Спосіб мікробіологічного окиснення n-, o- або s-гетероциклічних одно- або багатоядерних ароматичних сполук, спосіб мікробіологічного окиснення заміщених одно- або багатоядерних ароматичних вуглеводнів, нерозга

1. Спосіб мікробіологічного окиснення N-, Oабо S-гетероциклічних одно- або багатоядерних ароматичних сполук, який відрізняється тим, що а1) культивують рекомбінантний мікроорганізм, що експресує цитохром Р450-монооксигеназу бактеріального походження в культуральному середовищі UA (21) 2002021606 (22) 27.07.2000 (24) 15.09.2006 (86) PCT/EP00/07253, 27.07.2000 (31) 199 35 115.5 (32) 27.07.1999 (33) DE (31) 199 55 605.9 (32) 18.11.1999 (33) DE (31) 100 14 085.8 (32) 22.03.2000 (33) DE (46) 15.09.2006, Бюл. № 9, 2006 р. (72) Хауер Бернхард , DE, Пляйс Юрген , DE, Шванеберг Ульріх , DE, Шмітт Ютта , DE, Фішер Маркус , DE, Шмід Рольф , DE, Лі Кінг-Шен , JP, Лутц-Валь Сабіне , DE, Аппель Даніель , DE (73) БАСФ АКЦІЕНГЕЗЕЛЛЬШАФТ, DE (56) MUNRO ANDREW W. ET AL: "Regional saturation mutagenesis as an approach to іdentification of substrate specificity determinants in cytochrome P450 BM3". BIOCHEMICAL SOCIETY TRANSATIONS, Bd. 21, Nr. 4, 1993, Seite 409S, XP000971665. DE A 195 07 546, 12.09.1996. GB A 2 294 692, 08.05.1996. GB A 2 306 485, 07.05.1997. GRAHAM-LORENCE SANDRA ET AL: "An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R) arachidonic acid epoxygenase". JOURNAL OF BIOLOGІCAL CHEMISTRY, Bd. 272, Nr. 2, 1997, Seiten 1127-1135, XP002155914, ISSN: 0021-9258. 2 (19) 1 3 76701 4 в присутності екзогенного або проміжного субстраNО:2, що має щонайменше одну функціональну ту, що утворюється; або мутацію в області амінокислотної послідовності а2) інкубують реакційне середовище, що містить 86-88, і, в разі необхідності, додатково має щосубстрат, з цитохром Р450-монооксигеназою бакнайменше одну функціональну мутацію в одній з теріального походження; і областей амінокислотної послідовності 73-82, 172б) виділяють продукт окиснення, що утворився, 224, 39-43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356. 7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що екзоабо його наступний продукт з середовища; причому монооксигеназа є похідною від цитохром генний або проміжний субстрат, що утворюється, Р450-монооксигенази ВМ-3 з Bacillicus megaterium вибирають серед з амінокислотною послідовністю згідно з SEQ ID а) у разі необхідності, заміщених одно- або багаNО:2, що має щонайменше одну функціональну тоядерних ароматичних вуглеводнів; мутацію в області амінокислотної послідовності б) нерозгалужених або розгалужених алканів і ал86-88 і, в разі необхідності, додатково має щонайкенів; менше одну функціональну мутацію в одній з обв) у разі необхідності, заміщених циклоалканів і ластей амінокислотної послідовності 73-82, 172циклоалкенів. 8. Спосіб за п. 6 або 7, який відрізняється тим, 224, 39-43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що екзощо використовують мутант, що має щонайменше генний або проміжний субстрат, що утворюється, наступні одно- або багатократні замінення аміновибирають серед, у разі необхідності, заміщених кислот: N-, О- або S-гетероциклічних одно- або багатоядеа) Phe87Val; рних ароматичних сполук. б) Phe87Val, Leu188Gln; або 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, в) Phe87Val, Leu188Gln; Ala74Gly. 9. Спосіб за одним з пп. 6 - 8, який відрізняється що використовують мутант, що має щонайменше наступні одно- або багатократні замінення амінотим, що як екзогенний субстрат вибирають, як мікислот: німум, одну сполуку серед вищевизначених груп, в a) Phe87Val; разі необхідності, заміщених одно- або багатоядеб) Phe87Val, Leu188Gln; або рних ароматичних вуглеводнів, нерозгалужених в) Phe87Val, Leu 188Gln, Ala74Gly. або розгалужених алканів і алкенів, в разі необхід4. Спосіб за одним з пп. 1 - 3, який відрізняється ності заміщених циклоалканів і циклоалкенів, дотим, що як екзогенний субстрат вибирають, як мідають у середовище, а окиснення проводять шлянімум, одну сполуку групи в разі необхідності захом ензиматичного перетворення середовища, міщених N-, О- або S-гетероциклічних одно-, двощо містить субстрат, в присутності кисню при темабо багатоядерних ароматичних сполук, додають пературі від приблизно 20°С до 40°С і значенні рН у середовище, а окиснення проводять шляхом від приблизно 6 до 9, причому середовище, що ензиматичного перетворення середовища, що містить субстрат, містить крім того відносно субмістить субстрат, в присутності кисню при темпестрату приблизно 10-100-кратний молярний надратурі приблизно від 20°С до 40°С і значенні рН лишок відновних еквівалентів. 10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що як приблизно від 6 до 9, причому середовище, що містить субстрат, містить крім того відносно субекзогенний субстрат використовують сполуку, вистрату приблизно 10-100-кратний молярний надбрану серед наступних: н-гексан, н-октан, н-декан, лишок відновних еквівалентів. н-додекан, кумол, , i -ioнoн, нафталін. 5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що як 11. Спосіб мікробіологічного виробництва індиго екзогенний субстрат використовують сполуку, виі/або індирубіну, який відрізняється тим, що брану серед наступних: індол, 1-метиліндол, 5а1) культивують рекомбінантний мікроорганізм, що хлор або 5-броміндол, інден, бензотіофен, акривиробляє у культуральному середовищі цитохром дин, 6-метил або 8-метилхінолін, хінолін і хінальР450-монооксигеназу, що окислює індол у присутдин. ності екзогенного або проміжного індолу, що утво6. Спосіб мікробіологічного окислення, в разі необрюється; або хідності, заміщених одно- або багатоядерних ароа2) інкубують реакційне середовище, що містить матичних вуглеводнів, нерозгалужених або розгаіндол, з цитохром Р450-монооксигеназою, що окилужених алканів і алкенів, або, в разі необхідності, слює індол; і заміщених циклоалканів і циклоалкенів, який відб) виділяють продукт окиснення, що утворився, різняється тим, що або його наступний продукт з середовища; причоа1) культивують рекомбінантний мікроорганізм, що му монооксигеназа є похідною від цитохром Р450виробляє цитохром Р450-монооксигеназу, у кульмонооксигенази ВМ-3 з Bacillicus megaterium з амітуральному середовищі в присутності екзогенного нокислотною послідовністю згідно з SEQ ID NО:2, або проміжного субстрату, що утворюється; або що має щонайменше одну функціональну мутацію а2) інкубують реакційне середовище, що містить в області амінокислотної послідовності 86-88, і, в субстрат, з цитохром Р450-монооксигеназою, здаразі необхідності, додатково має щонайменше тною до окиснення вищевизначених сполук ; і одну функціональну мутацію в одній з областей б) виділяють продукт окиснення, що утворився, амінокислотної послідовності 73-82, 172-224, 39або його наступний продукт з середовища; 43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356. причому монооксигеназа є здатною до окиснення 12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що з вищевизначених сполук і є похідною від цитохром середовища виділяють індиго і/або індирубін, одеР450-монооксигенази ВМ-3 з Bacillicus megaterium ржаний шляхом окиснення проміжного індолу, що з амінокислотною послідовністю згідно з SEQ ID утворюється. 5 76701 6 13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що 3 з Bacillicus megaterium з амінокислотною посліокиснення індолу проводять шляхом культивувандовністю згідно з SEQ ID NО:2, що має щонайменя мікроорганізму у присутності кисню при темпенше одну функціональну мутацію в області аміноратурі приблизно 20-40°С і значенні рН від 6 до 9. кислотної послідовності 86-88, і щонайменше одну 14. Спосіб за одним з пп. 11-13, який відрізняєтьфункціональну мутацію в одній з областей амінося тим, що використовують мутант, що має щокислотної послідовності 73-82 і 172-224, і, в разі найменше наступні одно- або багатократні замінеобхідності, додатково має одну функціональну нення амінокислот: мутацію в одній з областей амінокислотної посліа) Phe87Val; довності 39-43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356. 16. Монооксигеназа за п. 15, яка відрізняється б) Phe87Val, Leu188Gln; або в) Phe87Val, Leu188Gln; Ala74Gly. тим, що вона має щонайменше одну функціональ15. Цитохром Р450-монооксигеназа, що, як мініну мутацію в області амінокислотної послідовності мум, здатна до однієї з наступних реакцій: 86-88 і має щонайменше одну функціональну муа) окиснення, в разі необхідності, заміщених N-, Отацію в одній з областей амінокислотної послідовабо S-гетероциклічних одно-, дво- або багатояденості 73-82 і 172-224. 17. Монооксигеназа за п. 15, яка відрізняється рних ароматичних сполук; б) окиснення, в разі необхідності, заміщених однотим, що вона має щонайменше багатократні заміабо багатоядерних ароматичних вуглеводнів; щення амінокислот: в) окиснення нерозгалужених або розгалужених а) Phe87Val, Leu188Gln; або алканів і алкенів і б) Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly; г) окислення, в разі необхідності, заміщених цика також їх функціональні еквіваленти, що здатні, як лоалканів і циклоалкенів, причому монооксигеназа мінімум, до однієї з вищевказаних реакцій окисє похідною від цитохром Р450-монооксигенази ВМнення. Даний винахід стосується нових цитохром Р450-монооксигеназ зі зміненою специфічністю субстрату, придатних для оксидування органічних субстратів, наприклад, N-гетероциклічних ароматичних сполук, кодованих для цього послідовностей нуклеотидів, що містять цю послідовність експресійних конструктів і векторів, і тим самим трансформованих мікроорганізмів, способу мікробіологічного оксидування різних органічних субстратів, таких як N-гетероциклічних ароматичних сполук і, зокрема, способу виготовлення індиго і індирубіну. Ензими з новими функціями і властивостями можуть бути отримані або шляхом відсівання природних проб або шляхом зміни білка відомих ензимів. При визначених обставинах останній метод може бути більш кращим в одержанні властивостей, що неймовірні на шляху природної селекції. Незважаючи на різні спроби по створенню ензимів, досі мало вдалих досліджень по стимулюванню каталітичної активності мутантів ензимів відносно визначеного субстрату (1-10). В цих відомих випадках субстрати структурно тісно зв'язані з природними субстратами відповідного ензиму. Досі немає повідомлень про успішне створення ензимів, що після модифікації каталізували б перетворення сполуки, що повністю відрізняється від природного субстрату ензиму. Виділена з бактерії Bacillius megaterium цитохром Р450-монооксигеназа звичайно каталізує субтермінальне гідроксилювання довголанцюжкових насичених кислот і відповідних амідів і спиртів з них або епоксидування ненасичених довголанцюжкових жирних кислот з середньою довжиною ланцюга (11-13). Оптимальна довжина ланцюга насичених жирних кислот складає від 14 до 16 атомів вуглецю. Жирні кислоти з довжиною ланцюга менш 12 не гідроксилюються (11). Структура гем-домену Р450 ВМ-3 визначалася за допомогою рентгеноструктурного аналізу (14-16). Місця зв'язування субстрату мають форму довгого тунелеподібного отвору, що від поверхні молекули йде до гем-молекули й обмежується майже винятково гідрофобними залишками амінокислот. Окремі заряджені залишки на поверхні гем-домену є залишками Arg47 і Туr51. Приймається, що вони беруть участь в зв'язуванні карбоксилатної групи субстрату шляхом утворення водневого зв'язку (14). Мутація Arg47 до Glu викликає дезактивацію ензиму арахідонової кислоти (13), але підвищує його активність в відношенні С12-С14-сполук алкілтриметиламіаку. Використання субстрату для ароматичних сполук, зокрема, для одно-, дво- або поліциклічних, зокрема, гетероциклічних ароматичних вуглеводнів, алканів, алкенів, циклоалканів і циклоалкенів відносно цього ензиму не було описано. Досі серед фахівців було прийнято, що інші, ніж описані тут органічні субстрати, як, наприклад, індол, не можуть бути субстратами через очевидні структурні розходження з природними субстратами Р450 ВМ-3, зокрема, через відсутність функціональних груп, що могли б зв'язувати вищезгадані залишки в кармані субстрату. Тому задачею даного винаходу є підготовка нових цитохром Р450 монооксигеназ зі зміненою специфічністю субстрату або зміненим профілем субстрату. Зокрема, повинні бути підготовлені мутанти монооксигенази, що в порівнянні з природним ензимом, що не підлягає мутації повинні бути ензиматично активні зі субстратами, що структурно суттєво відрізняються. "Змінений профіль субстрату" слід відрізняти в заявлених мутантів відносно природних ензимів. Для відповідних мутантів спостерігається, зокрема, поліпшення реакційної здатності, напри 7 76701 8 клад, підвищення питомої активності (вираженої Кращі мутанти монооксигенази мають, щов нмоль перетвореного субстрату/в хвилину/до найменше, одну функціональну мутацію, зокренмоль ензиму Р450), і/або, як мінімум, кінетичнома, заміщення амінокислоти, як мінімум, в одній з го параметра, обраного серед Kcat, Km або Kcat/Km областей послідовності 73-82, 86-88 і 172-224. (наприклад, як мінімум, 1%, від 10% до 1000%, Так, наприклад, Phe87 може бути заміщена амівід 10% до 500% або від 10% до 100%) при перенокислотою з аліфатичним боковим ланцюгом, творенні, як мінімум, однієї визначеної в групах як, наприклад, Ala, Val, Leu, зокрема, Val, Leu 188 від а) до d) сполуки, що оксидують. Заявлена може бути заміщений амінокислотою з амідним реакція оксидування охоплює ензимнобоковим ланцюгом, як, наприклад, Asn або, зоккаталітичне оксидування, як мінімум, однієї екзорема, GIn; а АІа74 може заміщатися іншою аміногенної (тобто такої, що додають в реакційне секислотою з аліфатичним боковим ланцюгом, як, редовище) або ендогенної (вже наявної в реакнаприклад, Val і, зокрема, Gly. ційному середовищі) сполуки. Зокрема, заявлена Особливо кращі мутанти монооксигенази реакція оксидування охоплює моно- або полігідцього типу відрізняються тим, що вони мають, роксилювання, як, наприклад, моно- і/або дигідщонайменше, одно- або багатократні заміщення роксилювання відносно аліфатичної або аромаамінокислот: тичної С-Н-групи, або епоксидування відносно 1) Phe87Val; переважно неароматичної С=С-групи. Можливі 2) Phe87Val, Leu188Gln; або також комбінації вищевказаних реакцій. Безпосе3) Phe87Val,Leu188Gln; Ala74Gly; редній продукт реакції може перетворюватися, а також їх функціональні еквіваленти. Числокрім того, в рамках неензиматичної послідовної ве значення тут позначає позицію мутації; перед або побічної реакції. Комбінації такого роду ензичисловим значенням стоїть первісна, за числоматичних і неензиматичних процесів також є вим значенням - нововведена амінокислота. об'єктом винаходу. "Функціональні еквіваленти" або аналоги муВищезгадані задачі неочевидним чином мотантів, що конкретно виявляються в цьому зв'язку жуть бути вирішені шляхом використання нових - різні мутанти, що надалі мають бажану специцитохром Р450-монооксигеназ, що, наприклад, фічність субстрату в рамках, як мінімум, однієї здатні оксидувати N-гетероциклічні дво- або бавищезгаданої реакції оксидування а)-d), тобто, гатоланкові ароматичні сполуки. наприклад, відносно гетероциклічних ароматичЗокрема, об'єктом винаходу є такі монооксиних вуглеводнів і, наприклад, гідроксилюють інгенази, в яких область, що з'єднує субстрат, здадол, або надалі в порівнянні з природними ензитна шляхом місцевого специфічного мутагенезу мами виявляють "змінений профіль субстрату". функціонально сприймати нові, наприклад, NПід "функціональними еквівалентами" розугетероциклічні субстрати. міють відповідно до винаходу також мутанти, що В кращій формі виконання винаходу нові мовиявляють, як мінімум, в одній з вищезгаданих нооксигенази розчинні, тобто існують не в мемпозицій послідовності інше, ніж конкретно назвабранно-зв'язаній формі й в цій формі ензиматичне заміщення амінокислоти, але, незважаючи на но активні. це таке, що приводить до мутанта, що також, як Заявлені монооксигенази переважно похідні з конкретно названі мутанти в порівнянні з природцитохром Р450-монооксигеназ бактеріального ними ензимами демонструють "змінений профіль походження, як, зокрема, похідна з цитохром субстрату" і каталізують, як мінімум, одну з вищеР450-монооксигенази ВМ-3 з Bacillicus згаданих реакцій оксидування. Функціональний megaterium з послідовністю амінокислот згідно з еквівалент задається, зокрема, також тоді, коли SEQ ID NO:2, що має, щонайменше, одну функзміни в профілі субстрату якісно співпадають, ціональну, тобто таку, що сприяє оксидуванню тобто, наприклад, коли однакові субстрати перенових органічних субстратів (див., зокрема, витворюються з різною швидкістю. значені від а) до d) групи сполук), як, наприклад, "Функціональні еквіваленти" охоплюють, звиN-гетероциклічні одно-, дво- або багатоланкові чайно, також мутанти Р450-монооксигенази, що ароматичні сполуки, мутацію в області послідовдоступні шляхом мутації ензимів Р450 з інших ності амінокислот 172-224 (замкнута область організмів тим же способом, як конкретно названі Р450 ВМ-3. Наприклад, шляхом послідовного F/G), 39-43 ( -смуга 1), 48-52 ( -смуга 2), 67-70 ( порівняння областей можна установити гомологісмуга 3), 330-335 ( -смуга 5), 352-356 ( -смуга 8), чні регіони послідовностей. За допомогою сучас73-82 (спіраль 5), 86-88 (спіраль 6). них методів молекулярного моделювання тоді Виготовлені відповідно до винаходу мутанти можна, ґрунтуючись на конкретних задачах винацитохром Р450-монооксигеназ переважно, як ходу, прийнятися за еквівалентні, що впливають мінімум, здатні до однієї з наступних реакцій: на зразок реакції мутації. a) оксидування в разі необхідності заміщених "Функціональні еквіваленти" охоплюють таΝ-, О-, або S-гетероциклічних одно-, дво- або кож мутанти, отримані шляхом однієї або багабагатоланкових ароматичних сполук; тьох добавок, заміщень, видалень і/або перетвоb) оксидування в разі необхідності заміщених рень амінокислот, причому названі додаткові одно- або багатоланкових ароматичних вуглевозміни можуть з'являтися в кожній позиції послідоднів; вності, поки вони приводять до мутанта зі змінеc) оксидування нерозгалужених або розгалуним профілем субстрату в вищезазначеному жених алканів і алкенів і смислі. d) оксидування в разі необхідності заміщених Субстрати групи а), що оксидуються відповіциклоалканів і циклоалкенів. 9 76701 10 дно до винаходу, в разі необхідності є заміщениалкани й алкени з 4-15, переважно з 6-12 атомами гетероциклічними одно-, дво- або багатоланми вуглецю. Як приклади можуть бути названі нковими ароматичними сполуками; зокрема, такибутан, н-пентан, н-гексан, н-гептан, н-октан, нми, що оксидуються або гідроксилюються N-, О-, нонан, н-декан, н-ундекан і н-додекан, а також або S-гетероциклічними одно-, дво- або багатоодно- або багатократно розгалужені аналоги цих ланковими ароматичними сполуками. Вони охопсполук, як, наприклад, аналоги сполук з 1-3 боколюють переважно двох або три, зокрема, дво, від вими метильними групами; або однократно або чотири до семиланкових, зокрема, шести або багатократно, наприклад, однократно ненасичені п'ятиланкові конденсовані кільця, причому, як аналоги вищеназваних алканів. мінімум, одно, переважно всі кільця мають ароСубстратами групи d), що оксидують відповіматичний вигляд і, як мінімум, одно з ароматичдно до винаходу є в разі необхідності заміщені них кілець несе в собі від одного до трьох, перециклоалкани і циклоалкени з 4-8 кільцевими атоважно один N-, О-, або S-гетероатом. У загальній мами вуглецю. Приклади такого роду представкільцевій структурі можуть бути в разі необхідноляють циклопентан, циклопентен, циклогексан, сті один або два інших однакових або різних гециклогексен, циклогептан і циклогептен. Кільцева тероатоми. Ароматичні сполуки можуть нести структура при цьому може містити один або декітакож від 1 до 5 замісників кільцевого вуглецю лька, наприклад, від 1 до 5 замісників відповідно або гетероатомів. Прикладами придатних замісдо вищевказаного визначення для сполук групи ників є від С1- до С4-алкіл, як метил, етил, n- або а) і b). Необмежуючими прикладами для цього є і-пропіл, або n-, і- або t-бутил, або від С2- до С4іонони, як -, - і -іонон, а також відповідні метиалкеніл, як етеніл, 1-пропеніл, 2-пропеніл, 1ліонони і ізометиліонони. Особливо кращі - і бутеніл, 2-бутеніл або 3-бутеніл, гідроксили і гаіонон. логени, як F, СІ або Вr. Названі алкілові або алОб'єктом винаходу є також послідовності нукенілові замісники в разі необхідності можуть клеїнових кислот, кодовані для заявленої моноомати також кето- або альдегідну групу, як, наприксигенази. Кращі послідовності виведені з SEQ ID клад, пропан-2-он-3-іл, бутан-2-ол-4-іл, 3-бутен-2NO:1, що, як мінімум, має одно нуклеотидне заол-4-іл. Необмежуючими прикладами придатних міщення, що веде до однієї з вищеописаних фунгетероциклічних субстратів є, зокрема, дволанкокціональних амінокислотних мутацій. Об'єктом ві гетероцикли, як індол, N-метиліндол і їх аналовинаходу є, крім того, функціональні аналоги нукги, заміщені від одного до трьох вищевизначенилеїнових кислот, що одержуються шляхом додами замісниками атомів вуглецю, як, наприклад, 5вання, заміщення, вставки і/або видалення одихлор-або 5-бром-індол; а також хінолін і похідні ночних або декількох нуклеотидів, що надалі хіноліну, як, наприклад, 8-метилхінолін, 6кодують монооксигеназу з бажаною специфічнісметилхінолін і хінальдин; бензотіофен і його анатю субстрату, як, наприклад, з окислюючою індол логи, заміщені від одного до трьох вищевизначеактивністю. ними замісниками атомів вуглецю. Відповідно до винаходу охоплюються також Субстрати групи b), що оксидують відповідно такі послідовності нуклеотидів, що включають так до винаходу, в разі необхідності є заміщеними називані німі мутації, або змінені відповідно до одно- або багатоланковими ароматичними вуглевикористання для кодування спеціального органіводнями, як бензол і нафталін. Ароматичні спозму походження або організму хазяїна в порівлуки в разі необхідності можуть бути однократно нянні з конкретно названою послідовністю, також або багатократно заміщеними і, наприклад, мати як і попередні природні варіанти. Винахід охопвід 1 до 5 замісників атомів вуглецю кільця. Прилює, крім того, також різновиди послідовностей кладами придатних замісників є від d- до С4нуклеїнових кислот, отримані шляхом дегенерації алкіл, як метил, етил, н- або ізо-пропіл, або н-, генетичного коду (тобто без зміни кореспондуюізо- або трет-бутил, або від С2- до С4-алкеніл, як чої послідовності амінокислот) або консервативетеніл, 1-пропеніл, 2-пропеніл, 1-бутеніл, 2ного заміщення нуклеотидів (тобто кореспондуюбутеніл або 3-бутеніл, гідроксили і галогени, як F, чі амінокислоти заміняються іншими СІ або Вr. Вищевказані алкілові або алкенілові амінокислотами того ж заряду, величини, полярзамісники в разі необхідності можуть мати також ності і/або розчинності), а також змінені шляхом кето- або альдегідну групу, як, наприклад, прододавання, вставки, інверсії або видалення нукпан-2-он-3-іл, бутан-2-ол-4-іл, 3-бутен-2-ол-4-іл. леотидів послідовності, що кодують заявлену Ароматичний вуглеводень в разі необхідності монооксигеназу "зі зміненим профілем субстраможе бути конденсований чотири - семичленним ту", а також кореспондуючі комплементарні поснеароматичним кільцем. Неароматичне кільце в лідовності. разі необхідності може виявляти один або два Об'єктом винаходу є, крім того, експресійні подвійних зв'язки С=С, одно або багатократно конструкти, що містять при генетичному контролі бути заміщене вищезгаданими замісниками й в регулятивних послідовностей нуклеїнових кислот, разі необхідності нести один або два кільцевих як мінімум, одну послідовність, що кодує заявлені гетероатоми. Прикладами особливо вживаних мутанти нуклеїнових кислот, а також вектори, що ароматичних вуглеводнів є одноланкові, як куохоплюють, як мінімум, один з цих експресійних мол, а також дволанкові субстрати, як інден і наконструктів. фталін, а також заміщені від одного до трьох виВідповідні до винаходу конструкти охоплющевизначеними замісниками атомів вуглецю. ють промотор 5'-вверх по довжині відповідної Субстрати групи с), що оксидують відповідно послідовності, що кодує, і термінаторну послідовдо винаходу - нерозгалужені або розгалужені ність 3'-вниз по довжині, а також, у разі необхід 11 76701 12 ності, інші звичайні регулятивні елементи, а саме, генази, а також сигналом термінатора або поліаоперативно зв'язані з послідовністю, що кодує. денілювання. Для цього застосовують доступну Під оперативним зв'язуванням розуміють послітехніку рекомбінації і клонування, описану в [Т. довне розташування промотору, що кодує посліМаньятіс, Е.Ф. Фрітш і Дж. Сембрук, Молекьюла довності, термінатора і, в разі необхідності, інших Клонін: Ε Лабораторі Меньюал, Колд Спрінг Харрегулятивних елементів такого роду, щоб кожний бор Лабораторі, Колд Спрінг Харбор, Нью Йорк з регулятивних елементів міг узгоджено викону(1989) (Т. Maniatis, E.F. Fritsch und J.Sambrook, вати свою функцію при експресії послідовності, Molecular Cloning: A Labaratory Manual, Cold що кодує. Прикладами оперативно зв'язаних посSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY лідовностей є послідовності мішеней, а також (1989)), а також у Т.Ж. Сільхеві, М.Л. Берман і трансляційний підсилювач, помножувач, сигнали Л.В. Енкуіст, Ікспіріментс уіз Джині Фьюжнс, Колд поліаденілювання й інші. Інші регулятивні елемеСпрінг Харбор Лабораторі, Колд Спрінг Харбор, нти охоплюють селективний маркер, сигнали поНью-Йорк (1984), (T.J Silhavy, M.L Berman und силення, репліки тому подібне. LW.Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Додатково до штучних регуляційних послідоSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY вностей перед первинним структурним геном (1984)), і в Аусабель Ф.М. і ін., Карент Протоколз можуть бути ще природна регуляційна послідовін Молекула Байолоджі, Гріні Паблішінг Ассос. ність. Шляхом генетичної зміни це природне реенд Уайлі Інтерсайнс (1987) (Ausubel, F.M. et al., гулювання може виключатися і підвищувати або Current Protocols in Molecular Biology, Greene знижувати експресію гена. Конструкт гена може Publishing Assoc. and Wiley lnterscience(1987))]. бути побудований простіше, що означає, що пеРекомбінантний конструкт нуклеїнової кислоред структурним геном не можуть бути вставлені ти, відповідно, генний конструкт уводиться для додаткові регуляційні сигнали, а природний пророзширення в придатний для цього організм хамотор зі своїм регулюванням не віддаляється. зяїна переважним чином у специфічному для Замість цього природна регулювальна послідовхазяїна векторі, що уможливлює оптимальну ексність мутує так, щоб більше не потрібно було пресію гена в хазяїні. Вектори відомі фахівцям і регулювання, а експресія гена підвищувалася можуть бути взяті з [книги "Вектори клонування" або знижувалася. Послідовності нуклеїнових кис(Ред. Поувелс П.Х. і ін., Hrsg., Ельсевьє, Амстерлот можуть міститися в генному конструкті в оддам - Нью-Йорк - Оксфорд, 1985) ("Cloning ній або багатьох копіях. Vectors", Pouwels P.H. et al., Hrsg., Elsevier, Прикладами вживаних промоторів є: cos-, tacAmsterdam-New York- Oxford, 1985))]. Під цими , tip-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclg-, T7-, T5-, векторами крім плазмідів слід розуміти також всі T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, I-PR або l-PL-промотори, інші відомі фахівцю вектори, як, наприклад, фаги, що знаходять застосування переважно в грамневіруси, як SV40, CMV (цитомегаловірус), бакулогативних бактеріях, а також грампозитивні промовірус і аденовірус, транспозонси, IS-елементи тори ату і SPO2, дріжджові промотори ADC1, (транспосабельні елементи), плазміди, косміди і MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH або рослинні пролінійні або циркулярні ДНК. Ці вектори можуть мотори CaMV/35S, SSU, OCS, ІіЬ4, usp, STLS1, репліціюватися або автономно в організмі хазяїВ33, nos або убіквітинові або фазеолінові промона, або хромосомно. тори. Особливо краще застосування промоторів, За допомогою описаних у винаході векторів що індукують, як, наприклад, світло- і, особливо, виробляються рекомбінантні мікроорганізми, що термоіндукованих промоторів, як РrРl. Принципотрансформуються, наприклад, як мінімум, одним во, всі природні промотори можуть застосовуваописаним у винаході вектором і можуть застосотися з їх регулюючими послідовностями. Виходявуватися для виробництва мутантів. Переважно чи з цього, можуть також з вигодою описані заявлені рекомбінантні конструкти ввозастосовуватися синтетичні промотори. дяться в придатну для цього систему хазяїна, Вказані регуляторні послідовності повинні запотім експресуються. При цьому фахівцями забезпечувати цілеспрямовану експресію послідовстосовуються переважно відомі методи клонуностей нуклеїнових кислот і експресію протеїнів. вання і трансфекції, щоб вставити названі нуклеЦе може, наприклад, у залежності від організму їнові кислоти в відповідну експресійну систему хазяїна означати, що ген експресується або зведля експресії. Придатні системи описуються, нархекспресується тільки після індукції, або він неприклад, у ["Карент протоколз ін молекьюла багайно експресується або зверхекспресується. йолоджі", Ф. Аусабель і ін., Hrsg., Вайлі ІнтерРегуляторні послідовності, відповідно, факсайнс, Нью-Йорк 1997 (Carrent Protocols in тори можуть при цьому переважно позитивно Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley впливати на експресію і тим самим підвищувати Interscience, NY 1997)]. або знижувати її. Таким чином, посилення регуЯк організми хазяїна принципово придатні всі ляторних елементів може здійснюватися переваорганізми, що уможливлюють експресію заявлежно в площині транскрипції, причому застосовуних нуклеїнових кислот, варіантів їх апелів, їх ються сильні транкскрипційні сигнали, як функціональних або еквівалентів похідних. Під промотори і/або "підсилювачі". Поряд з цим можорганізмами хазяїна слід розуміти, наприклад, ливо також посилення трансляції, причому, набактерії, гриби, дріжджі, рослинні або тварини приклад, поліпшується стабільність мРНК. клітини. Переважними організмами хазяїна є бакВиготовлення експресійної касети здійснютерії, як бактерії з роду Escherichia (наприклад, ється шляхом злиття придатного промотору з Escherichia coli), стрептоміцети, бацили або псепридатною послідовністю нуклеотидів монооксивдомонади, еукаріотичні мікроорганізми, як 13 76701 14 Saccharimyces cerevisiae, Aspergillus, еукаріотичні розкладаються, а монооксигеназа добувається з клітини більш високого порядку тваринного або лізату способом ізоляції білка. Клітини можуть рослинного походження, наприклад, Sf9 або розкладатися на вибір: високочастотним ультраСНО. звуком, високим тиском, як, наприклад, в комірці При бажанні генний продукт можна вносити тиску Френча, шляхом осмолізу, шляхом впливу для експресії також у трансгенні організми, як детергентів, літичних ензимів або органічних розтрансгенні тварини, зокрема, в мишей, овець або чинників, за допомогою гомогенізаторів або шляв трансгенні рослини. В разі трансгенних організхом комбінації декількох наведених способів. мів мова може йти також про так звані "нокаутні" Очищення монооксигенази може бути досягнуте тварини або рослини, в яких був виключений котакими відомими хроматографічними способами, респондуючий ендогенний ген, наприклад, шляяк хроматографією з молекулярним ситом (гелехом мутації або часткового або повного видава фільтрація), як хроматографія Q-Sepharose, лення. іонообмінна хроматографія і гідрофобна хромаСелекція успішно трансформованих організтографія, а також іншими звичайними способами, мів здійснюється маркерним геном, що також як ультрафільтрування, кристалізація, висалюміститься в векторі або експресійній касеті. Приквання, діаліз і нативний гелевий електрофорез. ладом таких маркерних генів є гени стійкості до Придатні способи описані, наприклад, у [Коопер антибіотиків і до ензимів, що каталізують кольоФ..Ж., "Біохемічні методи роботи", вид. Вальтер рову реакцію, що викликає фарбування трансфоде Грайтер, Берлін, Нью-Йорк (Cooper, F.G., рмованих клітин. Останні можуть тоді відбиратиBiochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de ся автоматично. Мікроорганізми, успішно Gruyter, Berlin, New York ) або в Скоупс, P., "Очитрансформовані вектором, що несуть ген стійкосщення білків", вид. Спрінгер, Нью-Йорк, Хайдеті до антибіотиків (наприклад, G418 або гідромільберг, Берлін (Scopes, R., Protein Purification, цин) можна селектувати шляхом середовищ, що Springer Verlag, New York, Heilelberg, Berlin)]. містять антибіотики, або живильних ґрунтів. МарОсобливо вигідно застосовувати для ізоляції керні білки, що представлені на поверхні клітин, рекомбінантного білка векторну систему або оліможуть використовуватися для селекції за допогонуклеотиди, що продовжують кДНК на визначемогою афінної хроматографії. ну послідовність нуклеотидів і тим самим кодують Комбінація організмів хазяїнів з векторами, подовжені поліпептиди або змішані білки, що що підходять для організмів, як то плазміди, віруслужать для більш простого очищення. Відповідні си або фаги, наприклад, плазміди з системою модифікації такого роду є, наприклад такі, що діють як іммобілізатор так звані "мітки", як, наприполімераза/промотор РНК, фаги , , або інші клад, відома як гексагістидиновий іммобілізатор помірні фаги або транспозонси і/або інші регулямодифікація або епітоп, що може розпізнаватися торні послідовності, що мають перевагу, утворює як антиген антитіл [описаний, наприклад, у Харекспресійну систему. Наприклад, під поняттям лоу Е. енд Лейн Д., 1988, Антитіла: Ε Лабораторі "експресійна система" слід розуміти комбінацію з Меньюал, Колд Спрінг Харбор (Нью-Йорк) Прес.) клітин ссавців, як СНО-клітини, і векторів, як век(Harlow E. and Lane D., 1988, Antibodies: A тор pcDNA3neo. Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Як уже згадувалося, генний продукт може пеPress)]. Ці іммобілізатори можуть служити для реважно вводитися для експресії в трансгенні зв'язування білка на твердих носіях, наприклад, тварини, наприклад, у мишей, в овець або в траполімерних матрицях, що, наприклад, можуть нсгенні рослини. Також можливо програмувати бути засипані в хроматографічну колонку, або вільні від клітин трансляційні системи з отриманої можуть застосовуватися на мікротитровальній з нуклеїнової кислоти РНК. пластині, або на інших носіях. Подальшим об'єктом винаходу є спосіб вигоОдночасно ці іммобілізатори можуть застосотовлення заявленої монооксигенази, коли кульвуватися для розпізнавання білків. Для розпізнативують мікроорганізм, що робить монооксигенавання білків можуть застосовуватися, крім того, зу, в разі необхідності індукують експресію такі звичайні маркери, як флуоресцентні барвнимонооксигенази і виділяють монооксигеназу з ки, ензимні маркери, що після реакції з субстракультури. Заявлена монооксигеназа при необхідтом утворюють продукт реакції, що детектується ності може вироблятися в промислових масштаабо радіоактивні маркери самостійно, або в комбах. бінації з іммобілізаторами для дериватизації Мікроорганізми можуть культивуватися і фебілків. рментуватися відомими способами. Бактерії моВинахід стосується, крім того, способу мікрожуть розмножуватися, наприклад, у ТВ- або LBбіологічного оксидування органічних сполук, як, середовищі і при температурі від 20°С до 40°С і наприклад, N-гетероциклічних одно-, дво- або значенні рН від 6 до 9. Докладно придатні умови багатоланкових вищевизначених ароматичних культивації описуються в [Т. Маньятіс, Е.Ф. Фрітш сполук, що відрізняються тим, що і Дж. Самбрук, Молекьюла Клонінг, Ε Лабораторі а1) культивують вишеозначений рекомбінанМеньюал, Колд Спрінг Харбор Лабораторі, Колд тний мікроорганізм у культурі в присутності екзоСпрінг Харбор, Нью-Йорк (1989) (Т. Maniatis, E.F. генного (внесеного ззовні) або утвореного проміFritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A жного оксидуючого субстрату, заявленої Labaratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, монооксигенази, переважно в присутності кисню Cold Spring Harbor, NY (1989))]. (тобто аеробно); або У тому випадку, коли монооксигеназа не виа2) інкубують утримуюче субстрат реакційне діляється в культуральне середовище, клітини 15 76701 16 середовище з заявленим ензимом, переважно в мів здійснюється переважно в присутності кисню присутності кисню і донора електронів; і в комплексному середовищі, як, наприклад, ТВb) виділяють продукт оксидування, що утвоабо LB-середовище при температурі культивації рився, або послідовний продукт цього з середоприблизно 20-40°С і значенні рН від 6 до 9, поки вища. не буде досягнута достатня щільність клітин. ДоПотрібний для перетворення кисень надхобавка екзогенного індолу звичайно не потрібна, дить в реакційне середовище з навколишнього оскільки він утворюються мікроорганізмом як повітря або може вводитися, якщо потрібно, віпроміжний продукт. При перетворенні інших субдомим способом. стратів може однак вимагатися добавка екзогенСубстрат, що оксидується, переважно вибиного субстрату. Щоб можна було краще керувати рається серед реакцією оксидування, кращим є використання a) у разі необхідності заміщених Nпромотору, що індукують, особливо, що індукугетероциклічних одно-, дво- або багатоланкових ють температурою. При цьому температуру підвищевизначених ароматичних сполук; вищують до точки індукції, наприклад, 42°С при b) у разі необхідності заміщених одно-, або промоторі РrРl, підтримують її протягом достатбагатоланкових ароматичних вуглеводнів; нього часу, наприклад, від 1 до 10, або від 5 до 6 c) нерозгалужених або розгалужених алканів годин, для експресії активної монооксигенази, а і алкенів; потім зменшують температуру до 30-40°С. При d) у разі необхідності заміщених циклоалканів цьому культивація продовжується в присутності і циклоалкенів. кисню від 12 годин до 3 днів. Зокрема, при оксиКращий варіант способу спрямований на дуванні індолу значення рН за рахунок добавки утворення індиго/індирубіну і відрізняється тим, NaOH може підвищуватися, наприклад, до 9-10, що субстрат є проміжним індолом, що утворений завдяки чому додатково сприяє утворенню індив культурі, і з культурального середовища видіго, відповідно, індирубіну шляхом оксидування на ляють індиго і/або індирубін, що утворюється, що повітрі ензиматично утворених продуктів оксидубув отриманий шляхом оксидування проміжних вання 2- і 3-гідроксиіндолу. гідроксиіндолів, що утворюються. Утворення індиго/індирубіну відповідно до Якщо оксидування відповідно до даного виданого винаходу пояснюється наступною схемою находу проводиться за допомогою рекомбінантреакції: ного мікроорганізму, то культивація мікроорганіз Якщо оксидування відповідно до винаходу, навпроти, проводиться за допомогою очищених або збагачених мутантів ензиму, то заявлений ензим розчиняють в утримуючому екзогенний 17 76701 субстрат, наприклад, індол, середовищі (приблизно 0,01-10мМ, або 0,05-5мМ) і проводять перетворення, переважно в присутності кисню, при температурі приблизно від 10°С до 50°С, наприклад, від 30°С до 40°С, і значенні рН приблизно від 6 до 9 (яке, наприклад, установлюється при 100-200мМ фосфатного або ТРІС-буфера), а також у присутності відновника, причому утримуюче субстрат середовище містить, крім того, відносно субстрату, що окислюється, приблизно 1-100 кратний, або 10-100 кратний молярний надлишок відновних еквівалентів. Кращим відновником є НАДФН. Добавка відновника може, в разі необхідності, здійснюватися порціями. Аналогічним способом як субстрати є кращі: н-гексан, н-октан, н-декан, н-додекан, кумол, Iметиліндол, 5-СІ або Br-індол, інден, бензотриофен, , і -іонон, акридин, нафталін, 6-метил або 8-метилхінолін, хінолін і хінальдин. Наприклад, заявлена ензиматична реакція оксидування може проводитися за наступних умов: Концентрація субстрату: від 0,01 до 20мМ Концентрація ензиму: від 0,1 до 10мг/мл Температура реакції: від 10°С до 50°С РН: від 6 до 8 Буфер: від 0,05 до 0,2Μ фосфата калію або ТРІС/НСІ Донор електронів: переважно додається порціями (початкова концентрація приблизно від 0,1 до 2мг/мл). Перед початком реакції, наприклад, шляхом добавки донора електронів (наприклад, НАДФН) може проводитися короткострокова (1-5 хвилин) Рhе87: Leu188: Ala74: 18 попередня інкубація (приблизно 20-40°С). Перетворення здійснюється аеробно, в разі необхідності при додатковому введенні кисню. При заявленому способі оксидування кисень, що одержується в реакційному середовищі або доданий, розщеплюється ензиматично і редуктивно. Потрібний відновний еквівалент поставляється відновним засобом, що додається, (донором електронів). Продукт оксидування, що утворюється, далі відокремлюється від середовища й очищається звичайним способом, як, наприклад, шляхом екстракції або хроматографії. Подальшими об'єктами винаходу є біореактори, що включають заявлений ензим або заявлений рекомбінантний організм у іммобілізованій формі. Останній об'єкт винаходу стосується застосування заявлених цитохром Р450-монооксигеназ або заявленого вектора або мікроорганізму для біологічного оксидування субстрату з груп а)-d), зокрема, N-гетероциклічних одно, дво або багатоланкових ароматичних сполук і, переважно, для утворення індиго і/або індирубіну. Запропонований винахід більш докладно описується з урахуванням наступних прикладів. Приклад 1 Рандомізація спеціальних кодонів Р450 ВМ-3 Дослідження в суттєвому ступені були проведені так, як описано в (19). Три позиції (Рhе87, Leu188 і АІа74) були рандомізовані за допомогою місцевоспецифічного мутагенезу з застосуванням набору Stratagene QuikChange kit, Ла Джолла, Каліфорнія, США (La Jolla, CA, USA). В окремих позиціях були використані наступні ПЦРприклади: 5' -gcaggagacgggttgnnnacaagctggacg-3' (SEQ ID NO:3) 5' -cgtccagcttgtnnncaacccgtctcctgc-3' (SEQ ID NO:4) 5' -gaagcaatgaacaagnnncagcgagcaaatccag-3" (SEQ ID NO:5) 5' -ctggatttgctcgctgnnncttgttcattgcttc-3' (SEQ ID NO:6) 5' -gctttgataaaaacttaaagtcaannncttaaatttgtacg-31 (SEQ ID NO:7) 5' -cgtacaaatttaagnnnttgacttaagtttttatcaaagc-3' (SEQ ID NO:8) Умови для ПЦР були для всіх трьох позицій ідентичні. Зокрема, застосовувалося по 50мкл реакційного об'єму, 17,5пмоль кожного прикладу, 20пмоль шаблона плазміду ДНК, 3од. Pfu полімерази і 3,25нмоль для кожного dNTP (дезоксинуклеозид-5'-трифосфат). Реакція ПЦР була почата при 94°С/1хв, а потім був 20 разів повторений наступний цикл: 94°С, 1хв; 46°С, 2,5хв; 72°С, 17хв. Після 20 циклів реакція була продовжена 15хв. при 72°С. Після ПЦР шаблон ДНК реагував з 20од. Dpni при 37°С протягом 3 годин. Далі трансформувалися клітини E.coli DH5 . Трансформовані клітини E.coli DH5 розміщалися на агарових LB-платах, що містили 150мг/мл ампіциліну. Після цього 18 годин при 37°С здійснювалася інкубація. Приклад 2 Експресія й очищення Р450 ВМ-3 і її мутантів і виробництво синього пігменту Ген Р450 ВМ-3 і його мутанти були експресовані під контролем сильного температурноіндукованого промотору PRPL плазміду pCYTEXPI в E.coli DH5 , як вже описано (20). Колонії були взяті стерильним зубчатим відбірником і перенесені на мікротитровальні пластини з 96 комірками, що містять 200мкл середовища ТВ і 100мкг/мл ампіциліну на комірку. Після цього всю ніч при 37°С здійснювалася інкубація. 40мкл клітинної культури кожної комірки були потім переведені в культуральну пробірку, що містила 2мл ТВ-середовища з 100мкг/мл ампіциліну. Після цього протягом 2 годин проводилася культивація при 37°С. Потім для індукції температура підвищувалася до 42°С на 6 годин. Після цього культивація продовжувалася всю ніч при 37°С, причому був отриманий блакитний пігмент. Препаративне виготовлення ензиму або блакитного пігменту проводилося, виходячи з 300мл клітинної культури (OD578нм=0,8-1,0). Для ізоляції ензиму клітини піддавалися центрифугуванню 10хв. при 4000об/хв, потім ресуспендувалися в 0,1Μ КхРО4-буфері, рН 7,4. Охолоджені до льоду клітини обережно розкладалися за допомогою приладу Branson Sonifiers W25 (Дайтцебах, Німе 19 76701 20 ччина) при вихідній потужності 80Вт шляхом триним центрифугуванням при 500g блакитний закратного опромінення по 2хв. Суспензії були лишок, що утворився, екстрагувався тетрагідроцентрифуговані 20хв. при 32750g. Сирий екстракт фураном (ТГФ). Екстракт випарювався майже до був використаний для визначення активності, сухого стану, і червоний пігмент багатократно відповідно, для очищення ензиму. Очищення екстрагувався абсолютним етанолом. Блакитна ензиму здійснювалася, як описано в (21), на що тверда речовина, що залишилася, була розчинетут здійснюється настійне посилання. Концентрана в ТГФ і аналізувалася методом тонкошарової ція очищеного ензиму визначалася з урахуванхроматографії (TLC). Розчин етанолу був випаруням різниці в екстинкції при 450 і 490нм, як вже ваний і очищений за допомогою силікагелевої описано в (11) із застосуванням коефіцієнта ексхроматографії (DC 60, Мерк, Дармштадт, Німечтинкції =91мМ-1см-1. чина; 2см 30см), перш ніж вона була промита Приклад 3 ТГФ і петролейним ефіром у співвідношенні 1:2. Виділення мутантів, що виробляють великі Отриманий червоний розчин був випарений і кількості блакитного пігменту аналізувався методом TLC. Абсорбційні спектри З кожної позиції були виділені відповідно 100 блакитного і червоного пігменту були отримані за колоній мутантів, що були отримані шляхом рандопомогою спектрофотометра Ultraspec 3000 домізації кодону відповідної позиції. Ці колонії (Фармасія, Уппсала, Швеція) в області від 400 до були культивовані в культуральних пробірках для 800нм. Крім того, блакитний і червоний барвник виробництва блакитного пігменту. Після промианалізувався за допомогою мас-спектроскопії і 1 вання клітин водою і багатьох уповільнених опеН-ЯМР-спектроскопії. рацій центрифугування (500об/хв) блакитний пігРезультати експериментів мент був екстрагований диметилсульфоксидом 1. Підвищення виробництва блакитного піг(ДМСО). Розчинність блакитного пігменту в менту шляхом мутагенезу Р450 ВМ-3 ДМСО була найбільшою. Абсорбція екстракту Природний Р450 ВМ-3 не має здатності до була визначена в області 677нм. Ті мутанти, що виробництва блакитного пігменту, що містить виробляли найбільшу кількість пігменту відносно індиго, відповідно, проміжні продукти - 2-, відповсіх мутантів визначеної позиції, були використавідно, 3-гідроксиіндол. Щоб одержати достатню ні для секвенування ДНК (набір АВІ DNA кількість блакитного пігменту, Р450 ВМ-3 був підданий цілеспрямованому перетворенню. Всі муSequenzierungs-Kit; ABI Prism 377 DNA танти, що виробляють блакитний пігмент, були Sequencer) і, крім того, застосовувалися як шабсеквеновані. Було встановлено, що мутувала, як лон для місцевоспецифічного рандомізованого мінімум, одна з трьох наступних позицій: Phe87, мутагенезу. Leu188 і АІа74. Тому приймалося, що ці три позиПриклад 4 ції відіграють вирішальну роль для активності Тестування на активність для гідроксилюванР450 ВМ-3 при виробництві блакитного пігменту. ня індолу Зі структури гем-домену цитохрома Р450 ВМ-3, Активність гідроксилювання індолу перевірякомплексованого пальмітолеїновою кислотою, лася в розчині, що містив 8мкл розчину індолу видно, що Phe87 охороняє субстрат від ближньо10-500мМ у ДМСО, 850мкл буфера ТРІС/НСІ го зсуву гем-групи (14). Мутант Phe87Val виявляє (0,1М, рН 8,2) і 0,6нмоль Р450 ВМ-3 природного високу регіо- і стереоселективність при епоксидутипу або мутантів у кінцевому об'ємі 1мл. Суміш ванні (14S,15R)-арахідонової кислоти (13), а мубула попередньо інкубована протягом 9хв, перш тант Phe87Ala переміщає позицію гідроксилюніж запускалася реакція шляхом добавки 50мкл водяного 1мМ розчину НАДФН. Реакція припинявання -1, -2 і -3 (22). Позиція 87 була тому ласячерез 20сек шляхом додавання 60мкл 1,2Μ обрана першою для місцевоспецифічного рандоΚΟΗ. Протягом 5-30сек (за аеробних умов) ензимізованого мутагенезу за допомогою ПЦР. У промні продукти були цілком переведені в індиго бірочних культурах було отримано 7 колоній, що після індукції виробляли незначну кількість бла([ 2,2'-бііндолін]-3,3'-діон) і індирубін ([ 2,3'китного пігменту. Колонія, що виробляла найбібііндолін]-2,3'-діон). Продукти індиго були визнальшу кількість блакитного пігменту, була обрана чені шляхом їх абсорбції в області 670нм. Градудля секвенування ДНК. Дані секвенації давали ювальний графік для чистого індиго на цій довзаміщення Рhе87 на Val. Мутант Phe87Val був у жині хвилі дає коефіцієнт екстинкції 3,9мМ-1см-1. підсумку застосований як шаблон на другому колі Лінійний хід градуювального графіка отриманий місцевоспецифічного рандомізованого мутагенедля виробництва індиго через час реакції в 40сек зу в позиції Leu188. Структура гем-домену, компри застосуванні 0,6нмоль природного типу, відплексованого пальмітолеїновою кислотою покаповідно, мутанта Р450 ВМ-3 і від 0,05 до 5,0мМ зує, що репозиціонування F- і G-спіралі індолу. Індирубін має дуже слабку абсорбцію при приводить залишок Leu188 у прямий контакт із 670нм, а кількості індирубіну, що утворилися, субстратом (14). Тому ця позиція може відігравазначно менше, ніж кількість індиго. При визнати важливу роль у зв'язуванні або орієнтуванні ченні кінетичних параметрів утворення індирубіну субстрату. Після проведення другого скринінгу не враховувалося. Споживання НАДФН визначаспостерігалася 31 колонія, що виробляла блакитлося шляхом виміру в області 340нм і розрахунку ний пігмент. Мутант, що виробляв найбільшу кіз використанням коефіцієнта екстинкції 6,2мМ1 лькість пігменту, містив заміщення Phe87Val і см-1, як описано в (17). Leu188Gln. Цей мутант був у підсумку мутований Приклад 5 в позиції АІа74 у третьому проході місцевоспеОчищення індиго і індирубіну цифічного рандомізованого мутагенезу. При цьоПісля промивання клітин водою і повторюва 21 76701 22 му одержували трикратні мутанти F87L188A74 не містить монооксигенази Р450. Відповідно до (Phe87Val, Leu188Gln і Ala74Gly), що робили бавинаходу, насамперед, повинна бути визначена гато мг блакитного пігменту в дволітровій колбі, каталітична активність чистого ензиму відносно що містить 300мл ТВ-середовища. Цієї кількості індолу. Мутант F87L1888A74 був змішаний з інбуло досить для виділення і визначення блакитдолом. Не спостерігалося ніякої кольорової реакного пігменту. ції. Тільки після добавки НАДФН у реакційну су2. Виділення і визначення блакитного пігмеміш приблизно через 20хв. утворився блакитний нту пігмент. Шляхом доведення значення рН реакПісля промивання клітин блакитний залишок ційної суміші до значення 11, через 30сек після був екстрагований ТГФ і проаналізований метододавання НАДФН, протягом декількох секунд дом тонкошарової хроматографії. Блакитний пігстало видно синє фарбування. Контрольні дослімент був розділений на блакитні компоненти, що дження з застосуванням природного Р450 ВМ-3 швидко просуваються і червоні компоненти, що були завжди негативні, навіть при застосуванні повільно просуваються. Обидва компоненти мапідвищених концентрацій ензиму, індолу і НАДють такі ж параметри рухливості, як компоненти ФН. Блакитний пігмент був екстрагований етилапроби комерційного індиго. цетатом і проаналізований методом тонкошароПісля очищення були зареєстровані абсорбвої хроматографії. Блакитний пігмент знову ційні спектри обох компонентів у ДМСО. Блакитрозділився на блакитний, що швидко просуваєтьний компонент має такий же спектр, як проба ся і червоний компонент, що повільно просувакомерційного індиго. Очищені блакитні і червоні ється. Рентгенофлуоресцентні значення й абсоркомпоненти, відповідно, були проаналізовані за бційні спектри були ідентичні тим же значенням, допомогою мас-спектрометрії. Мас-спектри обох що й в екстракті ферментаційного бульйону. Мупігментів мають сильний іонномолекулярний пік танти F87L188A74 Р450 ВМ-3 являють собою при m/z=262 і 2 фрагментарних піки при m/z=234 і гідроксилазу індолу. 205 (відносна інтенсивність, відповідно, 10%). Дотепер було описано тільки два шляхи енЦей зразок є типовим для індигоїдних сполук. зиматичної трансформації індолу в індиго. Один Елементарний склад цих іонів був визначений за шлях каталізує за допомогою діоксигенази, друдопомогою мас-спектроскопії високого розділенгий - стирол-монооксигенази (24, 25). Стехіометня як C16H10N2O2, C15H10N2O, відповідно, C14H9N2. рія НАДФН в обох випадках складає 2. Тому було Це також характерно для структур індигоїдних прийнято, що на противагу діоксигеназі заявлені типів. Тим самим блакитний пігмент був визначемутанти F87L188A74 індолу гідроксилюються ний як індиго, а червоний - як індирубін. Для підттільки в одній позиції, щоб утворити оксіндол (2 1 вердження структури був перевірений Н-ЯМР гідроксиіндол) або індоксил (3-гідроксиіндол). обох пігментів у розчині ДМСО-D6. Результати 4. Кінетичні параметри гідроксилювання інспівпадають з літературними даними (23). долу 3. Виробництво індиго з ізольованими ензиДля визначення кінетичних параметрів гідромами ксилювання індолу використовувалися чисті проВідомо, що індиго може бути отриманий з інби природного ензиму Р450 ВМ-3 і мутантів долу шляхом мікробіологічної трансформації (24Leu188Gln, Phe87Val, F87L188 і F87L188A74. Ре26). Однак жодна з цих мікробіологічних систем зультати представлені в нижченаведеній Табл. Таблиця Кінетичні параметри гідроксилювання індолу мутантів Р450 ВМ-3 Мутанти WT Leu188Gln Phe87Val F87L188 F87L188A74 а) b) Kcat (C-1) -a) н.о.b) 2,03 (0,14) 2,28 (0,16) 2,73 (0,16) Km (MM) н.о. 17,0 (1,0) 4,2 (0,4) 2,0 (0,2) Kcat/Km (M-1с-1) н.о. 119 543 1365 активності не спостерігалося не визначено (активність була занадто незначною щоб її можна було вимірити) Навіть при надлишку очищеного ензиму і високій концентрації індолу природний ензим не в змозі оксидувати індол. Мутант Leu188Gln виявляє незначну активність. Мутант Phe87Val має -1 -1 каталітичну активність 119М с для гідроксилювання індолу. Каталітична ефективність подвійних мутантів F87L188 (Phe87Val, Leu188Gln) підвищується до 543М-1с-1 і була підвищена за рахунок введення інших заміщень Ala74Gly до 1365М-1с-1. Значення Kcat підвищуються від Phe87Val до трикратних мутантів на, приблизно, 35%, в той час, як значення Km зменшуються приблизно в 7 разів. Це вказує на те, що Ala74Gly і Leu188Gln беруть участь в зв'язуванні субстрату. -1 Частка оборотності індолу (Kcat=2,73с ) для трикратних мутантів F87L188A74 більш ніж у 10 разів вище, ніж для більшості ензимів Р450 (18). Приклад 6: гідроксилювання н-октану модифікованої цитохром Р450-монооксигенази Перетворення було проведено за допомогою 23 76701 мутанта монооксигенази Р450 ВМ-3, що містить наступні мутації: Phe87Val, Leu188Gln, Ala74 Gly. Як субстрат був обраний н-октан. Для гідроксилювання н-октану застосовувався наступний реакційний набір: мутанти Р450 ВМ-3: 17,5мг(ліофілізат); буфер: 9,1мл (буфер з фосфату калію, 50мМ, рН 7,5); субстрат: 50мкл розчину 60мМ (в ацетоні); температура: 25°С Ліофілізат ензиму був розчинений в 500мкл буфера і відразу з субстратом і буфером був інкубований 5хв. при кімнатній температурі. Потім було здійснене додавання 300мкл розчину НАДФН (5мг/мл). Додавання НАДФН повторювалося двічі. Хід реакції контролювався шляхом виміру абсорбції на 340нм, завдяки чому можна було спостерігати зменшення НАДФН. НАДФН при цьому додавали по 300мкл, оскільки висока концентрація НАДФН веде до дезактивації ензиму. Потім для виділення продукту реакційний розчин був екстрагований 3 рази по 5мл діетилефіру. Об'єднані органічні фази висушувалися за допомогою MgSO4 і збиралися. Потім продукти були проаналізовані методами тонкошарової хроматографії (DC), газової хроматографії з масспектроскопічним закінченням (GC/MS) і ЯМР. GC/MS - аналіз реакційної суміші дав наступні результати: Сполука Rt (хв) 1) Конверсія (% 4-октанол 13,51 37 3-октанол 14,08 47 2-октанол 14,26 16 1) Температурна програма: 40°С 1хв. ізотерм/ 3°С/хв. 95°С/10°С/хв. 275°С; Апаратура Finnigan МАТ 95; GC: HP 5890 серія II щілинний інжектор; колонка: HP-5MS (метилсилоксан) 30м 0,25мм; газ носій: 0,065мл/хв. Не. 24 Продукт видобутку не був знайдений. Приклад 7 Гідроксилювання ароматичних вуглеводнів, гетероароматичних вуглеводнів, сполук триметилциклогексенілу а) Приклад 6 був повторений, однак при цьому замість н-октану як субстрат був узятий нафталін. Продуктами виявилися 1-нафтанол і цис1,2-дигідрокси-1,2-дигідронафталін. Уведений нафталін перетворювався на 88%. Аналіз реакцій нафталіну GC: Апаратура: Карло Ерба (Carlo Erba Strumentazion) тип HRGC 4160 на колоночном інжекторі; колонка: DB5 30м 0,2мм; матеріал: 5% дифеніл - 95% диметилполісилоксан; газ носій: 0,5бар Н2; температурна програма: 40°С 1хв. ізотерм/10°С/хв. до 300°С; Rt (1-нафтанол) = 16,68 1 Н-ЯМР: Були ідентифіковані 1-нафтанол і цис-1,2дигідрокси-1,2-дигідронафталін. b) Приклад 6 був повторений, однак при цьому замість н-октану як субстрат був узятий 8метилхінолін. Як головний продукт був ідентифікований 5-гідрокси-8-метилхінолін, крім інших похідних (співвідношення продукту 5:1). Уведений продукт перетворювався на 35%. c) Приклад 6 був повторений, однак при цьому замість н-октану як субстрат був узятий іонон. Як головний продукт був ідентифікований 3-гідрокси- -іонон, крім інших похідних (співвідношення продукту 76:24). Введений продукт перетворювався на 60%. d) Приклад 6 був повторений, однак при цьому замість н-октану як субстрат був узятий кумол (ізо-пропілбензол). Були ідентифіковані 5 продуктів моногідрооксиду й один продукт дигідрооксиду. Введений продукт перетворювався на 70%. 25 76701 26 27 76701 28 29 76701 30 31 76701 32 33 76701 34 35 76701 36 37 76701 38 39 76701 40 41 76701 42 43 76701 44 45 76701 46 47 76701 48 49 76701 50 51 76701 52 53 Література 1. Yano, Т., Oue, S. і Kagamiyama, Η. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5511-5515. 2. Zhang, J.-H., Dawes, G. і Stennner, W. P. C. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4504-4509. 3. Wan, L., Twitchett, M.B., Eltis, L.D., Mauk, A.G.i Smith, M. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 95,12825-12831. 4. Cronin, C.N. (1998) J. Biol. Chem. 273, 2446524469. 5. Wilks, H.M., Hart, K- W., Feeney, R., Dunn, C.R., Muirhead, H., Chia, W.N., Barstow, D.A., Atkinson, Т., Clarke, A.R., Holbrook, I J. (1988) Science 242, 1541-1544. 6. Hedstrom, L., Szilagyi, L, Rutter, W.J. (1992) 76701 54 Science 255, 1249-1253. 7. Tucker, C.L., Hurley, J.H., Miller, T.R.i Hurley, I B. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5993-5997. 8. Quemeneur, E., Moutiez, J.-B.C. і Menez, A. (1998) Mature (London) 391, 301-303. 9. Marsden, A- FA, Wilkinson, В., Cortes, J., Dunster, N.J., Staunton, I Leadlay, P.F. (1998) Science 279, 199-201. 10. Chen, R., Greer, Α., і Dean, A. M. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. US4 95, 11666-11670. 11. Boddupalli, S.S., Estabrook, R.W. і Peterson, J.A. (1990) J Biol. Chem. 265, 4233-4239. 12. Capdevila, J.H., Wie, S., Helvig, C, Faick, J.R., Belosludtsev, Y.,Truan, G., Graham-Lorence, S.E. і Peterson, J.A. (1996) J. Biol. Chem. 271, 22663 55 76701 56 22671. Nature Biotechnology 17, 379-384. 13. Graham-Lorence, S., Truan, G., Peterson, J.A., 20. Schwaneberg, U., Schmidt-Dannert, C, Schmitt, Flack, J.R., WeI S., Helvig, C, Capdevilla, J.H. J, і Schmid, R.D. (1999) Anal Biochem. 269,359(1997) J. Biol. Chem. 272, 1127-1135. 366. 14. Li, H., Poulos, T.L (1997) Nat. Structural Biol., 4, 21. Schwaneberg, U, Sprauer, A.L, Schmidt45 140-146. Dannert, C. і Schmid, R.D. J of Chromatogr. A, in 15. Ravichandran, K.G., Sekhar, S., Boddupalli, S., press. Hasemann, C.A., Peterson, J.A., Deisenhofer, 1 22. Oliver, C.F., Modi, S., Sutcliffe, M.J., Primrose, (1993) Science 261,731-736. W.U., Lian, L.Y. і Roberts, G.C.K (1997) 16. Modi S., Sutcliffe, M.J., Primrose, W.U., Lian, L.Biochemistry 36, 25 1567-1572. Y., Roberts, G.C.K (1996) Nat. Structura Biol. 3, 23. Hart, S., Koch, K.R. і Woods, D.R. (1992) J Gen. 414-417. Microbiol. 138, 211-216. 17. Oliver, C.F., Modi S., Primrose, W.U., Lian, LY. і 24. Murdock, D., Ensley, B.D., Serdar, С і Thalen, Roberts, G.C.K (1997) Biochem. J 327, 537-544. Μ. (1993) Bio/Technology 11, 381-385. 18. Guengerich, F.G. (1991) J. Biol. Chem. 266, 25. O'connor, ICE., Dobson, A-W. і Hartmans, S. 10019-10022. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63, 4287-4291. 19. Cherry, J.R., Lamsa, M.H., Schneider, P., Vind, 26. Eaton, R.W. і Chapman, P.J. (1995) J Bacteriol. J., Svendsen, Α., Jones, А. і Pedersen, A.H. (1999) 177, 6983-6988. Комп’ютерна верстка О. Гапоненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601