Лікування гепатиту с у азіатських народів за допомогою підшкірного введення інтерферону-бета

1. Застосування рекомбінантного IFN-бета для одержання лікарського засобу для лікування інфекції HCV шляхом підшкірного введення пацієнтам азіатської раси, які не відповідали на попереднє лікування альфа-інтерфероном. 2. Застосування за п. 1, де рекомбінантний IFNбета являє собою рекомбінантний IFN-бета-1а. 3. Застосування за п. 1 або 2, де пацієнти, які не відповідали на попереднє лікування альфаінтерфероном, є тими пацієнтами, яких лікували IFN-альфа щонайменше 12 тижнів в дозі, яка щонайменше дорівнювала 3 MIU 3 рази на тиждень, з одним з наступних результатів: (а) нездатність до нормалізації сироваткової ALT або (b) нормалізація ALT з подальшим раптовим підйомом (підйом ALT) до закінчення лікування. 4. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де дозування і режими лікування вибрані з групи, яка складається з 12 MIU (44 мкг) рекомбінантного IFN-бета-1а три рази на тиждень, 12 MIU (44 мкг) рекомбінантного IFN-бета-1а щодобово, 24 MIU (88 мкг) рекомбінантного IFN-бета-1а три рази на тиждень і 24 MIU (88 мкг) рекомбінантного IFNбета-1а щодобово. 2 (19) 1 3 79615 Даний винахід відноситься до застосування рекомбінантного IFN-бета для одержання лікарського засобу для лікування інфекції HCV шляхом його підшкірного введення пацієнтам азіатської раси, які характеризувалися недостатньою відповіддю на попереднє лікування альфаінтерфероном. Вірус гепатиту С (HCV) спричиняє стан хронічної інфекції майже у всі х гостро інфікованих суб'єктів. Приблизно у 20% пацієнтів з хронічною інфекцією HCV (CHC) розвивається цироз з подальшою печінковою недостатністю, портальною гіпертензією, асцитом, енцефалопатією і порушеннями з кровотечею [Alter M., 1992]. Довгострокові спостереження вказують на те, що дані оцінки можуть бути консервативні [Davis GL, 1990]; однак хронічна інфекція HCV виражено асоційована з гепатоцелюлярною карциномою [Tabor E. et al., 1992]. Інтерферони (IFN) являють собою глікопротеїни, які продукуються організмом у відповідь на вірусну інфекцію. Вони інгібують розмноження вірусів в захи щених клітинах. IFN, які складаються з білків з низькою молекулярною масою, чудово неспецифічні в своїй дії, тобто IFN, індукований одним вірусом, ефективний проти великої групи інших вір усів. Однак вони видоспецифічні, тобто IFN, який продукується одним видом, буде стимулювати лише противірусну активність в клітинах того самого або близькоспоріднених видів. IFN являли собою першу груп у цитокінів, які були використані в плані їх потенційної протипухлинної та противірусної активності. Три основних IFN позначені IFN-альфа, IFNбета та IFN-гамма. Такі основні типи IFN спочатку класифікували за клітинами, з яких вони походять (лейкоцит, фібробласт або Т-клітина). Однак стало зрозуміло, що декілька типів можуть продукуватися однією клітиною. Тому лейкоцитарний IFN зараз називають IFN-альфа, фібробластний IFN являє собою IFN-бета, і Т-клітинний IFN являє собою IFN-гамма. Також є четвертий тип IFN, лімфобластний IFN, який продукується в клітинній лінії «Namalwa» (що походить з лімфоми Беркитта), яка, виявляється, продукує суміш лейкоцитарного та фібробластного IFN. Зокрема, людський фібробластний інтерферон (IFN-бета) характеризується противірусною активністю і може також стимулювати дію клітинприродних кілерів проти клітин неоплазії. Це поліпептид масою приблизно 20000Да, який індукується вірусами і дволанцюговими РНК. З нуклеотидної послідовності гена фібробластного інтерферону, клонованої за технологією рекомбінантної ДНК, Derynk et al. [Derynk R. et al., Nature 285,542-547, 1980] передбачили повну амінокислотну послідовність даного білка. Її довжина становить 166 амінокислот. Shepard et al. [Shepard Η. Μ. et al., Nature, 294,563-565, 1981] описали мутацію основи 842 (Cys®Туr в положенні 141), яка відміняє противірусну активність та клон-варіант з делецією нуклеотидів 1119-1121. Mark et al. [Mark D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α., 81 (18) 5662-5666, 1984] вбудовували 4 штучн у мутацію шляхом заміни основи 469 (Т) на (А), що спричиняє переключення амінокислоти від Cys на Ser в положенні 17. Одержаний в результаті IFN-бета, як повідомляється, був активний як "нативний" IFN-b і стабільний під час довгострокового зберігання (-70°С). RebifÒ (рекомбінантний людський інтерферонбета-la) являє собою останню розробку в інтерфероновій терапії розсіяного склерозу (MS) і є суттєвим поліпшенням лікування. RebifÒ являє собою інтерферон (IFN)-бета-1a, який продукується клітинними лініями ссавців. Ме ханізми, по яких діють IFN, повністю не з'ясовані. Однак у більшості випадків вони діють шляхом впливу на індукцію транскрипції деяких генів, впливаючи таким чином на імунну систему. Дослідження in vitro показали, що IFN здатні індукувати або приглушува ти близько 20 генних продуктів. Для СНС немає повністю ефективного лікування. Кращі результати були одержані з альфаінтерфероном, хоча це не є універсальним рекомендованим лікуванням. Багато клініцистів тільки спостерігають пацієнтів з СНС внаслідок невизначеної природи інфекції HCV і токсичності, асоційованої альфа-інтерфероном. Більшість пацієнтів з СНС не дають повноцінної реакції на лікування альфа-інтерфероном. Контрольовані спроби введення альфа-інтерферону протягом шести місяців в результаті призвели до нормалізації сироваткової ALT у 40-50% пацієнтів в кінці лікування, але дана відповідь підтримувалася лише у 15-25% [Hoofnagle JH et al., 1997]. Збільшення доз і продовження лікування призводили до малого підвищення збереження відповіді, але ціною збільшення вартості і токсичності [Poynard Т. e t al., 1996]. Крім того, перевага збільшених доз часто є минущою, і після переривання лікування звичайні рецидиви [Lindsay KL et al., 1996]. За результатами дослідження 35 пацієнтів, які не відповідають на альфа-інтерферон, повідомлялося про відсутність переваги від продовження лікування від шести до 12 місяців, підвищення дози альфа-інтерферону, переключення лікування від рекомбінантного на лімфобластоїдний інтерферон або застосування стероїдів [Piccinino F et al., 1993]. Природа інфекції HCV після недостатності відповіді на альфа-інтерферон не була відповідним чином досліджена, тільки в одному дослідженні з моніторингом 28 пацієнтів протягом, щонайменше, 2 років після лікування був виявлений лише один випадок остаточної ремісії протягом 16 місяців (нормалізація ALT та зникнення РНК HCV) [Takeda T et al, 1993]. Деякі фактори, як було виявлено, асоційовані з більшою імовірністю довгострокової підтримки відповіді на альфа-інтерферон: генотип, який не відноситься до типу 1, низька концентрація РНК HCV в сироватці, менша тривалість інфекції, менша маса тіла, пом'якшена активність процесу на біопсії печінки, відсутність цирозу і низькі рівні феритина і заліза сироватки, насичення трансферину і концентрацій заліза в печінці [Schvarcz R et al., 5 79615 6 1989, Bacon BR et al., 1995, Conjeevaram HS et al., слідження, в якому вивчаються більш високі і 1995, Bonkovsky HL et al., 1997]. більш інтенсивні режими дозування протягом Пацієнти з СНС, які не можуть досягнути підбільш тривалого періоду лікування пацієнтів з хротримки відповіді після лікування альфанічним гепатитом С, які не відповідали на лікуванінтерфероном, як вважають, характеризуються ня IFN-альфа. більш агресивним проходженням захворювання, Через спонтанне повідомлення про результаможливо внаслідок відбору стійких генотипів, але ти з високою ефективністю, яке зробили автори вироблення нейтралізуючих антитіл проти альфаданого винаходу в Тайванському центрі, проводиінтерферону може також бути сприяючим фактоли дослідницькі аналізи по центру і за демографіром. Виявляється, є виражена кореляція між вичними характеристиками, що призвело до встаноробленням нейтралізуючих антитіл проти інтервлення відмінностей між пацієнтами азіатського та ферону-альфа-2а і недостатньою клінічною неазіатського походження. Тому план аналізу давигодою при інфекціях СНС і вірусом гепатиту В ного дослідження був змінений так, що воно пови(HBV) [Douglas DD et al., 1993, Milella MM et al., нне було охоплювати оцінку обох даних популяцій. 1993, Lok ASF et al., 1990]. Фактично, вироблення Головною метою даного винаходу є застосуантитіл до одного рекомбінантного типу альфавання рекомбінантного IFN-бета для одержання інтер'ферону може нейтралізувати інші субтипи лікарського засобу для лікування інфекції HCV альфа-інтерферону [Brand CM et al., 1993]. шляхом його підшкірного введення пацієнтам азіЄ відносно мало досвіду застосування бетаатської раси, які не відповідали на попереднє лікуінтерферону при інфекції HCV. Повідомлялися вання альфа-інтерфероном. дуже багатообіцяючі результати, які стосуються Тому іншою метою даного винаходу є спосіб лікування бета-інтерфероном гострої інфекції лікування інфекції HCV, що включає в себе підшкіHCV, притому, що 7 з 11 пацієнтів досягали триварне введення ефективної кількості IFN-бета разом лої нормалізації ALT протягом одного року в поріз фармацевтично прийнятним наповнювачем пацівнянні тільки з одним з 14 контрольних пацієнтів єнтам азіатської раси, які не відповідали на попе[Omata Μ et al., 1991]. Одинадцять пацієнтів лікуреднє лікування IFN-альфа. вали в середньому протягом 30 діб середньою «Ефективна кількість» відноситься до кількості в./в. дозою з 52 MU що походить з фібробластів, активних інгредієнтів, яка достатня для впливу на «нативного» інтерферону і бета-інтерферону. хід і тяжкість захворювання, що призводить до Примітно, що не повідомлялося про значущу токредукції або ремісії такої патології. Ефективна кісичність. лькість залежить від шляху введення і стану паціУ цей час в Японії природний IFN-бета повсюєнта. дно використовується для лікування хронічного «Фармацевтично прийнятний», як розуміється, гепатиту С, і режимом, який рекомендується, є охоплює будь-який носій, що не перешкоджає вивнутрішньовенне введення добової дози з 3-6 MIU яву біологічної активності активного інгредієнта і протягом 6-8 тижнів [див. Habersetzer et al., Liver, не токсичний відносно організму, в який він вво2000, 20, 438, 4th line]. диться. Наприклад, для парентерального введенБула дуже низька ефективність внутрішньоня вказані вище активні інгредієнти можуть бути м'язового введення IFN-бета (3 MU т.р.т.) пацієнскладені в порційні дозовані форми для ін'єкції в там з HCV неазіатської раси [Perez R. et al., J. таких носіях, як сольовий розчин, розчин декстроVirol. Hepat. 1995,2(2), 103-6]. зи, сироватковий альбумін та розчин Рінгера. У пацієнтів з HCV, які усі відносилися до неазіКрім фармацевтично прийнятного носія коматської (білої) раси, підшкірне введення (9 або 12 позиції за винаходом можуть також містити малі MU) рекомбінантного IFN-бета характеризувалося кількості домішок, таких як стабілізатори, наповефективністю, щонайменше, в групі пацієнтів нювачі, буфери та консерванти. [Habersetzer et al., Liver, 2000,20 437-441]. Термін «рекомбінантний бета-інтерферон Kishiara et al. [Fukukoka Acta Med., 86(4), 113(IFN-бета)» при використанні в даному винаході, 20, 1995] описують лікування натуральним IFNяк розуміється, охоплює людський фібробластний бета, що вводиться внутрішньовенно, в дозі 6 MIU інтерферон, одержаний способами рекомбінантної пацієнтам з HCV, які не відповідають на IFNДНК з прокаріотичних або еукаріотичних клітинальфа. хазяїв, а також його солі, функціональні похідні, У попередньому порівняльному вивченні альваріанти, аналоги та фрагменти. фа-інтерферону та бета-інтерферону при HBV та Термін «функціональні похідні» охоплює похіHCV, коефіцієнти відповіді були 81% для альфадні, які можуть бути одержані з функціональних інтерферону та 86% для бета-інтерферону, з подігруп, що виявляються боковими ланцюгами залибними коефіцієнтами відповіді, які підтримуються шків або з N- або С-кінцевих груп, засобами, відопротягом 6 місяців (72% для альфа-інтерферону мими в даній галузі, і вони відносяться до винахота 79% для бета-інтерферону) (Tundo L, 1993). ду, доки зберігають фармацевтичну прийнятність, Побічні дії призводять до припинення лікування тобто вони не відміняють описаної вище біологічдля 24% в групі, яка одержувала альфаної активності білків, тобто здатності зв'язувати інтерферон, в порівнянні з 0% в групі, яка одержувідповідний рецептор та ініціювати передачу сигвала бета-інтерферон. налу з рецептора, і не надають композиціям, які їх Подаючі надію початкові результати деякий містять, токсичних властивостей. Похідні можуть попередніх досліджень, проведених даним заявмати хімічні радикали, такі як вуглеводні або фосником, разом з хорошим профілем безпеки та пефатні залишки, що забезпечує збереження такому ренесенням IFN-бета-1а, призвели до даного до 7 79615 8 похідному біологічної активності білка та фармахімічним синтезом пептиду-варіанту з використанцевтичної прийнятності. ням способів, добре відомих у даній галузі. ЗвиНаприклад, похідні можуть включати аліфатичайно, такі варіанти будуть характеризуватися чні складні ефіри карбоксильних груп, аміди карзв'язуванням рецептора та активністю по ініціації боксильних груп за рахунок взаємодії з амонієм сигналу, схожими з такими для відповідного білка, або первинними або вторинними амінами, Nщо зустрічається в природі. ацильні похідні вільних аміногруп амінокислотних Варіанти амінокислотної послідовності, визназалишків, утворені ацильними радикалами (наприченi вище, можуть бути одержані шляхом мутацій клад, алканольні або карбоциклічні ароїльні групи) в ДНК, які кодують похідні, що синтезуються. Такі або О-ацильні похідні вільних гідроксильних груп варіанти включають, наприклад, делеції, вставки (наприклад, залишків серилу або треонілу), утвоабо заміни залишків в амінокислотній послідовносрені ацильними радикалами. Такі похідні можуть ті. Будь-яке поєднання делеції, вставки і заміни також включати, наприклад, бокові ланцюги політакож може бути здійснено для досягнення кінцеетиленгліколю, які можуть приховувати антигенні вої конструкції, при забезпеченні того, що кінцева ділянки і продовжувати присутність молекули в конструкція буде мати необхідну активність. Очерідинах організму. видно, що мутації, які можуть бути виконані в ДНК, Особливу значущість має білок, який дериваяка кодує пептид-варіант, не повинні міняти рамку тизований або об'єднаний з комплексоутворювазчитування і переважно не створюють областей чем для забезпечення більшої тривалості життя. комплементарності, які будуть призводити до Наприклад, кон'юговані з ПЕГ варіанти або генеутворення вторинних структур мРНК. тично сконструйовані білки, які характеризуються На генетичному рівні дані варіанти звичайно довгостроковою активністю в організмі, можуть одержують шляхом сайт-специфічного мутагенезу використовува тися за даним винаходом. Кон'югонуклеотидів в ДНК, яка кодує пептидну молекулу, з ваний з ПЕГ варіант інтерферону-бета-1 описаний продукцією таким чином ДНК, яка кодує варіант, в [WO 99/55377] і розглядається як включений до після чого ДНК експресується в рекомбінантній складу визначення бета-інтерферону за даною культурі клітин. Варіанти звичайно виявляють ту заявкою. саму якісну біологічну активність, що властива Термін «похідне», як передбачається, включає пептиду, який не є варіантом. тільки ті похідні, які не характеризуються замінами «Аналог» визначеного вище білка за даним одних амінокислот на інші в межах двадцяти привинаходом відноситься до неприродної молекули, родних амінокислот, що звичайно зустрічаються. яка по суті подібна цілим молекулам або їх активТермін «солі» відноситься до солей карбоксиному фрагменту. Такий аналог виявляє ту саму льних груп і до кислих адитивних солей аміногруп активність, що у відповідного білка, який зустрічабілків, описаних ви ще або їх аналогів. Солі карбоється в природі. ксильних груп можуть бути утворені засобами, Типи замін, які можуть бути зроблені в бетавідомими в даній галузі, і включають неорганічні інтерфероні за даним винаходом, можуть основусолі, наприклад, натрію, кальцію, амонію, солі заватися на аналізі частот амінокислотних замін у ліза або цинку, і тому подібне, і солі з органічними гомологічних білках різних видів. На основі даного основами, такі як утворені, наприклад, амінами, аналізу консервативні заміни можуть визначатися такими як триетаноламін, аргінін або лізин, піпеяк заміни в межах однієї з наступних п'яти гр уп: ридин, прокаїн і тому подібне. Кислі адитивні солі I. Малі, аліфа тичні, неполярні або слабко повключають, наприклад, солі неорганічних кислот, лярні залишки: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly. такі як, наприклад, солі хлористоводневої або сірII. Полярні, негативно заряджені залишки та їх чаної кислоти, і солі органічних кислот, такі як, аміди: Asp, Asn, Glu, Gin. наприклад, солі оцтової кислоти або щавлевої III. Полярні, позитивно заряджені залишки: His, кислоти. Звичайно, будь-які такі солі повинні зберіArg, L ys. гати свою біологічну активність білка, який відноIV. Великі, аліфатичні неполярні залишки: Met, ситься до даного винаходу, тобто здатність, зв'яLeu, lle, Val, Cys. зуватися з відповідним рецептором та ініціювати V. Великі ароматичні залишки: Phe, Туr, Trp. передачу сигналу від рецептора. У межах вказаних вище груп наступні заміни «Фрагмент» за даним винаходом відноситься вважаються «високо консервативними»: до будь-якої підмножини молекул, тобто до більш Asp/Glu короткого пептиду, який зберігає необхідну біолоHis/Arg/Lys гічну активність. Фрагменти можуть бути легко Phe/Tyr/Trp одержані шляхом видалення амінокислот з кожноMet/Leu/Ile/Val го кінця молекули і тестування одержаної в реНапівконсервативні заміни визначаються як зультаті молекули на предмет її властивостей як заміни між двома групами (I)-(IV), вказаними вище, агоніста рецептора. Відомі протеази для видаленякі обмежені надгрупою (А), яка включає (І), (II) та ня однієї амінокислоти за раз від N-кінця або С(III), вказані вище, або над групою (В), яка включає кінця поліпептиду, і визначення таким чином фра(IV) і (V), вказані вище. Заміни не обмежені аміногментів, які зберігають необхідну біологічну активкислотами, які генетично кодуються або навіть ність, включає тільки рутинне експериментування. зустрічаються в природі. Коли епітоп одержаний «Варіант» за даним винаходом відноситься до пептидним синтезом, необхідні амінокислоти момолекули, яка по суті схожа з цілими білками, вижуть бути використані безпосередньо. Альтерназначеними вище, або до її фрагмента. Пептидитивно, амінокислота, яка генетично кодується, моваріанти можуть бути зручно одержані прямим же бути модифікована шляхом її взаємодії з 9 79615 10 органічним дериватизуючим агентом, який здатний яка форма даних залишків лежить в обсязі даного взаємодіяти з вибраними боковими ланцюгами винаходу. або кінцевими залишками. Приклади одержання амінокислотних замін в Залишки цистеїнілу звичайно взаємодіють з білках, які можна використати для одержання анаальфа-галогенацетатами (і відповідними амінами), логів для застосування за даним винаходом, такими як хлороцтова кислота або хлорацетамід, з включають будь-які відомі стадії способу, такі як одержанням похідних карбоксиметилу або карбокпредставлені в [патентах США RE 33653; 4959314; сіамідометилу. Залишки цистеїнілу також дерива4588585 та 4737462, виданих Mark et al; 5116943, тизуються шляхом взаємодії з бромтрифторацевиданих Koths et al; 4965195, виданих Namen et al; тоном, альфа-бром-бета-(5-імідазоїл)пропіоновою та 5017691, виданих Lee et al], і заміщені лізином кислотою, хлорацетилфосфатом, Nбілки, представлені в [патенті США 4904584 (Shaw алкілмалеімідами, 3-нітро-2-піридилдисульфідом, et al)]. метил-2-піридилдисульфідом, пПереважно, визначений вище варіант або хлормеркурібензоатом, 2-хлормеркурі-4аналог, містить корову послідовність, яка співпанітрофенолом або хлор-7-нітробензо-2-окса-1,3дає з «нативною» послідовністю, або її біологічно діазолом. активний фрагмент, який характеризується, щоЗалишки гістидилу дериватизуються шля хом найменше, 70%-ною ідентичністю відносно нативвзаємодії з діетилкарбонатом при рН 5,5-7,0, оскіної амінокислотної послідовності і зберігає її біолольки даний агент є відносно специфічним відносно гічну активність. Більш переважно, така бокового ланцюга гістидилу. Парабромфенацилбпослідовність характеризується, щонайменше, ромід також може застосовуватися; взаємодію 80%-ною ідентичністю, щонайменше, 90%-ною переважно проводять в 0,1Μ какодилаті натрію ідентичністю, або, найбільш переважно, щонаймепри рН 6,0. нше, 95%-ною ідентичністю відносно природної Залишки лізинілу і амінокінцеві залишки взаєпослідовності. модіють з бурштиновим ангідридом або ангідриТермін "ідентичність послідовності", який видами інших карбонових кислот. Дериватизація користовується тут, означає, що послідовності даними агентами володіє дією по заміні заряду порівнюють таким чином. Послідовності вирівнюзалишків лізинілу. Інші придатні реагенти для деють з використанням версії 9 Genetic Computing риватизації залишків, які містять альфаGroup's GAP (програми глобального вирівнюванамінокислоти, включають імідоефіри, такі як меня), з використанням матриці по умовчанню тилпіколінімідат; піридоксальфосфат; піридоксаль; (BLOSUM62) (значення від -4 до +11) з штрафом хлорборгідрид; тринітробензолсульфонова кислоза відкриття вставки -12 (за перше незначуще зната; О-метилізосечовина; 2,4-пентандіон; і взаємочення вставки) і з штрафом за продовження вставдія з гліоксилатом, яка каталізується трансамінаки -4 (за кожне додаткове подальше незначуще зою. значення у вставці). Після вирівнювання ідентичЗалишки аргінілу модифікують шляхом взаєність у відсотках розраховують, виражаючи кільмодії з одним або декількома загальноприйнятими кість збіжностей як відсоток від кількості амінокисреагентами, серед яких фенілгліоксаль; 2,3лот в заявленій послідовності. бутандіон; та нінгідрин. Дериватизація залишків Аналоги або варіанти за даним винаходом аргініну вимагає, щоб взаємодія проводилася в можна також визначати за наступною процедурою. лужних умовах, внаслідок високого значення рКа ДНК з нативною послідовністю відома з поперефункціональної групи гуанідину. Більше того дані дніх досліджень в даній галузі і може бути знайдереагенти можуть взаємодіяти з групами лізину, а на в літературі. Поліпептиди, що кодуються будьтакож з епсилон-аміногрупою аргініну. якою нуклеїновою кислотою, такою як ДНК або Специфічну модифікацію залишків тирозилу РНК, яка гібридизується з комплементарною поper se інтенсивно досліджували, з особливою цікаслідовністю природної ДНК або РНК у високо жорвістю до введення спектральних позначок в залистких або помірно жорстких умовах, при зберешки тирозилу шляхом взаємодії з ароматичними женні таким поліпептидом біологічної активності сполуками діазонію або тетранітрометаном. Найприродної послідовності, також розглядаються як частіше N-ацетилімідазол та тетранітрометан витакі, що відносяться до обсягу даного винаходу. користовують для утворення сполук ОУмови жорсткості являють собою функцію температури, що використовується в експерименті з ацетилтирозилу та e-нітропохідних, відповідно. гібридизації, молярності одновалентних катіонів і Карбоксильні бокові групи (аспартил або глувідсоткового вмісту формаміду в розчині гібридитаміл) селективно модифікують шляхом взаємодії зації. Для визначення ступеня жорсткості, пов'язаз карбодіімідами (R'N-C-N-R'), такими як 1ної з будь-яким даним набором умов, спочатку циклогексил-3-[2-морфолініл-(4-етил)]карбодіімід використовують рівняння Meinkoth et al. (1984) для або 1-етил-3-(4-азоніа-4,4визначення стабільності гібридів з 100%-ною ідендиметилпентил)карбодіімід. Більше того залишки тичністю, вираженою у вигляді температури плаваспартилу та глутамілу перетворюються в залишки аспарагінілу та глутамінілу шляхом взаємодії з лення гібриду ДНК-ДНК Тm: Тm=81,5°С+16,6(Log M)+0,41(%GC)-0,61(%форм.)іонами амонію. 500/L, де Μ являє собою молярність одновалентЗалишки глутамінілу та аспарагінілу часто дених катіонів, %GC являє собою відсоткову частку амідуються з утворенням відповідних залишків нуклеотидів G та С в даної ДНК, %форм. являє глутамілу та аспартилу. Альтернативно, дані залишки деамідуються в м'яких кислих умовах. Будьсобою відсоток формаміду в розчині гібридизації, і L являє собою довжину пар основ. Для кожного 11 79615 12 1°С, на який знижується Тm від розрахованого для Як тут мається на увазі, «неазіат» означає погібриду з 100%-ною ідентичністю, кількість дозвосилання на інші людські раси/популяції, які не підлених розбіжностей підвищується приблизно на падають під вказане вище визначення «азіат». 1%. Таким чином, якщо Тm, яке використовується Пацієнтів звичайно запитують на предмет їх для якогось даного експерименту з гібридизації самоідентифікації за «расою», або лікар на основі при конкретних концентраціях солі та формаміду, їх соматичних ознак і/або країни походження вкастановить 10°С нижче розрахованого для 100%зує расу. ного гібриду Тm за рівнянням Meinkoth, гібридизаЗа даним винаходом «пацієнти, які недостатція буде відбуватися, навіть якщо є аж до 10% ньо відповідали на попереднє лікування IFNневідповідностей. альфа» являють собою тих пацієнтів з HCV, які Умови високої жорсткості, що використовуютьзазнавали попереднього лікування будь-яким тися, такі, що вони стійкі до розходження послідовпом (або типами) альфа-інтерферону (щонайменностей до 15%, в той час як помірно жорсткі умови ше, 12 тижнів лікування в дозі, яка, щонайменше, стійкі до розходження послідовностей до 20%. У дорівнювала 3 МIU, 3 рази на тиждень), з одним з необмежуючих прикладах високо жорстких умов наступних результатів: (а) нездатність нормалізу(12-15°С нижче розрахованої Тm гібриду) і помірно вати сироваткову AL T, або (b) нормалізація ALT з жорстких умов (15-20°С нижче розрахованої Tm подальшим раптовим підйомом (підйом ALT) до гібриду) використовується розчин для промивання закінчення лікування. Дозування і режими можуть 2 x SSC (стандартний цитратно-сольовий) та 0,5% бути вибрані лікарем в залежності від тяжкості SDS при придатній температурі нижче розраховазахворювання, віку та статі пацієнта. Згідно з даної Tm гібриду. Остаточна жорсткість умов перним винаходом використовували наступні чотири винно визначається умовами промивання, зокрережими і дозування. ма, якщо використовувані умови промивання такі, Режим А: 12 MIU (44мкг) рекомбінантного IFNщо дозволяють менш стабільним гібридам утвобета-1а три рази на тиждень, рюватися разом з стабільними гібридами. Тоді Режим В: 12 MIU (44мкг) рекомбінантного IFNумови промивання більш високої жорсткості видабета-1а щодобово, ляють менш стабільні гібриди. Звичайні умови Режим С: 24 MIU (88мкг) рекомбінантного IFNгібридизації, які можуть бути використані в умовах бета-1а три рази на тиждень, або промивання від високо жорстких до помірно жорсРежим D: 24 MIU (88мкг) рекомбінантного IFNтких, описаних вище, являють собою гібридизацію бета-1а щодобово. в розчині 6 x SSC (або 6 x SSPE), 5 x реагенти За переважним здійсненням винаходу лікуDenhardt, 0,5% SDS, 100мкг/мл денатурованої, вання IFN-бета потрібно проводити тільки в підфрагментованої ДНК сперми лосося, при темперагрупі пацієнтів, які характеризувалися кліренсом турі, приблизно на 20-25°С нижче Tm. При викориРНК HCV через 4 тижні лікування. Фактично було станні змішаних зондів переважно використати зазначено, що в даній підгрупі пацієнтів імовірність замість SSC хлорид тетраметиламонію (ТМАС) того, що лікування буде успішним через 48 тижнів (Ausubel, 1987-1998). лікування, є дуже високою, близькою до 100%. Хоча даний винахід надає рекомбінантні спо«Кліренс РНК HCV» означає відсутність детектособи одержання визначених ви ще похідних, дані ваної РНК HCV в сироватці пацієнтів, які зазнавапохідні можуть також бути одержані загальноприйли лікування. нятими способами білкового синтезу, які добре Іншими словами, лікування за даним винаховідомі фахівцям в даній галузі. дом може переважно випереджати «фаза тестуЗа даним винаходом «раса» являє собою повання», в якій пацієнти одержують таке саме лікупуляцію, яка може відрізнятися від іншої підгрупи вання IFN-бета протягом 4 тижнів і в кінці «фази всередині виду (наприклад, виду людина). Раса тестування» переважно пацієнтам, які характеримає унікальні та особливі ансамблі генів і визначазуються кліренсом РНК HCV, пропонують провести ється за ознаками (як інтелектуальними, так і філікування протягом більшої кількості тижнів. зичними), які продукуються даним генетичним анЗа подальшим переважним здійсненням даносамблем. Представники однієї раси виявляють го винаходу лікування IFN-бета можна суміщати з характерні генетичні характеристики, оскільки восуп утнім лікуванням іншим противірусним лікарсьни мають загального генетичного предка і, отже, ким засобом. Противірусним лікарським засобом, схожий генетичний ансамбль. який найбільше звичайно використовується при На основі досліджень ядерної ДНК Luigi Cavalli лікуванні HCV, є рибавірин (аналог нуклеозиду), Sforza та його колег можна визначити, щонайменале інші лікарські засоби характеризуються деше, 6 людських рас/популяцій: кавказоїдна (яка яким потенціалом при даному лікуванні, і вони включає європейську та індійську популяції), афперелічені в останньому огляді [Т Wilkinson, Curr. риканська, азіатська, арктична, американських Op. In vst. Drug, 2(11), 1516-22, 2002] і включають індіанців та тихоокеанська [L. Cavalli-Sforza, інгібітори серинових протеаз, інгібітори РНКScientific American, 72-78, Nov. 1991]. залежної РНК-полімерази (RdRp) та інгібітори хеЗа даним винаходом «азіат» означає будьлікази. Дані лікарські засоби можуть бути введені якого суб'єкта, що походить від будь-якого з корінодночасно, окремо або послідовно при поєднанні з них народів Китаю, Монголії, Тайваню, Сінгапура, рекомбінантним IFN-бета. Кореї, Японії, В'єтнаму, Камбоджі, Лаосу, Бірми, Даний винахід описаний з посиланням на конТаїланду, Малайзії, Індонезії та Філіппін. кретні здійснення, але зміст опису містить всі модифікації та заміни, які можуть бути проведені фа 13 79615 14 хівцем в даній галузі без відхилення за межі знаstd стандартне відхилення чення та цілі формули винаходу. SCOT Сироваткова глутаматоксалоацетаВинахід буде описаний за допомогою наступтгрансаміназа (AST) них прикладів, які ніяким чином не повинні бути SGPT Сироваткова глутаматпіруваттранпризначені для обмеження даного винаходу. Присаміназа (ALT) клади будуть посилатися на наступні фігури. SMA Антитіла проти гладкого м'яза Список скорочень TIBC Здатність до зв'язування загального А Азіат заліза АЕ Побічний ефект т.р.т. три рази на тиждень ALT Аланінамінотрансфераза (SGPT) VSV Вірус везикулярного стоматиту AN A Антитіла проти ядра WBC Лейкоцит(и) AST Аспартатамінотрансфераза (SGOT) BO3 Всесвітня Організація Охорони BUN Азот сечовини крові здоров'я С Циротичний WISH Амніотична клітинна лінія людини CHC Хронічний гепатит С СІ Довірчий інтервал На Фіг.1 представлений розподіл пацієнтів CR Повна відповідь протягом курсу дослідження загальної популяції: CRF Форма історії хвороби 198 з 267 розподілених випадковим чином пацієнCT Комп'ютерна томографія тів завершували 48 тижнів лікування (74,2%), і 183 ELISA Імуноферментний твердофазний завершували періоди лікування та спостереження аналіз (68,5%). П'ятдесят шість (56) пацієнтів вибули до H&E Гематоксилін та еозин закінчення періоду лікування. HAI Індекс гістологічної активності На Фіг.2 також наведений звіт про розподіл HBc Коровий антиген гепатиту В пацієнтів протягом курсу дослідження, але він обHBe Антиген e гепатиту В межений азіатською популяцією: двадцять один HBsAg Поверхневий антиген гепатиту В (21) з 24 пацієнтів-азіатів завершували 48 тижнів HBV Вірус гепатиту В лікування (87,5%), і всі ці пацієнти продовжували hCG Людський хоріонічний гонадотропін проходити період спостереження. HCV Вірус гепатиту С Фіг.3 також стосується розподілу пацієнтів за HIV Вірус імунодефіциту людини часом, але на ній представлене порівняння між IEC Незалежний комітет з етики азіатською та неазіатською популяціями. З Фігури IFN Інтерферон можна помітити, що відношення виконання серед IgM Імуноглобулін Μ азіатських пацієнтів помітно вище, ніж серед нев./м. Внутрішньом'язовий (но) азіатів: 87,5% завершували період лікування в INR Міжнародне нормоване відношення порівнянні із 72,8% (177 з 243) неазіатів, і 87,5% IRB Спостережна рада інституту завершували як період лікування, так і період споIU Міжнародна одиниця (і) стереження в порівнянні із 66,7% (162 з 243) для в./в. Внутрішньовенний (но) неазіатів. л літр (и) На Фіг.4 наводиться порівняння основних реLU Лабораторні одиницізультатів за ефективністю пацієнтів-азіатів та немкг мікрограм (и) азіатів для вихідного параметра, асоційованого з мкмоль мікромоль (і) кліренсом РНК HCV. Точки являють собою відсомекв міліеквівалент (и) ток пацієнтів в кожній популяції, які досягали вихіМIU Мільйон міжнародних одиниць (106 дного параметра, і горизонтальні лінії являють IU) собою довірчі інтервали даних відсоткових часток; мл мілілітр (и) також для даних коефіцієнтів відмінності предстамм рт.ст. міліметр (и) ртутного стовпа влені нескоректовані коефіцієнти відмінності (OR) ммоль мілімоль (і) та довірчі інтервали (СІ). Хоча кількість азіатських MRI магнітно-резонансне зображення пацієнтів була відносно малою, азіати значно з (сканування) більшою імовірністю, ніж неазіати, досягали повноMU Мільйон одиниць (106 U) го кліренсу РНК HCV на 48 тиждень лікування (неNA Неазіат скоректований OR 5,0; СІ для коефіцієнта відмінNAb Нейтралізуюче антитіло (антитіла) ності [1,7-14,5]; р=0,006), на 24 тиждень NANBH Гепатит ні А, ні В спостереження (нескоректований OR 8,2; СІ для NC Нециротичний коефіцієнта відмінності [2,4-27,5]; р=0,003), і в NU Нейтралізуючі одиниці обидва моменти часу (тривала вірусологічна відOD Оптична щільність повідь, первинні вихідні параметри ефективності OR Коефіцієнт відмінності дослідження: нескоректований OR 16,6; СІ для PCR Полімеразна ланцюгова реакція коефіцієнта відмінності [4,1-67,3]; р