванням pSCN-Bz-DOTA у якості біфункціонального хелатуючого агента, що утворює комплекс з радіонуклідом та приєднує його до антитіла (Див. Приклад 1). Препарат вводили до кожної тварини шляхом ін'єкції 100 мкл розчину у хвостову вену. Кожній тварині ввели препарат зактивністю у 120 кБк. На момент часу було застосовано 5 тварин. Розтини проводили після зсуву шийних хребців у різні моменти часу після ін'єкції. Було 111 визначено вагу кожного зразка тканини та In вимірювали за допомогою відкаліброваного 9 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гамма - детектора (Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA). Зразки ін'єкційних препаратів застосували у якості вихідних точок у процедурах вимірювання. 111 Поглинання In-HHl через 24 години після ін'єкції у мишей з ксенотрансплантатами Daudi та біорозподілення у нормальних тканинах наведено у Фіг. 5. Мічене радіоактивним ізотопом антитіло мало відповідний пухлинний таргетинг та 111 біорозподілення. Хелатор - кон'югат In-HHl показав добру стабільність in vivo. Приклад 6. Порівняння HH1 з трьома іншими анти-CD37 антитілами. Експеримент 1: антиген-блокуюча здатність анти-CD37 антитіл порівняно з міченими радіоактивним ізотопом HH1. Для перевірки, чи може взаємодія антигену HH1 бути блокованою іншими анти-CD37 антитілами, клітини Daudi блокували попереднім інкубуванням з антитілами HH1, O.N.108, IPO24 або 6D263. Клітини Daudi (2 млн./мл) інкубували протягом 15 хвилин з антитілами HH1, 125 O.N.108, IPO-24 або 6D263 (20 мг/мл), додали I - мічені HHl антитіла та ще інкубували протягом 1 години. Потім клітини центрифугували, тричі промили та підрахували значення активності у супернатанті та клітинному осаді з застосуванням рентгенівського/гамма лічильника. 125 У порівнянні з HHl блокованих клітин, приєднана фракція I - мічених HHl була на 48 %, 44 % та 51 % вищою для O.N.108, IPO-24 або 6D263 блокованих клітин, відповідно. 125 Отже, антигенне зв'язування I-HH1 краще блокувалося HHl, ніж трьома іншими антитілами, що свідчить про певні відмінності у їх взаємодії з антигеном. На закінчення треба відмітити, що HHl має значно інші антиген - зв'язувальні властивості порівняно з групою трьох інших анти-CD37 моноклональних антитіл. Експеримент II: Зв'язування антитіл з зафіксованими у парафіні зразками тканини лімфоми. Для порівняння здатності HHl та трьох комерційно наявних CD37 антитіл приєднуватися до зафіксованої тканини лімфоми, зразки біопсії від пацієнтів з лімфомою зафіксували у формаліні, закріпили у парафіні та розрізали на 10 мкм зрізи, що розмістили на предметне скло. Зразки, помічені антитілами HHl, IPO.24, ON.108 та 6D263 та ступінь мічення визначили з застосуванням анти-мишачих поіклональних антитіл кролів та забарвлення пероксидазою. Антитіла IPO.24 та ON.108 показали найсильніший рівень мічення зразків лімфоми. Мічення антитілами 6D263 було трохи слабшим. Мічення зрізів антитілами HHl було незначним. Отже, оскільки HHl не зв'язуються, на відміну від трьох інших анти-CD37 антитіл, можна зробити висновок про те, що HHl має суттєво іншу антигенну взаємодію. Експеримент III: Проточна цитометрія антитіл HHl, IPO.24, ON.108 та 6D263. Для визначення відмінностей у експресії антигену, що визначена за допомогою різних антитіл CD37 у порівнянні з HHl, клітини Daudi двічі промили середовищем RPMI 1640 з 5 % ембріональної телячої сироватки та помітили 10 мкг/м первинних антитіл HHl, IPO.24, ON.108 та 6D363 протягом 0.5 годин в льоді у 0.2 мл середовища з 10 % FCS. Потім клітини двічі промили PBS з 0.25 % FCS та FITC-міченими поліклональними антимишачими IgG Fab" 2 кролів (розведеними 1: 20) (Фіг. 6) протягом 0.5 годин в льоді. Флуоресцентність з FITC - міткою визначили випромінювання 488 - нм лазеру у проточному цитометрі. Мертві клітини та дублети усунули за допомогою прямого світлорозсіювання, бічного світлорозсіювання та сигналів йодистого пропідію. Значної мінливості між різними гістограмами FITC різних антитіл CD37 (Фіг. 6) не спостерігалося. На закінчення треба відзначити, що HHl та три інших анти-CD37 антитіла IPO.24, ON.108 та 6D363 при застосуванні проточної цитометрії дають схожі гістограми. Експеримент IV: Зв'язувальна фракція для HHl та трьох існуючих у продажу анти-CD37 антитіл. Було проведено порівняння зв'язувальної фракції HHl з O.N.108, IPO-24 або 6D263 антитілами (Santa Cruz Biotechnology) з застосуванням клітин Daudi. Клітинні суспензії, що являли собою великий надлишок антигену та складалися з 60 мільйонів клітин Daudi у 0.2 мл середовища RPMI 1640 з 5 % ембріональної телячої сироватки блокували протягом 15 хвилин з HHl, O.N.108, IPO-24 або антитілами 6D263 (500 мг/мл) для обчислення неспецифічного зв'язування антитіл. Інші паралелі були розблоковані. 125 Потім додали I - мічені антитіла HHl, O.N.108, IPO-24 або 6D263 (5-10 нг/мл) та клітини інкубували протягом 2 годин при 4 °C з обережним струшуванням. Після цього, клітини центрифугували та двічі промили PBS з 1 % FCS. Клітинний осад перенесли у скляні флакони та перелічили за допомогою гамма-лічильника. 10 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Зв'язувальну фракцію визначили у вигляді різниці у активності для неблокованих та блокованих флаконів у порівнянні з доданою активністю. Антитіла HHl показали значно більш високу зв'язувальну фракцію порівняно з іншими антитілами CD37 (Таблиця 5). На закінчення треба відзначити, що антитіла HHl показали значно вищу імунорeактивність проти живих клітин порівняно з IPO.24, ON.108 та 6D363 при аналогічному міченні антитіл радіоактивним ізотопом. Цей результат вказує на те, що HHl має суттєво іншу антигенну взаємодію, ніж три інших антитіла. Приклад 7. ДНК та амінокислотна послідовність легко- та важколанцюгових змінних регіонів. Генна та білкова послідовність змінних регіонів анти-CD37 антитіл HHl виглядає наступним чином: Послідовність гена VH aCD37 відповідно до SEQ ID NO: 1 та послідовність білка VH aCD37 відповідно до SEQ ID NO: 2. VH aCD37 gagatccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaaggta EIQLQQSGPELVKPGASVKV tcctgcaaggcttctggttactcattcactgactacaacatgtactgggtgaagcagagc SCKASGYSFTDYNMYWVKQS catggaaagagccttgagtggattggatatattgatccttacaatggtgatactacctac HGKSLEWIGYIDPYNGDTTY aaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgttgacaagtcctccagcacagccttc NQKFKGKATLTVDKSSSTAF atccatctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcccct IHLNSLTSEDSAVYYCARSP tatggtcactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca YGHYAMDYWGQGTSVTVSS Послідовність гена VL aCD37 відповідно до SEQ ID NO: 3 та послідовність білка VL aCD37 відповідно до SEQ ID NO: 4. VL aCD37 gacattgtgatgacccagtctcacaaactcttgtccacatcagtaggagacagggtcagc DIVMTQSHKLLSTSVGDRVS atcacctgcaaggccagtcaggatgtgagtactgctgtagactggtatcaacagaaacca ITCKASQDVSTAVDWYQQKP ggacaatctcctaaactactgattaactgggcatccacccggcacactggagtccctgat GQSPKLLINW ASTRHTGVPD cgcttcacaggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagtatgcaggct RFTGSGSGTDYTLTISSMQA gaagacctggcactttattactgtcgacaacattatagcactccattcacgttcggctcg EDLALYYCRQHYSTPFTFGS gggacaaagttggaaataaaa GTKLEIK Амінокислотна послідовність значно відрізняється від амінокислотної послідовності CD37 зв'язуючих антитіл AO (Heider et al., 2009). Перекривання між змінним легким ланцюгом HHl та AO дорівнює 56 %, у той час, як перекривання між змінним важким ланцюгом дорівнює 82 %. Приклад 8. Зв'язування мічених радіоактивним ізотопом HHl клітинами, насиченими ритуксимабом антитіл CD20. Пацієнти з не-ходжкінською лімфомою часто отримують ритуксимаб у якості стандартної терапії. Було б корисно, якщо б мічені радіоактивним ізотопом HHl могли бути застосовані у пацієнтів, навіть якщо вони проходять терапію з ритуксимаб. У якості моделі застосовували клітини лімфоми Daudi, що експресують обидва антигени CD20 та CD37. Клітини лімфоми Daudi (3, 3 мільйона у 0.5 мл) попередньо або спільно обробили надлишковими кількостями (100 мкг/мл ритуксимаб) протягом 5 хвилин та потім додали 1 мкг 125 125 I - мічених HHl або додали I -мічені HHl без попередньої обробки ритуксимабом. Для 125 визначення неспецифічного зв'язування I-HH1 застосували таку ж саме конфігурацію, як вказано вище, але з попередньою обробкою неміченими HHl (10 мкг/мл). Клітини інкубували протягом двох годин у PBS при кімнатній температурі, перелічили за допомогою гаммалічильника, тричі промили у 1 мл PBS, потім центрифугували та ще раз перелічили на радіоактивність клітинного зв'язування. З попередньою /спільною обробкою ритуксимабом, 26.0 % (загальне зв'язування - 27.4 % 125 мінус неспецифічне зв'язування - 1.4 %) доданого I-HH1 специфічно зв'язувалося з клітинами. 11 UA 108631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Без попередньої /спільної обробки ритуксимабом, специфічно зв'язувалося 25.5 % (26.9-1.4) (всі числові дані наведені у вигляді середнього від трьох паралельних серій). Тобто, була 125 відсутня значна різниця у зв'язуванні I-HH1, пов'язана з наявністю ритуксимаб. Попередня та спільна обробка надлишковими кількостями ритуксимаб не змінює здатність клітинного зв'язування мічених радіоактивним ізотопом HHl, отже, не в змозі блокувати доступ до антигену CD37. Це свідчить про те, що радіоімунотерапія з міченими радіоактивним ізотопом HHl може бути прийнятною для пацієнтів після або під час імунотерапії з анти-CD20 антитілами а також для пацієнтів, що не приймають ритуксимаб. Приклад 9. Обробка мишей SCID, внутрішньовенне інокульованих клітинами лімфоми Daudi 177 з застосуванням Lu-HHl. Лікування пацієнтів, що страждають на лімфому за допомогою сучасної CD20 - спрямованої радіоімунотерапії може бути проблематичним відносно пацієнтів, що попередньо приймали ритуксимаб через антигенний дрейф та можливе блокування антигену CD20. Тому, може бути більш ефективною радіоімунотерапія, що орієнтована на інші антигени. Ми отримали внутрішньовенну пухлинну модель за допомогою внутрішньовенної ін'єкції клітин лімфоми людини мишам з важким комбінованим імунодефіцитом (SCID). При внутрішньовенній інокуляції SCID мишей клітинами лімфоми Daudі, зростання цих пухлинних клітин спричинює розвиток паралічу задніх кінцівок. Експериментальним мишам SCID ввели шляхом внутрішньовенної ін'єкції 10 мільйонів 177 клітин Daudi за один тиждень перед введенням 50 або 100 мБк/кг Lu-HHl, 50 г. HHl, 50 г ритуксимаб або NaCI. Мишей перевіряли стосовно появи паралічу задніх кінцівок та втрати ваги а також кожного наступного тижня проводили підрахунок абсолютного вмісту лейкоцитів. За кінцеву точку обрали припинення наявності симптомів виживання. Для отримання мічених радіоактивним ізотопом антитіл, HHl спочатку помітили p-SCN-Bn-DOTA та очистили. Після 177 заміни буферу, до DOTA-HH1 додали Lu-HHl (Perkin Elmer, Boston, Ma, USA) та суміш струшували протягом 40 хв. при 40 °C. Питома активність для кінцевого продукту дорівнювала приблизно 3200 мБк/мкг. Кожен препарат розчинили у ізотонічному фізіологічному розчині до загального обсягу ін'єкції у 100 мкл на тварину. Середнє безсимптомне виживання сягало 26 днів (діапазон 21 – 33 дня) для фізіологічного розчину, 40 днів (діапазон 23-44) для HHl та 40 днів (діапазон 33-44) для ритуксимаб (Фіг. 8). 177 80 % тварин були живі через 79 днів після введення Lu-HHl (50 кБк /г). Дві миші у групі тварин, яким ввели 100 кБк /г померли перед будь-якою твариною у групах з фізіологічним розчином та підрахунок клітин крові показав радіотоксичність. Третя тварина з групи 100 кБк /г померла на 49 день. Інші тварини (70 %) залишалися живими на 79 день. Виживання мишей, оброблених 177 Lu-HHl було значно вищим, ніж виживання мишей, оброблених NaCI, HHl або ритуксимаб (p