Трансгенна рослина кукурудзи, яка продукує білки cry34ab1, cry35ab1 і cry3aa для запобігання розвитку стійкості у кукурудзяного кореневого жука

Реферат: Винахід належить до трансгенної рослини, яка продукує білок Cry34Ab1, білок Cry35Ab1 і інсектицидний білок Cry3Aa, де зазначені білки Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa мають різні сайти зв'язування рецепторів в кишечнику кукурудзяного кореневого жука. Комбінації білків Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa можуть використовуватися для запобігання розвитку стійкості (до будь-якої системи інсектицидного білка окремо) у популяції кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica spp.). UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Опис Передумови створення винаходу Люди вирощують кукурудзу для застосування в їжу і як джерела енергії. Кукурудза являє собою важливу сільськогосподарську культуру. Вона є важливим джерелом їжі, харчових продуктів і корму для тварин у багатьох регіонах світу. Комахи поїдають і ушкоджують рослини і, таким чином, підривають ці зусилля людей. Щорічно мільярди доларів витрачаються для боротьби з комахами-шкідниками, і ще мільярди втрачаються внаслідок заподіюваного ними збитку. Шкода, заподіювана комахами-шкідниками, є основним фактором втрати врожаю кукурудзи в усьому світі, незважаючи на використання захисних заходів, таких як хімічні пестициди. У зв'язку з цим, у сільськогосподарські культури, такі як кукурудза, методами генної інженерії були введені гени стійкості до комах для боротьби зі збитком, заподіюваним комахами, і для зниження потреби в традиційних хімічних пестицидах. Щорічно, більше 10 мільйонів акрів (більше 4050000 га) кукурудзяних полів у США заражаються комплексом видів кукурудзяного кореневого жука. Комплекс видів кукурудзяного кореневого жука включає північного кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica barberi), південного кукурудзяного кореневого жука (D. undecimpunctata howardi) і західного кукурудзяного кореневого жука (D. virgifera virgifera) (інші види включають Diabrotica virgifera zeae (Мексиканський кукурудзяний кореневий жук), Diabrotica balteata (Бразильський кукурудзяний кореневий жук) і комплекс Бразильського кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica viridula і Diabrotica speciosa)). Личинки цих видів Diabrotica, що живуть у ґрунті, харчуються коренями рослин кукурудзи, викликаючи вилягання. Вилягання, у кінцевому рахунку, знижує врожайність і часто приводить до загибелі рослини. Поїдаючи маточкові стовпчики кукурудзи, дорослі жуки зменшують запилення і, тому, згубно впливають на врожай зерна кукурудзяної рослини. Крім того, дорослі особини і личинки роду Diabrotica атакують гарбузові культури (огірки, дині, гарбузи і т. д.) і багато овочевих і польових культур у промисловому рослинництві, а також культури, що вирощуються в городах на присадибних ділянках. Синтетичні органічні хімічні інсектициди були першочерговими інструментами, використовуваними для боротьби з комахами-шкідниками, але біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, одержані з Bacillus thuringiensis (B.t.), відігравали важливу роль у деяких регіонах. Можливість одержання стійких до комах рослин за допомогою трансформації генами інсектицидного білка B.t. радикально змінила сучасне сільське господарство і підвищила значення і цінність інсектицидних білків і їх генів. Інсектицидні кристалічні білки з деяких штамів Bacillus thuringiensis (B.t.) добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Hofte et al. Microbial Reviews, Vol. 53, № 2, pp. 242-255 (1989). Ці білки звичайно продукуються бактеріями у вигляді протоксинів з молекулярною масою приблизно 130 кДа, які потім розщеплюються протеазами в середній кишці комах після потрапляння в травну систему комахи для продукції корового токсину з молекулярною масою приблизно 60 кДа. Ці білки відомі як кристалічні білки, тому що в деяких штамах B.t. можуть спостерігатися виразні кристалічні включення зі спорами. Ці кристалічні включення часто складені з декількох різних білків. Однією групою генів, що були використані для одержання трансгенних, стійких до комах культур, є дельта-ендотоксини з Bacillus thuringiensis (B.t.). Дельта-ендотоксини були успішно експресовані в таких сільськогосподарських культурах як бавовна, картопля, рис, соняшник, а також кукурудза, і, як виявилося, забезпечують чудовий контроль над комахами-шкідниками (Perlak F.J et al. (1990), Bio/Technology 8, 939-943; Perlak F.J. et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22:313321; Fujimoto H. et al. (1993), Bio/Technology, 11:1151-1155; Tu et al. (2000), Nature Biotechnology, 18:1101-1104; PCT публікація заявки на Міжнародний патент WO 01/13731; і Bing J. W. et al. th (2000), Efficacy of Cry IF Transgenic Maize, 14 Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, Colo.). Декілька білків B.t. були використані для створення стійких до комах трансгенних рослин, що були успішно зареєстровані і в даний час запущені в серійне виробництво. Вони включають Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F, Cry3Aa і Cry3Bb у кукурудзі, Cry1Ac і Cry2Ab у бавовні і Cry3A у картоплі. Мається також SMART STAX у кукурудзі, що містить Cry1A.105 і Cry2Ab. Продукти, що випускаються в промисловому масштабі, експресуючі ці білки, експресують один білок, за винятком випадків, де бажаний комбінований інсектицидний спектр із 2 білків (наприклад, Cry1Ab і Cry3Bb у кукурудзі, комбіновані для забезпечення стійкості відповідно до лускокрилих шкідників і блішки довговусої), або де незалежна дія білків робить їх корисними як інструмент для затримки розвитку стійкості у популяцій сприйнятливих комах (наприклад, 1 UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Cry1Ac і Cry2Ab у бавовні, комбіновані для забезпечення керування стійкістю відносно тютюнової совки). Деякі з якостей стійких до комах трансгенних рослин, що привели до швидкого і широко розповсюдженого прийняття цієї технології, також викликають занепокоєність, що у популяцій шкідників розів'ється стійкість до інсектицидних білків, продукованих цими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для збереження корисності ознак стійкості до комах на основі B.t., що включають розміщення білків у високій дозі в комбінації з резерватом, чергування з різними токсинами або спільне розміщення з ними (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol. 16:144-146). Білки, вибрані для використання в пакеті Керування стійкості до комах (IRM), повинні бути активними для того, щоб стійкість, що розвилася до одного білка, не надавала стійкості до другого білка (тобто перехресна стійкість до білків відсутня). Якщо, наприклад, популяція шкідників, вибрана для стійкості до "білка A", чутлива до "білка B", то можна зробити висновок, що немає перехресної стійкості і що комбінація білка A і білка B буде ефективною в затримці стійкості до одного білка A. За відсутності стійких до комах популяцій, оцінки можуть здійснюватися на основі інших характеристик, що вважаються пов'язаними з потенціалом перехресної стійкості. При ідентифікації інсектицидних білків з імовірністю відсутності прояву перехресної стійкості було запропоноване використання рецепторно-опосередкованого зв'язування (van Mellaert et al. 1999). Ключовим прогностичним показником відсутності перехресної стійкості, властивим цьому підходу, є те, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори у чутливого виду комах. У випадку, коли токсини B.t. конкурують за один і той же рецептор, то, якщо цей рецептор мутує у цій комасі, так що один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором і, таким чином, більше не є інсектицидним проти комахи, то в цьому випадку комаха буде також стійкою до другого токсину (який конкурентно зв'язаний з тим же рецептором). Тобто, комаха вважається перехресно стійкою до обох токсинів B.t. Однак, якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це може бути показником того, що комаха не буде одночасно стійкою до цих двох токсинів. Відносно більш нова система інсектицидного білка була виявлена в Bacillus thuringiensis, як описано в міжнародному патенті WO 97/40162. Ця система містить два білки - один масою приблизно 15 кДа і інший масою приблизно 45 кДа. Див. також патенти США 6083499 і 6127180. Тепер ці білки були віднесені до їх власного класу і, відповідно, одержали позначення Cry, відповідно Cry34 і Cry35. Див. Crickmore et al. сайт Інтернету (biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). На даний час виявлені багато інших споріднених білків цього типу системи. Див., наприклад, патент США 6372480; міжнародні патенти WO 01/14417 і WO 00/66742. Були також описані оптимізовані для рослин гени, що кодують такі білки, де гени створені методами генної інженерії для використання кодонів для оптимізованої експресії у рослин. Див. наприклад патент США 6218188. Точний тип дії системи Cry34/35 ще має бути визначений, але вважають, що вона утворює пори в мембранах клітин кишечнику комах. Див. Moellenbeck et al. Nature Biotechnology, vol. 19, p. 668 (July 2001); Masson et al. Biochemistry, 43 (12349-12357) (2004). Точний механізм дії залишається неясним, незважаючи на тривимірні атомарні координати і структури кристалів, відомі для білка Cry34 і Cry35. Див. патенти США 7524810 і 7309785. Наприклад, неясно, один чи обидва з цих білків зв'язуються з конкретним видом рецептора, таким як лужна фосфатаза або амінопептидаза. Крім того, через те, що існують різні механізми, за допомогою яких у комахи може розвитися стійкість до білка Cry (такі як зміна глікозилуванням рецептора [див. Jurat-Fuentes et al. (2002) 68 AEM 5711-5717], видалення рецепторного білка [див. Lee et al. (1995) 61 AEM 3836-3842], мутування рецептора або іншими механізмами [див. Heckel et al. J. Inv. Pathol. 95 (2007) 192-197]), було неможливо свідомо прогнозувати, чи буде існувати перехресна стійкість між Cry34/35 і іншими білками Cry. Прогнозування конкурентного зв'язування для системи Cry34/35 також додатково ускладнюється тим, що два білки залучені в бінарну систему Cry34/35. Крім того, неясно, чи зв'язуються і наскільки ефективно зв'язуються ці білки з кишечником/клітинами кишечнику, і чи взаємодіють вони і як взаємодіють або зв'язуються один з одним. Інші варіанти для боротьби з твердокрилими комахами включають токсини Cry3Bb, Cry3C, Cry6B, ET29, ET33 з ET34, TIC407, TIC435, TIC417, TIC901, TIC1201, ET29 з TIC810, ET70, ET76 з ET80, TIC851 і інші. Були також запропоновані підходи РНКі (інтерференція РНК). Див. наприклад, Baum et al. Nature Biotechnology, vol. 25, № 11 (Nov. 2007), pp. 1322-1326. Короткий опис сутності винаходу 2 UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід стосується частково Cry34Ab/35Ab у комбінації з Cry3Aa. Даний винахід стосується частково відкриття, що Cry34Ab/Cry35Ab і Cry3Aa можуть використовуватися для запобігання розвитку стійкості (до будь-якої системи інсектицидного білка окремо) у популяції кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica spp.). Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі після ознайомлення з переважними аспектами розкритого в даному описі винаходу, рослини, продукуючі ці інсектицидні білки Cry, можуть використовуватися для зниження побоювань того, що може розвитися популяція кукурудзяного кореневого жука, яка може бути стійкою до будьякої з цих систем інсектицидного білка окремо. Даний винахід частково підтверджується виявленням того, що компоненти цих систем білка Cry не конкурують один з одним за зв'язування з рецепторами кишечнику кукурудзяного кореневого жука. Даний винахід також частково стосується потрійних пакетів або "пірамід" із трьох (або більше) систем токсинів, з Cry34Ab/Cry35Ab і Cry3Aa, що є парою основ. Таким чином, рослини (і посівна площа, засаджена такими рослинами), які продукують дві системи інсектицидних білків, включені в обсяг даного винаходу. Короткий опис фігур Докладний опис фігур, зокрема, стосується супровідних фігур, на яких: 125 125 Фіг. 1. Зв'язування I-Cry35Ab1 (A) і I-Cry3Aa (B) як функція внесених мічених радіоактивним ізотопом Cry-токсинів у BBMV (мембранних пузирчиках щіткової облямівки), одержаних з личинок західних кукурудзяних кореневих жуків. Специфічне зв'язування=загальне зв'язування-неспецифічне зв'язування, помилка "вуса"=SEM (стандартна помилка середньої). 125 125 Експерименти зв'язування продемонстрували, що і I-Cry35Ab1, і I-Cry3Aa були здатні 125 125 специфічно зв'язуватися з BBMV (фіг. 1A і 1B). I-Cry35Ab1 і I-Cry3Aa мали афінітет зв'язування Kd=2,31±1,26, 24,0±9,7 (нМ), відповідно, і концентрацію сайтів зв'язування Bmax=31,69±6,38, 146,3±39,9 (пкмоль/мкг BBMV), відповідно. 125 Фіг. 2. Зв'язування I-Cry3Aa з BBMV, одержаними з личинок західного кукурудзяного кореневого жука в різних концентраціях неміченого конкурента. "Вуса" для гомологічного конкурентного зв'язування представляють стандартне відхилення, а "вуса" для гетерологічної конкуренції не показані. Експериментальні результати продемонстрували, що Cry3Aa здатний повністю зміститися, 125 коли молярна концентрація збільшувалася до 500 нМ (100-кратний надлишок I-Cry3Aa) (фіг. 125 2). Однак Cry35Ab1 окремо або суміш Cry35Ab1+Cry34Ab1 (1:3) були нездатні змістити ICry3Aa. Ці дані вказують на те, що Cry35Ab1 окремо або Cry35Ab1+Cry34Ab1 (1:3) не розділяють рецептор з Cry3Aa. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO:1: повна послідовність нативного білка Cry3Aa; SEQ ID NO:2: послідовність усіченого трипсином корового білка Cry3Aa; SEQ ID NO:3: повна послідовність нативного білка Cry34Ab1; SEQ ID NO:4: повна послідовність нативного білка Cry35Ab1; SEQ ID NO:5 послідовність усіченого хімотрипсином корового білка Cry35Ab1; SEQ ID NO:6: ДНК Сry34Ab; SEQ ID NO:7: ДНК Сry35Ab; SEQ ID NO:8: ДНК Сry3Aa. Докладний опис Послідовності білка Cry34Ab/35Ab можуть бути одержані, наприклад, з ізоляту Bacillus thuringiensis PS149B1. Інші гени, білкові послідовності і ізоляти-джерела для використання відповідно до даного винаходу описані, наприклад, Crickmore et al. на сайті Інтернету (lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore /Bt/intro.html). Даний винахід включає використання інсектицидних білків Cry34Ab/35Ab у комбінації з токсином Cry3Aa для захисту кукурудзи від ушкодження і втрати врожайності, викликаних поїданням популяціями кукурудзяних кореневих жуків, у яких може розвитися стійкість до будьякого із системи білків Cry окремо (без іншого). Таким чином, у даному винаході мова йде про пакет Керування стійкості комах (IRM) для запобігання розвитку у кукурудзяного кореневого жука стійкості до Cry3Aa і/або Cry34Ab/35Ab. Даний винахід стосується композицій для боротьби зі шкідниками-кореневими жуками, які містять клітини, що продукують білок токсину Cry3Aa і систему токсину Cry34Ab/35Ab. Винахід додатково включає хазяїна, трансформованого для продукції і білка Cry3Aa, і бінарного токсину Cry34Ab/35Ab, де зазначений хазяїн являє собою мікроорганізм або рослинну клітину. 3UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Додатково передбачається, що винахід стосується способу боротьби зі шкідникамикореневими жуками, який включає приведення в контакт зазначених шкідників або середовища мешкання зазначених шкідників з ефективною кількістю композиції, що містить білок Cry3Aa і додатково містить бінарний токсин Cry34Ab/35Ab. Варіант здійснення винаходу включає маїс, що містить експресований рослиною ген, який кодує бінарний токсин Cry34Ab/35Ab, і експресований рослиною ген, який кодує білок Cry3Aa, і насіння такої рослини. Додатковий варіант здійснення винаходу включає маїс, де експресований рослиною ген, який кодує бінарний токсин Cry34Ab/35Ab, і експресований рослиною ген, який кодує білок Cry3Aa, були інтрогресовані в зазначений маїс, і насіння такої рослини. Як описано в розділі "Приклади", дослідження конкурентного зв'язування з рецепторами з використанням міченого радіоактивним ізотопом корового токсинного білка Cry35Ab показують, що коровий токсинний білок Cry3Aa не конкурує за зв'язування в зразках тканини комах CRW (кукурудзяних кореневих жуків), з якими зв'язується Cry35Ab. Див. Фіг. 2. Ці результати вказують на те, що комбінація білків Cry3Aa і Cry34Ab/35Ab являє собою ефективний засіб для зменшення розвитку стійкості у популяцій CRW до будь-якої білкової системи окремо. Таким чином, частково на основі даних, описаних вище і в інших місцях даного опису, білки Cry34Ab/35Ab і Cry3Aa можуть використовуватися для одержання комбінацій IRM для запобігання і зменшення розвитку стійкості у CRW. Можуть бути додані інші білки до цієї комбінації, наприклад, для розширення спектра боротьби з комахами. Пара/комбінація, що розглядається, може також використовуватися в деяких переважних "потрійних пакетах" або "піраміді" у комбінації з ще одним білком для боротьби з кореневими жуками, таким як Cry3Ba і/або Cry6Aa. РНКі проти кореневих жуків являє собою ще один варіант. Див., наприклад, Baum et al. Nature Biotechnology, vol. 25, № 11 (Nov. 2007), pp. 1322-1326. Крім того, у світлі даних і представлених у даному описі положень, можна замінити Cry3Aa білком Cry3Ba і/або Cry6Aa, що проілюстровано в даному описі у вигляді спарювання комбінації основ з Cry34A/35A. Таким чином, розглянуті комбінації забезпечують множинні типи дії проти кореневого жука. Варіанти здійснення даного винаходу включають використання білків Cry3Aa і Cry34Ab/35Ab у місцях вирощування кукурудзи, де Diabrotica spp. є проблематичними. Іншим варіантом здійснення може бути використання одного або обох з білків Cry3Aa і Cry34Ab/35Ab у комбінації з іншими ознаками. У світлі опису заявки USSN 61/388273 (поданої 30 вересня, 2010 р.), що стосується комбінацій Cry34Ab/35Ab і Cry6Aa, заявки USSN 61/476005 (поданої 15 квітня, 2011 р.), що стосується комбінації білків Cry34Ab/35Ab і Cry3Ba, і заявки USSN 61/477447 (поданої 20 квітня, 2011 р.), що стосується комбінацій білків Cry3Aa і Cry6Aa, деякі переважні "потрійні пакети" або "множинні типи пакетів дії" даного винаходу включають білок Cry3Aa у комбінації з білками Cry34Ab/35Ab, разом з білком Cry6Aa і/або білком Cry3Ba. Трансгенні рослини, включаючи кукурудзу, що містять ген Сry3Ba, гени Сry34Ab/35Ab і третю або четверту систему токсинів (наприклад, ген(и) Сry3Aa і/або Сry6Aa), включені в обсяг даного винаходу. Таким чином, такі варіанти здійснення націлені на комаху щонайменше трьома типами дії. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що токсини B.t., навіть у межах визначеного класу, такого як Cry3Aa і Cry34Ab/35Ab, можуть до деякої міри варіювати. Гени і токсини. Термін "ізольований" стосується полінуклеотиду в конструкті, що не зустрічається в природних умовах, або білка в очищеному стані або в стані, що іншим чином не зустрічається в природних умовах. Гени і токсини, використовувані відповідно до даного винаходу, включають не тільки повні описані послідовності, але також фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, що зберігають характерну пестицидну активність токсинів, конкретно проілюстрованих у даному описі. Використовувані в даному описі терміни "варіанти" або "зміни" генів стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують ті ж токсини, або які кодують еквівалентні токсини, які мають пестицидну активність. Використовуваний у даному описі термін "еквівалентні токсини" стосується токсинів, що мають таку ж або по суті таку ж біологічну активність проти шкідників-мішеней, як заявлені токсини. Домени/субдомени цих білків можуть бути переставлені для одержання химерних білків. Див. наприклад, патенти США 7309785 і 7524810. У патенті '785 мова також йде про усічені білки Cry35. Усічені токсини також ілюструються в даному описі. Використовуваний у даному описі термін "границі" представляє приблизно 95 % (Cry3Aa іCry34Ab і Cry35Ab), 78 % (Cry3A і Cry34A і Cry35) і 45 % (Cry3 і Cry34 і Cry35) ідентичність послідовностей відповідно до "Revision of Nomenclature for Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins" (Перегляд номенклатури пестицидних кристалічних білків Bacillus thuringiensis) N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, D.H. Dean. 4 UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998), Vol 62:807-813. Те ж стосується Cry6 при використанні в потрійних пакетах, наприклад, відповідно до даного винаходу. Для фахівця в даній галузі повинно бути очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані й одержані декількома способами. Визначені гени або частини генів, проілюстровані в даному описі, можуть бути одержані з ізолятів, депонованих у депозитарії культур. Ці гени або їх частини або варіанти також можуть бути сконструйовані синтетично, наприклад, шляхом використання генного синтезатора. Варіанти генів можуть бути легко сконструйовані з використанням стандартних технологій одержання точкових мутацій. Також, фрагменти цих генів можуть бути одержані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз, згідно зі стандартними методиками. Наприклад, ферменти, такі як Bal31, або сайт-направлений мутагенез можуть використовуватися для систематичного відсічення нуклеотидів від кінців цих генів. Гени, які кодують активні фрагменти, можуть також бути одержані з використанням різноманітних рестрикційних ферментів. Протеази можуть використовуватися для безпосереднього одержання активних фрагментів цих білкових токсинів. Фрагменти й еквіваленти, що зберігають пестицидну активність проілюстрованих токсинів, входять в обсяг даного винаходу. Також, через надмірність генетичного коду, різноманітність різних послідовностей ДНК може кодувати амінокислотні послідовності, розкриті в даному описі. Фахівець у даній галузі цілком може створити альтернативні послідовності ДНК, які кодують однакові або по суті однакові токсини. Такі варіантні послідовності ДНК входять в обсяг даного винаходу. Використовуване в даному описі посилання на "по суті однакову" послідовність стосується послідовностей, що мають амінокислотні заміщення, делеції, додавання або вставки, які суттєво не впливають на пестицидну активність. Фрагменти генів, які кодують білки, що зберігають пестицидну активність, також включені в це визначення. Фрагменти генів, які кодують білки, що зберігають пестицидну активність, також включені в це визначення. Додатковий спосіб ідентифікації генів, які кодують токсини, і частин генів, використовуваних відповідно до даного винаходу, здійснюється шляхом використання олігонуклеотидних зондів. Ці зонди являють собою детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можуть бути детектовані за допомогою відповідної мітки або можуть бути одержані ендогенно флуоресцентними, як описано в Міжнародній патентній заявці № WО 93/16094. Як добре відомо в даній галузі, якщо молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються з утворенням міцного зв'язку між двома молекулами, то можна резонно припустити, що зонд і зразок мають суттєву гомологію. Переважно, гібридизацію проводять у жорстких умовах методиками, добре відомими в даній галузі, як описано, наприклад, у публікації Keller G.H., Manak M.M. (1987), DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Деякі приклади сольових концентрацій і температурних комбінацій наступні (у порядку збільшення жорсткості умов): 2X SSPE (0,18M NaCl, 10 мМ NaHPO4, 1 мМ EDTA, pН 7,0) або SSC (15 мМ цитрату натрію, 150 мМ хлориду натрію, pН 7,0) при 42C; 0,1X SSPE або SSC при 42C; 0,1X SSPE або SSC при 65C. Виявлення зонда забезпечує засіб для визначення відомим чином, чи відбулася гібридизація. Такий зондовий аналіз забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів даного винаходу, які кодують токсин. Нуклеотидні сегменти, використовувані як зонди відповідно до винаходу, можуть синтезуватися з використанням синтезатора ДНК і стандартних методик. Ці нуклеотидні послідовності можуть також використовуватися як затравки ПЛР для ампліфікації генів за даним винаходом. Варіантні токсини. У даному описі були спеціально проілюстровані визначені токсини за даним винаходом. Оскільки ці токсини просто ілюструють токсини за даним винаходом, то повинно бути цілком очевидно, що даний винахід включає варіантні або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), які мають таку ж або подібну пестицидну активність, як ілюстрований токсин. Еквівалентні токсини мають гомологію амінокислот з ілюстрованим токсином. Ця амінокислотна ідентичність звичайно складає більше ніж 75 % або переважно більше ніж 85 %, переважно більше ніж 90 %, переважно більше ніж 95 %, переважно більше ніж 96 %, переважно більше ніж 97 %, переважно більше ніж 98 % або в деяких варіантах здійснення переважно більше ніж 99 %. Амінокислотна ідентичність звичайно найвища в критичних областях токсину, що відповідають за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, яка, у кінцевому рахунку, відповідальна за біологічну активність. У цьому відношенні, прийнятні і можуть очікуватися деякі амінокислотні заміщення, якщо ці заміщення відбуваються в областях, що не мають вирішального значення для активності або являють собою консервативні амінокислотні заміщення, що не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можуть бути розміщені в наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислотні. Консервативні заміщення, за допомогою яких амінокислота одного класу заміщається іншою амінокислотою того ж типу, 5 UA 116081 C2 входять в обсяг даного винаходу, поки заміщення суттєво не змінює біологічну активність сполуки. У таблиці 1 представлений список прикладів амінокислот, що належать до кожного класу. Таблиця 1 Клас амінокислот Приклади амінокислот Ala, Val, Leu, Ile, Pro Met, Неполярні Phe, Trp Незаряджені Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, полярні Asn, Gln Кислотні Asp, Glu Основні Lys, Arg, His 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 У деяких випадках, можуть також здійснюватися неконсервативні заміщення. Вирішальним фактором є те, що ці заміщення не повинні значно знижувати біологічну активність токсину. Рекомбінантні хазяїни. Гени, які кодують токсини даного винаходу, можуть вводитися в широку різноманітність мікробних або рослинних хазяїнів. Експресія гена токсину приводить, прямо або побічно, до внутрішньоклітинної продукції і підтримання пестициду. Кон'югальне перенесення і рекомбінантне перенесення можуть використовуватися для створення штаму B.t., що експресує обидва токсини даного винаходу. Інші організми хазяїнів можуть також трансформуватися одним або більше генами токсину, використовуваними потім для надання синергічного ефекту. З придатними мікробними хазяїнами, наприклад Pseudomonas, мікроби можуть наноситися на місцезнаходження шкідників, де вони проліферують і споживаються. Результатом є контроль над шкідником. Альтернативно, мікроб, що несе ген токсину, може піддаватися обробці в умовах, що продовжують активність токсину і стабілізують клітину. Оброблена клітина, що зберігає токсичну активність, потім може вноситися в середовище мешкання шкідника-мішені. В обсяг даного винаходу включені нерегенеровані/нетотипотентні рослинні клітини з рослини за даним винаходом (що містять щонайменше один з розглянутих генів IRM). Трансформація рослини. Переважним варіантом здійснення даного винаходу є трансформація рослин генами, що кодують розглянутий інсектицидний білок або його варіанти. Трансформовані рослини стійкі до атаки цільовою комахою-шкідником за рахунок присутності контролюючих кількостей розглянутого інсектицидного білка або його варіантів у клітинах трансформованої рослини. При включенні генетичного матеріалу, що кодує інсектицидні властивості інсектицидних токсинів B.t., у геном рослини, споживаної в їжу визначеною комахою-шкідником, дорослі особини або личинки загинуть після вживання в їжу рослини. Були трансформовані численні члени односім'ядольних і дводольних класифікацій. Трансгенні агрономічні культури, а також фрукти й овочі становлять промисловий інтерес. Такі культури включають, але без обмеження, маїс, рис, сою, канолу, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовну, арахіс, томати, картоплю і подібні. Існує декілька технологій введення стороннього генетичного матеріалу в клітини рослин і для одержання рослин, що стабільно підтримують і експресують введений ген. Такі технології включають акселерацію генетичного матеріалу, нанесеного на мікрочастинки, безпосередньо в клітини (патент США 4945050 і патент США 5141131). Рослини можуть бути трансформовані з використанням технології Agrobacterium, див. патент США 5177010, патент США 5104310, заявку на Європейський патент 0131624B1, заявку на Європейський патент 120516, заявку на Європейський патент № 159418B1, заявку на Європейський патент № 176112, патент США 5149645, патент США 5469976, патент США 5464763, патент США 4940838, патент США 4693976, заявку на Європейський патент № 116718, заявку на Європейський патент № 290799, заявку на Європейський патент № 320500, заявку на Європейський патент № 604662, заявку на Європейський патент № 627752, заявку на Європейський патент № 0267159, заявку на Європейський патент № 0292435, патент США 5231019, патент США 5463174, патент США 4762785, патент США 5004863 і патент США 5159135. Інша технологія трансформації включає технологію WHISKERS™, див. патент США 5302523 і патент США 5464765. Технологія електропорації також використовувалася для трансформації рослин, див. Міжнародний патент WO 87/06614, патент США 5472869, патент США 5384253, Міжнародний патент WO 9209696 і Міжнародний патент WO 9321335. Усі ці патенти і публікації, що стосуються трансформації, включені в даний опис за допомогою посилання. На доповнення до численних технологій трансформації рослин, тип тканини, що контактує зі сторонніми генами, також може змінюватися. Така тканина включає, але не 6 UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обмежується ними, ембріональну тканину, I і II типи калюсної тканини, гіпокотиль, меристему і подібні. Майже всі рослинні тканини можуть бути трансформовані під час дедиференціювання з використанням відповідних технологій у межах кваліфікації фахівця в даній галузі. Гени, які кодують будь-який з розглянутих токсинів, можуть бути вставлені в клітини рослини з використанням різноманітних технологій, що добре відомі в даній галузі, як описано вище. Наприклад, доступне велике число векторів клонування, що містять маркер, який забезпечує можливість відбору трансформованих мікробних клітин, і реплікаційна система, функціональна в Escherichia coli, для одержання і модифікації сторонніх генів для вставки у вищі рослини. Такі маніпуляції можуть включати, наприклад, введення мутацій, усічень, додавань або заміщень, як бажано для передбачуваного використання. Вектори включають, наприклад, pBR322, групу pUC, групу M13mp, pACYC184 і т. д. Відповідно, послідовність, що кодує білок Cry або варіанти, може бути вставлена у вектор у придатний сайт рестрикції. Одержана плазміда використовується для трансформації клітин E. coli, які культивують у придатному живильному середовищі, потім збирають і лізують для того, щоб була витягнута придатна для обробки кількість плазміди. Аналіз послідовності, аналіз фрагментів рестрикції, електрофорез і інші біохімічні-молекулярно-біологічні способи, як правило, здійснюють як способи аналізу. Після кожної маніпуляції, використовувана послідовність ДНК може бути розщеплена і з'єднана з наступною послідовністю ДНК. Кожна піддана маніпулюванню послідовність ДНК може бути клонована в ту ж або іншу плазміду. Використання векторів, що містять T-ДНК, для трансформації клітин рослин інтенсивно досліджувалося і достатньо описане в Європейському патенті EP 120516; публікаціях Lee і Gelvin (2008), Fraley et al. (1986), і An et al. (1985), і достатньо загальноприйняте в даній галузі. Як тільки вставлена ДНК інтегрується в геном рослини, вона стає відносно стійкою у всіх наступних поколіннях. Вектор, використовуваний для трансформації клітини рослини, звичайно містить вибраний маркерний ген, який кодує білок, що надає трансформованим клітинам рослин стійкість до гербіциду або антибіотика, такого як, поряд з іншими, біалафос, канаміцин, G418, блеоміцин або гігроміцин. Відповідно, окремо використовуваний вибраний маркерний ген повинен забезпечити можливість вибору трансформованих клітин, у той час як ріст клітин, що не містять вставлену ДНК, пригнічується селекційною сполукою. Доступне велике число способів вставлення ДНК у клітину рослини-хазяїна. Ці способи включають трансформацію T-DNA, доставлену Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як агентом трансформації. Додатково, може бути використане злиття протопластів рослини з ліпосомами, що містять підлягаючу доставці ДНК, пряма ін'єкція ДНК, трансформація біологічною балістикою (бомбардуванням мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі способи. У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини будуть трансформуватися генами, де використання кодону області, що кодує білок, було оптимізоване для рослин. Див., наприклад, патент США 5380831, що включений у даний опис за допомогою посилання. Також, переважно будуть використовуватися рослини, що кодують усічений токсин. Усічений токсин звичайно кодує приблизно від 55 % до приблизно 80 % токсину повної довжини. Способи створення синтетичних генів B.t. для використання в рослинах відомі в даній галузі (Stewart, 2007). Незалежно від методики трансформації, ген переважно включають у вектор перенесення гена, адаптований для експресування генів інсектицидного токсину B.t., і варіанти в рослинній клітині включенням у вектор рослинного промотору. На доповнення до рослинних промоторів, у рослинних клітинах для експресування чужорідних генів можуть ефективно використовуватися промотори з різноманітних джерел. Наприклад, можуть бути використані промотори бактеріального походження, такі як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази і промотор манопінсинтази. У деяких переважних варіантах здійснення можуть використовуватися промотори, не зв'язані з Bacillus thuringiensis. Можна використовувати промотори, що походять з рослинних вірусів, наприклад промотори 35S і 19S вірусу мозаїки цвітної капусти, промотор з вірусу мозаїки жилок касави і подібні. Рослинні промотори включають, але без обмеження, малу субодиницю (ssu), промотор бета-конгліциніну, промотор фазеоліну, промотор ADH (алкогольдегідрогенази), промотори теплового шоку, промотор ADF (деполімеризації актину), промотор убіквітину, промотор актину і тканиноспецифічні промотори. Промотори можуть також містити визначені енхансерні елементи послідовності, які можуть підвищити ефективність транскрипції. Конкретні енхансери включають, але без обмеження, ADH1-інтрон 1 і ADH1-інтрон 6. Можуть використовуватися конститутивні промотори. Конститутивні промотори направляють безупинну генну експресію майже у всіх типах клітин і майже в будь-який час (наприклад, актину, убіквітину, CaMV 35S). Тканиноспецифічні 7 UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 промотори відповідальні за генну експресію у певних типах клітин або тканини, таких як листи або насіння (наприклад, промотори зеїну, олеозину, напіну, ACP (ацил білка-носія)), і ці промотори також можуть використовуватися. Можна також використовувати промотори, які активні під час певної стадії розвитку рослин, а також активні у певних тканинах і органах рослин. Приклади таких промоторів включають, але без обмеження, промотори, що є специфічними для коренів, специфічними для пилка, специфічними для зародків, специфічними для "шовку" кукурудзи, специфічними для бавовняних волокон, специфічними для ендосперми насіння, специфічними для флоеми тощо. У певних умовах може бути бажаним використання індукованого промотору. Індукований промотор відповідальний за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий як фізичний стимул (наприклад, гени теплового шоку); світло (наприклад, RUBP карбоксилаза); гормон (наприклад, глюкокортикоїд); антибіотик (наприклад, тетрациклін); метаболіти; і стрес (наприклад, посуху). Можна використовувати інші бажані транскрипційні і трансляційні елементи, що функціонують у рослинах, такі як 5'-нетрансльовані лідерні послідовності, РНК послідовності транскрипції термінації і сигнальні послідовності додавання поліаденілату. У даній галузі відомі численні специфічні для рослин вектори перенесення генів. Трансгенні культури, що містять ознаки стійкості до комах (IR), є переважними в рослинах кукурудзи і бавовни по всій Північній Америці, і використання цих ознак поширюється по усьому світі. Промислові трансгенні культури, що комбінують ознаки IR і стійкість до гербіцидів (HT), були розроблені множиною насіннєвих компаній. Вони включають комбінації ознак IR, наданих інсектицидними білками B.t., і ознак HT, таких як стійкість до інгібіторів ацетолактатсинтази (ALS), таких як сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолпіримідин, сульфонаніліди тощо, інгібіторів глутамінсинтетази (GS), таких як біалафос, глюфосинат тощо, інгібіторів 4гідроксифенілпіруватдіоксигенази (HPPD), таких як мезотріон, ізоксафлутол тощо, інгібіторів 5енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (EPSPS), таких як гліфосат тощо, інгібіторів ацетилкоензим-A-карбоксилази (ACCase), таких як галоксифоп, квілазофоп, диклофоп тощо. Відомі інші приклади, у яких трансгенно одержані білки забезпечують стійкість рослин до хімічних класів гербіцидів, таких як гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі ауксинпіридилоксіацетатів (див. міжнародну патентну заявку WO 2007/053482 A2) або гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі арилоксифеноксипропіонатів (див. міжнародну патентну заявку 2005107437 A2, A3). Здатність контролювати множинні, пов'язані зі шкідниками проблеми за допомогою ознак IR являє собою цінну концепцію промислового продукту, і зручність цієї продуктової концепції підвищується, якщо ознаки, що забезпечують контроль над комахами, і ознаки, що забезпечують контроль над бур'янами, комбінуються в одній рослині. Додатково, підвищена значимість може бути одержана за допомогою комбінацій в одній рослині ознак IR, що надаються інсектицидним білком B.t., таким як інсектицидний білок за даним винаходом, з однією або більше додатковими ознаками HT, такими, як зазначено вище, плюс одна або більше додаткових ознак, що вводяться (наприклад, стійкості до інших комах, наданої білками, що походять з B.t. або з інших інсектицидних білків, стійкості до комах, що надається такими механізмами, як РНКі, тощо, стійкості до нематодів, стійкості до захворювань, стійкості до стресу, поліпшеної утилізації азоту тощо), або продуктивні ознаки (наприклад, високий вміст олій, корисний для здоров'я склад, поліпшення живильної цінності тощо). Такі комбінації можуть бути одержані або звичайною селекцією (селекційний пакет), або спільно у вигляді нового явища трансформації, що включає одночасне введення множинних генів (молекулярний пакет). Сприятливі ефекти включають здатність справлятися зі шкідниками і поліпшену боротьбу з бур'янами культур рослин, що забезпечує вторинні вигоди для виробника і/або споживача. Таким чином, даний винахід може бути використаний в комбінації з іншими ознаками для забезпечення повного агрономічного пакета поліпшеної якості культури зі здатністю гнучко й економічно рентабельно регулювати будь-яке число агрономічних питань. Трансформовані клітини ростуть усередині рослин звичайним чином. Вони можуть утворювати зародкові клітини і передавати трансформовану ознаку(и) потомству рослин. Такі рослини можуть бути вирощені звичайним чином і схрещені з рослинами, що мають такі ж трансформовані спадкові фактори або інші спадкові фактори. Одержані гібридні індивіди мають відповідні фенотипічні властивості. У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини будуть трансформуватися генами, де використання кодону було оптимізоване для рослин. Див., наприклад, патент США 5380831. Крім того, способи створення синтетичних генів B.t. для використання в рослинах відомі в даній галузі (Stewart і Burgin, 2007). Одним необмежувальним прикладом переважної трансформованої рослини є фертильна рослина маїсу, що містить експресований рослиною 8 UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ген, що кодує білок Cry3Ba, і додатково містить другий набір експресованих рослиною генів, що кодують білки Cry34Ab/35Ab. Перенесення (або інтрогресія) обумовленої(их) білками Cry3Ba і Cry34Ab/35Ab ознаки (ознак) в інбредні лінії маїсу може бути досягнуте рекурентним селекційним розведенням, наприклад зворотним схрещуванням. У цьому випадку, бажаного рекурентного батька спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентним батьком), що несе відповідний(і) ген(и) для обумовлених Cry ознак. Потім потомство такого однократного схрещування знову спарюють з рекурентним батьком з наступною селекцією в одержаному потомстві для перенесення бажаної ознаки (ознак) від нерекурентного батька. Після трьох, переважно чотирьох, більш переважно п'яти або більше поколінь зворотного схрещування з рекурентним батьком із селекцією бажаної ознаки (ознак), потомство буде гетерозиготним відносно локусів, що контролюють ознаку(и), що переноситься(яться), але буде як рекурентний батько відносно більшості або майже всіх інших генів (див., наприклад, Poehlman & Sleper (1995), Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987), Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376). Стратегії керування стійкістю до комах (IRM). Roush et al., наприклад, описують "двотоксинні" стратегії, також називані "пірамідуванням" або "пакетуванням", для керування інсектицидними трансгенними культурами (Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998), 353, 1777-1786). Агентство США по захисту навколишнього середовища на своєму сайті в Інтернеті (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) публікує наступні вимоги до забезпечення нетрансгенних (тобто, які не містять B.t.-білки) резервних культур (блока культур, що не містять білки Bt/кукурудзи) для використання з трансгенними культурами, продукуючими один білок B.t., активний проти шкідників-мішеней. "Специфічні структуровані вимоги до захищеного від кукурудзяного метелика B.t. (Cry1Ab або Cry1F) кукурудзяним продуктам наступні: структуровані резервати: 20 % не захищених від лускокрилих B.t. кукурудзяних резервних культур у Кукурудзяній смузі; 50 % не захищених від лускокрилих B.t. резервних культур у Бавовняній смузі. Блоки внутрішній (тобто в межах поля B.t.); 1 зовнішній (тобто окремі поля в межах ½ милі (804 м) (якщо можливо /4 милі (402 м)) від поля B.t. для максимізації випадкового спарювання). Смуги усередині поля смуги повинні бути шириною щонайменше 4 ряди (переважно 6 рядів) для зменшення ефектів пересування личинок". Крім того, Національна Асоціація фермерів, що вирощують кукурудзу, на своєму сайті Інтернету (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) також публікує аналогічне керівництво відносно вимог до резервату. Наприклад: "Вимоги до IRM відносно кукурудзяного метелика: - Засійте щонайменше 20 % вашого кукурудзяного поля гібридами немодифікованого насіння. - В областях, продукуючих бавовну, резерват повинний складати 50 %. 1 - Повинні бути засіяні в межах /2 милі (804 м) від гібридів немодифікованого насіння. - Немодифіковане насіння може засіватися у вигляді смуг у межах поля B.t.; смуги резервних культур повинні мати ширину щонайменше 4 ряди. - Резервні культури можуть оброблятися звичайними пестицидами, тільки якщо для комахимішені досягаються економічні пороги. - Розпилювані інсектициди на основі B.t. не можуть використовуватися на немодифікованій кукурудзі. - Відповідна резервна культура повинна висіватися на кожній фермі з B.t.-кукурудзою". Як зазначено Roush et al. (наприклад, на стор. 1780 і 1784 у правому стовпчику), пакетування або "пірамідування" із двох різних білків, кожного ефективного проти шкідниківмішеней і з невеликою або відсутньою перехресною стійкістю, може забезпечити можливість використання меншого резервату. Roush припускає, що для успішного пакета, розмір резервату менше ніж 10 % може забезпечити керування стійкістю, порівнянне приблизно з 50 % резерватом для однієї ("непірамідованої") ознаки. Для доступних у даний час "пірамідованих" B.t. кукурудзяних продуктів, Агентство США по захисту навколишнього середовища вимагає засівання значно меншого (як правило 5 %) структурованого резервату не B.t. кукурудзою, ніж для продуктів з однією ознакою (як правило 20 %). 9 UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Існують різні шляхи забезпечення ефектів IRM резервату, включаючи різні геометричні типи посіву на полях (як зазначено вище) і суміші насіння у мішку, як додатково обговорюється Roush et al. (див. вище) і в патенті США 6551962. Зазначені вище процентні частки або подібні співвідношення резервату можуть використовуватися для розглянутих подвійних або потрійних пакетів або пірамід. Оскільки даний винахід стосується множинних, неконкурентних типів дії проти комахи-мішені кореневого жука, даний винахід може забезпечити одержання "нульового резервату", тобто поля, де відсутні немодифіковані рослини (оскільки вони не вимагаються). Дозвіл звичайно вимагається для конкретних B.t. трансгенних полів, більше приблизно 10 акрів (40,4 га). Таким чином, даний винахід включає поле 10 акрів (40,4 га) або більше з "нульовим резерватом" або без B.t.рослин; поля даного розміру раніше були потрібні для одержання значного резервату, що не містить білка B.t. Усі патенти, патентні заявки, тимчасові заявки і публікації, наведені у вигляді посилання або процитовані в даному описі, повністю включені за допомогою посилання в тій мірі, у якій вони не суперечать визначеним положенням даного опису. Нижче наведені приклади, що ілюструють методи здійснення винаходу. Ці приклади не слід розглядати як обмежувальні. Якщо не зазначене інше, усі процентні частки представлені по масі, і всі пропорції сумішей у розчиннику представлені по об'єму. Усі величини температури представлені в градусах Цельсія. Якщо спеціально не зазначене інше або не мається на увазі інше, однина означає використовуваний у даному описі термін "щонайменше один". ПРИКЛАДИ Приклад 1 - Експресія й очищення Конструювання експресійних плазмід, що кодують токсини повної довжини Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa. Стандартні способи клонування використовували при конструюванні експресійних плазмід Pseudomonas fluorescens (Pf), сконструйованих для продукції відповідно Cry-білків Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa1. Рестрикційні ендонуклеази з біологічних лабораторій Нової Англії (NEB; Ipswich, MA) використовували для розщеплення ДНК, і T4 ДНК лігазу від компанії Invitrogen використовували для лігування ДНК. Плазміди одержували з використанням набору Plasmid Midi (Qiagen), додержуючись інструкцій постачальника. Фрагменти ДНК очищали, використовуючи картридж Millipore Ultrafree®-DA (Billerica, MA), після гельелектрофорезу в агарозному гелі з тріс-ацетатним буфером. Основна стратегія клонування передбачала субклонування кодуючих послідовностей (CDS) Cry-білків Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa1 повної довжини в pMYC1803, наприклад, відповідно в рестрикційні сайти SpeI і XhoI (або XbaI, або HindIII), за допомогою чого їх поміщали під контроль промотору Ptac і термінатора rrnBTl2 із плазміди pKK223-3, відповідно (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). pMYC1803 являє собою середню копію плазміди з походженням реплікації з RSF1010, гена стійкості до тетрацикліну, і сайтом зв'язування рибосоми, що передує сайтам розпізнавання рестрикційного ферменту, у які можуть бути внесені фрагменти ДНК, що містять кодуючі білок області (заявка на патент США № 20080193974). Експресійну плазміду трансформували електропорацією у штам MB214 P. fluorescens, витягнутий у середовищі SOC-соєвий гідролізат, і висівали на чашки з бульйонним середовищем Luria (LB), що містить 20 мкг/мл тетрацикліну. Подробиці мікробіологічних маніпуляцій доступні в заявці на патент США № 20060008877, заявці на патент США № 20080193974 і заявці на патент США № 20080058262, включених у даний опис за допомогою посилання. Проводили скринінг колоній рестрикційним розщепленням мініпрепарату плазмідної ДНК. Послідовність плазмідної ДНК вибраних клонів, що містять вставки, визначали за контрактом з комерційною організацією, що проводить визначення послідовностей, такою як MWG Biotech (Huntsville, AL). Дані послідовностей збирали й аналізували, використовуючи програмне забезпечення Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI). Ріст і експресія. Аналіз росту й експресії в струшуваних колбах і продукцію токсинів Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa1 для характеристики, включаючи зв'язування рецептора B.t. і біологічний аналіз комах, здійснювали штамами P. fluorescens, що містять експресійні конструкти, вирощеними в струшуваних колбах (наприклад, клону pMYC2593 для Cry34Ab1, pMYC3122 для Cry35Ab1, і pMYC1334 для Cry3Aa1). Культури, що висіваються, вирощені в середовищі LB з добавкою 20 мкг/мл тетрацикліну, використовували для інокуляції 200 мл того ж середовища з 20 мкг/мл тетрацикліну. Експресію токсинів Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa1 за допомогою промотору Ptac індукували додаванням ізопропіл-β-D-1-тіогалактопіранозиду (IPTG) після початкової інкубації протягом 24 годин при 30C при струшуванні. Зразки культури брали 10 UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 під час індукції й у різні часові точки після індукції. Густину клітин вимірювали по оптичній густині при 600 нм (OD600). Фракціонування клітин і аналіз SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію) зразків зі струшуваних колб. У кожну часову точку узяття проб густину клітин зразків доводили до OD600=20 і аліквоти об'ємом по 1 мл центрифугували при 14000g протягом 5 хвилин. Клітинні осади після центрифугування заморожували при -80C. Розчинні і нерозчинні фракції з заморожених зразків клітинних осадів після центрифугування зі струшуваних колб генерували з використанням розчину для екстракції бактеріального білка EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Кожен клітинний осад ресуспендували в 1 мл розчину EasyLyse™ і додатково розводили 1:4 у літичному буфері і інкубували при струшуванні при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14000 об./хв. протягом 20 хвилин при 4C, і супернатант витягали у вигляді розчинної фракції. Потім осад після центрифугування (нерозчинну фракцію) ресуспендували в рівному об'ємі забуференого фосфатом сольового розчину (PBS; 11,9 мМ Na 2HPO4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, pН 7,4). Зразки змішували у співвідношенні 1:1 буфером зразка 2X Laemmli, що містить βмеркаптоетанол, і кип'ятили протягом 5 хвилин перед завантаженням на гелі NuPAGE Novex 420 % Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA). Електрофорез виконували в рекомендованому буфері XT MOPS. Гелі забарвлювали безпечною фарбою SimplyBlue™ Safe Stain відповідно до протоколу виробника (Invitrogen) і візуалізували з використанням візуалізуючої системи Typhoon (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA). Одержання тілець включення. Препарати тілець включення (IB) білка Cry одержували на клітинах у результаті ферментації P. fluorescens, що забезпечувало продукцію нерозчинного інсектицидного білка B.t., як продемонстровано SDS-PAGE і MALDI-MS (лазерною десорбцією при сприянні матриці/іонізаційною мас-спектрометрією). Ферментаційні осади P. fluorescens розморожували на водяній бані при 37C. Клітини ресуспендували до 25 % мас./об. у літичному буфері (50 мМ Тріс, pН 7,5, 200 мМ NaCl, 20 мМ динатрієвої солі EDTA (етилендіамінтетраоцтової кислоти), 1 % Triton X-100 і 5 мМ дитіотреїтолу (DTT)); безпосередньо перед використанням додавали 5 мл/л коктейлю інгібітору бактеріальної протеази (P8465 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Клітини суспендували, використовуючи гомогенізатор при установленні на найнижчий режим (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). До клітинної суспензії додавали лізоцим (25 мг Sigma L7651 з білка курячого яйця), змішуванням металевим шпателем, і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію охолоджували на льоду протягом 15 хвилин, потім обробляли ультразвуком, використовуючи ультразвуковий генератор Branson Sonifier 250 (два 1-хвилинних сеанси, при 50 % робочому циклі, продуктивність 30 %). Лізис клітин перевіряли мікроскопією. За необхідності, додавали додаткові 25 мг лізоциму й інкубацію й обробку ультразвуком повторювали. Коли лізис клітин підтверджувався мікроскопією, то лізат центрифугували при 11500×g протягом 25 хвилин (4 °C) для утворення осаду IB, і супернатант видаляли. Осад IB ресуспендували 100 мл літичного буфера, гомогенізували ручною мішалкою і центрифугували, як зазначено вище. Осад IB повторно промивали ресуспендуванням (у 50 мл літичного буфера), гомогенізацією, обробкою ультразвуком і центрифугуванням доти, поки супернатант не ставав безбарвним, і осад IB ставав щільним і не зовсім білим за кольором. Для кінцевого промивання, осад IB ресуспендували в підданій стерилізаційній фільтрації (через фільтр із розміром пор 0,22 мкм) дистильованій воді, що містить 2 мМ EDTA, і центрифугували. Кінцевий осад ресуспендували в підданій стерилізаційній фільтрації дистильованій воді, що містить 2 мМ EDTA, і зберігали в 1 мл аліквотах при -80C. Аналіз SDS-PAGE і кількісне визначення. Аналіз SDS-PAGE і кількісне визначення білка в препаратах IB проводили розморожуванням 1 мл аліквоти осаду IB і розведенням 1:20 підданою стерилізаційній фільтрації дистильованою водою. Потім розведений зразок кип'ятили з 4X відновлювального буфера зразка [250 мМ Тріс, pН 6,8, 40 % гліцерин (об./об.), 0,4 % бромфенол синій (мас./об.), 8 % SDS (мас./об.) і 8 % β-меркаптоетанол (об./об.)] і завантажували на Novex® 4-20 % Тріс-гліцин, 12+2-ямковий гель (Invitrogen), що працює з буфером IX Тріс/гліцин/SDS (Invitrogen). Гель задіювали протягом приблизно 60 хв. при 200 вольтах, потім забарвлювали і знебарвлювали, додержуючись методик з використанням безпечного барвника SimplyBlue™ Safe Stain (Invitrogen). Кількісне визначення цільових смуг проводили порівнянням денситометричних величин для смуг, у порівнянні зі зразками бичачого сироваткового альбуміну (BSA), обробленими на тому ж гелі, для побудови стандартної кривої, використовуючи програмне забезпечення Bio-Rad Quantity One. Солюбілізація тілець включення. 10 мл суспензій тілець включення з клонів P. fluorescens MR1253, MR1636 і MR832 (що містять, відповідно, 50-70 мг/мл білків Cry34Ab1, Cry35Ab1 і 11 UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Cry3Aa1) центрифугували при установленні на найвищий режим мікроцентрифуги Eppendorf моделі 5415C (приблизно 14000g) для осадження включень. Супернатант буфера для зберігання видаляли і заміняли 25 мл 100 мМ буфера ацетату натрію, pН 3,0, і відповідно для Cry34Ab1 і Cry35Ab1, і 100 мМ буфера карбонату натрію, pН 11 для Cry3Aa1, у конічній пробірці ємністю 50 мл. Включення ресуспендували, використовуючи піпетку, і перемішували у вихровій мішалці для ретельного змішування. Пробірки поміщали на платформу, що повільно обертається, при 4C протягом ночі для екстракції білків Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa1 повної довжини. Екстракти центрифугували при 30000g протягом 30 хв. при 4C, і зберігали одержані супернатанти, що містять солюбілізовані білки Cry повної довжини. Усічення протоксинів повної довжини. Білки Cry35Ab1 і Cry3Aa1 повної довжини були усічені або перетравлені хімотрипсином або трипсином для одержання їх хімотрипсинової або трипсинової серцевини, що являють собою активну форму білків. Зокрема, солюбілізований білок Cry35Ab1 повної довжини інкубували з хімотрипсином (з бичачої підшлункової залози) (Sigma, St. MO) (при 50:1=білок Cry:фермент, мас./мас.) у 100 мМ буфера ацетату натрію, pН 3,0, при 4 °C при обережному струшуванні протягом 2-3 днів, у той час як білок Cry3Aa1 повної довжини інкубували з трипсином (з бичачої підшлункової залози) (Sigma, St. MO) (при 20:1=білок Cry:фермент, мас./мас.) у 100 мМ буфера карбонату натрію, pН 11, при кімнатній температурі протягом 1-3 годин. Повну активацію або усічення підтверджували аналізом SDSPAGE. Молекулярна маса Cry35Ab1 і Cry3Aa1 повної довжини склала ≈44 і ≈73 кДа, і їх хімотрипсинової або трипсинової серцевини склала відповідно ≈40 і ≈55 кДа. Амінокислотна послідовність хімотрипсинової серцевини Cry35Ab представлена у вигляді SEQ ID NO:5. Амінокислотна послідовність трипсинової серцевини Cry3Aa представлена у вигляді SEQ ID NO:2. Ні хімотрипсинова, ні трипсинова серцевина не доступна для Cry34Ab1; таким чином, для аналізів зв'язування використовували Cry34Ab1 повної довжини. Амінокислотна послідовність Cry34Ab1 повної довжини представлена у вигляді SEQ ID NO:3. Очищення усічених токсинів. Очищали хімотрипсинізований Cry35Ab1 і трипсинізований Cry3Aa1. Зокрема, перетравлені матеріали центрифугували при 30000×g протягом 30 хв. при 4 °C для видалення ліпідів, і одержаний супернатант концентрували 5 разів, використовуючи пристрій з центрифужним фільтром з регенерованої целюлози Amicon Ultra-15 (відсікання молекулярної маси 10000; Millipore). Потім буфери зразків заміняли буфером 20 мМ ацетату натрію, pН 3,5, і для Cry34Ab1, і для Cry35Ab1, і на 10 мМ CAPS [3-(циклогексаміно)-1пропансульфонову кислоту], pН 10,5, для Cry3Aa1, використовуючи одноразові колонки PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Кінцеві об'єми доводили до 15 мл, використовуючи відповідний буфер для очищення з використанням системи рідинної хроматографії ATKA Explorer (Amersham Biosciences). Для Cry35Ab1, буфер A являв собою буфер у вигляді 20 мМ ацетату натрію, pН 3,5, і буфер B являв собою буфер A+1M NaCl, pН 3,5. Використовували колонку HiTrap SP (5 мл) (GE). Після того, як колонка була повністю зрівноважена з використанням буфера A, розчин Cry35Ab1 інжектували в колонку при швидкості потоку 5 мл/хв. Елюювання виконували з використанням градієнта 0-100 % буфера B при 5 мл/хв. із 1 мл/фракцію. Для Cry3Aa1 буфер A являв собою буфер у вигляді 10 мМ CAPS, pН 10,5, і буфер B являв собою буфер у вигляді 10 мМ CAPS, pН 10,5+1M NaCl. Використовували колонку Capto Q (5 мл) (GE), і всі інші процедури були аналогічні процедурам для Cry35Ab1. Після аналізу SDS-PAGE вибраних фракцій для додаткового вибору фракцій, що містять білок-мішень найкращої якості, фракції об'єднували. Буфер для очищеної хімотрипсинової серцевини Cry35Ab1 заміняли 20 мМ Bist-Tris, pН 6,0, як описано вище. Для очищеної трипсинової серцевини Cry3Aa1 сіль видаляли, використовуючи одноразові колонки PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Зразки зберігали при 4C для проведення пізніше аналізу зв'язування після кількісного визначення з використанням SDS-PAGE і аналізів системою візуалізації Typhoon (GE) з BSA як стандартом. Приклад 2 - Аналізи зв'язування Препарати BBMV. Препарати пузирчиків мембрани щіткової облямівки (BBMV) середньої кишки комах широко використовували для аналізів зв'язування Cry-токсину з рецептором. Препарати BBMV, використовувані в даному винаході, одержували з ізольованих середніх кишок третьої вікової стадії західного кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), використовуючи спосіб, описаний Wolferberger et al. (1987). Лейцинамінопептидазу використовували як маркер мембранних білків у препараті, і активність лейцинамінопептидази неочищеного гомогенату і препарату BBMV визначали, як описано раніше (Li et al. 2004a). Концентрацію білка в препараті BBMV вимірювали, використовуючи спосіб Bradford (1976). 125 Мічення I. Очищений Cry34Ab1 повної довжини, хімотрипсинізований Cry35Ab1 і 125 трипсинізований Cry3Aa мітили, використовуючи I для аналізів гомологічного і конкурентного зв'язування. Для пересвідчення в тому, що мічення радіоактивним ізотопом не усуває біологічну 12 UA 116081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 активність Cry-токсинів, проводили йодування в холодному вигляді, використовуючи NaI, відповідно до інструкцій з використання гранул для йодування Pierce® (Pierce Biotechnology, Thermo Scientific, Rockford IL). Результати біоаналізу показали, що йодована хімотрипсинова серцевина Cry35Ab1 залишалася активною проти личинок західного кукурудзяного кореневого 125 жука, але йодування інактивувало Cry34Ab1. Мічений радіоактивним ізотопом I-Cry34Ab1 специфічно не зв'язувався з BBMV комах, і Cry34Ab1 вимагає іншого способу мічення для оцінки зв'язування з мембранними рецепторами. Біоаналіз з використанням йодованої трипсинової серцевини Cry3Aa продовжували, і результат був доступний через один або два 125 125 тижні. Радіоактивно мічені I-Cry35Ab1 і I-Cry3Aa1 одержували йодуванням гранулами для 125 йодування Pierce® (Pierce) і Na I. Колонки для знесолення на вибір Zeba™ (Pierce) 125 використовували для видалення не включеного або вільного Na I з йодованого білка. Величини питомої радіоактивності йодованих Cry-білків знаходилися в діапазоні від 1 до 5 мкКі/мкг. Проводили множинні серії мічення й аналізів зв'язування. Аналізи специфічного зв'язування. Аналізи специфічного зв'язування виконували, 125 використовуючи мічені I Cry-токсини, як описано раніше (Li et al. 2004b). Для визначення специфічного зв'язування й оцінки афінності зв'язування (константи дисоціації, Kd) і концентрації сайтів зв'язування (Bmax) Cry35Ab1 і Cry3Aa з BBMV комах, серії зростаючих 125 125 концентрацій або I-Cry35Ab1, або I-Cry3Aa інкубували з даною концентрацією (0,05 мг/мл) BBMV комах відповідно в 150 мкл 20 мМ Bis-Tris, pН 6,0, 136,9 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl з додаванням 0,1 % BSA при кімнатній температурі протягом 60 хв. при обережному струшуванні. Токсин, зв'язаний з BBMV, відділяли від вільних токсинів у суспензії центрифугуванням при 20000×g при кімнатній температурі протягом 8 хв. Осад після центрифугування двічі промивали 900 мкл льодяного такого ж буфера, що містить 0,1 % BSA. Радіоактивність, що залишається в осаді після центрифугування, вимірювали автоматично гамма-лічильником COBRAII AutoGamma (Packard, Canberra company) і враховували загальне зв'язування. Паралельно проводили іншу серію реакцій зв'язування, і 500-1000-кратний надлишок неміченого відповідного токсину включали в кожну з реакцій зв'язування для того, щоб він повністю зайняв усі ділянки специфічного зв'язування неміченого відповідного токсину на BBMV, що використовували для визначення неспецифічного зв'язування. Специфічне зв'язування оцінювали відніманням неспецифічного зв'язування з загального зв'язування. Величини Kd і Bmax цих токсинів оцінювали, використовуючи специфічне зв'язування, у порівнянні з концентраціями використаного міченого токсину, використовуючи програмне забезпечення GraphPad Prism 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA). Графіки складали з використанням програм або Microsoft Excel, або GraphPad Prism. Експерименти повторювали щонайменше три 125 125 рази. Ці експерименти зв'язування продемонстрували, що як I-Cry35Ab1, так і I-Cry3Aa були 125 125 здатні специфічно зв'язуватися з BBMV (фіг. 1A і 1B). I-Cry35Ab1 і I-Cry3Aa мали афінність зв'язування Kd=2,31±1,26 і 24,0±9,7 (нМ), відповідно, і концентрацію ділянок зв'язування Bmax=31,69±6,38, 146,3±39,9 (пкмоль/мкг BBMV), відповідно. Аналізи конкурентного зв'язування. Аналізи конкурентного зв'язування додатково проводили для визначення того, чи розділяють Cry35Ab1 і Cry3Aa один і той же набір рецепторів. Для аналізів гомологічного конкурентного зв'язування Cry3Aa, збільшувані кількості (0-5000 нМ) неміченого Cry3Aa спочатку змішували з 5 нМ міченого Cry3Aa, і потім інкубували з даною концентрацією (0,05 мг/мл) BBMV при кімнатній температурі протягом 60 хв., відповідно. 125 Процентні частки зв'язаного I-Cry3Aa з BBMV визначали для кожної з реакцій, у порівнянні з початковим специфічним зв'язуванням за відсутності неміченого конкурента. Також проводили 125 аналізи гетерологічного конкурентного зв'язування між I-Cry3Aa і неміченим Cry35Ab1 окремо або неміченими Cry35Ab1+Cry34Ab1 (у молярному співвідношенні 1:3), відповідно, для ідентифікації того, чи розділяють вони один і той же набір рецептора(ів). Це досягалося збільшенням кількості неміченого Cry35Ab1 окремо або суміші Cry35Ab1+Cry34Ab1 як одного або двох конкурентів, включених у реакції, для конкуренції за передбачуваний рецептор(и) на BBMV з міченим Cry3Aa. Експерименти повторювали щонайменше три рази. Експериментальні результати продемонстрували, що Cry3Aa був здатний повністю витіснятися, коли молярна 125 концентрація збільшувалася до 500 нМ (100-кратний надлишок I-Cry3Aa) (фіг. 2). Однак або Cry35Ab1 окремо, або суміш Cry35Ab1+Cry34Ab1 (у співвідношенні 1:3) не була здатна 125 витіснити I-Cry3Aa. Ці дані вказують на те, що Cry35Ab1 окремо або Cry35Ab1+Cry34Ab1 (у співвідношенні 1:3) не розділяє рецептор з Cry3Aa. Посилання Bradford M.M. 1976. A rapid и sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248-254. 13 UA 116081 C2 5 10 15 Li H., Oppert B., Higgins R.A., Huang F., Zhu K.Y., Buschman L.L., 2004a. Comparative analysis of proteinase activities of Bacillus thuringiensis-XQsistant and-susceptible Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Insect Biochem. Mol. Biol. 34, 753-762. Li H., Oppert B., Gonzalez-Cabrera J., Ferre J., Higgins R.A., Buschman L.L. and Zhu K.Y. and Huang F. 2004b. Binding analysis of Cry1Ab и Cry1Ac with membrane vesicles from Bacillus thuringiensis-resistant and-susceptible Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 52-57. Wolfersberger M.G., Luthy P., Maurer A., Parenti P., Sacchi F., Giordana B., Hanozet G.M., 1987. Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the cabbage butterfly (Pieris brassicae). Comp. Biochem. Physiol. 86A, 301308. US Patent Application № 20080193974. 2008. BACTERIAL LEADER SUQUENCES FOR INCREASED EXPRESSION. US Patent Application № 20060008877, 2006. Expression systems with sec-system secretion. US Patent Application № 20080058262, 2008. rPA optimization. 14 UA 116081 C2 15 UA 116081 C2 16 UA 116081 C2 17 UA 116081 C2 18 UA 116081 C2 19 UA 116081 C2 20 UA 116081 C2 21 UA 116081 C2 22 UA 116081 C2 23 UA 116081 C2 24 UA 116081 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1. Трансгенна рослина кукурудзи, що продукує білок Cry34Ab1, білок Cry35Ab1 і інсектицидний білок Cry3Aa, де зазначений білок Cry35Ab1 має послідовність, що складається з SEQ ID NO: 4, зазначений інсектицидний білок Cry3Aа має послідовність, що складається з SEQ ID NO: 1, і зазначений білок Cry34Ab1 має послідовність, що складається з SEQ ID NO: 3, де комбінація білка Cry34Ab1, білка Cry35Ab1 і інсектицидного білка Cry3Aa є ефективною проти кукурудзяного кореневого жука в кишечнику кукурудзяного кореневого жука, і де білок Cry35Ab1 і білок Cry3Aa мають різні сайти зв'язування в кишечнику кукурудзяного кореневого жука. 2. Насінина зазначеної рослини кукурудзи за п. 1, де зазначена насінина містить зазначену ДНК, яка кодує зазначений білок Cry34Ab1, зазначений білок Cry35Ab1 і зазначений інсектицидний білок Cry3Aa. 3. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 1, яка додатково містить резервні рослини, які не містять білки B.t., де зазначені резервні рослини складають менше ніж 40 % зазначеної множини рослин. 4. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 30 % всіх сільськогосподарських рослин зазначеної множини рослин. 5. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 20 % всіх сільськогосподарських рослин зазначеної множини рослин. 6. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 10 % всіх сільськогосподарських рослин зазначеної множини рослин. 7. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 5 % всіх сільськогосподарських рослин зазначеної множини рослин. 8. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини розташовані блоками або смугами. 9. Суміш трансгенного насіння кукурудзи, яка містить резервне насіння від резервних рослин, що не містять білки B.t., і множину насіння за п. 2, де зазначене насіння містить зазначену ДНК, яка кодує зазначений білок Cry34Ab1, зазначений білок Cry35Ab1 і зазначений інсектицидний білок Cry3Aa, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 40 % усього насіння у суміші. 10. Суміш трансгенного насіння кукурудзи за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 30 % усього насіння у суміші. 11. Суміш трансгенного насіння кукурудзи за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 20 % усього насіння у суміші. 12. Суміш трансгенного насіння за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 10 % усього насіння у суміші. 13. Суміш трансгенного насіння кукурудзи за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 5 % усього насіння у суміші. 14. Множина насіння трансгенної рослини кукурудзи за п. 2, де вказана множина міститься в мішку або контейнері насіння і не містить резервного насіння, де зазначене насіння містить вказану ДНК, яка кодує вказаний білок Cry34Ab1, указаний білок Cry35Ab1 і вказаний інсектицидний білок Cry3Aa. 15. Спосіб керування розвитком стійкості до білка Cry у кукурудзяного кореневого жука, який включає стадію, на якій висівають насіння за будь-яким з пунктів 9-13 для одержання множини рослин за пп. 3-7, і стадію, на якій контактують кукурудзяного кореневого жука із зазначеною множиною трансгенних рослин кукурудзи. 16. Множина трансгенних рослин кукурудзи за будь-яким з пп. 3-8, де зазначені трансгенні рослини кукурудзи займають більше ніж 10 акрів (40,5 га). 17. Трансгенна рослина кукурудзи за п. 1, де зазначена трансгенна рослина кукурудзи являє собою рослину маїсу. 18. Рослинна клітина трансгенної рослини кукурудзи за п. 1, де зазначений білок Cry35Ab1 щонайменше на 95 % ідентичний послідовності, яка складається з SEQ ID NO: 4, зазначений 25 UA 116081 C2 5 інсектицидний білок Cry3Aa щонайменше на 95 % ідентичний послідовності, що складається з SEQ ID NO: 1, і зазначений білок Cry34Ab1 щонайменше на 95 % ідентичний SEQ ID NO: 3. 19. Спосіб одержання рослинної клітини трансгенної рослини кукурудзи за п. 18, який включає трансформацію рослинної клітини трансгенної рослини кукурудзи ДНК, яка кодує інсектицидний білок Cry3Aa, ДНК, яка кодує білок Cry34Ab1, і ДНК, яка кодує білок Cry35Ab1. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 26