Вакцинний препарат та спосіб лікування хворого з інфекцією вірусу гепатиту або схильного до інфікування вірусом гепатиту

1 Вакцинный препарат, содержащий антиген вируса гепатита и фармацевтически приемлемый носитель, отличающийся тем, что он содержит антиген вируса гепатита в комбинации с 3-0дезацилированным монофосфорил-липидом А в количестве 10-100 мкг на дозу 2 Вакцинный препарат по п 1, отличающийся тем, что в качестве носителя он содержит алюминат 3 Вакцинный препарат по п 1, отличающийся тем, что в качестве носителя он содержит эмульсию типа масло в воде или иной носитель на липидной основе 4 Вакцинный препарат по любому из пп 1-3, отличающийся тем, что антигеном вируса гепатита является антиген вируса гепатита А 5 Вакцинный препарат по п 4, отличающийся тем, что антигеном вируса гепатита является инактивированный препарат, который происходит из штамма НМ-175 6 Вакцинный препарат по любому из пп 1-3, отличающийся тем, что антигеном вируса гепатита является антиген вируса гепатита В 7 Вакцинный препарат по п 6, отличающийся тем, что антигеном вируса гепатита является поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) или его вариант 8 Вакцинный препарат по п 7, отличающийся тем, что HBsAg представляет собой S антиген HbsAg, содержащий 226 аминокислот 9 Вакцинный препарат по п 8, отличающийся тем, что HBsAg дополнительно содержит пред-S последовательность 10 Вакцинный препарат по п 7 или 8, отличающийся тем, что HBsAg является составной частицей формулы (L*, S), где L* представляет модифицированный L-белок вируса гепатита В с аминокислотной последовательностью, содержащей остатки 12-52, за которыми следуют остатки 133-145, а затем - остатки 175-400 L-белка, при этом S представляет собой S-белок HBsAg 11 Вакцинный препарат по любому из пп 6-10, отличающийся тем, что он дополнительно содержит антиген вируса гепатита А 12 Вакцинный препарат по любому из пп 1-11, отличающийся тем, что он содержит один или несколько антигенов вируса гепатита и по меньшей мере один другой компонент, выбранный из негепатитного антигена, который обеспечивает защиту от одного или нескольких следующих заболеваний дифтерии, столбняка, коклюша, Наеmophilus influenzae b (Hib) и полиомиелита 13 Вакцинный препарат по п 12, отличающийся тем, что он выбран из группы, состоящей из комбинации DTP (дифтерия-столбняк-коклюш)HBsAg, комбинации Hib- HBsAg, комбинации DTPHib-HBsAg и комбинации IPV (инактивированная вакцина полиомиелита)-ОТР- HBsAg 14 Вакцинный препарат по п 12, отличающийся тем, что он дополнительно содержит антиген вируса гепатита А 15 Вакцинный препарат по любому из пп 1-14, отличающийся тем, что он предназначен для использования в медицине 16 Способ лечения больного, страдающего от протекающей инфекции вирусом гепатита или склонного к инфицированию вирусом гепатита, включающий введение вакцинного препарата, отличающийся тем, что больному вводят эффективное количество вакцинного препарата по любому из пп 1-15 О 00 00 (О 44688 Настоящее изобретение относится к новым вакцинным препаратам, способам их получения и их применению в медицине В частности, настоящее изобретение относится к новым препаратам для лечения инфекций гепатита и к комбинированным вакцинным препаратам, включающими компонент вакцины против гепатита Вирусный гепатит, вызываемый вирусами гепатита А, В, С, D и Е, является очень распространенным вирусным заболеванием Что касается вирусов В и С, то при их участии, в частности, во многих случаях развивается рак печени Таким образом, создание эффективных вакцин имеет важнейшее значение, и несмотря на заметный успех в этой области, тем не менее остается задачей дня Обзор современных вакцин против гепатита, включающий ряд ключевых ссылок можно найти в статье Lancel, 12-го мая 1990 г, стр 1142 (Проф A L W F Essleston) См также "Вирусный гепатит и заболевания печени" (Труды Международного симпозиума, 1990 г, ред І В Hollmger, S М Lemon, H Margohs, публикация Вильяме энд Вилкинс В применяемом здесь значении выражение "антиген гепатита" относится к любому антигенному материалу, происходящему из вируса гепатита, который может быть использован для создания иммунности к вирусу у человека Антиген гепатита может представлять собой, например, полипептид, синтезированный методами биотехнологии, или ослабленный штамм вируса гепатита возможно дезактивированный известными способами Изобретением охватываются все антигены гепатита, будь то гепатит А, В, С, D и Е, примеры которых приводятся ниже Инфицирование вирусом гепатита А (ГАВ) является широкораспространенной проблемой, но существуют и вакцины, которые могут быть использованы для массовой иммунизации, например, продукт под названием "Хавтрикс" (СмитКлайн Бичам Байолоджикалс), представляющий собой умерщвленную ослабленную вакцину, полученную из штамма НМ-175 ГАВ (см "Дезактивированные вероятные вакцины против гепатита А", F Е Andre, A Hepburn, E D Hondt, Prog Med Virol, 37, стр 72 - 95 (1990) и монографию о продукте "Хавтрикс", опубликованную компанией СмитКлайн Бичам Байолоджикалс (1991)) В работе Fleming и др (местн ссылка, стр 56 - 71) сделан обзор клинических аспектов, вирусологии иммунологии и эпидемиологии гепатита А, и рассматриваются пути создания вакцин против этой обычной вирусной инфекции В применяемом здесь значении выражение "ГАВ антиген" относится к любому антигену, способному стимулировать в человеческом организме нейтрализацию антител к ГАВ ГАВ антиген может представлять собой живую ослабленную вирусную частицу или дезактивированную ослабленную вирусную частицу, или может быть, например, ГАВ капсидой или ГАВ вирусным белком, который обычно получают методами биотехноло гии Инфицирование вирусом гепатита В (ГВВ) является широко распространенной проблемой, но вакцины, которую можно было бы использовать для массовой иммунизации, не создано В качестве примера можно указать созданный методами биотехнологии продукт под названием "Энджетрикс-Б" (Смит-Кпайн Бичам) Получение поверхностного антигена вируса гепатита В (HbsfAg) хорошо документировано См , например Harford и др, Develop Biol Standard 54, стр 125 (1983), Greog и др, Biotechnology, 5, стр 479 (1987), ЕР-А-0 226 846, ЕР-А-0 299 108 и ссылки в этих публикациях В применяемом здесь значении выражение "поверхностный антиген вируса гепатита В" или "HBsAg" включает любой антиген HBsAg или его фрагмент, проявляющие антигенность поверхностного антигена ГВВ Необходимей указать, что помимо последовательности из 226 аминокислот HBsAg S антигена (см Tiollais и др , Nature, 317, 489 (1985) и прилагаемые к работе ссылки) HbsAg, упоминаемый здесь, может при желании содержать всю или часть предпоследовательности, описанной в вышеприведенных ссылках и в ЕР-А0 278 940 В частности HBsAg может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, включающей остатки 12-52, за которыми следуют остатки 133 - 145 и затем остатки 175 - 400 L-белка HBsAg относительно открытой рамки считывания вируса гепатита В ad серотипа (данный полипептид получил обозначение L*, см ЕР 0 414 374) HBsAg в объеме изобретения может включать также npeflS1-npeflS2-S полипептид, описанный в ЕР О 198 474 (Endotronics) или его аналоги, например, аналоги, описанные в ЕР 0 304 578 (Me Cormick и Jones) Упоминаемый здесь HBsAg может также относится к мутантам, такому как например, "ускользнувший" мутант, раскрытый в WO 91/14703 или заявке на Европейский патент, № публикации 0 511 855 А1, особенно HBsAg, в котором замещение аминокислоты в положении 145 представлено заменой глицина на аргинин Обычно HBsAg имеет вид частицы Частицы могут состоять, например, из одного только 3 белка или это могут быть, составные частицы, например (L*, S), где L* принимает вышеуказанные значения и S представляет S-белок HbsAg Указанная частица предпочтительно имеет ту форму, в которой она экспрессируется в дрожжах Вирус гепатита С (ГСВ) подробно рассмотрен в GB 2 212 511В и приведенных в нем ссылках Указано, что вакцины могут быть получены из одного или нескольких иммуногенных полипептидов, происходящих из ГСВ кДНК Вирус гепатита D обсуждается в издании "Вирусный гепатит и заболевания печени" (Симпозиум 1990 г (см выше)) Вирус гепатита Е (ГЕВ) подробно рассмотрен в WO 89/12462 и приведенных в нем ссылках Пример вакцинного препарата включает рекомби 44688 нантный белок или белковую смесь, происходящую из ГЕВ, в фармакологически приемлемом адьюванте Хотя экспериментальные и промышленные вакцины гепатита, например Хаврикс и ЭнгериксБ дают прекрасные результаты, общепризнанный факт, что нужна оптимальная вакцина, которая не только стимулировала нейтрализующие антитела, но также возможно более эффективно стимулировала клеточную иммунность, передаваемую через Т-клетки Кроме того существует необходимость в комбинированных вакцинах, содержащих гепатитный компонент, предназначенный стимулировать указанным путем клеточную иммунность Настоящим изобретением указанные цели достигаются Настоящим изобретением дается вакцина, содержащая антиген гепатита в сочетании с 3-0дезацилированным монофосфориллипидом А (сокращенно МФЛ) и приемлемым носителем 3-0-Дезацилированный монофосфорил-липид А (или З-дез-0-ацилированный монофосфориллипид А) ранее обозначался, как ЗД-МФЛ или дЗМФЛ для указания на то, что положение 3 восстанавливающего конца дез-0-ацилировано Его получение см GB 2 220 211 А С химической точки зрения он представляет собой смесь 3дезацилированного монофосфорил-липида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями В данном описании обозначение, ЗД-МФЛ (или дЗ-МФЛ) сокращенно до МФЛ, поскольку МФЛ ("MPL") - это зарегистрированное фирменное наименование для выпускаемого фирмой Риби Иммунокем , Монтана в качестве готового продукта 3-0дезацилированного Монофосфорил-липида А В GB 2 220 211А упоминается, что эндотоксичность ранее применяемых энтеробактериальных липополисахаридов (ЛПС) уменьшается с сохранением при этом иммуногенных свойств Однако, в GB 2 220 211 эти открытия указаны всего лишь в связи с бактериальными (грамотрицательными) системами Ко времени даты приоритета данного изобретения применение 3дезацилированного монофосфорил-липида А в качестве адьюванта для вакцины, содержащей вирусный антиген гепатита, и не предполагалось Однако, неожиданно было обнаружено, что вакцинные препараты изобретения, содержащие вирусные антигены гепатита, обладают особыми преимуществами, как будет показано ниже Их главное преимущество состоит в том, что вакцинные составы изобретения очень эффективны в создании защитной иммунности даже при очень низких дозах антигена Составы создают прекрасную защиту против первичной инфекции и с успехом стимулируют как специфичную гуморальную (нейтрал изирующие антитела), так и передаваемую эффекторными клетками (DTH) иммунные реакции Еще одно важное, преимущество состоит в том, что вакцинные препараты изобретения могут быть также использованы и в качестве лечебных вакцин Вышеуказанный МФЛ обычно присутствует в интервале концентраций 10 - ЮОуг, предпочтительно 25 - 50уг с одновременным присутствием антигена гепатита в интервале 2 - 50уг на дозу Носителем может служить эмульсия типа масло в воде, липидный носитель или алюминат (соль алюминия) Неядовитые эмульсии, типа масло в воде предпочтительно содержат неядовитое масло, напр , сквален и эмульгатор, например, Твин 80 в водной среде Водная среда может представлять собой, например, фосфатный буферный солевой раствор Одно из воплощений изобретения представлено TAB антигеном (например, таким, как в Хавриксе) в смеси с МФЛ и гидроксидом алюминия (см ниже) Еще одно воплощение изобретения, описанное ниже, представлено HBSAg S антигеном (например, таким, как в Энгериксе-Б) в смеси с МФЛ и гидроксидом алюминия Другое характерное воплощение изобретения представлено HBSAg антигеном в виде (L*, S) частиц (определение см выше) в смеси с МФЛ и гидроксидом алюминия В вышеприведенных воплощениях эмульсия типа масло в воде может быть использована вместо алюмината Другие воплощения изобретения показаны в нижеследующих примерах Изобретением в своем дополнительном аспекте дается вакцинный состав, описанный выше и предназначенный для применения в медицине, в частности, для лечения или профилактики инфицирования вирусом гепатита В рекомендуемом аспекте изобретения вакцина изобретения является лечебной вакциной, применимой для лечения текущей инфекции гепатита, особенно в случае людей, страдающих инфицированным гепатитом В и/или гепатитом С В свете полученных удивительно эффективных результатов еще одним своим рекомендуемым аспектом изобретением дается вакцинный препарат для лечения или профилактики инфицирования гепатитом и/или гепатитом В Предпочтительно вакцинный препарат гепатита изобретения содержит другие антигены с тем, чтобы быть эффективным для лечения или профилактики одной или нескольких бактериальных, вирусных или грибковых инфекций Соответственно изобретенный вакцинный препарат изобретения предпочтительно содержит хотя бы один другой компонент, выбранный из негепатитных антигенов, для которого известна способность обеспечивать защиту против одного или нескольких следующих заболеваний дифтерии, коклюша, столбняка, Гемофильного гриппа В (Ггв) и полиомиелита Рекомендуется, чтобы изобретенная вакцина включала вышеохарактеризованный HBsAg Конкретные комбинированные вакцины, охватываемые объемом изобретения, включают ДСК (дифтерия-столбняк-коклюш)-гепатит В комбинированный вакцинный состав, Ггв-гепатит В вакцинный препарат, ДСК-Ггв-гепатит В вакцинный состав и ИВП (инактивированная вакцина полиомиелита)-ДСК-Ггв-гепатит В вакцинный состав Вышеприведенные комбинации могут с успехом включать компонент, обеспечивающий защиту против гепатита А, особенно умерщвленный ос 44688 8 лабленный штамм, происходящий из НМ-175 натной температуре Затем к раствору добавляют штамма, такого, как присутствующий в Хавриксе 30 - 50уг ДМФЛ (концентрация раствора 1мг/мл) Объем и осмолярность устанавливают до бООул Приемлемые для применения в таких вакцидобавлением воды для инъекций и фосфатного нах компоненты уже выпускаются промышленнобуфера в 5х концентрации Раствор выдерживают стью, и касающиеся их подробности могут быть один час при комнатной температуре и хранят при получены во Всемирной Организации Здраво4°С до момента применения Созревание состава охранения К примеру, ИВП компонентом может происходит в ходе хранения В результате полуслужить инактивированная вакцина полиомиелита чают 10 доз для инъекций, предназначенных для Сальк Вакцина коклюша может состоять из целых испытания на мышах клеток или бесклеточного продукта Вакцина гепатита или комбинированная вакАналогичный состав может быть получен прицина изобретения предпочтительно является пеменением в качестве HBsAg компонента составнодиатрической вакциной го (L*, S) антигена, охарактеризованного выше Вакцинные препараты в целом описаны в изПример 2 Вакцинный состав против гепатита дании "Новые направления в создании вакцин", А под ред Voller и др , Универ-сити Парк Пресс, МФЛ получен от фирмы Риби Иммунокем РиБалтимор, Мерилэнд, США, 1978 Капсулирование серч Инк Гидроксид алюминия получен от фирмы в липосомы описано, например, Fullerton, патент Суперфос (Альгидрогель) США 4,235,877 Конъюгирование белков с макроГАВ (360-22 ЭЕ на дозу) предварительно адмолекулами, раскрыто, например Likhite, патент сорбируют на 10% гидроксида алюминия до коСША 4,372,945 и Armor и др, патент США нечной концентрации 0,5мг/мл, Затем к раствору 4,474,757 добавляют МФЛ (12,5 - ЮОуг на дозу) Количество антигена в каждой дозе вакцины К раствору добавляют остальное количество подбирают такое, чтобы это было количество, гидроксида алюминия и оставляют на один час индуцирующее иммунозащитную реакцию без при комнатной температуре Объем устанавливазаметных нежелательных побочных эффектов ют добавлением фосфатного буфера (фосфат типичных вакцин Такое количество будет менятьЮмМ, NaCI 150мМ) и конечный состав хранят при ся в зависимости от применяемых специфичных 4°С до момента применения иммуногенов Как правило, ожидается, что каждая Пример 3 Комбинированный вакцинный содоза будет содержать 1 - ЮООуг общего иммуностав гепатит В + гепатит А гена, предпочтительно 2 - ЮОуг, наиболее предHBsAg адсорбируют на 90% конечного колипочтительно 4 - 40уг Оптимальное количество чества гидроксида алюминия (0,5мг/мл) и выдердля конкретной вакцины может быть выявлено живают в течение ночи при комнатной температустандартными исследованиями, включающими ре Устанавливают рН 6,2 и препарат оставляют определение титров антител и других реакций у на 14 дней при комнатной температуре для высубъектов После начальной вакцинации субъекты зревания примерно через 4 недели могут быть подвергнуты Антиген гепатита А (360-22 ЭЕ на дозу) в виде бустерному инъектированию инактивированного производного штамма НМ-175 (как в Хавриксе) предварительно адсорбируют на В своем дополнительном аспекте настоящим 10% гидроксида алюминия с конечной концентраизобретением дается способ изготовления вакцицией 0,5мг/мл Затем к раствору добавляют осны, обладающей эффективностью в предотвратальное количество гидроксида и перемешивают щении или лечении инфекции гепатита Способ один час при комнатной температуре состоит в смешивании антигена гепатита (определение см выше) с МФЛ и носителем После этого к составу HBsAg добавляют адсорбированный на гидроксиде алюминия ГАВ Применением данного способа рекомендуется смешивать с HBSAg один или несколько дополниК раствору ГАВ - HBsAg добавляют МФЛ при тельных компонентов с получением комбинироконечной концентрации 12,5 - ЮОуг на 1мл дозы, ванной вакцины, предпочтительно применяемой в объем доводят до конечного объема дозы и сопедиатрии став хранят при 4°С до момента применения Следующие примеры иллюстрируют изобреПример 4 Комбинированные вакцины, содертение и его преимущества жащие дополнительные антигены Пример 1 Вакцинный состав против гепатита Комбинированные вакцины, содержащие ДСК, В ИВП, Ггв, бесклеточных или полноклеточных антигенов коклюша, получают добавлением одного МФЛ получен от фирмы Риби Иммунокем Риили нескольких целевых антигенов к составам, серч Инк Гидроксид алюминия получен от фирмы описанным в вышеприведенных примере 1, приСуперфос (Альгидрогель) мере 2 или примере 3 МФЛ суспендируют в воде для инъекций до концентрации в интервале 0,2 - 1мг/мл путем обПример 5 работки ультразвуком на водяной бане, пока разПовышение гуморальной иммунности и индумер частиц не достигнет 80 - 500нм, при опредецирование передаваемой клетками иммунности лении фотокорреляцией светорассеивания иммунизацией мышей HBsAg в составах с гидроксидом алюминия и МФЛ HBsAg (S-антиген такой, как в Энгериксе-Б, 1 20уг) в фосфатном буферном солевом растворе А Влияние АІ(ОН)з + МФЛ на индуцирование (1мг/мл) адсорбируют на 30 - ЮОуг гидроксида анти-гв антител алюминия (раствор с концентрацией Al + Мышей линии Balb/c иммунизируют подкожно 10,38мг/мл) перемешиванием один час при комили внутрикожно, рекомбинантным HBsAg, адсор 44688 10 всего лишь маргинальную реакцию (0,75мИЕ/мл) Число мышей, показывающих результаты, также более высоко в случае МФЛ (9/10 и 9/10 против 1/10 в отсутствие МФЛ) Действие МФЛ подтверждена после бустерной инъекции, поскольку титры, полученные для лотов DSAR501 и 502, были в 6 раз выше, чем наблюдаемые без МФЛ Результаты показывают, что по меньшей мере, для мышей МФЛ (> 500нм) способен улучшить как кинетику анти-ГВ реакции, так и уровень антиГВ реакции Полученные результаты определением специфичных ИгГ и ИгГ2а после иммунизации лотами DSAH16 (без МФЛ) и DSAR502 (с МФЛ) титр антиГБ ИгГ в 5 раз (первичная реакция) и 3 раза (вторичная реакция) выше в случае присутствия МФЛ Что касается ИгГ2а реакции, то действие МФЛ еще более поразительно, по крайней мере после второй дозы, указывая на преимущественное индуцирование ИгГ2а Это косвенно отражает активацию передаваемого, клетками иммунитета (секретирование г-интерферона) содержащим МФЛ препаратом ОПЫТ III Действие дозы МФЛ (< ЮОнм) на иммуногенность рек HBsAg адсорбированного на А1(ОН)3 Поскольку МФЛ гораздо проще получить в воспроизводимом режиме в виде частиц размером 500нм, исследовано влияние частиц МФЛ размером < ЮОнм на иммуногенность рек HBsAg, предварительно адсорбированного на АІ(ОН)з Группы из 10 мышей (Balb/c, самки, возраст 7 недель) инъектируют подкожно 1мкг рек HBsAg адсорбированного на 50мкг AI+++ (в виде АІ(ОН)з), и в присутствии увеличивающихся количеств (3,1 25мкг) МФЛ ( 500нм) индуцируют сильное повышение реакции, как в Получено 3 клинических лота, рек HBsAg адслучае первичной реакции, так и в случае вторичсорбированного на АІ(ОН)з лот DSAH16 не соной реакции Максимум реакции наблюдается при держал МФЛ и служил в качестве контроля Лоты дозе 6,25мкг, после чего понижается и становится DSAR501 и 502 получены одинаковым путем равной реакции без МФЛ при более высоких при(20мкг рек HBsAg, адсорбированного на 0,5мг меняемых дозах МФЛ (25мкг) AI+++ в виде АІ(ОН)з), но содержат 50мкг МФЛ (> бированным на АІ(ОН)з с МФЛ в качестве адъюванта Мышей иммунизируют дважды HBsAg/AI/МФЛ составами и реакцию антител определяют после введения первой и второй доз Общий Иг определяют методом ФИСА (ELISA) или применением набора AUSAB (Аббот Лаб , ИЛ), при этом особое внимание обращают на индуцирование антител ИгГ2а изотипа, поскольку данный изотип в основном индуцируется секретированием г-интерферона Таким образом, индуцирование данного изотипа косвенно отражает активацию передаваемого клетками иммунитета, а именно, активацию Tkl Определяют отношение HBsAg/МФЛ, а также размер частиц МФЛ, поскольку суспендирование МФЛ может привести к частицам размером 500нм ОПЫТ 1 Влияние дозы МФЛ (> 500нм) на иммуногенность рек HBsAg, адсорбированного на А1(ОН)3 Группам из 10 самок Balb/c мышей инъектируют подкожно 2,5мкг рек HBsAg, адсорбированного на 50мкг AI+++ (в виде АІ(ОН)з), и возрастающими количествами МФЛ (3,1 - 50мкг) с размером частиц > 500нм Мышей инъектируют дважды в объеме ЮОмкл и с интервалом в 2 недели Мышам пускают кровь через 2 недели после первой инъекции (частичное кровопускание,) и через неделю после бустерной инъекции Методом ФИСА определяют общий анти-ГВ ИгГ и специфичный ИгГ2а применением рек HBsAg в качестве антигена захвата Титры выражают в виде обратной величины разбавления, соответствующего 50% максимальной величины (разбавление в средней точке) Полученные результаты приведены в таблице 1 Результаты указывают на повышение как ИгГ, так и ИгГ2а с ростом доз МФЛ, особенно для доз в интервале 12,5 - 50мкг Это влияние показано и для первичной, и для вторичной реакций и особенно очевидно, в случае ИгГ2а (вплоть до 20-тикратного повышения), что косвенно указывает на секретирование г-интерферона, индуцируемое иммунизацией МФЛ 500нм) Три лота инъектируют подкожно в группах из 10 мышей (200мкл, содержащих 2,5мкг HBsAg, ЮОмкг AI+++ и 6,25мкг МФЛ) дважды с интервалом в 2 недели Кровь у мышей берут на 14-ый день и неделю спустя после бустерной инъекции Анти-ГВ антитела определяют либо для ИгГ, либо для ИгГ2а применением набора AUSAB или самодельного ФИСА Полученные результаты приведены в таблице 2 Результаты показывают, что 2 недели спустя после первой инъекции два содержащих МФЛ лота индуцируют весьма существенную анти-ГВ реакцию (12,4 и 41,9мИЕ/мл), в то время как не содержащий МФЛ лот индуцирует Характер реакции антител аналогичен для ИгГ, ИгГ2а и общего Иг В этом отличие от результатов, полученных для МФЛ с большим размером частиц (7500нм) (см опыт 1), и это наталкивает на мысль о том, что МФЛ с меньшим размером частиц ( 500нм) (по меньшей мере для гуморального иммунитета), поскольку для достижения максимального эффекта требуется меньше МФЛ Наивысшая активность МФЛ с меньшим размером частиц подтверждена в нескольких экспериментах Как показано для частиц МФЛ большего размера (> 500нм), действие МФЛ в качестве адъю 11 44688 12 ванта более эффективно для ИгГ2а, чем для обзации HBsAg, адсорбированным на АІ(ОН)з, даже щего Иг и ИгГ При максимальном проявлении в присутствии МФЛ вторичной реакции (6,25мкг МФЛ) наблюдается Такой характер секретирования указывает, 25-тикратное повышение ИгГ2а, в то время как что специфичные Тп1 клетки (ИЛ-2, ИНФ-г) индуповышение для ИгГ и для общего Иг составляет цируются иммунизацией адсорбированным HBsAg соответственно 7,6 и 4,3 раза в присутствии МФЛ, но не в отсутствие МФЛ Тем не менее в данных условиях иммунизации никаких В Индуцирование передаваемого клетками Тп2 клеток (ИЛ-4) не обнаружено иммунитета рек HBsAg, адсорбированным на АІ(ОН)з, влияние МФЛ ОПЫТ 11 Влияние дозы МФЛ ( 500нм) на индуци5мкг/мл рек HBsAg рование ThI клеток после иммунизации Balb/c мышей адсорбированным на АІ(ОН)з HBsAg Секретирование ИЛ-2 определяют стимулированием пролиферации VDA2 клеток и концентраГруппу из 10 Balb/c мышей (самки, возраст 5 цию ИЛ-2 выражают в виде индекса стимулируванедель) иммунизируют инъекций в подошвы кажния (ИС), секретирование ИНФ-г определяют с дой лапки ЗОмкл, содержащих Юмкг HBsAg, 15мкг помощью промышленного набора и выражают в AI+++ (в виде АІ(ОН)з) и 15мкг МФЛ Контрольных пг/мл мышей инъектируют аналогично тем же количеством рек HBsAg, смешанным либо с ПАФ (положиОбнаружено, что секретирование ИЛ-2 резко тельный контроль), либо адсорбированным на возрастает при самой низкой дозе МФЛ (7,5мкг), и АІ(ОН)з без МФЛ (отрицательный контроль) максимальный эффект достигается при 15мкг МФЛ Через шесть дней после иммунизации мышей убивают и у них удаляют подколенные лимфатиСекретирование ИЛ-2 в целом более важно ческие узлы Клетки лимфатических узлов (КЛУ, через 24ч, чем через 48ч или 72ч 2105клеток/мл) культивируют различное время (от Секретирования ИНФ-г не происходит, если 24 часов до 74 часов) в RPMI среде с добавкой 1% HBsAg адсорбирован на АІ(ОН)з в отсутствие отрицательной мышиной сыворотки и содержаМФЛ Небольшая доза МФЛ (7,5мкг) индуцирует щей 5мкг/мл рек HBsAg После, прекращения секретирование ИНФ-г, и в этом случае максикультивирования определяют количество секремальный эффект достигается при 15мкг МФЛ В тируемых в среду ИЛ-2, ИНФ-г и ИЛ-4, ИЛ-2 выявотличие от результатов, наблюдаемых для ИЛ-2, ляют по его способности стимулировать пролифесекретирование ИНФ-г замедлено и возрастает со рацию (устанавливают введением ЗН-тимидина) временем вплоть до 96 часов ИЛ-2-зависимой CTL линии (VDA2 клетки) и титр Суммируя полученные данные, можно скавыражают в виде индекса стимулирования (ИС = зать, что МФЛ (ЮОнм) является эффективным количеству ЗН-тимидина, введенного в стимулииндуктором Тп1 клеток в сочетании с HBsAg, адрованные клетки/количество ЗН-тимидина, ввесорбированным на АІ(ОН)з денного в нестимулированные клетки) КоличестС ЗАКЛЮЧЕНИЕ ва ИЛ-4 и ИНФ-г определяют промышленных Исследовано действие состава, содержащего ФИСА наборов (Холланд Биотекнолоджи для HBsAg, адсорбированного на АІ(ОН)з, и МФЛ, как ИФН-г и Эндоген для ИЛ-4) Титры выражают в пг на гуморальный, так и передаваемый клетками ИНФ-г/мл иммунитет у Balb/c мышей Результаты показывают, что МФЛ явно улучшает кинетику анти-ГВ реПолученные результаты показывают, что ИЛакции, поскольку после как первичной, так и вто2, ИЛ-4 или ИНФ-г не секретируются в заметных ричной иммунизации наблюдается гораздо количествах КЛУ от мышей, иммунизированных больше анти-ГВ антител Меняется также и качеадсорбированным на АІ(ОН)з HBsAg Напротив, ство антител и наблюдается преимущественное отмечен высокий уровень секреции ИЛ-2 (ИС = 38 индуцирование ИгГ2а, косвенно отражающего за 48ч) и значительные количества ИНФ-г КЛУ от секретирование ИНФ-г, т е индуцирование перемышей, иммунизированных HBsAg, адсорбиродаваемого клетками иммунитета ванным на АІ(ОН)з + МФЛ Секретирование аналогично (ИНФ-г) или выше (ИЛ-2) в сравнении с наПрямое исследование индцирования Тп1 клеблюдаемым для мышей, иммунизированных ток составами, содержащими HBsAg, АІ(ОН)з и HBsAg + ПАФ, и секретирование in vitro происхоМФЛ, четко указывает на то, что МФЛ является дит раньше эффективным индуктором Тп1 клеток, секретирующих и ИЛ-2, и ИНФ-г Таким образом, составы Никакого ИЛ-4 не обнаружено после иммуни 13 44688 такого типа имеют важное значение для создания лечебных вакцин Что касается Таблиц, показывающих результаты вышеописанных экспериментов, см нижеследующие Таблицы 1 - 6 Пример 6 Клиническое применение МФЛ в качестве адъюванта к HBsAg Предварительные результаты Исследование МФЛ-ГВВ-002 (продолжаются) Данным исследованием HBsAg сравнивается с Энгериксом-Б в экспериментах на молодых здоровых непримированных добровольцах Цели Иммуногенность величина реакции анти-ГВ антител Кинетика реакции анти-ГВ антител Передаваемый клетками иммунитет, индуцируемый обеими вакцинами (in vitro и in vivo) Реактогенность, токсикология и безопасность Материалы и методы а) Вакцины HBsAg (как в Энгериксе-Б) 20мкг 20мкг Алюминат МФЛ 500мкг 500мкг 50мкг Отсутствие b) Контингент - Здоровые взрослые добровольцы в возрасте 18 - 30 лет - Добровольцы должны быть отрицательными на маркеры ГВВ и никогда прежде не вакцинированными против гепатита В c) Методика - Дважды слепой неупорядоченный метод исследования - План вакцинации 0, 1, 6 месяцев - Наблюдение до 12-го месяца - Образцы крови - Тест на анти-ГВ антитела проводят до 7 дней, 15 дней, 30 дней после каждой вакцинации - Биохимию и гематологические параметры определяют до и 2 дня спустя после каждой дозы - Кровь на определения передаваемого клетками иммунитета берут до и после курса первичной вакцинации и бустерной инъекции - Реактогенность Необходимо регистрировать в карте вакцинации субъектов появление местных и общих признаков и симптомов в день вакцинации и в течение 7 последующих дней Результаты Результаты исследований вплоть до 2 месяцев после второй дозы приводятся ниже Контингент Всего 29 субъектов дали свое информированное согласие, но только 27 (15 мужчин и 12 женщин) отвечали предъявляемым требованиям 15 субъектов образовали группу 1 и 12 - группу 11 Безопасность Никаких серьезных нежелательных проявлений не отмечено, и ни один из субъектов не был выведен или должен быть выведен из эксперимента Никаких клинически значимых изменений в 14 гематологических или биохимических параметрах не наблюдалось Частота и тяжесть общих и местных признаков и симптомов была одинаковой в обеих группах Иммуногенность Титры анти-ГВ антител определялись вплоть да 90-го дня после введения второй дозы Степень сероконверсии (СС в %) определяется, как появление антител у первоначально сероотрицательных субъектов Степень сероконверсии определяется, как процент субъектов с титрами защитных анти-ГВ антител Очевидно, если не наблюдается четкой разницы в величине реакции, антител с ГЗТ, сравнимым для двух групп, в этом случае, кинетика реакции будетразличной, и в этом явное преимущество содержащей МФЛ вакцины В самом деле, через 7 дней после введения второй дозы 93% и 80% субъектов, вакцинированных МФЛ-ГВВ, оказались серопревращенными и соответственно защищенными В этом случае степень сероконверсии составляет 95% Для сравнения степень сероконверсии в группе, вакцинированной Энгериксом-Б, составляет 58% Эта разница сохраняется и через два месяца после введения второй дозы и особенно очевидно в случае степени сероконвесии В указанный момент времени все субъекты, вакцинированные МФЛ-ГВВ, были защищены в сравнении с 58% субъектов, вакцинированных вакциной с алюминатом в качестве адъюванта Исследование МФЛ-ГВВ-003 (продолжаются) Материалы и методы аналогичны тем, которые применялись при исследовании МФЛ-ГВВ002 (см выше) Но схема вакцинации была другой Группа Число субъектов I 25 МФЛ-HBsAgалюм II 25 Энгерикс-Б III 25 МФЛ-HBsAgалюм IV 25 Энгерикс-Б Вакцина Схема 0 -2 ца 0 -2 ца 0 -6 цев 0 -6 цев месямесямесямеся Результаты Хотя кинетика реакций анти-ГВ антител не изучалась столь же тщательно, как в предыдущем исследовании, в настоящем исследовании, видимо, можно сделать те же выводы Субъекты, вакцинированные вакциной с МФЛ в качестве адъюванта, дают лучшую реакцию по сравнении с субъектами, инъектированными вакциной без МФЛ Все, кроме одного субъекта (95,8%) имеют защитные титры через месяц после введения второй дозы МФЛ-ГВВ в сравнении с 72,7% в группе, вакцинированной Энгетриксом-Б Более того, в отличие от предыдущего исследования МФЛ-ГВВ вакцина, видимо, индуцирует более высокие титры антитела по сравнению с Энгериксом-Б (214 и 72мИЕ/мл соответственно) Возможно важную роль играет увеличение интервала между двумя дозами "ел 15 44688 16 Выводы вакцине против ГАВ (мкг/дозу) В этих двух исследованиях- на здоровых 0 123,7 взрослых добровольцах испытана вакцина против 154 гепатита В (содержит HBsAg такой, как в Энгет6 101,1 риксе-Б, и алюминат) с МФЛ в качестве адъюван12,5 47,1 та, которая сравнивалась с Энгериксом-Б (HBsAg S-антиген в смеси с алюминатом) с применением Таблица 2 различных схем вакцинации Если, видимо, не существует разницы в иммуногенности между Влияние возрастающих доз МФЛ (> 500нм) на двумя вакцинами после одной дозы, то МФЛ-ГВВ иммуногенность рек HBsAg, адсорбированного вакцина показывает явное преимущество после на АІ(ОН)з второй дозы, особенно с точки зрения болеет высокого процента субъектов с титрами защитного Анти-ГБ реакция Количество антитела ГЗТ также более высоко в этой группе, МФЛ Общий ИгГ ИгГ2а если интервал между двумя дозами два месяца, а (м кг/доза) Д14 Д14 Д21 Д21 не один 0* 69 743 3,2 11 Это могло бы указывать на лучшее примиро3,13 122 541 3,8 20 вание реакции при добавлении к антигену МФЛ 6,25 296 882 6,4 24 Поэтому такая вакцина могла бы иметь большую 12,5 371 1359 10 48 ценность для субъектов с замедленной или низкой 25 456 1493 189 138 реакцией на вакцинацию против гепатита В, на50 403 1776 33 242 пример, людей старшего возраста или иммунокомпромисных субъектов Таблица 3 Что касается Таблиц, в которых приведены результаты вышеописанных экспериментов, см Сравнение 3 клинических лотов, содержащих или нижеследующие Таблицы 7 - 9 не содержащих МФЛ, А АВ реакция Пример 7 Гепатит А Исследования МФЛ на мышах Доза HBsAg Доза Следующий эксперимент показывает, что доГЗТ анти-ГВ на А1(ОН)3 VAK Лот бавление МФЛ к вакцине против гепатита А ока(мИЕ/мл) (мкг) (мкг) зывает благоприятное воздействие Это показано DSAH16 2,5 0 0,75 15,1 более низкими значениями ЭД50 (доза, выраженная в ФИСА единицах (ФЕ), вызывающая серолоDSAR501 2,5 6,25 12,4 96,7 гическую реакцию у 50% инъектированных животDSAR502 2,5 6,25 41,9 89,2 ных) Метод Таблица 4 Мышей линии NMRI инъектируют 1 дозой экспериментальной вакцины против ГАВ, содержаСравнение 2 клинических лотов, содержащих или щей 360, 120, 40, 13,ЗФЕ/дозу в в сочетании с не содержащих МФЛ (> 500нм) различными концентрациями МФЛ (0, 1,5, 6, Реакция анти-ГВ ИгГ и ИгГ2а 12,5мкг/дозу) Через 20 дней после инокуляции берут образцы крови и сыворотку анализируют в Доза Анти-ГВ реакция HAVAB анализа (с применением 20%-го отброса) HBsAg Доза ИгГ ИгГ2а Подсчитывают ЭД50 (выраженную в ФЕ), которая на Лот МФЛ соответствует доза, индуцирующей серологичеА1(ОН)3 (мкг) Д15 Д21 Д15 Д21 скую реакцию у 50% испытуемых животных (мкг) Результаты DSAH16 2,5 0 20 178 5 5 Результаты суммированы в нижеследующей DSAR502 2,5 6,25 113 641 5 28 Таблице Вакцина, не содержащая МФЛ, имела ЭД50 в 123,7, вто время как вакцина, содержащая Таблица 5 1,5мкг/мл МФЛ, имела значение ЭД50 в 154 Более высокие дозы МФЛ оказывают благоприятное Влияние дозы МФЛ (< ЮОнм) на иммуногенность воздействие (ЭД50 наблюдались при более низрек HBsAg, адсорбированного на АІ(ОН)з ких значениях ФЕ) При 12,5мкг МФЛ на дозу наблюдаемая ЭД50 составляет 47.1ФЕ Доза HBsAg Доза МФЛ Выводы наА1(ОН)3 ( 500нм) на индуцирование HBsAg специфичных Тп1 клеток у Balb/c мышей Доза HBsAg Состав (м кг/мышь) 20 FCA FCA 20 А1(ОН)3 20 А1(ОН)3 40 40 Таблица 7 Влияние различных доз МФЛ (< ЮОнм) на индуцирование HBsAg специфичных Тп1 клеток Секретирование in vitro ИЛ-2 (ИС) ИНФ-у (пг/мл) ИЛ-4 (пг/мл) 24ч 48ч 72ч 24ч 48ч 72ч 24ч 48ч 72ч < < 1 3 20 80 385 125 125 < < < 07 1 8 07 125 125 125 < < < < < < 10 14 12 125 125 125 40 40 40 2 38 10 < 280 280 < < < Доза HBsAg (м кг/мышь) 20 20 20 20 Состав 0 75 15 30 Секретирование in vitro ИЛ-2 (ИС) 24ч 48ч 72ч 2 6 28 21 8 207 173 58 270 71 36 41 59 36 24ч