Трансгенна рослина, яка продукує білки cry1ab і vip3ab для запобігання розвитку стійкості у комахи совки бавовняної

Є ще 19 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Трансгенна рослина кукурудзи або сої для застосування для запобігання розвитку стійкості до білка Cry у комахи совки бавовняної (Helicoverpa zea), яка включає ДНК, що кодує інсектицидний білок Vip3Ab, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Ab, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab містить SEQ ID NO:2, і де вказаний інсектицидний білок Vip3Ab містить SEQ ID NO:1, і вказаний Cry1Ab і вказаний Vip3Ab не мають однакові сайти зв’язування в кишечнику совки бавовняної.

2. Насіння трансгенної рослини за п. 1, де вказане насіння містить ДНК, яка кодує вказаний інсектицидний білок Vip3Ab, і ДНК, яка кодує вказаний інсектицидний білок Cry1Ab, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab містить SEQ ID NO:2, і де вказаний інсектицидний білок Vip3Ab містить SEQ ID NO:1.

3. Суміш насіння, яка включає резерватне насіння від не-Bt-резерватних рослин і множину насіння за п. 2, де вказане резерватне насіння складає менше 40 % від усього насіння у суміші.

4. Суміш насіння за п. 3, у якій вказане резерватне насіння складає менше 30 % від усього насіння у суміші.

5. Суміш насіння за п. 3, у якій вказане резерватне насіння складає менше 20 % від усього насіння у суміші.

6. Суміш насіння за п. 3, у якій вказане резерватне насіння складає менше 10 % від усього насіння у суміші.

7. Суміш насіння за п. 3, у якій вказане резерватне насіння складає менше 5 % від усього насіння у суміші.

8. Спосіб регулювання розвитку стійкості в комах Helicoverpa zea до інсектицидного білка, одержуваного з Bacillus thuringiensis, причому вказаний спосіб включає сіяння насіння для одержання сукупності рослин, які включають не-Bt-резерватні рослини і множину рослин за п. 1, де вказане резерватне насіння складає менше 40 % від усіх рослин сільськогосподарських культур на вказаному полі, і контактування вказаних комах Helicoverpa zea з вказаною сукупністю рослин.

9. Композиція для боротьби з комахами Helicoverpa zea, які є стійкими до білка Cry, причому вказана композиція включає клітини рослини за п. 1, що експресують ефективну кількість як інсектицидного білка Cry1Ab, так і інсектицидного білка Vip3Ab, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab містить SEQ ID NO:2, і де вказаний інсектицидний білок Vip3Ab містить SEQ ID NO:1.

10. Спосіб боротьби з комахами Helicoverpa zea, які є стійкими до білка Cry, причому вказаний спосіб включає надання вказаним комахам ефективної кількості композиції за п. 9.

11. Трансгенна рослина за п. 1, у якій вказана рослина є рослиною кукурудзи.

12. Рослинна клітина рослини за п. 1, яка включає ДНК, що кодує інсектицидний білок Vip3Ab, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Ab, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab містить SEQ ID NO:2, і де вказаний інсектицидний білок Vip3Ab містить SEQ ID NO:1.

Текст

Реферат: UA 114596 C2 (12) UA 114596 C2 Винахід належить до трансгенної рослини, яка продукує інсектицидно активний білок Cry1Aa і інсектицидно активний білок Vip3Ab, де зазначений інсектицидно активний білок Cry1Aa і інсектицидно активний білок Vip3Ab мають різні сайти зв'язування рецепторів в кишечнику совки бавовняної (Helicoverpa zea). Комбінації Сrу1Аа і Vip3Ab можуть використовуватися для запобігання розвитку стійкості (до будь-якої системи інсектицидного білка окремо) у популяції совки бавовняної (Helicoverpa zea). UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Попередній рівень техніки Кукурудзу вирощують для застосування в їжу й одержання енергії. Вирощують також багато інших сільськогосподарських культур, включаючи сою і бавовну. Комахи поїдають і пошкоджують рослини і, таким чином, підривають ці зусилля людини. Мільярди доларів витрачаються щороку для боротьби з комахами-шкідниками і ще мільярди втрачаються зі збитком, який вони наносять. Основними засобами, застосовуваними для боротьби з комахамишкідниками, є синтетичні органічні хімічні інсектициди, але в деяких регіонах важливу роль відіграють біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, одержувані з Bacillus thuringiensis (Bt). Здатність одержувати стійкі до комах рослини шляхом транформації генами з Bt, які експресують інсектицидні білки, докорінно змінила сучасне сільське господарство і підвищила важливість і значення інсектицидних білків і експресуючих їх генів. Кілька білків з Bt застосовували для створення стійких до комах трансгенних рослин, що на даний момент успішно зареєстровані і комерціалізовані. Ці білки включають Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F і Cry3Bb у кукурудзі, Cry1Ac і Cry2Ab у бавовні і Cry3A у картоплі. Комерційні продукти, що виробляють ці білки, виробляють єдиний білок крім випадків, коли бажаний об'єднаний інсектицидний спектр із 2 білків (наприклад, Cry1Ab і Cry3Bb об'єднані в кукурудзі для додавання стійкості до лускокрилих шкідників і личинок, що пошкоджують коріння, відповідно) або коли незалежна дія білків робить їх корисними як засіб для затримки розвитку стійкості в сприйнятливих популяцій комах (наприклад, Cry1Ac і Cry2Ab у бавовні, об'єднані для забезпечення регулювання розвитку стійкості в тютюнового брунькоїда). Див. також патент США 2009 0313717, що стосується білка Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F або Cry1A для боротьби з Helicoverpa zea або armigera. WO 2009 132850 стосується Cry1F або Cry1A і Vip3Aa для боротьби з Spodoptera frugiperda. Патент США 2008 0311096 стосується частково Cry1Ab для боротьби з Cry1F-стійким ECB. Таким чином, деякі якості трансгенних рослин, які мають стійкість до комах, що привели до швидкого і широко поширеного впровадження цієї технології, також створило проблему того, що популяції шкідників розвивають стійкість до інсектицидних білків, що виробляються цими рослинами. Було запропоновано кілька стратегій для збереження корисності ознак стійкості до комах, основаних на Bt, що включають застосування білків у великій дозі в комбінації з резерватами, і зміна за допомогою або спільне застосування різних токсинів (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management" Nature Biotechnol. 16:144-146). Необхідно, щоб білки, вибрані для застосування в IRM стеку, виявляли свої інсектицидні дії незалежно так, щоб стійкість, вироблена до одного білка, не додавала стійкості до другого білка (тобто відсутність перехресної стійкості до білків). Якщо, наприклад, популяція шкідника, вибрана по стійкості до "білка А", була б чутливою до "білка Б", можна було б зробити висновок, що перехресної стійкості немає і, що комбінація білка A і білка Б буде ефективною для затримки розвитку стійкості до білка А окремо. Під час відсутності стійких популяцій комах, можна робити оцінки на основі інших характеристик, що, як передбачається, зв'язані з механізмом дії і потенціалом перехресної стійкості. Запропоновано можливість ідентифікації інсектицидних білків, швидше за все не виявляють перехресної стійкості, шляхом рецептор-опосередкованого зв'язування (van Mellaert et al. 1999). Ключовим показником недоліку перехресної стійкості, властивому цьому підходу, є те, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори в чутливих видів комах. У випадку, коли два Bt токсини конкурують за той самий рецептор, то якщо цей рецептор мутує у цієї комахи так, що один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором і, таким чином, більше не є інсектицидним відносно комахи, може статися так, що комаха також буде стійкою до другого токсину (який вибірково зв'язується з тим же самим рецептором). Таким чином, говорять, що комаха має перехресну стійкість до обох Bt токсинів. Однак, якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, це може вказувати на те, що комаха не є стійкою одночасно до цих двох токсинів. Cry1Fa корисний у боротьбі з багатьма видами лускокрилих шкідників, включаючи метелика кукурудзяного (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) і совку трав'яну (FAW; Spodoptera frugiperda) і активний проти точильника стебел цукрової тростини (SCB; Diatraea saccharalis). Білок Cry1Fa, що утворюється в рослинах кукурудзи, що містить фрагмент TC1507, відповідає за провідну для промисловості ознаку стійкості до комах для боротьби з FAW. Cry1Fa додатково застосовується в продуктах Herculex®, SmartStax™ і WideStrike™. Додаткові Cry токсини перераховані на веб-сайті офіційного комітету зі специфікації B.t. (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В даний час існує майже 60 головних груп токсинів "Cry" (Cry1-Cry59) з додатковими Cyt-токсинами і VIP-токсинами і т. п. 1 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Багато з кожної числової групи містять підгрупи з великою літерою, і підгрупи з великою літерою містять підпідгрупи з малими літерами. (Cry1 містить A-L, і Cry1A містить a-i, наприклад). Суть даного винаходу Розглянутий винахід частково стосується відкриття того, що Vip3Ab і Cry1Ab не конкурують один з одним за зв'язування з рецепторами кишечнику в Heticoverpa zea (совка бавовняна; CEW). Розглянутий винахід також стосується частково дивного відкриття того, що Vip3Ab є активним проти капустяної молі (DBM), що стійка до Cry1Ab. Як буде зрозуміло фахівцю в галузі техніки, сприятливий ефект цього розкриття, полягає в тому, що рослини, експресуючі Vip3Ab і Cry1Ab, або їх інсектицидні частини, будуть корисними для затримки або запобігання розвитку стійкості до кожного з цих інсектицидних білків окремо. Таким чином, розглянутий винахід має відношення частково до застосування білка Vip3Ab у комбінації з білком Cry1Ab. Рослини (і площа землі в акрах, засаджена такими рослинами), що виробляють Vip3Ab плюс Cry1Ab, включені в об'єм розглянутого винаходу. Розглянутий винахід також має відношення частково до потрійних стоків або "пірамід" із трьох (або більше) токсинів з Vip3Ab і Cry1Ab як основної пари. Такі потрійні стеки можуть забезпечувати три білки, чинячи неконкурентну дію проти CEW. Це може допомогти додатково знизити або позбавити від необхідності створення площі насаджень резерватних рослин. Короткий опис креслень Фіг. 1. Реакція на смертельну дозу повнорозмірного Vip3Ab1 у личинок Plutella xylostella (Linnaeus) (DBM) і стійкого до Cry1A Plutella xylostella (rDBM), Heliothis zea (CEW), Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), (FAW) і Ostrinia nubilalis (Hubner), (ECB), коли очищений токсин застосовували місцево до штучної їжі комахи. Летальність у відсотках основана на спостереженні за 8 комахами для кожної дози через 5 днів після експонування токсину. Фіг. 2. Реакція на дози інгібування росту повнорозмірного Vip3Ab1 у личинок Plutella xylostella (Linnaeus) (DBM) і стійкого до Cry1A Plutella xylostella (rDBM), Heliothis zea (CEW), Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), (FAW) і Ostrinia nubilalis (Hubner), (ECB), коли очищений токсин застосовували місцево до штучної їжі комахи. Інгібування росту у відсотках основане на порівнянні середньої ваги 8 личинок, оброблених тільки буфером, до ваги личинок, експонованих до дії токсину протягом 5 днів. 125 Фіг. 3. Криві конкурентного заміщення при зв'язуванні I Cry1Ab з білком з BBMV, 125 отриманим з H. zea. Концентрація білка з BBMV складала 0,10 мг білка/мл і концентрація I 125 Cry1Ab складала 0,25 нМ. 100 % специфічне зв'язування I Cry1Ab вимірювали як загальне зв'язування під час відсутності немаркованого Cry1Ab мінус неспецифічне зв'язування, вимірюване в присутності 500 нМ Cry1Ab. Vip3Ab1 тестували в таких високих концентраціях як 1000 нМ (у 4000 разів вище, ніж мічений радіоактивним ізотопом заміщувальний ліганд), і він не 125 125 витісняв зв'язаний I Cry1Ab. Немічений радіоактивним ізотопом ліганд заміщував I Cry1Ab на 50 % при концентрації приблизно 2 нМ. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO:1 являє собою повнорозмірний білок Vip3Ab, що, як використовувалося в дослідженнях зв'язування, обробляли трипсином до корового фрагмента (залишки 200-788). SEQ ID NO:2 являє собою повнорозмірний білок Cry1Ab, що, як використовувалося в дослідженнях зв'язування, обробляли трипсином до корового фрагмента (залишки 29-612). Докладний опис даного винаходу Розглянутий винахід частково підтримується відкриттям того, що Vip3Ab і Cry1Ab не конкурують один з одним за зв'язування з рецепторами в кишечнику в Helicoverpa zea (совка бавовняна; CEW). Розглянутий винахід включає застосування Vip3Ab і Cry1Ab для захисту кукурудзи й інших економічно важливих видів рослин від пошкодження і втрати врожаю, що викликаються поїданням CEW, і запобігання розвитку в популяцій CEW стійкості до кожного з цих білків. Даний винахід описує композиції для боротьби з лускокрилими шкідниками, що включають клітини, які виробляють коровий токсиновмісний білок Cry1Ab і коровий токсиновмісний білок Vip3Ab. Даний винахід додатково включає хазяїна, трансформованого для вироблення як інсектицидного білка Cry1Ab, так і інсектицидного білка Vip3Ab, де вказаний хазяїн є мікроорганізмом або рослинною клітиною. У деяких варіантах здійснення даного винаходу рослинні клітини є нерозмножуваними/нетотипотентними клітинами. Розглянутий полінуклеотид(и) у генетичній конструкції, переважно, знаходиться під контролем (функціонально зв'язаний з/що включає) промотору не з Bacillus thuringiensis. Розглянуті полінуклеотиди можуть включати кодон рослин для посиленої експресії в рослині. 2 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Додатково передбачається, що даний винахід забезпечує спосіб боротьби з лускокрилими шкідниками, що включає приведення в контакт вказаних шкідників або середовища вказаних шкідників з ефективною кількістю композиції, що містить коровий токсиновмісний білок Cry1Ab і додатково містить коровий токсиновмісний білок Vip3Ab. Варіант здійснення даного винаходу включає рослину кукурудзи, що містить експресуючий у рослині ген, що кодує коровий токсиновмісний білок Vip3Ab, і експресуючий у рослині ген, що кодує коровий токсиновмісний білок Cry1Ab, і насіння такої рослини. Додатковий варіант здійснення даного винаходу включає рослину кукурудзи, де в вказану рослину кукурудзи і насіння такої рослини введений експресуючий у рослині ген, що кодує коровий токсиновмісний білок Vip3Ab, і експресуючий у рослині ген, що кодує коровий токсиновмісний білок Cry1Ab. Як описано в прикладах, дослідження конкурентного зв'язування з рецептором із застосуванням міченого радіоактивним ізотопом білка Cry1Ab показують, що коровий токсиновмісний білок Cry1Ab не конкурує за зв'язування в тканинах комахи CEW з рецептором, з якими зв'язується Vip3Ab. Ці результати також указують на те, що комбінація білків Cry1Ab і Vip3Ab являє собою ефективний засіб для зниження розвитку стійкості до Cry1Ab у популяцій CEW (і аналогічно, розвитку стійкості до Vip3Ab), і, імовірно, збільшує рівень стійкості до цього шкідника в рослин кукурудзи, що виробляють обидва білки. Таким чином, частково на основі даних, приведених у даному описі, вважається, що спільне вироблення (стекування) білків Vip3Ab і Cry1Ab, може бути застосовано для одержання великої дози стека IRM для CEW. До цієї пари можуть бути додані інші білки для розширення спектра боротьби з комахами. Іншим варіантом застосування може бути застосування білків Cry1Ab і Vip3Ab у комбінації з іншим, третім токсином/геном, і застосування цього потрійного стека для зниження розвитку стійкості до кожного з цих токсинів у CEW. Таким чином, інший варіант застосування розглянутого винаходу полягає в тому, щоб застосовувати два, три або більше білки в регіонах, де вирощують сільськогосподарські культури, де в CEW можуть розвиватися стійкі популяції. Відповідно, розглянутий винахід також частково має відношення до потрійних стеків або "пірамід" із трьох (або більше) токсинів з токсинами Cry1Ab і Vip3Ab, що представляють собою основну пару. У деяких кращих варіантах здійснення пірамід, обрані білки забезпечують неконкурентну дію проти CEW. Рослини (і територія, засаджена такими рослинами), що виробляють кожну з розглянутих комбінацій білків, включені в об'єм розглянутого винаходу. Також можуть бути додані додаткові токсини/гени, але конкретні стеки, розглянуті вище з перевагою і на подив забезпечують багато способів дії проти CEW. Це може сприяти зниженню або відмові від необхідності виділення площі сільськогосподарської землі під резерватні рослини. Поле, засаджене в такий спосіб на площі більше 10 акрів, таким чином, включено в об'єм розглянутого винаходу. GENBANK також може бути застосований для одержання послідовностей для кожного з генів і білків, розкритих або вказаних у даному описі. Комбінації білків, описаних у даному описі, можуть бути застосовані для боротьби з лускокрилими шкідниками. Дорослі лускокрилі, наприклад, метелики і метелі, головним чином харчуються нектаром квіток і є важливим фактором запилення. Майже усі личинки лускокрилих, тобто гусениці, харчуються рослинами, і багато з них є серйозними шкідниками. Гусениці харчуються на або усередині листя або на коренях або стеблі рослини, лишаю рослини живильних речовин і часто руйнуючи структуру фізичної опори рослини. Додатково, гусениці харчуються плодами, тканинами і запасами зерна і борошном, роблячи неможливим продаж цих продуктів або сильно знижуючи їхню вартість. Як застосовано в даному описі, посилання на лускокрилих шкідників стосуються різних стадій життєвого циклу шкідника, включаючи личинкові стадії. Деякі химерні токсини по розглянутому винаходу включають повністю N-кінцеву частину корового Bt токсину і, у деякій точці після кінця корової частини токсину білок має перехід до гетерологічної послідовності протоксину. N-кінцева, інсектицидно активна токсинова частина Bt токсину вказана як "коровий" токсин. Перехід від сегмента корового токсину до сегмента гетерологічного протоксину може зустрітися приблизно в області з'єднання токсину/протоксину або, альтернативно, частини нативного протоксину (що простягається через частину корового токсину) може бути збережена з переходом до гетерологічної частини протоксину, що має місце нижче. Як приклад, один химерний токсин розглянутого винаходу, являє собою цілу частину корового токсину Cry1Ab (приблизно перші 600 амінокислот) і гетерологічний протоксин (залишок від молекули до C-кінця). В одному переважному варіанті здійснення частину химерного токсину, що включає протоксин, одержують з іншого Cry1Ab білкового токсину. 3 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фахівцю в галузі техніки буде зрозуміло, що Bt токсини, навіть у межах визначеного класу, такого як Cry1A, змінюються до деякої міри в довжині і точному розташуванні переходу від частини корового токсину до частини протоксину. Як правило, токсини Cry1Ab містять від приблизно 1150 до приблизно 1200 амінокислот у довжину. Перехід від частини корового токсину до частини протоксину, як правило, зустрічається між приблизно 50 % і приблизно 60 % загальної довжини токсину. Химерний токсин розглянутого винаходу включає всю довжину цієї N-кінцевої частини корового токсину. Таким чином, химерний токсин включає щонайменше приблизно 50 % загальної довжини Cry1Ab Bt білкового токсину. Це, як правило, являє собою щонайменше приблизно 590 амінокислот. Відносно частини протоксину загальна довжина частини протоксину Cry1Ab складає від кінця частини корового токсину до C-кінця молекули. Гени і токсини. Гени і токсини, корисні відповідно до розглянутого винаходу, включають не тільки повнорозмірні розкриті послідовності, але також і фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутантні і зшиті білки, що зберігають характерну пестицидну дію токсинів, конкретно проілюстрованих у даному описі. Як застосовано в даному описі, терміни "варіанти" або "варіації" генів стосуються нуклеотидних послідовностей, що кодують ті ж самі токсини або кодують еквівалентні токсини, що мають пестицидну дію. Як застосовано в даному описі, термін "еквівалентні токсини" стосується токсинів, що мають ту же саму або по суті ту ж саму біологічну активність проти цільових шкідників як патентовані токсини. Як застосовано в даному описі, граничні значення складають приблизно 95 % (Cry1Ab і Vip3Ab's), 78 % (Cry1F і Vip3A's) і 45 % (Cry1’s і Vip3’s) ідентичності послідовності по "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins" N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum і D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998), тім 62: 807-813. Ці фрагменти також можуть бути застосовані тільки до корових токсинів (для Cry1Ab, наприклад). Білки для застосування відповідно до розглянутого винаходу можуть бути, наприклад, щонайменше на 75 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % (і будь-яке цілочислове збільшення в межах цього діапазону) ідентична (ідентичність по амінокислотах) білка, приведеного як приклад, або специфічно запропонованого в даному описі. Вони включають білки, кодовані полінуклеотидами/ДНК, застосовуваними відповідно до розглянутого винаходу. Фахівцю в галузі техніки буде зрозуміло, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані й отримані декількома шляхами. Конкретні гени або частини генів, приведені в даному описі як приклад, можуть бути отримані з ізолятів, депонованих у депозитарії культур. Ці гени або їх частини або варіанти також можуть бути отримані синтетичними шляхом, наприклад, за допомогою генного синтезатора. Варіації генів можуть бути легко отримані з застосуванням стандартних способів точкової мутації. Крім того, фрагменти цих генів можуть бути отримані з застосуванням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз стандартними способами. Наприклад, для систематичного відрізання нуклеотидів на кінцях цих генів можуть бути застосовані ферменти, такі як Bal31, або сайт-направлений мутагенез. Гени, що кодують активні фрагменти, також можуть бути отримані із застосуванням множини рестрикційних ферментів. Для прямого одержання активних фрагментів цих білкових токсинів можуть бути застосовані протеази. Фрагменти й еквіваленти, що зберігають пестицидну дію токсинів, приведених як приклад, входять в об'єм розглянутого винаходу. Крім того, завдяки надмірності генетичного коду багато різних послідовностей ДНК можуть кодувати послідовності амінокислот, розкритих у даному описі. Фахівець в галузі техніки з легкістю може одержати ці альтернативні послідовності ДНК, що кодують такі ж або по суті такі ж токсини. Ці різні послідовності ДНК входять в об'єм розглянутого винаходу. Як застосовано в даному описі, посилання на "по суті таку ж" послідовність стосується послідовностей, що містять заміни, видалення, додавання або вставки амінокислот, що фактично не впливають на пестицидну дію. Фрагменти генів, що кодують білки, які зберігають пестицидну дію, також включені в це визначення. Додатковим способом ідентифікації генів, що кодують токсини, і частини генів, корисні відповідно до розглянутого винаходу, є застосування олігонуклеотидних зондів. Ці зонди являють собою що виявляються нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можуть бути виявлені по відповідній мітці або можуть бути створені флуоресцентними по своїй природі, як описано в міжнародній заявці № WO93/16094. Як відомо в галузі техніки, якщо тест-молекула і контрольна нуклеїнова кислота гібридизують шляхом утворення міцного зв'язку між цими двома молекулами, можна обґрунтовано припускати, що тест-молекула і контрольна нуклеїнова кислота істотно гомологічні. Переважно, гібридизація проводиться в жорстких умовах способами, відомими в галузі техніки, як описано, наприклад, у Keller, G.H., М.М. Manak (1987) LNA Probes, Stockton Press, Нью Йорк, N.Y., стор. 169-170. Деякі приклади комбінацій 4 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 концентрації солі і температури приведені далі (у порядку збільшення твердості умов): 2X SSPE або SSC при кімнатній температурі; 1X SSPE або SSC при 42 °C; 0,1Х SSPE або SSC при 42 °C; 0,1X SSPE або SSC при 65 °C. Виявлення тест-молекули забезпечує засіб для визначення того, чи відбулася гібридизація. Такий зондовий аналіз забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів, що кодують токсини по розглянутому винаходу. Нуклеотидні сегменти, застосовувані як тестмолекули згідно із даним винаходом, можуть бути синтезовані за допомогою ДНК синтезатора і стандартних способів. Ці нуклеотидні послідовності також можуть бути застосовані як праймери ПЛР для ампліфікації генів по розглянутому винаходу. Варіанти токсинів. Зокрема, для приклада в даному описі приведені визначені токсини по розглянутому винаходу. Оскільки ці токсини є типовими для токсинів по розглянутому винаходу, відразу повинно бути очевидно, що розглянутий винахід включає варіанти токсинів або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають таку ж або схожу пестицидну дію з дією токсину, приведеного для приклада. Еквівалентні токсини будуть гомологічні по амінокислотах токсину, приведеного для прикладу. Ця амінокислотна гомологічність, як правило, складає більше 75 %, переважно, більш 90 % і найбільш переважно, більше 95 %. Амінокислотна гомологічність є найвищою в критичних частинах токсину, що відповідають за біологічну активність або залучені до створення тривимірної конфігурації, що, у кінцевому рахунку, відповідає за біологічну активність. У цьому відношенні визначені заміни амінокислот прийнятні і можуть бути очікувані, якщо ці заміни знаходяться в частинах, що не є критично важливими відносно активності або є консервативними замінами амінокислот, що не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можуть бути класифіковані в такий спосіб: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислотні. Консервативні заміни, при яких амінокислота одного класу заміняється іншою амінокислотою того ж типу, входять в об'єм розглянутого винаходу, якщо при цьому заміна фактично не змінює біологічну активність сполуки. Нижче приведений список прикладів амінокислот, що належать кожному класу. Клас амінокислоти Неполярні Незаряджені полярні Кислотні Основні 30 35 40 45 50 55 Приклади амінокислоти Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Asp, Glu Lys, Arg, His У деяких випадках також можуть бути зроблені неконсервативні заміни. Критичним фактором є те, що ці заміни не повинні значно порушувати біологічну активність токсину. Рекомбінантні хазяїни. Гени, що кодують токсини по розглянутому винаходу, можуть бути введені великій різноманітності рослин-хазяїнів або мікроорганізмів-хазяїнів. Експресія токсинового гена приводить прямо або опосередковано до внутрішньоклітинного утворення і збереження пестициду. Кон'югаційне перенесення і рекомбінантне перенесення можуть бути застосовані для одержання штаму Bt, що виробляє обидва токсини по розглянутому винаходу. Інші організми-хазяїни також можуть бути модифіковані одним або обома токсиновими генами і потім застосовані для здійснення синергічної дії. З прийнятними мікроорганізмами-хазяїнами, наприклад, Pseudomonas, мікроорганізми можуть бути застосовані до місця перебування шкідника, де вони будуть поширюватися і потрапляти усередину шкідника. Результатом є боротьба зі шкідником. Альтернативно, мікроорганізм-хазяїн токсинового гена можна обробляти в умовах, що продовжують дію токсину і стабілізують клітину. Потім оброблена клітина, що зберігає токсичну дію, може бути застосована до середовища цільового шкідника. У випадках, коли в мікроорганізм-хазяїн уводять Bt токсиновий ген за допомогою прийнятного вектора, і вказаний мікроорганізм-хазяїн застосовують до середовища в живому стані, необхідно застосування визначених мікроорганізмів-хазяїнів. Вибирають такі мікроорганізми-хазяїни, про які відомо, що вони займають "фітосферу" (філоплану, філосферу, прикореневу зону і/або ризоплану) однієї або більше сільськогосподарських культур, які представляють інтерес. Ці мікроорганізми вибирають так, щоб вони були здатні успішно конкурувати в конкретному навколишньому середовищі (сільськогосподарська культура й інші середовища проживання комахи) з мікроорганізмами дикого типу, забезпечувати стійке збереження й експресію гена, експресуючого поліпептидний пестицид, і, за бажанням, забезпечувати поліпшений захист пестициду від розкладання й інактивації в навколишньому середовищі. Відомо, що велика кількість мікроорганізмів населяє філоплану (поверхню листя рослини) і/або прикореневу зону (ґрунт, що оточує корені рослини) великої різноманітності важливих 5 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сільськогосподарських культур. Ці мікроорганізми включають бактерії, водорості і гриби. Особливий інтерес представляють мікроорганізми, такі як бактерії, наприклад, роду Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc і Alcaligenes; гриби, зокрема, дріжджі, наприклад, роду Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula і Aureobasidium. Особливий інтерес представляють такі види фітосферних бактерій, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus і Azotobacter vinlandii; і види фітосферних дріжджів, такі як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. Зокрема, цікаві пігментовані мікроорганізми. Існує велика різноманітність способів для введення Bt гена, що кодує токсин у мікроорганізмі-хазяїні при умовах, що дозволяють стійке збереження й експресію гена. Ці способи відомі фахівцям в галузі техніки й описані, наприклад, у патенті США № 5135867, включеному в даний опис за допомогою посилання. Обробка клітин. Bacillus thuringiensis або рекомбінантні клітини, що утворюють Bt токсини, можна обробляти так, щоб продовжити дію токсину і стабілізувати клітину. Утворена пестицидна мікрокапсула включає Bt токсин або токсини усередині стабілізованої клітинної структури, що захищає токсин, коли мікрокапсулу застосовують до середовища проживання цільового шкідника. Прийнятні клітини-хазяїни можуть включати як прокаріотів, так і еукаріотів, звичайно обмежуючи тими клітинами, що не утворюють токсичні речовини для вищих організмів, таких як ссавці. Однак, організми, які утворюють токсичні речовини для вищих організмів, можуть бути застосовані, у випадку, коли токсичні речовини нестійкі або норма внесення є досить низкою, такою, щоб виключити будь-яку можливість токсичності для ссавцяхазяїна. Як хазяїни особливо цікаві прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби. Клітина, як правило, є інтактною і під час обробки знаходиться по суті в проліферативній фазі, а не у фазі спори, хоча в деяких випадках спори можуть бути застосовані. Обробка мікробної клітини, наприклад, мікроорганізму, що містить ген або гени B.t. токсину, може бути здійснена хімічними або фізичними засобами або комбінацією хімічних і/або фізичних засобів, у випадку, якщо цей спосіб не має шкідливого впливу на властивості токсину і не знижує здатність клітини захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галоїдуючі агенти, зокрема, галогени з атомним номером 17-80. Більш конкретно, для досягнення бажаних результатів може бути застосований йод у м'яких умовах і протягом достатньої кількості часу. Інші прийнятні способи включають обробку альдегідами, такими як глютаральдегід; протиінфекційними засобами, такими як хлорид зефірану і хлорид цетилпіридинію; спиртами, такими як ізопропіловий і етиловий спирти; різними гістологічними фіксаторами, такими як йодний розчин Люголю, фіксатор Буена, різні кислоти і фіксатор Хеллі (див. Humason, Gretchen L., Animal tissue techniques, W.H. Freeman and Company, 1967); або комбінацією фізичних (висока температура) і хімічних агентів, що зберігають і продовжують дію токсину, що утворюється в клітині, коли клітину вносять у середовище проживання хазяїна. Прикладами фізичних агентів є короткохвильова радіація, така як гамма-випромінювання і рентгенівське випромінювання, заморожування, УФ випромінювання, ліофілізація і т. п. Способи обробки мікробних клітин розкриті в патентах США №№ 4695455 і 4695462, включених у даний опис за допомогою посилання. Загалом, клітини будуть мати підвищену структурну стійкість, що збільшить стійкість до факторів навколишнього середовища. Коли пестицид знаходиться у вигляді проформи, спосіб обробки клітини необхідно вибирати так, щоб не інгібувати переведення проформи в підсумкову форму пестициду цільовим патогенним організмом шкідника. Наприклад, формальдегід зшиває білки і може інгібувати трансформацію проформи поліпептидного пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати щонайменше істотну частку біодоступності або біоактивність токсину. Характеристики, що представляють особливий інтерес при відборі клітини-хазяїна з метою одержання включають легкість уведення B.t. або гена генів хазяїну, придатність систем експресії, ефективність експресії, стійкість пестициду в хазяїні і наявність допоміжних спадкоємних характеристик. Характеристики, які представляють інтерес, при застосуванні як пестицидної мікрокапсули включають захисні властивості для пестициду, такі як товстостінність клітинних оболонок, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або утворення тілець-включень; виживаність у водних середовищах; низька токсичність для ссавців; привабливість для заковтування шкідниками; легкість знищення і фіксації без пошкодження токсину; і т. п. Інші 6 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 прийняті до розгляду фактори включають легкість при складанні в композицію і поводженні, економічність, стійкість при збереженні і т. п. Ріст клітин. Хазяїн клітини, що містить B.t. інсектицидний ген або гени, може бути вирощений у будь-якому зручному поживному середовищі, в якому конструкт ДНК забезпечує селективну перевагу, забезпечуючи селективне поживне таке середовище чином, щоб істотно всі або всі клітини зберігали B.t. ген. Потім ці клітини можна збирати відповідно до традиційних способів. Альтернативно, клітини можна обробляти до їх збирання. B.t. клітини, що виробляють токсини за даним винаходом можуть бути культивовані із застосуванням стандартних в галузі техніки середовища і способів ферментації. По завершенню циклу ферментації бактерії можуть бути зібрані шляхом початкового відділення B.t. спор і кристалів від ферментативного бульйону засобами, відомими в галузі техніки. Виділені B.t. спори і кристали можуть бути складені в композицію у вигляді змочуваного порошку, рідкого концентрату, гранул або у вигляді інших композицій шляхом додавання поверхнево-активних речовин, диспергуючих агентів, інертних носіїв і інших компонентів для полегшення поводження з ними і застосування відносно конкретних цільових шкідників. Усі ці композиції і способи застосування відомі в галузі техніки. Композиції. Складені в композицію приманні гранули, що містять атрактант і спори, кристали і токсини ізолятів B.t., або рекомбінантні мікроорганізми, що включають гени, одержувані з ізолятів B.t., розкритих у даному описі, можуть бути застосовані до ґрунту. Складений у композицію продукт також може бути застосований як покриття для насіння або обробки кореня або обробки всієї рослини на більш пізніх стадіях циклу розвитку сільськогосподарської культури. Обробка рослини і ґрунту клітинами B.t. може бути здійснена у вигляді змочуваних порошків, гранул або пудр шляхом змішування з різними інертними матеріалами, такими як неорганічні мінерали (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і т. п.) або рослинні матеріали (стерті кукурудзяні качани, рисове лушпиння, шкарлупа волоського горіха і т. п.). Композиції можуть включати допоміжні агенти, що поліпшують розтікання-зв'язування, стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі композиції можуть бути водними або неводними і можуть бути застосовані у вигляді пін, гелів, суспензій, емульгованих концентратів і т. п. Інгредієнти можуть включати реологічні агенти, поверхневоактивні речовини, емульгатори, диспергатори або полімери. Фахівцю в галузі техніки зрозуміло, що концентрація пестициду буде значно розрізнятися залежно від природи конкретної композиції, зокрема, того, або є вона концентратом чи буде застосована безпосередньо. Пестицид може складати щонайменше 1 % по масі і 100 % по масі. У сухих композиціях кількість пестициду складає приблизно 1-95 % по масі, у той час як у рідких композиціях тверда фаза в рідкій фазі складає приблизно 1-60 % по масі. Композиції, загалом, 2 4 містять приблизно від 10 до приблизно 10 клітин/мг. Ці композиції застосовують у кількості від приблизно 50 мг (рідкої або сухої) до 1 кг або більше на гектар. Композиції можуть бути застосовані до середовища проживання лускокрилого шкідника, наприклад, листя або ґрунту, шляхом розбризкування, розпилювання, обприскування і т. п. Модифікування рослин. Переважним рекомбінантним хазяїном для одержання інсектицидних білків по розглянутому винаходу є модифікована рослина. Гени, які кодують токсинові B.t. білки, як розкрито в даному описі, можуть бути введені в рослинні клітини з застосуванням множини способів, відомих в галузі техніки. Наприклад, для підготовки до введення чужорідних генів у вищі рослини доступна велика кількість клонуючих векторів, що включають систему реплікації в Escherichia Coli і маркерний ген, що дозволяє вибирати модифіковані клітини. Вектори включають серед іншого, наприклад, pBR322, ряд pUC, ряд M13mp, pACYC184. Відповідно, фрагмент ДНК, що містить послідовність, яка кодує Bt токсиновий білок, може бути введений у вектор на прийнятному сайті рестрикції. Одержувану плазміду застосовують для введення в E. coli. Клітини E. coli клітини культивують у прийнятному поживному середовищі, потім збирають і піддають лізису. Плазміду регенерують. Як методи аналізу, як правило, застосовують секвенування, рестрикційний аналіз, електрофорез і інші біохімічні методи молекулярної біології. Після кожного етапу застосована послідовність ДНК може бути розщеплена і приєднана до наступної послідовності ДНК. Кожна послідовність плазміди може бути клонована в тій ж самій або інших плазмідах. Залежно від способу введення бажаних генів у рослину можуть знадобитися інші послідовності ДНК. Якщо, наприклад, Ti- або Ri-плазміду застосовують для модифікування рослинної клітини, то щонайменше правий кінець, але часто правий і лівий кінці T-ДНК Ti- або Ri-плазміди, повинні бути з'єднані як фланкуюча область генів, що вставляються. Застосування T-ДНК для модифікування рослинних клітин інтенсивно досліджене і достатньо описане в EP 120516, Lee і 7 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986) і An et al., (1985), і широко відоме в галузі техніки. Як тільки введена ДНК інтегрується в геном рослини, вона стає відносно стійкою. Модифікуючий вектор, як правило, містить селектований маркер, що надає модифікованим рослинним клітинам стійкості до біоциду або антибіотика, такого як серед інших Біафос, Канаміцин, G418, Блеоміцин або Гігроміцин. Індивідуально застосовуваний маркерний ген повинен відповідно дозволяти вибір модифікованих клітин, а не клітин, що не містять введену ДНК. Існує велика кількість способів для введення ДНК у клітину рослини-хазяїна. Ці способи включають модифікування за допомогою T-ДНК із застосуванням Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як модифікуючого агента, злиття, ін'єкція, балістична трансфекція (бомбардування мікрочастинками) або електропорація, так само як і інші можливі способи. Якщо для модифікування застосовують Agrobacteria, то ДНК, що вводиться, необхідно клонувати у спеціальних плазмідах, а саме, і в допоміжному векторі або в бінарному векторі. Допоміжні вектори можуть бути інтегровані в Ti- або Ri-плазміду шляхом гомологічної рекомбінації в силу послідовностей, що є гомологічними послідовностям у T-ДНК. Ti- або Riплазміда також включає vir-область, необхідну для перенесення T-ДНК. Допоміжні вектори в Agrobacteria не можуть реплікуватися. Допоміжний вектор може бути перенесений у Agrobacterium tumefaciens за допомогою плазміди-помічника (кон'югація). Бінарні вектори можуть реплікуватися як у E. Coli, так і в Agrobacteria. Вони включають маркерний ген відбору і лінкер або полілінкер, що обмежені областями правої і лівої межі T-ДНК. Вони можуть бути перенесені безпосередньо в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). Agrobacterium, застосовувана як клітка-хазяїн, повинна включати плазміду, що несе vir-область. Vir-областьнеобхідні для перенесення T-ДНК у рослинну клітину. До складу може входити додаткова T-ДНК. Модифіковану в такий спосіб бактерію застосовують для модифікування рослинних клітин. Експлантати рослини з перевагою можуть бути культивовані з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes для перенесення ДНК у рослинну клітину. Потім можуть бути відтворені цілі рослини з інфікованої рослинної тканини (наприклад, частини листка, сегментів стебла, коренів, а також протопластів або культивованих у суспензії клітин) у прийнятному поживному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди для відбору. Потім рослини, одержувані таким чином, можуть бути протестовані на наявність введеної ДНК. Не пред'являється ніяких спеціальних вимог до плазмід у випадку ін'єкції і електропорації. Допускається застосування звичайних плазмід, таких як, наприклад, похідні pUC. Модифіковані клітини ростуть усередині рослин звичайним чином. Вони можуть утворювати зародкові клітини і передавати модифіковану ознаку(и) рослинам потомства. Такі рослини можуть бути вирощені звичайним чином і схрещені з рослинами, що містять такі ж модифіковані спадкоємні ознаки або інші спадкові ознаки. Одержувані в результаті гібридні рослини, мають відповідні фенотипічні ознаки. У переважному варіанті здійснення розглянутого винаходу рослини модифікують генами, у яких частота використання кодону оптимізована для рослин. Див., наприклад, патент США № 5380831, що у такий спосіб включений за допомогою посилання. Одночасно з тим, що в даному описі для прикладу приведені деякі укорочені токсини, в області дослідження B.t. відомо, що токсини з молекулярною масою 130 кДа (загальна довжина) містять половину з N-кінцем, що є коровим токсином і половину з C-кінцем, що є протоксином "хвостом". Таким чином, прийнятні "хвости" можуть бути застосовані з укороченими/коровими токсинами по розглянутому винаходу. Див., наприклад, патент США № 6218188 і патент США № 6673990. Крім того, в галузі техніки відомі способи створення синтетичних Bt генів для застосування в рослинах (Stewart and Burgin, 2007). Одним необмежуючим прикладом переважної модифікованої рослини є фертильна рослина кукурудзи, що включає експресований рослиною ген, що кодує білок Cry1Ab, і додатково включає другий експресований рослиною ген, що кодує білок Vip3Ab. Перенесення (або інтрогресія) Cry1Ab- і Vip3Ab-обумовленої ознаки(ознак) в інбредну лінію кукурудзи може бути здійснено розмноженням з рекурентною селекцією, наприклад, зворотним схрещуванням. У цьому випадку бажаного рекурентного батька спочатку схрещують з інбредною рослиною-донором (нерекурентний батько), що несе прийнятний ген(и) для Cry1F- і Vip3Ab-обумовлених ознак. Потомство від цього схрещування потім знову схрещують з рекурентним батьком з наступною селекцією в одержуваному потомстві відносно бажаної ознаки(ознак), щоб передати його від нерекурентного батька. Після трьох, переважно, чотирьох, більш переважно, п'яти або більше поколінь зворотного схрещування з рекурентним батьком і із селекцією відносно бажаної ознаки(ознак), потомство буде гетерозиготним по локусах, що відповідають за передану ознаку(и), але буде схожим на рекурентного батька по більшості або 8 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 майже всіх інших генах (див., наприклад, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4-і видання, 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Том 1: Theory and Technique, 360-376). Стратегії боротьби зі стійкістю в комах (IRM). Roush et al, наприклад, виділяє стратегії з двома токсинами, що також називаються "пірамідування" або "стекування", для вирощування інсектицидних трансгенних сільськогосподарських культур. (The Royal Society. Phil. Транс. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786). На своєму веб-сайті Управління по охороні навколишнього середовища Сполучених Штатів Америки (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) публікує наступні вимоги для створення резерватів з резерватними рослинами (тобто нев.t.) (секція неBt сільськогосподарських культур/кукурудзи) для застосування разом із трансгенними сільськогосподарськими культурами, що виробляють один Bt білок, активний проти цільових шкідників. "Конкретні структурні вимоги для продуктів Bt кукурудзи (Cry1Ab або CryIF), захищеної від кукурудзяного метелика, є наступними: Структуровані резервати: 20 % резерват Bt кукурудзи для нелускокрилих у кукурудзяному поясі; 50 % резерват Bt кукурудзи для нелускокрилих у бавовняному поясі Блоки Внутрішній (тобто, у межах B.t. поля) Зовнішній (тобто, окремі поля в межах Ѕ милі (по можливості ј милі) від Bt поля для максимізування випадкового схрещування) Смужки усередині поля Смужки повинні мати щонайменше 4 ряди в ширину (переважно, 6 рядів) для зменшення ефектів від пересування личинок» Крім того, Національна асоціація виробників кукурудзи на своєму веб-сайті: (ncga.com/insectresistance-management-fact-sheet-bt-corn) також приводить схоже керівництво щодо вимог до резерватів. Наприклад: "Вимоги для IRM кукурудзяного метелика: - щонайменше 20 % вашої території посадок кукурудзи повинні бути зайняті резерватними гібридами - В областях вирощування бавовни резервати повинні складати 50 % - Необхідно робити посадки в межах 1/2 милі від резерватних гібридів - Резерват може бути засаджений смугами в межах B.t. поля; резерватні смуги повинні мати щонайменше 4 ряди в ширину - Резерват можна обробляти одними тільки звичайними пестицидами, якщо при цьому досягається економічно вигідний ефект відносно цільової комахи - розпилювані інсектициди на основі B.t. не можна застосовувати до резерватної кукурудзи - прийнятний резерват повинний бути посаджений на кожній фермі з Bt кукурудзою» Як заявлено авторами Roush et al. (у правому стовпчику на сторінках 1780 і 1784, наприклад), стекування або пірамідування двох різних білків, кожний з який ефективний проти цільових шкідників і з невеликою або відсутністю перехресної стійкості, може дозволити застосування меншого резервату. Roush припускає, що у випадку утворення успішного стека, менше ніж 10 % резервату, може забезпечити боротьбу зі стійкістю, порівнянну з такою приблизно 50 % резервату у випадку окремої (непірамідованої) ознаки. Для доступних у даний час пірамідованих Bt продуктів кукурудзи, Управління по охороні навколишнього середовища США вимагає створення значно менше (у цілому, 5 %) структурованого резервату неBt кукурудзи, ніж для продуктів з однією ознакою (загалом, 20 %). Існують різні способи одержання IRM ефектів від резервату, включаючи різні геометричні структури посадки на полях (як вказано вище) і пакетування суміші насіння, як розглянуто додатково авторами Roush et al. (вище) і в патенті США № 6551962. Вищевказані величини в відсотках або подібні співвідношення в резерватах можуть бути застосовані з метою створення подвійних або потрійних стеків або пірамід. Для потрійних стеків із трьома режимами дії проти єдиного цільового шкідника метою буде нульовий резерват (або, наприклад, менше 5 % під резерват). Це, зокрема, вірно для комерційних площ, наприклад, розміром більше 10 акрів. Усі патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації, на які зроблені посилання або процитовані в даному описі, включені повністю за допомогою посилання в тій мірі, у якій вони не узгоджуються з чіткими вказівками в даному описі. 9 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Якщо зокрема не вказано або мається на увазі інше, невизначена і визначена форми однини, як застосовано в даному описі, позначають "щонайменше" один. Наступні приклади ілюструють способи здійснення даного винаходу. Ці приклади не повинні бути розглянуті як обмежуючі. Усі відсотки приведені по масі, і всі співвідношення розчинні компоненти в суміші приведені по об'єму, якщо не вказано інше. Усі температури приведені в градусах Цельсія. Приклади Приклад 1 - Короткий опис прикладів Наступні приклади демонструють, що Vip3Ab1 разом з Cry1Ab надає неперехресної стійкості до гусениць бавовняної американської совки (CEW), таким чином, показуючи, що ці два білки можуть протидіяти розвитку стійкості в CEW до кожного з цих білків окремо. Ми додатково показали, що Vip3Ab1 діє проти личинок Plutella xylostella (Linnaeus) (капустяна міль) і проти Cry1Ab-стійких личинок Plutella xylostella (Linnaeus). У біотесті включення в харчування Vip3Ab1 виявився токсичним для обох штамів цієї комахи. Додаткове підтвердження цьому боротьбі зі стійкістю дають дослідження конкурентного 125 зв'язування з радіоактивною міткою із застосуванням I Cry1Ab. Представлені дані показують, 125 що Cry1Ab мічений радіоактивним ізотопом I міцно і специфічно зв'язується зі специфічним набором рецепторних білків, розташованих у препаратах мембранних везикулах щіткової облямівки (BBMV) із середньої кишки личинок Heliothis zea. Зв'язування радіоактивного Cry1Ab з його рецепторами може бути конкурентним чином замінено шляхом застосування нерадіоактивного Cry1Ab у BBMV з цієї комахи. Однак, Vip3Ab1, як у формі своєї повної довжини в 85 кДа, так і у ферментативно перетвореній трипсином формі до більш 125 низькомолекулярних перетворених білків, не замінює зв'язування I Cry1Ab з його рецепторами у цієї комахи. Ці результати показують, що Vip3Ab виявляє свою біологічну дію на ділянці, відмінній від тієї ділянки, на якій зв'язується Cry1Ab. Приклад 2 - Очищення й обробка трипсином білків Cry1Ab і Vip3Ab1 Гени, що кодують протоксини Cry1Ab і Vip3Ab1, експресувалися у експресуючих штамах Pseudomonas fluorescens, і повнорозмірні білки відділялися у вигляді нерозчинних внутрішньоклітинних тілець. Промиті внутрішньоклітинні тільця розчиняли шляхом перемішування при 37 °C у буфері, що містить 20 мм буфер CAPS з pН 11, + 10 мм DDT, + 0,1 % 2-меркаптоетанол, протягом 2 годин. Розчин центрифугували при 27000×g протягом 10 хвилин при 37 °C, і надосадовий розчин обробляли 0,5 % (мас/об) трипсин, обробленим TCPK (Sigma). Цей розчин інкубували при перемішуванні протягом ще 1 години при кімнатній температурі, фільтрували, потім завантажували в колонку Pharmacia Mono Q 1010, урівноважену 20 мм CAPS з М 10,5. Після промивання заправленої колонки 2 колонковими об'ємами буфера укорочений токсин елюювали за допомогою лінійного градієнта від 0 до 0,5М NaCl у 20 мм CAPS у 15 колонкових об'ємах при об'ємній швидкості потоку 1,0 мл/хв. Очищені укорочені трипсином Cry білки елюювались при концентрації NaCl приблизно 0,2-0,3М. Чистоту білків перевіряли за допомогою SDS PAGE і з візуалізацією з застосуванням барвника Кумассі брильянтовий блакитний. У деяких випадках об'єднані фракції очищеного токсину концентрували і завантажували в колонку Superpose 6 (діаметром 1,6 см., довжиною 60 см) і додатково очищали гель-хроматографією. Фракції, що складають один пік з молекулярною масою мономера, поєднували і концентрували, одержуючи гомогенний на більше ніж 95 % препарат білка з молекулярною масою приблизно 60000 кДа. Обробку Vip3Ab1 досягали схожим чином, починаючи з очищеного повнорозмірного білка в 85 кДа (DIG 307). Білок (12 мг) піддавали діалізу в 50 мм буфері фосфату натрію з pН 8,4, потім обробляли шляхом додавання 1 мг твердого трипсину і інкубування протягом 1 години при кімнатній температурі. Розчин завантажували в аніоннообмінну колонку Mono (діаметром 1 см, довжиною 10 см) і елюювали за допомогою лінійного градієнта NaCl від 0 до 500 мМ у 20 мМ буфері фосфату натрію з pН 8,4 більше ніж 7 об'ємами колонки. Елюювання білка спостерігали за допомогою SDS-PAGE. Основна смуга обробки містила сполуки з молекулярною масою 65 кДа, що визначали за допомогою SDS-PAGE із застосуванням стандартів порівняння молекулярної маси. Приклад 3 - Біотест комах Очищені білки тестували на інсектицидну дію в біотесті, проведеному з новонародженими личинками Plutella xylostella (Linnaeus) і Heliothis zea, що знаходяться на штучному харчуванні для комах. CryйA-стійкі P. xylostella розвивалися в режимах зміни харчування з застосуванням комерційного Bt продукту (DiPel®), одержуваного зі штаму NO-QA (Tabashnik et al., 1996; Tabashnik et al., 1997). 10 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Біотест комах проводили в пластмасових лотках для біотесту з 128 ямками (C-D International, Пітман, Нью-Джерсі). Кожна ямка містила 0,5 мл корму для різних видів лускокрилих (Southland Products, Лейк-Вилледж, Арканзас). Аліквоту об'ємом 40 мкл очищеного білка Cry або Vip3Ab1 розбавляли до різних концентрацій у 10 мМ CAPS з pН 10,5, або в кожну 2 2 ямку на поверхню корму площею 1,5 см піпеткою наносили контрольний розчин (26,7 мкл/см ). Тестували по 16 ямок на кожен зразок. Негативним контролем служив буферний розчин, що не містить білок. Позитивні контролі включали препарати Cry1Ac або Cry1F. Оброблені лотки тримали у витяжній шафі доти, доки рідина на поверхні корму не випаровувалася або не всмоктувалася в корм. Протягом декількох годин після вилуплення індивідуальні личинки збирали зволоженою щіткою з верблюжої вовни і розташовували на обробленому кормі по одній личинці в ямці. Потім заражені ямки запечатували липкими аркушами чистої пластмаси, через які створювали вентиляцію для можливості газообміну (C-D International, Пітман, Нью-Джерсі). Лотки для біотесту тримали в кліматичній камері (28C, відносна вологість ~40 %, фотоперіод 16:8 [Світло:Темрява]). Через 5 днів усіх комах піддавали впливу кожного з білкових зразків, реєстрували кількість мертвих комах і масу комах, що вижили. Приклад 4 - Йодування Cry1Ab токсинів Очищений коровий токсин Cry1Ab, укорочений трипсином йодували з застосуванням йодних кульок (Pierce). Коротко, дві йодні кульки промивали двічі за допомогою 500 мкл PBS (20 мМ фосфат натрію, 0,15М NaCl, pН 7,5) і поміщений у центрифугальну пробірку на 1,5 мл за свинцевий екран. До цих йодних кульок додавали 100 мкл PBS. Під витягуванням і відповідними способами поводження з радіоактивними речовинами до розчину PBS з йодними кульками 125 додавали 0,5 мКі Na I (17,4 Кі/мг, Perkin Elmer). Компонентам дозволили реагувати протягом 5 хвилин при кімнатній температурі, потім 5 мкг укороченого Cry1Ab високого ступеня очищення додавали до розчину і дозволяли реагувати протягом ще 3-5 хвилин. Реакцію завершували шляхом відділення розчину від йодних кульок і нанесення йогона демінералізуючу спін-колонку для очищення (G-20, GE biosciences), урівноважену 10 мМ CAPS з pН 10,5. Йодні кульки промивали двічі 50 мкл PBS, і промивний розчин також вносили в демінералізуючу колонку. Радіоактивний розчин елюювали з демінералізуючої колонки шляхом центрифугування при 125 1000g протягом 2 хвилин. Йодо-Cry1Ab, мічений радіоактивним ізотопом I, вимірювали в гамма-лічильнику на кількість радіоактивності і питому активність, визначали на основі припущення про 80 % ефективності регенерації вихідної кількості токсину. Приклад 5 - Одержання і фракціонування розчиненого препарату з BBMV Стандартні способи кількісного аналізу білка і електрофорез на СДС-поліакриламідному гелі застосовували так, як описано, наприклад, у публікації авторів Sambrook et al. (Sambrook і Russell, 2001) і її відновленнях. Личинки H. zea в останній віковій стадії не годували протягом ночі і потім препарували після охолодження на льоду протягом 15 хвилин. Тканину середньої кишки видаляли з порожнини тіла, залишаючи приєднаною до зовнішньої оболонки за задньою кишкою. Середню кишку поміщали в 9-кратний об'єм охолодженого льодом гомогенізуючого буфера (300 мМ манітол, 5 мМ ЕГТА, 17 мМ Тріс основа, pН 7,5), з додаванням суміші інгібіторів протеаз (Sigma-Aldrich P-2714), розведеної відповідно до рекомендації виробника. Тканину гомогенізували 15 тактами скляного гомогенізатора тканини. Препарати з BBMV одержували методом осадження Вульферсбергера за допомогою MgCl2 (Wolfersberger, 1993). Коротко, у рівному об'ємі змішували 24 мМ розчин MgCl2 у 300 мМ манітолі з гомогенатом середньої кишки, перемішували протягом 5 хвилин і залишали на льоду протягом 15 хвилин. Розчин центрифугували при 2500g протягом 15 хвилин при 4 °C. Надосадовий розчин зберігали, а таблетку-осад суспендували в початковому об'ємі в 0,5х розведеному гомогенізуючому буфері і знову центрифугували. Ці два надосадові розчини поєднували і центрифугували при 27000g протягом 30 хвилин при 4 °C для одержання фракції BBMV. Таблетку-осад суспендували в буфері для збереження BBMV (10 мм HEPES, 130 мм KCl, 10 % гліцерин, pН 7,4) до концентрації білка приблизно 3 мг/мл. Концентрацію білка визначали з застосуванням BSA як стандарту. Активність L-лейцин-п-нітроанілідамінопептидази (маркерний фермент для фракції BBMV) визначали до заморожування зразків. Коротко, 50 мкл L-лейцин-п-нітроаніліду (1 мг/мл у PBS) додавали до 940 мл 50 мм Тріс-HCl у стандартній кюветі. Кювету поміщали в спектрофотометр Cary 50 Bio, обнуляли вимірювання поглинання при довжині хвилі 405 нм, і ініціювали реакцію шляхом додавання 10 мкл або гомогенату середньої кишки або комахи препарат з BBMV комахи. Збільшення поглинання при 405 нм спостерігали протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Питому активність гомогенату і препаратів BBMV визначали на основі кінетики 11 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 збільшення поглинання згодом на ділянці лінійного збільшення поглинання на одиницю загальної кількості білка, доданого для аналізу, по наступному рівнянню: ΔOD/(хв*мг) = Швидкість амінопептидази (ΔOD/мл*хв)/[білок](мг/мл) Питома активність цього ферменту, як правило, збільшувалася в 7 разів у порівнянні з такою, що виявляється у вихідній фракції гомогенату середньої кишки. Аліквоти препаратів з BBMV додавали в зразки об'ємом у 250 мкл, різко заморожували в рідкому N 2 і зберігали при 80C. Приклад 6 - Електрофорез Аналіз білків за допомогою SDS-PAGE проводили у відновних умовах (тобто в 5 % βмеркаптоетанол, BME) і денатуруючих (тобто нагрівання протягом 5 хвилин при 90 у присутності 4 % СДС) умовах. Потім білки завантажували в ямки з 4-20 % тріс-гліцин поліакриломідним гелем (BioRad; Hercules, Каліфорнія) і розділяли при 200 вольтах протягом 60 хвилин. Смужки білка виявляли шляхом фарбування барвником Кумассі брильянтовий синій R250 (BioRad) протягом однієї години і знебарвлювали розчином 5 % метанолу в 7 % оцтовій кислоті. Знімки гелів і аналіз робили за допомогою приладу Fluro-S Multi Imager™ компанії BioRad. Відносні молекулярні маси білків у смужках визначали шляхом порівняння з рухливістю білків з відомою молекулярною масою, що спостерігаються в зразку BenchMark™ Protein Ladder (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія), завантаженому в одну ямку гелю. 125 Приклад 7 - Зв'язування I-маркованого Cry1Ab із препаратом BBMV з личинки H. zea Будували криву насичення для визначення оптимальної кількості білка в препараті BBMV 125 для застосування в тестах на зв'язування з коровим токсиновим Cry-білком. 0,5 нМ I-міченого радіоактивним ізотопом корового токсинового білка Cry1Ab інкубували протягом 1 години при 28 у буферному розчині (8 мМ NaHPO4, 2 мМ KH2PO4, 150 мМ NaCl, 0,1 % BSA, pН 7,4) з 125 кількістю білка з BBMV у межах від 0 мкг/мл до 500 мкг/мл (загальний об'єм 0,5 мл). Iмаркірований коровий токсиновий Cry-білок, зв'язаний з білками з BBMV, відділяли від незв'язаної фракції шляхом відбору 150 мкл реакційної суміші в трьох паралелях в окремі центрифугальні пробірки об'ємом 1,5 мл і центрифугування зразків при 14000g протягом 8 хвилин при кімнатній температурі. Надосадовий розчин акуратно видаляли, і таблетку-осад промивали три рази крижаним буферним розчином. Основу центрифугальної пробірки, що містить таблетку-осад, відрізали, поміщали в скляну культуральну пробірку розміром 1375 мм, і кожний зі зразків вимірювали протягом 5 хвилин у гамма-лічильнику. Будували графік залежності одержуваного CPM (число імпульсів на хвилину) мінус фонове CPM (реакція під час відсутності білка з BBMV) від концентрації білка з BBMV. Оптимальну концентрацію білка з BBMV для застосування в тесті на зв'язування визначали як таку, що дорівнює 150 мкг/мл. Тести на гомологічне і гетерологічне конкурентне зв'язування проводили з застосуванням 125 150 мкг/мл білка з BBMV і 0,5 нМ міченого радіоактивним ізотопом I корового токсинового Cryбілка. Концентрації конкурентного неміченого радіоактивним ізотопом корового токсинового Cryбілка, доданого до реакційної суміші, змінювалися від 0,045 нМ до 1000 нМ і її додавали одночасно з радіоактивного корового токсинового Cry-білка, щоб гарантувати дійсно 125 конкурентне зв'язування. Інкубації проводили протягом 1 години при 28, і кількість Iмаркірованого корового токсинового Cry-білка, зв'язаного з BBMV (сумарне зв'язування) вимірювали як описані вище. Неспецифічне зв'язування представляли у вигляді рахунку, отриманого в присутності 1000 нМ гомологічного корового токсинового Cry-білка неміченого радіоактивим ізотопом. Специфічне зв'язування вимірювали шляхом вирахування отриманого рівня неспецифічного зв'язування із сумарного зв'язування. Стовідсотковим специфічним зв'язуванням вважали кількість зв'язування, отриману під час відсутності будь-якого конкурентного ліганду, мінус кількість зв'язування, отримана в присутності 1000 нМ гомологічного корового токсинового Сry-білка неміченого радіоактивним ізотопом. Кількість 125 заміщень гетерологічними лігандами порівнювали з 100 % специфічним зв'язуванням I Cry1Ab з його рецептором. Приклад 8 - Суть результатів Результати смертності в біотестах з повнорозмірним білком Vip3Ab1, тестованим у різних дозах проти дикого типу і Cry1A-стійких личинок P. xylostella і личинок H. Zea, показані на Фіг. 1. Результати біотестів інгібування росту, виражені у відсотках, представлені на Фіг. 2. 2 Протестовані концентрації Vip3Ab1 складали 9000, 3000, 1000, 333, 111, 37 і 12 нг/см . Токсин був найактивніший проти личинок P. xylostella, показуючи еквівалентну відповідь на летальну дозу як для дикого типу, так і для Cry1Ab-стійких личинок. Половинна летальна доза LC-50 для 2 P. xylostella складала приблизно 200 нг/см . Інгібування росту спостерігали в личинок H. zea, хоча для летального результату під час тесту були потрібні вищі концентрації. Високий рівень 12 UA 114596 C2 5 10 15 20 25 інгібування росту, що спостерігався в личинок H. zea, указує на те, що ці комахи, найбільш імовірно, відмирали б, якби їх залишали на більш тривалий час. Тести на конкурентне зв'язування з радіоактивною міткою проводили для визначення того, чи конкурує укорочений трипсином Vip3Ab1 зі зв'язуванням міченими радіоактивним ізотопом 125 I Cry1Ab рецепторними білками, що містяться в препаратах BBMV з H. zea. Експерименти проводили шляхом порівняння здатності Vip3Ab1 конкурувати зі зв'язуванням 125 I Cry1Ab із препаратів BBMV, отриманих з личинок H. zea (Фіг. 3). У препаратах BBMV було показано, що немічений радіоактивним ізотопом Cry1Ab ефективно конкурував зі зв'язуванням 125 I Cry1Ab з білків BBMV H. zea, але Vip3Ab1 не заміщав мічений радіоактивним ізотопом ліганд Cry1Ab з цих препаратів BBMV. Ці три дослідження демонструють, що Vip3Ab1 не конкурує зі зв'язуванням Cry1Ab у личинках H. zea. Комахи можуть розвивати стійкість до токсичності Cry-білків за допомогою декількох різних біохімічних механізмів, але найбільш розповсюджений механізм відбувається через зниження здатності токсинового Cry-білка зв'язуватися зі своїм специфічним рецептором у кишечнику комахи (Heckel et al., 2007; Tabashnik et al., 2000; Xu et al., 2005). Це може бути викликано невеликими точковими мутаціями, великими делеціями гена або іншими генетичними або біохімічними механізмами. Vip3Ab1 доповнює дію Cry1Ab тим, що має біологічну дію проти схожих комах, але при цьому не зв'язується з тими ж сайтами рецептора, як ці Cry-білки, і, таким чином, не залежить від механізмів стійкості, що викликали б зниження зв'язування Cry-токсину. Ми робимо висновок з цих досліджень, що Vip3Ab1 є чудовим токсином для комах і при об'єднанні з Cry1Ab, як підхід до боротьби зі стійкістю в комах, забезпечить біологічну дія проти комах, що можуть розвивати стійкість до кожного з цих білків, а також запобігати виживанню Cry1A-стійких комах. Тому що Vip3Ab1 є токсичним для Cry1A-стійких комах, цей токсин буде чудовим партнером для стекування при об'єднанні з Cry1Ab для прояву активності, як проти дикого типу, так і проти стійких комах. 13 UA 114596 C2 Джерела інформації: 14 UA 114596 C2 15 UA 114596 C2 16 UA 114596 C2 17 UA 114596 C2 18 UA 114596 C2 19 UA 114596 C2 20 UA 114596 C2 21 UA 114596 C2 22 UA 114596 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 1. Трансгенна рослина кукурудзи або сої для застосування для запобігання розвитку стійкості до білка Cry у комахи совки бавовняної (Helicoverpa zea), яка включає ДНК, що кодує інсектицидний білок Vip3Ab, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Ab, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab містить SEQ ID NO:2, і де вказаний інсектицидний білок Vip3Ab містить SEQ ID NO:1, і вказаний Cry1Ab і вказаний Vip3Ab не мають однакові сайти зв’язування в кишечнику совки бавовняної. 2. Насіння трансгенної рослини за п. 1, де вказане насіння містить ДНК, яка кодує вказаний інсектицидний білок Vip3Ab, і ДНК, яка кодує вказаний інсектицидний білок Cry1Ab, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab містить SEQ ID NO:2, і де вказаний інсектицидний білок Vip3Ab містить SEQ ID NO:1. 3. Суміш насіння, яка включає резерватне насіння від не-Bt-резерватних рослин і множину насіння за п. 2, де вказане резерватне насіння складає менше 40 % від усього насіння у суміші. 4. Суміш насіння за п. 3, у якій вказане резерватне насіння складає менше 30 % від усього насіння у суміші. 5. Суміш насіння за п. 3, у якій вказане резерватне насіння складає менше 20 % від усього насіння у суміші. 6. Суміш насіння за п. 3, у якій вказане резерватне насіння складає менше 10 % від усього насіння у суміші. 7. Суміш насіння за п. 3, у якій вказане резерватне насіння складає менше 5 % від усього насіння у суміші. 8. Спосіб регулювання розвитку стійкості в комах Helicoverpa zea до інсектицидного білка, одержуваного з Bacillus thuringiensis, причому вказаний спосіб включає сіяння насіння для одержання сукупності рослин, які включають не-Bt-резерватні рослини і множину рослин за п. 1, де вказане резерватне насіння складає менше 40 % від усіх рослин сільськогосподарських культур на вказаному полі, і контактування вказаних комах Helicoverpa zea з вказаною сукупністю рослин. 9. Композиція для боротьби з комахами Helicoverpa zea, які є стійкими до білка Cry, причому вказана композиція включає клітини рослини за п. 1, що експресують ефективну кількість як інсектицидного білка Cry1Ab, так і інсектицидного білка Vip3Ab, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab містить SEQ ID NO:2, і де вказаний інсектицидний білок Vip3Ab містить SEQ ID NO:1. 10. Спосіб боротьби з комахами Helicoverpa zea, які є стійкими до білка Cry, причому вказаний спосіб включає надання вказаним комахам ефективної кількості композиції за п. 9. 11. Трансгенна рослина за п. 1, у якій вказана рослина є рослиною кукурудзи. 12. Рослинна клітина рослини за п. 1, яка включає ДНК, що кодує інсектицидний білок Vip3Ab, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Ab, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab містить SEQ ID NO:2, і де вказаний інсектицидний білок Vip3Ab містить SEQ ID NO:1. 23 UA 114596 C2 24 UA 114596 C2 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 25

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Combined use of vip3ab and cry1ab for managemetn of resistance isects

Автори англійською

Narva, Kenneth, E., Meade, Thomas, Woosley, Aaron, T., Burton, Stephanie, Storer, Nicholas, P., Sheets, Joel, J.

Автори російською

Нарва Кеннет Е., Мид Томас, Вусли Аарон Т., Бертон Стэфани, Сторер Николас П., Шитс Джоел Дж.

МПК / Мітки

МПК: A01H 5/00, C12N 5/14, A01N 63/02, C07K 14/325

Мітки: продукує, розвитку, рослина, білки, запобігання, яка, трансгенна, совки, комахи, cry1ab, vip3ab, стійкості, бавовняної

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/27-114596-transgenna-roslina-yaka-produkueh-bilki-cry1ab-i-vip3ab-dlya-zapobigannya-rozvitku-stijjkosti-u-komakhi-sovki-bavovnyano.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Трансгенна рослина, яка продукує білки cry1ab і vip3ab для запобігання розвитку стійкості у комахи совки бавовняної</a>

Подібні патенти