Рекомбінантний поксвірус, який експресує гомологічні гени, вставлені в поксвірусний геном

Номер патенту: 90838

Опубліковано: 10.06.2010

Автори: Лейрер Сонья, Хаулі Пол

Є ще 20 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Рекомбінантний поксвірус, який містить щонайменше два гомологічних чужорідних гени з гомологією, що складає щонайменше 50 %, в якому кожний із вказаних генів вбудований в окремий сайт інсерції вірусного геному.

2. Рекомбінантний поксвірус, що містить щонайменше два гомологічних чужорідних гени, при цьому вказані гени мають гомологію, що складає щонайменше 60 %.

3. Рекомбінантний поксвірус за п. 1 або 2, в якому гени мають гомологію 65-75 %.

4. Рекомбінантний поксвірус за пп. 1-3, де гени отримані із флавівірусу.

5. Рекомбінантний поксвірус за п. 4, де флавівірусом є вірус Денге.

6. Рекомбінантний поксвірус за п. 4 або 5, в якому гени являють собою щонайменше два гомологічних гени, отримані щонайменше із двох різних серотипів вірусу.

7. Рекомбінантний поксвірус за пп. 4-6, в якому гени являють собою щонайменше два гени РrМ.

8. Рекомбінантний поксвірус за пп. 4-7, в якому гени являють собою 4 гени РrМ.

9. Рекомбінантний поксвірус за пп. 1-8, створений на основі вірусу Vaccinia.

10. Рекомбінантний поксвірус за п. 9, де вірус Vaccinia є модифікованим вірусом вакцинії Ankara (MVA).

11. Рекомбінантний поксвірус за п. 10, де MVA є MVA-BN, депонованим у Європейській колекції культур клітин тварин (ЕСАСС) під номером V00083008.

12. Рекомбінантний поксвірус за пп. 1-11, де поксвірус є дефіцитним за реплікацією або некомпетентним за реплікацією в клітинах ссавців, включаючи клітини людини.

13. Рекомбінантний поксвірус за пп. 1-12, в якому гени вбудовані в сайт, що зустрічається в природі, делеції і/або в міжгенну ділянку поксвірусного геному.

14. Рекомбінантний поксвірус за пп. 1-13 як лікарський засіб або вакцина.

15. Вакцина для впливу на імунну відповідь, переважно, на її індукування у тварини, включаючи людину, що містить рекомбінантний поксвірус за будь-яким з пп. 1-13.

16. Фармацевтична композиція, що містить рекомбінантний поксвірус за будь-яким з пп. 1-13 і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач, ад'ювант і/або добавку.

17. Рекомбінантний поксвірус за будь-яким з пп. 1-13, вакцина за п. 15 або композиція за п. 16 для впливу на імунну відповідь, переважно, її індукування у живої тварини, включаючи людину.

18. Застосування рекомбінантного поксвірусу за будь-яким з пп. 1-13 для приготування лікарського засобу.

19. Спосіб впливу на імунну відповідь, переважно, її індукування у живої тварини, включаючи людину, що передбачає введення терапевтично ефективної кількості рекомбінантного поксвірусу за будь-яким з пп. 1-13, вакцини за п. 15 або композиції за п. 16 тварині або людині, що підлягає лікуванню.

20. Клітина, що містить рекомбінантний поксвірус за пп. 1-13.

21. Спосіб одержання рекомбінантного поксвірусу за пп. 1-13, що передбачає стадії

- інфікування клітини поксвірусом;

- трансфекції інфікованої клітини першою векторною конструкцією, що містить ген, який є гетерологічним відносно поксвірусного геному, і геномну послідовність поксвірусу, здатну направляти інтеграцію гетерологічного гена в сайт інсерції поксвірусного геному;

- ідентифікації, виділення й необов'язково очищення утвореного рекомбінантного поксвірусу;

- повторення вказаних вище стадій з використанням рекомбінантного поксвірусу, отриманого на попередніх стадіях, для інфекції клітини й додаткової конструкції вектора, що містить наступний ген, що є гетерологічним відносно поксвірусного геному й гомологічним відносно гена першої конструкції вектора.

22. Набір, що містить

- дві або більше векторних конструкцій, причому кожна конструкція містить ген під транскрипційним контролем елемента регуляції експресії поксвірусу, де гени, включені в різні вектори, є гомологічними генами з гомологією, що складає щонайменше 50 %, і де кожний ген фланкований послідовністю ДНК поксвірусу, здатною направляти інтеграцію гена в поксвірусний геном, і

- засоби для ідентифікації і/або селекції рекомбінантних поксвірусів, які включили вказані гомологічні гени у свій геном.

23. Набір за п. 22, де кожний гомологічний ген фланкований послідовністю ДНК поксвірусу, здатною направляти інтеграцію вказаного гомологічного гена кожної конструкції вектора в особливий сайт інсерції поксвірусного геному.

24. Послідовність ДНК, отримана або гомологічна рекомбінантному поксвірусному геному рекомбінантного поксвірусу за пп. 1-13, де вказана послідовність ДНК містить щонайменше два гомологічних гени й щонайменше частину послідовностей поксвірусного геному.

25. Спосіб реєстрації клітин, інфікованих рекомбінантним поксвірусом за пп. 1-13, причому вказаний спосіб передбачає введення послідовності ДНК за п. 24 у вказані клітини.

26. Спосіб ідентифікації рекомбінантного поксвірусу за пп. 1-13, причому вказаний спосіб передбачає введення послідовності ДНК за п. 24 у вказаний вірус.

27. Спосіб виявлення клітин, інфікованих рекомбінантним поксвірусом за пп. 1-13, що передбачає контактування клітини із ДНК-праймерами, селективно ампліфікуючими гомологічні гени і/або фланкуючу послідовність відносно сайтів інсерції генів.

28. Спосіб ідентифікації рекомбінантного поксвірусу за пп. 1-13, що передбачає контактування вірусу із ДНК-праймерами, селективно ампліфікуючими гомологічні гени і/або фланкуючу послідовність відносно сайтів інсерції генів.

Текст

1. Рекомбінантний поксвірус, який містить щонайменше два гомологічних чужорідних гени з гомологією, що складає щонайменше 50 %, в якому кожний із вказаних генів вбудований в окремий сайт інсерції вірусного геному. 2. Рекомбінантний поксвірус, що містить щонайменше два гомологічних чужорідних гени, при цьому вказані гени мають гомологію, що складає щонайменше 60 %. 3. Рекомбінантний поксвірус за п. 1 або 2, в якому гени мають гомологію 65-75 %. 4. Рекомбінантний поксвірус за пп. 1-3, де гени отримані із флавівірусу. 5. Рекомбінантний поксвірус за п. 4, де флавівірусом є вірус Денге. 6. Рекомбінантний поксвірус за п. 4 або 5, в якому гени являють собою щонайменше два гомологіч 2 (19) 1 3 90838 4 19. Спосіб впливу на імунну відповідь, переважно, послідовністю ДНК поксвірусу, здатною направляїї індукування у живої тварини, включаючи людину, ти інтеграцію гена в поксвірусний геном, і що передбачає введення терапевтично ефектив- засоби для ідентифікації і/або селекції рекомбіної кількості рекомбінантного поксвірусу за будьнантних поксвірусів, які включили вказані гомолояким з пп. 1-13, вакцини за п. 15 або композиції за гічні гени у свій геном. п. 16 тварині або людині, що підлягає лікуванню. 23. Набір за п. 22, де кожний гомологічний ген 20. Клітина, що містить рекомбінантний поксвірус фланкований послідовністю ДНК поксвірусу, здатза пп. 1-13. ною направляти інтеграцію вказаного гомологічно21. Спосіб одержання рекомбінантного поксвірусу го гена кожної конструкції вектора в особливий за пп. 1-13, що передбачає стадії сайт інсерції поксвірусного геному. - інфікування клітини поксвірусом; 24. Послідовність ДНК, отримана або гомологічна - трансфекції інфікованої клітини першою векторрекомбінантному поксвірусному геному рекомбіною конструкцією, що містить ген, який є гетеролонантного поксвірусу за пп. 1-13, де вказана послігічним відносно поксвірусного геному, і геномну довність ДНК містить щонайменше два гомологічпослідовність поксвірусу, здатну направляти інтегних гени й щонайменше частину послідовностей рацію гетерологічного гена в сайт інсерції поксвіпоксвірусного геному. русного геному; 25. Спосіб реєстрації клітин, інфікованих рекомбі- ідентифікації, виділення й необов'язково очинантним поксвірусом за пп. 1-13, причому вказащення утвореного рекомбінантного поксвірусу; ний спосіб передбачає введення послідовності - повторення вказаних вище стадій з використанДНК за п. 24 у вказані клітини. ням рекомбінантного поксвірусу, отриманого на 26. Спосіб ідентифікації рекомбінантного поксвірупопередніх стадіях, для інфекції клітини й додатсу за пп. 1-13, причому вказаний спосіб передбакової конструкції вектора, що містить наступний чає введення послідовності ДНК за п. 24 у вказаген, що є гетерологічним відносно поксвірусного ний вірус. геному й гомологічним відносно гена першої конс27. Спосіб виявлення клітин, інфікованих рекомбітрукції вектора. нантним поксвірусом за пп. 1-13, що передбачає 22. Набір, що містить контактування клітини із ДНК-праймерами, селек- дві або більше векторних конструкцій, причому тивно ампліфікуючими гомологічні гени і/або флакожна конструкція містить ген під транскрипційним нкуючу послідовність відносно сайтів інсерції генів. контролем елемента регуляції експресії поксвіру28. Спосіб ідентифікації рекомбінантного поксвірусу, де гени, включені в різні вектори, є гомологічсу за пп. 1-13, що передбачає контактування віруними генами з гомологією, що складає щонаймесу із ДНК-праймерами, селективно ампліфікуючинше 50 %, і де кожний ген фланкований ми гомологічні гени і/або фланкуючу послідовність відносно сайтів інсерції генів. Даний винахід стосується рекомбінантного поксвірусу, який експресує два або більше гомологічних гена. Вказані гени є гетерологічними до вірусного геному, але гомологічними в порівнянні один з одним. Головними чином, гени одержують з близьких варіантів або підтипів мікроорганізмів. Також винахід стосується способу одержання такого поксвірусу та застосування такого поксвірусу як ліків або вакцини. Крім того, винахід стосується способу, який забезпечує вплив, переважно індукуючий, на імунну відповідь в живих тваринах, включаючи людину. Кожний живий організм постійно наражається на небезпеку бути інфікованим або патогенними агентами, такими як бактерії, віруси, гриби, або паразитами. Так звана імунна система захищає організм від перманентних інфекцій, захворювань або інтоксикацій, спричинених такими агентами. Імунну систему ссавців можна поділити на специфічну та неспецифічну частини, не дивлячись на те, що обидві частини тісно переплітаються. Неспецифічна імунна відповідь безпосередньо запускає захист проти широкого кола патогенних речовин або інфекційних агентів. Специфічна імунна відповідь запускається після лаг (lag) фази, коли організм вперше заражається відповідною речовиною. Головним чином ця специфічна відповідь базується на продукуванні антигенспецифіч них антитіл та на утворенні макрофагів та лімфоцитів, наприклад, цитотоксичних Т-клітин. Специфічна імунна відповідь є відповідальною за той факт, що індівідуум, який перехворів на специфічну інфекцію, є захищеним від цієї специфічної інфекції, але все ще залишається сприйнятливим до інших інфекційних захворювань. Взагалі, повторне зараження тим самим або дуже подібним інфекційним агентом викликає набагато слабші симптоми або такі симптоми відсутні взагалі. Цей так званий імунітет продовжує існувати протягом тривалого часу, в деяких випадках навіть довічно. Часто основний ефект, котрий може бути використаний для запропонованих вакцинацій, розглядають як імунологічну пам'ять. Термін "вакцинація" описаний як спосіб, коли індівідуума заражають нешкідливою, частково інактивованою або повністю інактивованою формою інфекційного агента, яка забезпечує вплив, переважно індукуючий, на імунну відповідь у вказаного індівідуума, котра є причиною довготривалого, якщо не довічного, імунітету проти специфічного інфекційного агента. Збудником натуральної віспи людини є Variola virus. Variola virus належить до родини Poxviridae, родини великих за розміром ДНК-вмісних вірусів, які розмножуються в цитоплазмі клітин як хребетних, так і безхребетних. 5 90838 6 Базуючись на природі хазяїна: хребетні та ковірусного реплікаційного циклу, який має місце в махи, родина Poxviridae може бути розділена на клітині-хазяїні, що співінфікована двома або більдві підродини Chordopoxvirinae та ше різними вірусами, або іншими генетичними Entomopoxvirinae. Chordopoxvirinae, крім інших, конструкціями. Секція ДНК від першого геному містить рід Orthonoкceipyces та Avinoкceipyces рівнозначно використовується при конструюванні (Fields Virology, ed. by Fields B.N., Lippincott-Raven секції геному другого співінфекційного вірусу, в Publishers, 3rd edition 1996, ISBN: 0-7817-0253-4, якому ДНК є гомологічною до тієї, що взята від Chapter 83). першого вірусного геному. Рід Orthonoкceipyces містить Variola virus Для успішної експресії вставленої генетичної збудник натуральної віспи людини, а також інші послідовності ДНК модифікованим інфекційним економічно важливі віруси, наприклад, віруси вервірусом необхідні дві умови. По-перше, вставка блюжої віспи, коров'ячої віспи, віспи овець, віспи повинна здійснюватись не в суттєву ділянку вірусу кіз, мавп'ячої віспи і вакцинія вірус. Всі члени цього для того, щоб модифікований вірус залишався роду генетично зв'язані і мають подібну морфоложиттєздатним. Другою необхідною умовою для гію або ряд хазяїнів. Ендонуклеазні карти рестрикекспресії вставленої ДНК є присутність промотора ції показали високу ідентичність послідовностей, у певному положенні по відношенню до вставленої аж навіть до 90% між різними членами ДНК. Згідно з правилами промотор повинен бути Orthonoкceipyces (Mackett & Archard, [1979], J Gen розміщений вище від послідовності ДНК, яка буде Virol, 45: 683-701). експресуватись. Variola virus (VV) - це назва, надана агенту, Придатність рекомбінантних експресійних VV, який використовується щонайменше останні 100 наприклад, поверхневих антигенів вірусу гепатиту років для вакцинації проти віспи. Невідомо, чи VV В (HBsAg), гемаглютиніну вірусу грипу (InfflA) або це новий вид, отриманий від вірусу коров'ячої вісспорозоїта Plasiaodium knowlesi, як живих вакцин пи або вакцинія вірусу шляхом довготривалих седля профілактики інфекційних захворювань була рійних пасажів, чи це живий представних зараз продемонстрована і розглянута (Smith, et al. [1984] вимерлого вірусу або, можливо, продукт генетичBiotechnology and Genetic Engineering RevieVVs 2, ної рекомбінації. 383-407). Більше того, в ході історії VV виникло багато Додатковою перевагою VV є місткість - здатштамів Variola virus. Ці різні штами демонструють ність прийняти велику кількість чужорідних посліперемінну імуногенність і в тій чи іншій мірі перепдовностей, генів або антигенів в межах одного літаються з потенційними ускладненнями, найсергеному VV (Smith & Moss [1983], Gene, 25(1): 21йознішим з яких є поствакцинальний енцефаліт. 28). До того ж, повідомлялося, що імунітет до цілоПроте багато з цих штамів використовувались для го ряду гетерологічних інфекційних захворювань вакцинації проти віспи. Наприклад, штам можна викликати єдиним щепленням полівалентNYCBOH, Western Reserve or Wyeth використовуної вакцини (Perkus et al., [1985], Science, Vol. 229, валися перш за все в США, тоді коли штами 981-984). Ankara, Bern, Copenhagen, Lister i MVA використоОдин приклад експресії різних антигенів єдивувалися для вакцинації в Європі. В результаті ним VV був описаний Bray et al. Було показано, що глобальної програми вакцинації різними штамами рекомбінантний VV, який є здатним експресувати VV в 1980 році WHO остаточно оголосила про устри різні структурні протеїни четвертого серотипу пішне викорінення Variola virus. вірусу тропічної лихоманки (Dengue virus), а саме Сьогодні VV переважно використовується як капсид (С), передмембрану (рrМ), протеїн оболонлабораторний штам, але поряд з цим він все ще ки (Е), і два неструктурні протеїни четвертого серозглядається як прототип Orthonoкceipyces, що є ротипу вірусу тропічної лихоманки, а саме NS1 і причиною того, чому VV став одним з найбільш NS2a, був здатним захистити мишей від гомологівививчених вірусів (Fields Virology, ed. by Fields чного вірусу тропічної лихоманки четвертого сероB.N., Lippincott-Raven Publishers, 3rd edition 1996, типу в контрольному зараженні (Bray et al., [1989], ISBN: 0-7817-0253-4, Chapter 83 and 84). Virology 2853-2856). Ще недавно VV та інші поксвіруси були викоВірус тропічної лихоманки з його чотирма серистовувалися для вставлення і експресії чужорідротипами, серотип 1 вірусу тропічної лихоманки них генів. Основна технологія вставки чужорідних (Den-1) - серотип 4 вірусу тропічної лихоманки генів в живий інфекційний поксвірус включає ре(Den-4), є одним з важливих членів виду Flavivirus, комбінацію між послідовністю покс-ДНК, яка фланщо стосується інфікування людей. Інфікування куює чужорідний генетичний елемент в донорській вірусом тропічної лихоманки приводить до ряду плазміді, і гомологічною послідовністю, присутхвороб: від таких, що за симптомами подібні до ньою в поксвірусі-рятівнику (rescuing). В основногрипу, до тяжких або фатальних захворювань му, генетична рекомбінація - це обмін відповіднигеморагічної тропічної лихоманки (DHF) з шоковим ми секціями ДНК між двома ланцюгами ДНК. В синдромом (DSS). Спалахи тропічної лихоманки деяких вірусах РНК може замінити ДНК. Гомологіпродовжують бути головною проблемою організачні секції нуклеїнової кислоти - це секції нуклеїнові цій охорони здоров'я в густонаселених областях кислоти (ДНК або РНК), які мають ту ж саму послітропічних і субтропічних регіонів, багатих на москідовність нуклеотидів. Генетична рекомбінація мотні вектори. же зустрічатися в природі під час реплікації або Турбота про нерозповсюдження інфекції тропри виробництві нового вірусного геному в інфікопічної лихоманки та інших захворювань, індуковаваній клітині-хазяїні. Тому генетична рекомбінація них Flavivirases, що переносяться москітами, в між вірусними генами може відбуватися протягом багатьох частинах світу привела до активізації 7 90838 8 зусиль в напрямку розробки вакцин проти тропічбаченій формі, як це було показано для протеїну ної лихоманки, які могли б запобігти як тропічній оболонки вірусу тропічної лихоманки 2 (Deuble et лихоманці (DF), так і геморагічній тропічній лихоal., [1988], J. Virol 65: 2853), тому така вакцинація манці (DHF), та вакцин, корисних при захисті індінадзвичайно ризикована для хворого. Неповна відуумів, щеплених проти інфекцій, індукованих вакцинація з використанням панелі рекомбінантдекількома або всіма флавівірусами, які переноних Vaccinia вірусів забезпечить імунний захист сяться москітами. тільки проти деяких, але не всіх серотипів вірусу Тоді як більшість випадків DF доведена після тропічної лихоманки. На жаль, у разі зараження першого інфікування будь-яким з чотирьох серотропічною лихоманкою неповна вакцинація є надтипів, великий відсоток випадків DHF зустрічається звичайно неприйнятною, оскільки вона збільшує у суб'єктів, які вдруге інфіковані серотипом, який ризик летальних ускладнень, наприклад, геморагівідрізняється від того, що спричинив перше зарачної тропічної лихоманки. ження вірусом тропічної лихоманки. Ці спостереТаким чином, об'єктом даного винаходу є стійження дали початок гіпотезі, згідно з якою посліка, ефективна і надійна вакцина проти інфекційних довне інфікування індівідуумів, які мають антитіла захворювань, які можуть викликатися більше ніж до одного серотипу вірусу лихоманки, через певодним штамом, клейдом, варіантом, підтипом або ний інтервал часу в ряді випадків може привести серотипом мікроорганізму, який спричиняє вказане до DHF. інфекційне захворювання. Відтак, вакцинація проти одного серотипу не Ще одним об'єктом даного винаходу є стійка, призводить до повного захисту від інфікування ефективна і надійна вакцина проти зараження вівірусом тропічної лихоманки, але тільки до захисту русом тропічної лихоманки, яка дозволяє одержавід інфікування тим самим штамом вірусу тропічти надійну вакцинацію проти всіх серотипів вірусу ної лихоманки. Навіть більше того, персона, щептропічної лихоманки. лена проти одного серотипу, має підвищений риДаний винахід заснований на ідеї включення у зик розвитку тяжких ускладнень, наприклад, поксвірус гомологічних генів, одержаних від різних геморагічної тропічної лихоманки, коли вказана штамів, клейдів, варіантів, підтипів або серотипів персона інфікована штамом іншого серотипу вірумікроорганізму, який спричиняє інфекційне захвосу тропічної лихоманки. рювання. Як вже згадано вище, вони складають, Тому є потреба у мультивалентній вакцині, яка наприклад, 4 групи, підтипи або серотипи існуючомістить антигени до всіх чотирьох серотипів вірусу го вірусу тропічної лихоманки, всі вони містять ті ж тропічної лихоманки. самі види генів, наприклад такі, як ген, що кодує До цього часу пропонувалось виготовляти мукапсидний протеїн (С), ген, що кодує передмембльтивалентну вакцину шляхом змішування панелі рану (PrM) або протеїн оболонки (Е). Проте послі(набору) рекомбінантних VV, кожний VV кодує подовність нуклеїнової кислоти того ж самого виду слідовності різних вірусів (Moss, [1990] гена не є повністю ідентичною і відповідно не є Immunology, 2, 317-327] Імунологія, 2, 317-327). ідеально гомологічною у всіх 4 серотипів: наприПроте така мультивалентна вакцина має окремі клад, порівняння (з Lasergene 4.05 Magalign, недоліки. По-перше, є обтяжливим одержувати Macintosh) послідовностей гена PrM усіх чотирьох декілька незалежних рекомбінантних VV. Поряд з серотипів вірусу тропічної лихоманки - 1, 2, 3 та 4 відокремленими виробничими процесами, переві(РrМ1-4) - виявило 66,5-72,9% ідентичність послірка і гарантія якості - це також надзвичайно тривадовностей, тобто, гомологія становить приблизно лий процес. По-друге, інфікування сумішшю реко65-75%. Передбачається, що відмінності та гомомбінантних вірусів, які експресують різні логічні варіації в генах різних підтипів мікроорганіпослідовності, завжди несе ризик, що результат зму, який викликає інфекційне захворювання, є інфікування не є добре прорахованим. Головний причиною того, чому вакцинація проти одного підризик - це те, що тільки індивідуальні рекомбінантипу автоматично не приводить до захисту проти ти, але не все різні рекомбінанти, що містяться у інфікування іншими варіантами того ж мікроорганівакцині, інфікуватимуть клітини-мішені. Однією з зму. Таким чином, метою винаходу було одержати причин може бути нерівномірне розповсюдження рекомбінантний вірус, який містить тісно споріднерекомбінантних вірусів. Іншою причиною може ні або гомологічні гени, отримані від різних штамів, бути інтерференція між різними рекомбінантними клейдів, варіантів, підтипів або серотипів мікроорвірусами при інфікуванні окремих клітин. Такі інтеганізму, який викликає інфекційне захворювання. рференції відомі як феномен суперінфікування. В Проте, як також вже було вказано вище, гомологіданому випадку тільки деякі антигени, але не всі чна рекомбінація між гомологічними послідовносрізні антигени мультивалентної вакцини, в фіналі тями відбувається протягом життєвого циклу вірубудуть експресуватись в інфікованих клітинах, а су та навіть має місце між секціями ДНК, які не є тому і бути присутніми у імунній системі хворого. ідеально гомологічними. Тому очікується, що встаЯк результат, імунний захист буде отриманий тільвка гомологічних генів в один вірусний геном прики проти деяких з антигенів, але далекий від заведе до гомологічної рекомбінації і делецій вставбезпечення повного імунного захисту проти різних лених гомологічних генів. антигенів, які містяться або представлені мультиПроте, при одержанні рекомбінантного поксвівалентною вакциною. русу, який містить в своєму геномі принаймні два В контексті вакцини проти інфікування вірусом чужорідних гени з гомологією принаймні 60%, нетропічної лихоманки, підхід через мультивалентну сподівано було знайдено, що вказані гомологічні вакцину має недоліки, оскільки різні послідовності гени залишаються жорстко вставленими у вірусекспресуються в різних кількостях або в непередний геном. 9 90838 10 Навіть якщо гомологічні гени, переважно з голідовності, які мають гомологію принаймні 50%, мологією принаймні 50%, вставлені в різні інсерцілком вставляються в один і той самий або поокційні сайти вірусного геному, гени також залишаремий інсерційний сайт в межах вірусного геному. ються жорстко вставленими у вірусний геном: В Згідно з дійсним винаходом гомологічні гени даному випадку очікувалось, що додатковим реабо послідовності мають гомологію принаймні зультатом рекомбінації, яка відбувається між вка50%, тобто гомологію 50%-100%, тобто принаймні заними гомологічними генами, буде втрата вірус50% ідентичних пар нуклеотидів. Гени або посліних генів, важливих для ампліфікації вірусу та для довності, що мають гомологію нижчу за 50%, мовірусного життєвого циклу відповідно, тобто очікужуть розглядатися як гетерологічні. В контексті вали, що вірусний життєвий цикл буде серйозно даного винаходу термін "гомологічний" або "гомопошкоджений. Оскільки частота рекомбінації є логія" використовується, коли гени або послідовпропорційною відстані між двома зв'язаними генаності порівнюються один з одним, тоді як терміни ми, крім того, очікували, що частота рекомбінації, "чужорідний" ген, "екзогенна" або "гетерологічна" яка відбувається між двома або більше гомологічпослідовність використовуються, коли гени або ними генами, локалізованими в різних інсерційних послідовності порівнюються з поксвірусним геносайтах, буде високою, а тому призведе до делецій мом; тобто вказані терміни застосувуються до ДНК вказаних генів та/або серйозних інтерференцій. послідовності, що зазвичай не зустрічається в Дивовижним відповідно було те, що рекомбінація природі і яка згідно з винаходом зв'язана з поксвіне відбувалась, але гомологічні гени залишались русом. Відтак, дійсний винахід стосується рекомбіжорстко вставленими в різні інсерційні сайти вірунантних поксвірусів, які містять принаймні два гесного геному. ни, які є гетерологічними у порівнянні з вірусним Згідно з попереднім рівнем техніки рекомбінагеномом, але які є гомологічними по відношенню нтні поксвіруси, які містять чужорідні ДНК від флаодин до одного. Термін "гени" відноситься до ковівірусів, наприклад, від Japanese Encaphalitis дуючих послідовностей, які кодують, наприклад, Virus (JEV), Yellow Fever Virus (YFV) і вірусу тропіпротеїни, поліпептиди, пептиди, антигени і тому чної лихоманки, уже відомі (US Patent No. подібне. Протеїни, поліпептиди, пептиди, які тран5,514,375). Проте, кожний ген, одержаний від вкаслюються від гомологічних генів, виконують ті ж заних флавівірусів, був вставлений тільки один самі задачі і демонструють ті ж самі функціональні раз і тільки в один і той самий інсерційний сайт. властивості. Гомологічні гени регулярно одержуКрім того, порівняння послідовностей за допомоють від різних, але близьких джерел або організгою гомологічного комп'ютерного програмного замів. Згідно з одним прикладом втілення даного безпечення (Lasergene 4.05 Megalign, Macintosh) винаходу гомологія кодуючих послідовностей педля генів, вставлених в геном поксвірусу, виявило реважно становить 70%-80%, ще краще 80%-90% таку гомологію: для одержаних від JEV - 20,2%або 90%-100%. Краще всього, коли гомологія ста29,6%, від YFV - 29,2%-45,3% і від вірусу тропічної новить 65%-75%. лихоманки - 22,8%-29,5%. Оскільки згідно з даним винаходом рекомбінаПодібне розкрито у заявці WO 98/13500, де нтний поксвірус містить релевантну генетичну інописана вставка антигенів вірусу тропічної лихоформацію в одній єдиній інфекційній одиниці або манки в один і той самий інсерційний сайт модифітільки в одній частинці вірусу, то ризик нерівноміркованого Анкара вірусу коров'ячої віспи (MVA), ного зараження і незбалансованої експресії різних особливо у делеційний сайт II. гомологічних послідовностей відсутній. Тому, згідВ патенті США 5,338,683 описана вставка 13 і но з даним винаходом, рекомбінантний поксвірус, 14 gp генів глікопротеїну герпевірусу в два різні який містить або здатний експресувати окремі інсерційні сайти одного рекомбінантного поксвірублизько або навіть дуже близько зв'язані гени або су; проте обидва гени мають гомологію тільки майже ідентичні послідовності в одній інфікованій 25,2%. клітині, є особливо вигідним для одержання мульПорівняння між собою послідовностей генів тивалентних вакцин. гемаглютиніну та нуклеопротеїну вірусу грипу, Ця перевага є особливо цікавою для розробки вставлених в один і той самий інсерційний сайт вакцин проти захворювань, які можуть викликатися (делеційний сайт III) модифікованого Анкара вірублизько зв'язаними штамами або серотипами вісу коров'ячої віспи (MVA), показало гомологію русу, наприклад вірусу тропічної лихоманки. Реко49,1% (Патент США 5,676,950; Sutter et al., [1994], мбінантні поксвіруси, які містять гомологічні гени Vaccine 12: 1032). різних серотипів вірусу тропічної лихоманки, опиВ патенті США 5,891,442 розкрито рекомбінансані в Прикладах. тний поксвірус, який містить кодуючі послідовності Згідно з даним винаходом гомологічні гени або для поліпротеїнів VP2, VP3 і VP4 збудника інфекпослідовності можуть походити від будь-якого мікційного захворювання bursal. Вказані гени злиті і роорганізму, наприклад, від будь-якого вірусу, тому були вставлені в один і той самий інсерційокрім вірусного вектора, будь-якої бактерії, будьний сайт та мають гомологію 41,9%-50,3%. якого гриба або паразита. Переважно гомологічні На завершення, патент США 6,217,882 описує гени або послідовності отримані від інфекційного рекомбінантний свінпоксвірусний вектор, який місабо патогенного мікроорганізму і краще всього від тить 50 gp та 63 gp антигенів псевдосказу з гоморізних штамів або клейдів, варіантів, підтипів або логією 52,7%, вставлених в один і той самий інсесеротипів вказаного мікроорганізму. рційний сайт. Терміни "штам" або "клейд" - це технічні терПідсумовуючи, може статися, що згідно з поміни, які добре відомі фахівцю в даній галузі та переднім рівнем техніки гомологічні гени або посвідносяться до таксономії мікроорганізмів. Таксо 11 90838 12 номічна система класифікує всі охарактеризовані 3831. Fields Virology, ed. by Fields B.N., Lippincottна сьогодні мікроорганізми в ієрархічний спосіб Raven Publishers, 4th edition 2001, Chapter 85: page родина, рід, види, штами (Fields Virology, ed. by 2916), penguin pox viruses (Stannard et al. [1998] J Fields Β.Ν., Lippincott-Raven Publishers, 4th edition Gen Virol, 79, pp. 1637-1649) або їх похідних. Оскі2001). В той час як критерієм для членства в рольки ці віруси належать до роду Avipoxvirases, то дині є філогенетична схожість, рід містить всі члевони можуть легко культивуватись та ампліфікувани, об'єднані загальними характеристиками, види тись в клітинах птахів. Проте в людських клітинах визначаються як політетичні (об'єднані на підставі та в клітинах ссавців вони є реплікаційно дефектпорівняння декількох ознак) класи, які складаються ними, це означає, що ніякого суттєвого продукуз врахуванням гомологічного походження та здатвання потомства інфекційних вірусів не відбуваності займати специфічні екологічні ніші. Термін ється. "штам" або "клейд" описує мікроорганізм, тобто Згідно з подальшим втіленням даного винаховірус, який розділяє загальні характеристики, подіду Vaccinia virusc (вірус коров'ячої віспи або вакбну основну морфологію або структуру та органіцинія вірус), переважно ослаблений Vaccinia зацію генома, але відрізняється за біологічними viruse, використовується для одержання рекомбівластивостями, подібний ряд хазяїв, тропізм тканантних поксвірусів, які містять два або більше нин, географічне розповсюдження, атенуацію та гомологічних гени. патогенність. Термін "варіанти" або "серотипи", Хоча відомо, що Vaccinia viruse (VV) може закрім того, визначає відмінності між членами того ж знавати гомологічну рекомбінацію коротких гомосамого штаму, також названими підтипами, які логічних послідовностей, а відтак і видалення годемонструють індивідуальний інфекційний спектр мологічних послідовностей (Howley et al., [1996], або антигенні властивості внаслідок незначних Gene 172: 233-237), винахід забезпечує рекомбізмін в геномі. нантний Vaccinia viruse, який включає гомологічні Згідно з подальшим втіленням даного винахопослідовності або гени, жорстко вставлені в його ду гомологічні гени або послідовності відбираютьгеном. Це відкриття є особливо непередбачувася з вірусів, переважно таких вірусів, які належать ним, оскільки згідно з Howely et al. вже тільки кородо роду Flaviviruses, переважно таких як, але не тких послідовностей від 300 пар нуклеотидів (bр) обмежуючись цим, вірус тропічної лихоманки, було достатньо для того, щоб індукувати реконстWest Nile virus або Japanese encephalitis virus; які рукцію геному та делецію гомологічних послідовналежать до роду Retroviruses, переважно таких ностей у Vaccinia viruse. Практикуючий фахівець як, але не обмежуючись цим, Human повинен очікувати, що більш довгі послідовності Immunodeficiency Virus (HIV); які належить до роду індукуватимуть рекомбінаційні події навіть з виEnteroviruses, переважно таких як, але не обмещою вірогідністю. Проте, згідно з даним винахожуючись цим, збудники захворювань рук, ніг та дом, навіть послідовності, які містять повні гомолороту, EV71; які належить до роду Rotavirases або гічні гени, можуть жорстко вставлятися у геном які належать до роду Orthomyxoviruses, переважно Vaccinia virase. таких як, але не обмежуючись цим, вірус грипу. Одним - не лімітуючим - прикладом вірусу коНайбільша перевага віддається гомологічним геров'ячої віспи є надзвичайно ослаблений і з обменам, одержаним від Flavivirus. женим рядом хазяїв штам модифікованого Ankara Згідно з переважним прикладом втілення, гоVaccinia вірусу (MVA) (Sutter, G. et al. [1994], мологічні гени вибрають з генів вірусу тропічної Vaccine 12: 1032-40). MVA був одержаний шляхом лихоманки, переважно С, NS1 та/або NS2, краще приблизно 570 серійних пасажів на фібробластах Е, ще краще PrM. Найпереважнішими є гомологічні курячих ембріонів Ankara штаму коров'ячої віспи гени, одержані від різних серотипів вірусу, коли (СVА) (для ознайомлення дивись Мауr, Α., et al. вказані гени можуть бути одержані від одного, [1975], Infection 3, 6-14). Результатом цих тривалих двох, трьох або від усіх чотирьох серотипів вірусу пасажів CVA було видалення близько 31 кілобаз тропічної лихоманки. його геномної послідовності. Одержаний вірусний Згідно з ще одним прикладом втілення гомоштам MVA було описано як надзвичайно обмежелогічні гени вибирають з різних штамів або клейдів ний відносно клітин-хазяїв (Meyer, Η. et al., J. Gen. HIV. Переважно гомологічні гени вибирають з Virol. 72, 1031-1038 [1991]). Типовим штамом MVA gag/pol кодуючої послідовності, більш переважно є MVA 575, який задепонований в European з env кодуючої послідовності або ще краще - з Collection of Animal Cell Cultures під реєстраційним комбінації структурних або регуляторних HIV кономером ЕСАСС V00120707. дуючих послідовностей. В іншому втіленні згідно з даним винаходом Вірусний вектор, придатний для даного винаможе використовуватися штам MVA-Vero або його ходу, вибирають з групи поксвірусів, які можна похідні. Штам MVA-Vero задепоновано в European легко культивувати у вибраних клітинах хазяїна, Collection of Animal Cell Cultures під реєстраційним наприклад в клітинах птахів, але які є надзвичайно номером ЕСАСС V99101431 та ЕСАСС 01021411. дефектними за реплікацією або фактично не відтБезпечність MVA-Vero визначається біологічними, ворюються в людині або в людських клітинах. хімічними і фізичними особливостями, як це проЗгідно з одним із переважних втілень поксвірус демонстровано в описі міжнародної заявки на визгідно з даним винаходом вибирають з групи, яка нахід РСТ/ЕРО1/02703. В порівнянні з нормальним складається з canarypox viruses (Plotkin et al. MVA, MVA-Vero має одну додаткову геномну де[1995] Dev Biol Stand, vol 84: pp 165-170. Taylor et лецію. al. [1995] Vaccine, Vol 13. No. 6: pp 539-549), Згідно з даним винаходом термін "похідні" віfowlpox viruses (Afonso et al. [2000] J Virol, pp 3815русу застосовується до вірусного потомства, яке 13 90838 14 демонструє ті ж самі характерні риси, що й батьконсервантів, ад'ювантів, розріджувачі та/або стаківський вірус, але виявляє відмінності в одній або білізаторів. Такі допоміжні субстанції можуть бути більше частинах його геному. водою, соляним розчином, гліцеролом, етаноом, Ще в одному прикладі здійснення даного визмочувальним або емульгуючим агентом, рН бунаходу використовують MVA-BN. MVA-BN задепоферним розчином або тому подібним. Придатні нований в European Collection of Animal Cell носії звичайно є великими, повільно метаболізоCultures під реєстраційним номером ЕСАСС VO ваними молекулами, такими як протеїни, поліса0083008. Шляхом використання MVA-BN або його хариди, полімери молочної кислоти, полімери гліпохідного була одержана специфічна безпечна колевої кислоти, полімери амінокислот, вірусна вакцина, оскільки було показано, що вірус співполімери амінокислот, ліпідні агрегати або MVA-BN - це надзвичайно сильно ослаблений вітому подібне. рус, отриманий від модифікованого Анкара вірусу Для приготування вакцин, рекомбінантний покоров'ячої віспи. Таким чином, згідно з даним виксвірус згідно з винаходом переводять у фізіологінаходом в переважному його втіленні MVA-BN або чно прийнятну форму. Це може бути зроблено, похідні від нього, які містять два або більше гомобазуючись на досвіді приготування поксвірусної логічних гени, використовуються як вірусний веквакцини, яку використовують для щеплення проти тор. Термін "похідна MVA-BN" описує вірус, який віспи (як описано Sfcickl, Η. et al. [1974] Dtsch. med. має ті ж самі функціональні особливості у порівняWschr. 99, 2386-2392). Наприклад, очищений вірус ні з MVA-BN. Особливості MVA-BN, опис біологічзберігається при -80° С в титрі 5x108, ТСID50/ml в них випробувань, які дозволяють визначити, чи композиції з 10mМ Tris, 140mМ NaCI при рН 7,4. MVA - це MVA-BN і його похідна, та методів, які Наприклад, для приготування дози вакцини 102дозволяють одержати MVA-BN або його похідні, 108 частин вірусу в 100мл фосфат-буферної солі описані в WO 02/42480 (включений сюди як поси(PBS) в присутності 2% пептону і 1% людського лання). Одним з легких шляхів визначення функціальбуміну ліофілізують в ампулі, переважно скляональних особливостей MVA-BN або його похідних ній ампулі. Як альтернатива, доза вакцини може є його виснаження і відсутність реплікації в людсьбути одержана сублімаційною сушкою з композиких клітинах HaCat. ції, яка містить вірус. Ця композиція може містити Згідно з даним винаходом в рекомбінантному додаткові компоненти, такі як, наприклад, манітол, поксвірусі експресія екзогенних послідовностей декстран, цукор, гліцин, лактоза або полівінлпіропереважно контролюється поксвірусним транскрилідон, або інші добавки, такі як антиоксиданти або пційним контролюючим елементом, більш переваінертний газ, стабілізатори або рекомбінантні прожно MVA, вірусу сифілісу канарок, пташиного ситеїни (наприклад, сироватковий людський альбуфілісу або контролюючим транскрипційним мін), придатні для застосування in vivo. Скляну елементом вірусу сифілісу пінгвіна, або краще ампулу потім запечатують і вона може зберігатися всього - промотором вірусу коров'ячої віспи. Згідно при між 4°С і кімнатною температурою протягом з даним винаходом поксвірусні транскрипційні кондекількох місяців. Проте, до тих пір, доки не винитролюючі елементи включають, крім того, будькне потреба, ампулу переважно зберігають при який транскрипційний контролюючий елемент, температурах нижчих за -20°С. Для вакцинації який функціонує в поксвірусній системі. ліофілізат може бути розчинений в 0,1-0,5 мілілітЗгідно з даним винаходом вставка екзогенних рах водного розчину, переважно фізіологічного послідовностей переважно здійснюється в несутрозчину або Tris буферу, і застосовуватись або тєву ділянку геному вірусу. Несуттєвими ділянкасистемно, або локально, тобто парентерально, ми, наприклад, є локуси або відкриті рамки зчитувнутрішньом'язово або застосовуватись будь-який вання (ORF) поксвірусних генів, які не є іншим шляхом, відомим фахівцю. Спосіб застосуважливими для життєвого циклу поксвірусу. Згідно вання, доза і кількість введень можуть бути оптиз даним винаходом міжгеномні ділянки, описані як мізовані обізнаним спеціалістом у відомий спосіб. простір між двома ORF, також розглядаються як Проте в загальному, пацієнтові здійснюють повтонесуттєві ділянки. В іншому втіленні винаходу, рне щеплення в період від близько одного місяця екзогенні послідовності вставлені на місце природо шести тижнів після того, як було зроблено пердно утворених делецій геному MVA (розкрито в шу вакцинацію. РСТ/ЕР96/02926 і наведено тут як посилання). Згідно з даним винаходом рекомбінантний віЗгідно з даним винаходом орієнтація вставлерус використовується для введення екзогенних ної ДНК не має впливу на функціональність або кодуючих послідовностей в клітину-мішень. Ввестабільність рекомбінантного вірусу. дення екзогенної кодуючої послідовності в клітинуОскільки рекомбінантний поксвірус згідно з вимішень може використовуватися для продукування находом є надзвичайно обмеженим в рості, а тому in vitro протеїнів, поліпептидів, пептидів, антигенів - надзвичайно ослабленим, то він є ідеальним ката епітопів відповідно. До того ж, метод введення ндидатом в агенти для лікування широкого кола гомологічної або гетеро логічної послідовності в ссавців, включаючи людей та навіть імуннозкомпклітини може застосовуватися для in vitro та in vivo роментованих людей. Відтепер даний винахід татерапії. Для in vitro терапії ізольовані клітини, що кож забезпечує фармацевтичну композицію і вакпопередньо були (ex vivo) інфіковані рекомбінантцину для індукування імунної відповіді в живому ним поксвірусом згідно з винаходом, вводяться в тваринному організмі, включаючи людину. живий тваринний організм для індукування імунної Фармацевтична композиція може загалом місвідповіді. Згідно з винаходом для in vivo терапії тити один або більше фармацевтично прийнятних рекомбінантний поксвірус безпосередньо вводитьта/або схвалених носіїв, добавок, антибіотиків, ся в живий тваринний організм для індукування 15 90838 16 імунної відповіді. В даному випадку, клітини, що ген, переважно під транскрипційним контролем оточують зону щеплення, безпосередньо заражапоксвірусного контролюючого експресію елемента. ються in vivo вірусом або його рекомбінаном згідно Як пояснено вище, плазмідний вектор також місз винаходом. Після зараження, клітини синтезують тить послідовності, здатні направляти вставку екпротеїни, поліпептиди, пептиди або антигени, які зогенної послідовності у вибрану частину поксвізакодовані в екзогенних кодуючих послідовностях і русного геному. Плазмідний вектор необов'язково згодом вони самі або їх частини присутні на клівключає також касету, що містить маркерний тинній поверхні. Спеціалізовані клітини імунної та/або селекційний ген, який оперативно зв'язаний системи розпізнають присутність таких чужорідних з поксвірусним промотором. Придатним маркером протеїнів, поліпептидів, пептидів, антигенів і епітоабо селективним геном є, наприклад, гени, які копів і запускають специфічну імунну відповідь. дують зелений флуоресцентний протеїн, Методи одержання рекомбінантних поксвірусів галактозидазу, неоміцин, фосфорибозилтрансфеабо введення екзогенних кодуючих послідовносразу або інші маркери. Використання селекційних тей в поксвірусний геном добре відомі спеціалісту або маркерних касет спрощує ототожнення та вив даній галузі. Крім того, метод описаний в прикдалення одержаного рекомбінантного поксвірусу. ладах і також може бути взятий або поповнений з Крім того, рекомбінантний поксвірус також можна наступних посилань: ідентифікувати, використовуючи PCR технологію. - Molecular Cloning-, A laboratory Manual. Згодом наступну клітину інфікують рекомбінантним Second Edition. By J. Sainbrook, E.F. Frifcsch and T. поксвірусом, отриманим як описано вище, та тренManiatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 198: сфікують другим вектором, що містить ген, який є описус методи і ноу-хау для стандартних методів гомологічним до гена, включеного в перший векмолекулярної біології, таких як клонування ДНК, тор. Якщо цей ген повинен включатися в інший вестерн-блотінг аналізу, RT-PCR та PCR ампліфіінсерційний сайт поксвірусного геному, то другий каційних методів. вектор також відрізняється за послідовністю, яка - Virology Methods Manual, Edited by Brian WJ направляє інтеграцію гомологічного гена в геном Mahy and Hillar 0 Kangro. Academic Press. 1996: поксвірусу. Після того, як гомологічна рекомбінація описує методи обробки та маніпулювання вірусавідбулася, рекомбінантний вірус, що містить два ми. гомологічні гени, може бути ізольований. Для вве- Molecular Virology: A Practical Approach. дення більш ніж двох гомологічних генів у рекомEdited by AJ Davison and KM Elliott. The Practical бінантний вірус, кроки інфікування та трансфікуApproach Series. IRL Press at Oxford University вання повторюють, використовуючи Press. Oxford 1993. Chapter 9: Експресія генів векрекомбінантний вірус, ізольований в попередніх торами вірусу коров'ячої віспи. кроках для інфікування, та за допомогою наступ- Current Protocols in Molecular Biology. ного вектора, який містить наступний гомологічний Publisher: John Wiley and Son Inc. 1998. Chapter 16, ген для трансфікування. section IV: Експресія протеїнів в клітинах ссавця з Альтернативно, кроки зараження і трансфікувикористанням вектору вірусу коров'ячої віспи: вання, як описано вище, є взаємозамінними, тобописує методи і ноу-хау для обробки, маніпулюто, придатна клітина може спочатку бути трансфівання і генетичної інженерії MVA. кованою плазмідним вектором, який містить Для одержання рекомбінантних поксвірусів чужорідний ген і потім бути інфікованою поксвірузгідно з даним винаходом придатними можуть бусом. ти різні методи: Як подальша альтернатива, також є можливим вставлена у вірус послідовність ДНК може роввести кожний гомологічний ген в різні віруси, спізміщуватися в плазмідній конструкції Е. coli, ДНК вінфікувати клітину усіма одержаними рекомбінанякої є гомологічною до секції ДНК поксвірусу, то тними вірусами та відібрати рекомбінант, який була вставлена. Крім того, вставлена ДНК з'єднамістить всі гомологічні гени. на з промотором. Зчеплення промотор-ген розміВинахід, крім того, забезпечує набір, який місщене в плазмідній конструкції таким чином, що тить дві або більше плазмідні векторні конструкції, вказане промотор-ген зчеплення з обох кінців граздатні направляти включення експресійних гомоничить з ДНК послідовністю, гомологічною до послогічних генів в геном поксвірусу. Поряд з придатлідовності ДНК, що фланкує ділянку покс-ДНК, яка ним сайтом клонування такі плазмідні вектори місмістить несуттєвий локус. тять послідовності, здатні направляти вставку Результуючу плазмідну конструкцію ампліфіекзогенної послідовності у вибрані частини поксвікують в бактерії Е. Соїі та ізолюють. Ізольовану русного геному. Необов'язково такі вектори місплазміду, яка містить вставлену ДНК послідовність тять селекційні або маркерні генні касети. Набір, гена, разом з поксвірусом трансфікують в клітинні крім того, містить засоби та інструкції для вибору культури, наприклад, в курячі ембріональні фібровірусів, які є рекомбінантними для одного або дебласти (CEPs). Рекомбінація між гомологічною кількох гомологічних генів і необов'язково селекпокс-ДНК в плазміді та вірусним геномом відповідційного або маркерного гена, вставленого у вказано надає модифікований завдяки присутності чуну векторну конструкцію. жорідної ДНК послідовності поксвірус. Згідно з ще іншим варіантом здійснення винаЗгідно з найбільш переважним варіантом втіхід включає послідовності Дії К або їх частини, лення винаходу клітина культури клітин, як, напригомологічнідо рекомбінантного поксвірусу за даклад, клітини CEF, є інфікованою поксвірусом. Інним винаходом. Такі послідовності містять прифікована клітина згодом трансфікується першим наймні частину екзогенної послідовності, яка місплазмідним вектором, який містить чужорідний тить принаймні фрагмент одного гомологічного 17 90838 18 гена згідно з даним винаходом та принаймні фрачисло означає серотип, з якого вони походять. гмент геномної поксвірусної послідовності згідно з Μ=маркер молекулярної ваги. даним винаходом, вказана геномна поксвірусна Наступні приклади в подальшому ілюструють послідовність переважно фланкує екзогенну посданий винахід. Для спеціаліста в даній галузі є лідовність. добре зрозумілим те, що наведені приклади жодТакі ДНК послідовності можуть застосовуваним чином не можуть інтерпретуватися як такі, що тись для ідентифікації та видалення вірусу або обмежують обсяг застосування наданих даним його похідних шляхом їх використання для одервинаходом технологій лише цими прикладами. жання PCR-праймерів, гібридизаційних зондів або Приклад 1 в інших технологіях. Інсерційні вектори Фігура 1: Схематичне уявлення інсерційних Інсерційний вектор для делеції А сайтів чотирьох PrM (=рre-membrane) генів (сероДля вставки екзогенних послідовностей в гетип 1-4) в геномі MVA за Прикладом 1. ном MVA в так звану делецію А або делецію 1 відФігури 2-9 і 12-17: Вставки у плазмідній вектоповідно, що відповідає 7608-7609 геномній позиції, рній конструкції вказують назву вектора, його розбув сконструйований плазмідний вектор, який місмір та локалізацію інтересуючих послідовностей, тить біля 600 bр фланкуючих послідовностей по наприклад: сусідству з делеційним сайтом А. Для того, щоб AmpR=ген резистентності до ампіциліну, виділити фланкуючі послідовності з геномних ДНК bfp=ген голубого флуоресцентного протеїну, MVA-BN, придатні PCR-праймери можуть підбираdA=делеція A, dE=делеція Е, d2=делеція 2, тися за допомогою придатного комп'ютерного заEcogpt=ген гуанозинфосфорибозилтрансферази безпечення (DNAsis, Hitashi software engeneering, E.coli, EGFP=збільшений ген зеленого флуоресSan Bruno, USA). Такі праймери містять подовцентного протеїну, F1=фланкуюча послідовність 1, ження з ензиморестрикційними сайтами, які викоF2=фланкуюча послідовність 2, I4L=міжгенна діляристовуватимуться для того, щоб клонувати фланнка I4L, IGR=міжгенна ділянка, МРТII=ген резистекуючі послідовності в плазмідний вектор. В ділянку нтності до неоміцину, Ρ=поксвірусний промотор, між цими фланкуючими послідовностями введена pr7.5=Vaccinia промотор 7.5 (коров'ячої віспи), селекційна генна касета, наприклад, NPT II ген PrM=ген передмембрани вірусу тропічної лихома(резистентність до неоміцину) під транскрипційним нки, число вказує на серотип, з якого він походить, контролем поксвірусного промотора. Крім того, є rpt=повторення фланкуючої послідовності. сайт клонування для вставки додаткових генів або Фігура 10: PCR-перевірка вектора, що кодує екзогенних послідовностей, який вставлений в стратегії чотирьох різних інсерційних векторів делеційний сайт А. Одна така векторна конструк(pBN49, pBN50, pBN40, pBN39). Кожна плазміда ція згідно з даним винаходом розкрита на Фігурі 2 була протестована з 4 різними PCR-праймерними (pΒΝΧΙΟ). комбінаціями. Кожна комбінація є специфічною Інсерційний вектор для делеції Е для однієї конкретної PrM послідовності, інтегроДля вставки екзогенних послідовностей в геваної в один конкретний інсерційний сайт. ном MVA в так звану делецію Ε або делецію 4 відФігура 11: PCR-перевірка рекомбінантного поповідно, що відповідає 170480-170451 геномній ксвірусу, що включає чотири гомологічні PrM гени позиції, був сконструйований плазмідний вектор, вірусу тропічної лихоманки (Приклад 1). Тоді як у який містить біля 600 bр фланкуючих послідовносверхній частині гелю показані різні PCRтей по сусідству з делеційним сайтом Ε. Вектор результати рекомбінантного вірусу, нижня частина спланований і сконструйований подібно до описанадає результати тих самих PCR реакцій для вканого вище. В ділянці між фланкуючими послідовзаних контрольних плазмід. Плазміди, які містять ностями розміщений EGFP ген (зелений флуоресгомологічні послідовності, названі pBN39, pBN49 центний протеїн, Clonetech) під транскрипційним або pBN50. PrM означає вставлені передмембконтролем поксвірусного промотора. Крім того, є ранні гени вірусу тропічної лихоманки, число ознасайт клонування для вставки додаткових генів або чає серотип, з якого вони походять. dA=делеція A, послідовностей, який вставлений в делеційний dE=делеція Е, d2=делеція 2, 14L=між генетична сайт А. Одна така векторна конструкція згідно з ділянка I4L описує інсерційний сайт екзогенної даним винаходом розкрита на Фігурі 3 (pBNX32). ДНК. Інсерційний вектор для делеції 2 Фігура 18: Схематичне уявлення інсерційних Для вставки екзогенних послідовностей в гесайтів трьох PrM генів (серотип 2-4) в MVA-геномі ном MVA в так звану делецію 2, що відповідає згідно з Прикладом 2. 20718-20719 геномній позиції, був сконструйоваФігура 19: PCR-перевірка рекомбінантного поний плазмідний вектор, який містить біля 600bp ксвірусу, який містить три гомологічних PrM гена фланкуючих послідовностей по сусідству з делевірусу тропічної лихоманки, вставлених в міжгенну ційним сайтом 2. Вектор спланований і сконструділянку (Приклад 2). Верхня панель показує рейований подібно до описаного вище. В ділянці між зультати PCR-реакцій, специфічних для PrM2; фланкуючими послідовностями розміщений hbfp середня панель показує результати PCR-реакцій, ген (humanized blue fluorescing protein, Pavalkis GN специфічних для PrM3, і нижня панель показує et al.) під транскрипційним контролем поксвіруснорезультати PCR-реакцій, специфічних для PrM4. го промотора. Крім того, є сайт клонування для Полоса 8 показує ті ж самі PCR-реакції для контвставки додаткових генів або послідовностей, який рольних плазмід. Полоса 2 показує холостий веквставлений в делеційний сайт 2. Одна така вектоторний контроль MVA. PrM означає вставлені перна конструкція згідно з даним винаходом розкриредмембранні гени вірусу тропічної лихоманки, та на Фігурі 4 (pBNX36). 19 90838 20 Інсерційний вектор для міжгенної ділянки, I4L Інсерційний вектор для делеції 2, який містить Для вставки екзогенних послідовностей в міжPrM ген першого серотипу вірусу тропічної лихогенну ділянку, між ORF I3L та I4L, що відповідає манки, був вибраний з праймерів oBN194 56760 геномній позиції, був сконструйований век(ATGTTGAACATAATGAACAGGAGGAAAAGATCTG тор, який вектор конструювався, який містить біля TGACCATGCTCCTCATGCTGCTGCCCACAGCCCT 600bp фланкуючих послідовностей по сусідству з GGCGTTCCATCT. SEQ ID NO.: 3) та oBN476 міжгенною ділянкою при I4L локусі. Вектор спла(GATTTTGCTATTCAGTGGACTGGATG. SEQ ID, нований і сконструйований подібно до описаного NO.: 4). вище. В ділянці між фланкуючими послідовностяІнсерційний вектор для міжгенної ділянки I4L, ми розміщений Ecogpt ген (або gpt означає ген який містить PrM ген третього серотипу вірусу трофосфорибозилтрансферази, виділений з Е.coli) під пічної лихоманки, був вибраний з праймерів транскрипційним контролем поксвірусного промоoBN255 тора. Крім того, є сайт клонування для вставки (CCTTAATCGAATTCTCATGTCATGGATGGGGTAA додаткових генів або послідовностей, який вставCCAGCATTAATAGT. SEQ ID, NO.: 5) та oBN479 лений в міжгенну ділянку I4L ORF. Одна така век(GCTCCCATTCAATTCACATTGG. SEQ ID, NO.: 6). торна конструкція згідно з даним винаходом розкІнсерційний вектор для делеції Е, який містить рита на Фігурі 5 (pBNX39). PrM ген четвертого серотипу вірусу тропічної лиКонструювання рекомбінантного поксвірусу, хоманки, був вибраний з праймерів οΒΝ210 який містить декілька гомологічних генів, інтегро(ATCCCATTCCTGAATGTGGTGTTAAAGCTACTGA ваних в його геном. GCGCTTCTCTCGTCTCCGTTCTCCGCTCTGGGTG Інсерційні вектори CATGTCCCATAC SEQ ID NO.: 7) та oBN478 Для того, щоб вставити чотири PrM гени чоти(GTACATGGATGATATAGATATG. SEQ ID NO.: 8). рьох серотипів вірусу тропічної лихоманки в MVA PCR-експерименти виконувались в термодигеном були використані чотири незалежні рекомбінамічному циклізаторі (Thermal cycler) GeneAmp наційні вектори. 9700 (Perkin Elmer), використовуючи набір Tag ДІ Як детально описано вище, ці вектори містять IK полімерази, який містить 10х PCR-буфер, MgCl2 послідовності, гомологічні до MVA геному, для буфер та Tag ДНК полімеразу (Roche, Cat.no. націлювання вставки шляхом гомологічної реком201205) або еквівалент. Взагалі, PCR-реакції були бінації. Додатково кожний вектор містить касету підготовлені із загальним реакційним об'ємом 50 l, селекційного гена або гена-репортера. який містить 45 l маточної суміші, зразком ДНК і PrM послідовності чотирьох серотипів вірусу ddH2O як вимагається. Маточна суміш була приготропічної лихоманки були одержані синтетично тована з 3,75 l DdH2O, 5 l 10x буферу, 1 l dNTPшляхом олігоанеляції та PCR-ампліфікації. PrM суміші (10mM кожного), 2,5 l кожного прамера послідовності були даунстрім-клоновані по відно(5pmol/ l), 3 l MgCl2 (25mМ) і 0,25 l Taqшенню до поксвірусних промоторних елементів полімерази (5U/ l). для того, щоб сформувати експресійну касету. Ця Ампліфікація виконувалась, використовуючи експресійна касета була тоді клонована в сайт наступну програму: клонування релевантних інсерційних векторних 1) Денатурація 4хв 94°С конструкцій. 2) 30 циклів: Як результат, інсерційна векторна конструкція Денатурація 30 секунд 94°С для делеції А містить PrM ген серотипу 2 вірусу Апеляція 30 секунд 55°С тропічної лихоманки (Фігура 6 - pBN39). Інсерційна Елонгація 1-3хв72°С векторна конструкція для делеції 2 містить PrM ген 3) Елонгація 7хв 72°С серотипу 1 вірусу тропічної лихоманки (Фігура 7 4) Зберігання 4°С pBN49). Інсерційна векторна конструкція для міжВиходячи з розміру вставленого гена, час елогенної ділянки I4L містить PrM ген серотипу 3 вірунгації повинен бути принаймні 1хв/kb. су тропічної лихоманки (Фігура 8 - pBN50). ІнсерРезультати PCR, показані на Фігурі 10, демонційна векторна конструкція для делеції Ε містить струють специфічність праймерних комбінації, PrM ген серотипу 4 вірусу тропічної лихоманки використаних для одиничних вставок. (Фігура 9 - pΒΝ40). Праймерна комбінація oBN194/oBN476 є спеPCR-перевірка інсерційних векторів цифічною для делеції 2 і PrM1 як вставки. ОчікуДля перевірки стратегій клонування здійснюваний PCR-фрагмент для плазміди pBN49 має вали PCR випробування. Для цих PCR випробурозмір 678bp (показано на полосі 3 у верхній часвань були вибрані пари праймерів, які є комбінацітині гелю). єю праймера, специфічно зв'язаного з Праймерна комбінація oBN255/oBN479 є спеспецифічною фланкуючою послідовністю відносно цифічною для міжгенної ділянки I4L і PrM3 як інсерційного сайту, та другого праймера, який спевставки. Очікуваний PCR фрагмент плазміди цифічно зв'язаний з одним із високогомологічних pBN50 має розмір 825bp (показано на полосі 9 у PrM генів вірусу тропічної лихоманки (Dengue верхній частині гелю). virus). Праймерна комбінація oBN210/oBN478 є спеІнсерційний вектор для делеції А, який містить цифічною для делеції Ε та PrM4 як вставки. ОчікуPrM ген другого серотипу вірусу тропічної лихомаваний PCR фрагмент плазміди pΒΝ40 має розмір нки, був вибраний з праймерів oBN93 607bp (показано на полосі 5 в нижній частині ге(CGCGGATCCATGCTGAACATCTTGAACAGGAGA лю). CGCAGA. SEQ ID NO.: 1) та oBN477 Праймерна комбінація οΒΝ93/οΒΝ477 є спе(CATGATAAGAGATTGTATCAG. SEQ ID, NO.: 2). цифічною для делеції та PrM2 як вставки. Очікува 21 90838 22 ний PCR фрагмент плазміди pΒΝ39 має розмір Для збору урожаю, клітини зшкрябуються в 636bp (показано на полосі 11 в нижній частині гесередовище, потім клітинну суспензію переносять лю). у відповідну пробірку та заморожують при -20°С Утворення рекомбінантного MVA через гомодля короткострокового зберігання або при -80°С логічну рекомбінацію для довгострокового зберігання. Для експресії чужорідних генів рекомбінантним Вставка а PrM4 в MVA MVA ці гени доведеться вставити у вірусний геном В першому раунді клітини були інфіковані за допомогою процесу, названого гомологічна реMVA-BN згідно з описаним вище протоколом та комбінація. Для цієї мети, чужорідний ген, в якому додатково трансфіковані інсерційним вектором зацікавлені, був клонований в інсерційний вектор, pBN40, який містить PrM ген четвертого серотипу як описано вище. Цей вектор буде трансфікований вірусу тропічної лихоманки та ген EGFP як генпісля інфікування клітин MVA-BN. Рекомбінація репортер. Оскільки трансфікований вектор містить відбуватиметься в клітинній цитоплазмі інфіковаген-репортер, EGFP, то синтезований протеїн в них та трансфікованих клітин. З допомогою селекінфікованих рекомбінантним вірусом клітинах виційної касети та/або касети-репортера, які також являється найпізніше через три дні. Одержані ревходять до складу інсерційного вектора, клітини, комбінантні віруси мають бути очищені методом які містять рекомбінантні віруси, ідентифікуються бляшок. та видаляються. Для очистки методом бляшок інфіковані клітиГомологічна рекомбінація ни (флуоресціюючі або забарвлені) були ізольоваДля гомологічної рекомбінації ВНК (Baby ні за допомогою спеціальної піпетки, ресуспендоhamster kidney) клітинами або CEF (первинні фібвані та аспіровані в 200 l PBS або середовищі. робласти курячих ембріонів) клітинами засівають Потім чашку зі свіжою культурою, яка містить блишестилуночні пластинки, використовуючи DMEM зько 10Е6 клітин інфікують 100 l ресуспендованих (Dulbecco's Modified Eagles Medium, Gibco бляшок. Після 48 годин клітини поміщають в 300 l BRL)+10% ембріональної телячої сироватки (FCS) PBS. ДНК екстрагують із суспензії та відбирають або VP-SFM (Gibco BRL)+4ммол/л L-Глутаміну для за допомогою PCR аналізу. Клон, який показує без сироваткового процесу виробництва. очікувані зони, відбирають і шестилункові пластинКлітини повинні витримуватись у фазі росту, і, ки інфікують різними кількостями цього вірусу. Для таким чином, повинні досягти 60-80% злиття на запобігання подальшого розповсюдження вірусу трасфекційний день. Перед посівом клітини були лунки покривають 1% агарозою. Після 48 годин пораховані, оскільки кількість клітин має бути віінфіковані клітини, які містять клон рекомбінантнодомою для визначення кратності зараження (mоi) го вірусу, ізолюють. для інфекції. Ця процедура повторюється доти, поки в PCR Для інфікування вихідний MVA розводили аналізі перестає виявлятись дикий тип MVA-BN. DMEM/FCS або VP-SFM/L-глутаміном до такої Після чотирьох повторів процедури очистки міри, щоб 500 l розчину містило таку кількість вірекомбінантних вірусів методом бляшок, MVAрусу, яка б давала mоі=0,01. Передбачається, що PrM4 були ідентифіковані за допомогою PCR анаклітини після посіву будуть ділитися один раз. Селізу, використовуючи праймерну пару, селективно редовище відділяли від клітин і клітини інфікували ампліфікуючу очікувану вставку (oBN210 і OBN478, 500 l розведеного вірусу, погойдуючи протягом як викладено вище), та як контроль використовуюоднієї години при кімнатній температурі. Інокулюм чи праймерну пару, яка специфічно розпізнає інвидаляли та промивали клітини DMEM/VP-SFM. серційний сайт делеції Ε (οΒΝ453: Інфіковані клітини залишали в 1,6мл DMEM/FCS GTTGAAGGATTCACTTCCGTGGA, SEQ ID NO.: 9 і та VP-SFM/L-глутаміну відповідно доти, доки встаoBN454: GCATTCACAGATTCTATTGTGAGTC, SEQ новлюється реакція трансфекції (Qiagen Effectene ID, NO.: 10). Kit). Вставка PrM2 в MVA-PrM4 Для трансфекції використовується "Effectene" Клітини були інфіковані MVA-PrM4 згідно з трансфекційний набір (Qiagen). Трансфекційну вищеописаним протоколом і були додатково трансуміш готують з 1-5 г лінеаризованого інсерційносфіковані інсерційним вектором pBN39, який місго вектора (загальна кількість для багаторазової тить PrM ген другого серотипу вірусу тропічної трансфекції), додаючи буфер ЕС до кінцевого лихоманки (Dengue virus) та як селекційний ген NPT II та ген резистентності до неоміцину. Для об'єму 150 l. Додають 8,0 l підсилюючого агента очистки рекомбінантного MVA, який експресує ген на г ДНК, струшують та інкубують при кімнатній резистентності до антибіотика, рекомендується температурі протягом 5 хвилин. Після струшуванперед методом бляшок провести три раунда ампня потім додають 25 l Effectene на г ДНК та розліфікації віруса в селективних умовах. Для відбору чин ретельно перемішують струшуванням при кімнеоміцинфосфотрансферази до середовища був натній температурі протягом 10 хвилин. Додають доданий G418. G418 походить від неоміцину та 600 l DMEM/FCS і VP-SFM/L-глутаміну відповідно, пригнічує біосинтез протеїну шляхом втручанням в потім перемішують, всю трансфекційну суміш додію рибосом. Активність NPT гена інактивує G418 дають до клітин, які уже покриті середовищем. шляхом фосфорилювання. Обережно погойдують посудину щоб змішати траПісля 16 повторів процедури очистки методом нсфекційні реагенти. Інкубація відбувається при бляшок при неоміцин-селекції рекомбінантних ві37°С з 5% СО2 протягом ночі. Назавтра середорусів, MVA-PrM4/PrM2 були ідентифіковані шлявище відділяють та заміняють свіжим DMEM/FCS хом PCR аналізів, використовуючи праймерну паабо VP-SFM/L-глутаміном. Інкубація продовжуєтьру, селективно ампліфікуючу очікувану вставку ся протягом 3 днів. 23 90838 24 (oBN93 і oBN477, як описано вище), та як контроль клонів рекомбінантних вірусів були проведені PCR використовуючи праймерну пару, яка специфічно аналізи з використанням праймерних пар (oBN255 розпізнає інсерційний сайт делеції A (oBN477: як і oBN479. oBN499 і oBN500. oBN194 і oBN476. описано вище) та oBN452: oBN54 і oBN56, як описано вище). Одержані рекоGTTTCATCAGAAATGACTCCATGAAA, SEQ ID мбінантні віруси були позначені MVA-PrM1/PrM3. NO.: 11). Також вставка PrM4 у делецію Ε була Співїнфікування MVA-PrM1/PrM і MVAперевірена з праймерною парою: οΒΝ210 PrM2/PrM4 oBN478 та οΒΝ453 - οΒΝ454. Клітини були інфіковані рівними кількостями Вставка PrM1 в МVА MVA-PrM1/PrM3 та MVA-PrM2/PrM4 згідно зі згаВ першому раунді клітини були інфіковані даним вище протоколом. Очищення методом MVA-BN згідно з вищеописаним протоколом і добляшок проводили в умовах фосфорибозилтрандатково були трансфіковані інсерційним вектором сферазного метаболізму та неоміцинового відбоpΒΝ49, який містить PrM ген першого серотипу ру. Рекомбінантні віруси, яки індукують зелену та вірусу тропічної лихоманки, та як ген-репортер голубу флуоресценцію, були ізольовані і проаналімістить hbfp ген та ген гуманізуючого голубого зовані PCR з використанням праймерних пар флуоресциюючого протеїну. Синтезований hbfp (oBN255 і oBN479. OBN499 і oBN500. oBN194 і протеїн в інфікованих рекомбінантним вірусом oBN476. oBN54 і oBN56. oBN93 і oBN477. oBN477 і клітинах виявляється на третій день. Одержані oBN452. oBN210 і oBN478. oBN453 і oBN454, як рекомбінантні віруси були очищені методом бляописано вище). шок. PCR аналіз рекомбінантного вірусу (Клон 20), Після 10 повторів процедури очищення рекомякий містить всі чотири PrM гени, показаний на бінантних вірусів методом бляшок MVA-PrMI були Фігурі 11. Тоді як у верхній частині гелю показані ідентифіковані шляхом PCR аналізів, використорізні PCR результати для рекомбінантного вірусу, вуючи праймерну пару, селективно ампліфікуючу більш низька частина забезпечує результати тих очікувану вставку (oBN194 та OBN476, як описано самих PCR реакцій для контрольної плазміди (як вище), та як контроль використовуючи праймерну вказано). Полоси 1, 10 і 11 показують 1kb та 100bp пару, яка специфічно розпізнає інсерційний сайт молекулярного маркера. делеції 2 (oBN54: Праймерна комбінація oBN210/oBN478 є спеCGGGGTACCCGACGAACAAGGAACTGTAGCAGA цифічною для делеції Ε і PrM4 як вставки. ОчікуGGCATC, SEQ ID NO.: 12 і oBN56: ваний фрагмент PCR рекомбінантного вірусу і AACTGCAGTTGTTCGTATGTCATAAATTCTTTAAT плазміди pΒΝ40 має розмір 607bp (показаний поTAT, SEQ ID, NO.: 13). лосою 2). Вставка PrM3 в MVA Праймерна комбінація οΒΝ453/οΒΝ454 є спеВ першому раунді клітини були інфіковані цифічною для делеції Е. Очікуваний фрагмент MVA-BN згідно з вищеописаним протоколом і були PCR рекомбінантного вірусу складає 2,7kb, очікудодатково трансфіковані інсерційним вектором вана зона вірусу дикого типу - 2,3kb (показана поpBN50, який містить PrM ген третього серотипу лосою 3). Також у верхній частині гелю можна ідевірусу тропічної лихоманки і як ген-репортер міснтифікувати специфічну для вірусу дикого типу тить ген Ecogpk (Ecogpt або скорочений до gpt для зону. Це означає, що препарат рекомбінантного гена фосфорибозилтрансферази). Одержані ревірусу ще повністю не звільнений від вірусу дикого комбінантні віруси були очищені в три раунди метипу. Необхідне подальше очищення методом тодом бляшок в умовах відбору фосфорибозилтбляшок. рансферазного метаболізму шляхом додавання Праймерна комбінація oBN93/oBN477 є спемікофенолової кислоти, ксантину та гіпоксантину. цифічною для делеції А та PrM2 як вставки. ОчікуМікофенолова кислота (МРА) пригнічує інозинмований фрагмент PCR рекомбінантного вірусу і нофосфатдегідрогеназу і приводить до блокуванплазміди pBN39 має розмір 636bp (показана полоня пуринового синтезу та пригнічення вірусної ресою 4). плікації в більшості клітинних ліній. Це блокування Праймерна комбінація oBN477/oBM452 є спеможе бути подолане за допомогою експресії цифічною для делеції А. Очікуваний фрагмент Ecogpt з конститутивного промотора та забезпеPCR рекомбінантного вірусу складає 4,1kb, очікучення субстратів ксантину і гіпоксантину. вана зона для вірусу дикого типу - 2,7kb (показана Одержані рекомбінантні віруси MVA-PrM3, буполосою 5). У верхній частині гелю може бути ідели ідентифіковані за допомогою PCR аналізів, винтифікована зона, специфічна для вірусу дикого користовуючи праймерну пару, що вибірково амптипу. ліфікує очікувану вставку (оВМ255 і oBN479, як Праймерна комбінація oBN255/oBN479 є спеописано вище), та як контроль - праймерну пару, цифічною для міжгенної ділянки I4L і PrM3 як яка специфічно розпізнає інсерційний сайт I4L вставки. Очікуваний фрагмент PCR рекомбінант(oBN499: CAACTCTCTTCTTGATTACC, SEQ ID ного вірусу і плазміди pBN50 має розмір 825bp NO.: 14 і oBN500: CGATCAAAGTCAATCTATG; (показано полосою 6). SEQ ID NO.: 15). Праймерна комбінація oBN499/oBN500 є спеСпівінфікування MVA-PrM1 тa MVA-PrM3 цифічною для міжгенної ділянки I4L. Очікуваний Клітини були інфіковані рівними кількостями фрагмент PCR рекомбінантного вірусу складає MVA-PrM1 та MVA-PrM3 згідно із згаданим вище 1,0kb, очікувана зона вірусу дикого типу - 0,3kb протоколом. Після 3 раундів очистки методом (показана полосою 7). бляшок в умовах відбору фосфорибозилтрансфеПраймерна комбінація oBN194/oBN476 є сперазного метаболізму голубих флуоресциюючих цифічною для делеції 2 і PrMІ як вставки. Очікува 25 90838 26 ний фрагмент PCR рекомбінантного вірусу і плазйований плазмідний вектор, який містить близько міди pBN49 має розмір 678bp (показано полосою 600bp фланкуючих послідовностей, сусідніх до 8). інсерційного сайту. Для того, щоб виділити фланПраймерна комбінація oBN54/oBN56 є специкуючі послідовності з геномної ДНК MVA-BN мофічною для делеція 2. Очікуваний фрагмент PCR жуть бути розроблені придатні PCR праймери. Такі рекомбінантного вірусу складає 1,6kb, очікувана праймери містять подовження з ензиморестрикзона вірусу дикого типу - 0,9kb (показано полосою ційними сайтами, які використовуватимуться для 9). У верхній частині гелю можна ідентифікувати клонування фланкуючих послідовностей у векторзону, специфічну для вірусу дикого типу. ну плазміду. Між цими фланкуючими послідовносАльтернативно, один може продукувати 4 різні тями введена селекційна генна касета, наприклад, віруси, коінфікувати клітини всіма чотирма вірусаNPT II ген (резистентний до неоміцину) під транскми і відбирати рекомбінанти. рипційним контролем поксвірусного промотора (Ρ). Також можуть досягатися удосконалення з реКрім того, є клонуючий сайт для вставки додаткокомбінаційним вектором, який містить наступні вих генів або екзогенних послідовностей, вставлеселекційні або резистентні маркери. ний в IGR 44-45 (PacI). Одна така векторна консПриклад 2 трукція згідно з даним винаходом розкрита на Інсерційні вектори Фігурі 14 (pΒΝΧ87) Рекомбінантний вектор для міжгенної ділянки Конструювання рекомбінантиого поксвірусу, 136-137 (IGR 136-137) який містить декілька гомологічних генів, інтегроДля вставки екзогенних послідовностей в MVA ваних в його геном. геном в так звану міжгенну ділянку (IGR) 136-137, Інсерційні вектори яка відповідає геномній позиції 129.940, був сконсДля вставки трьох PrM генів серотипів 2, 3 і 4 труйований плазмідний вектор, який містить бливірусу тропічної лихоманки в MVА геном були одезько 600bp фланкуючих послідовностей, сусідніх ржані три незалежні рекомбінантні вектори. до інсерційного сайту. Для того, щоб виділити Ці вектори містять - як детально описано вище фланкуючі послідовності з геномної ДНК MVA-BN - послідовності, гомологічні до MVA геному, для можуть бути розроблені придатні PCR праймери. направленої вставки шляхом гомологічної рекомТакі праймери містять подовження з ензиморестбінації. Крім того, кожний вектор містить селекційрикційними сайтами, які використовуватимуться ну касету або касету гена-репортера. для клонування фланкуючих послідовностей у PrM послідовності трьох серотипів вірусу тровекторну плазміду. Між цими фланкуючими посліпічної лихоманки були синтетично одержані як довностями введена селекційна генна касета, наописано в Прикладі 1. приклад, ΝΡΤ II ген (резистентний до неоміцину) Як результат, інсерційна векторна конструкція під транскрипційним контролем поксвірусного для IGR 136-137 містила PrM четвертого серотипу промотора (Ρ). Крім того, є клонуючий сайт для вірусу тропічної лихоманки (Фіг.15 - pΒΝ27). Інсервставки додаткових генів або екзогенних послідовційна векторна конструкція для IGR 07-08 містила ностей, вставлений в IGR 136-137 (РасI). Одна PrM другого серотипу вірусу тропічної лихоманки така векторна конструкція згідно з даним винахо(Фіг.16 - pBN34) та інсерційна векторна конструкція дом розкрита на Фігурі 12 (pΒΝΧ67). для IGR 44-45 містила PrM третього серотипу віРекомбінантний вектор для міжгенної ділянки русу тропічної лихоманки (Фіг.17 - pBN47). 07-08 (IGR 07-08) Одержання рекомбінантного MVA через гомоДля вставки екзогенних послідовностей в MVA логічну рекомбінацію геном в так звану міжгенну ділянку (IGR) 07-08, яка Одержання рекомбінантного MVA шляхом говідповідає геномній позиції 12.800, був сконструмологічної рекомбінації виконувалася як описано в йований плазмідний вектор, який містить близько Прикладі 1. 600bp фланкуючих послідовностей, сусідніх до Інсерційні сайти для PrM4, PrM3 і PrM 2 в MVA інсерційного сайту. Для того, щоб виділити флангеномі зображені на Фігурі 18. куючі послідовності з геномної ДНК MVA-BN моВставка PrM4 в MVA жуть бути розроблені придатні PCR праймери. Такі В першому раунді клітини були інфіковані праймери містять подовження з ензиморестрикMVA-BN згідно з описаним вище протоколом та ційними сайтами, які використовуватимуться для додатково трансфіковані інсерційним вектором клонування фланкуючих послідовностей у векторpBN27, який містить PrM ген четвертого серотипу ну плазміду. Між цими фланкуючими послідовносвірусу тропічної лихоманки та ген EGFP як гентями введена селекційна генна касета, наприклад, репортер. Оскільки трансфікований вектор містить Ecogpt ген (гуанінфосфорибозилтрансфераза) піл ген-репортер, EGFP, то синтезований протеїн в транскрипційним контролем поксвірусного промоінфікованих рекомбінантним вірусом клітинах витора (Ρ). Крім того, є клонуючий сайт для вставки являється найпізніше через три дні. Одержані редодаткових генів або екзогенних послідовностей, комбінантні віруси мають бути очищені методом вставлений в IGR 07-08 (PacI). Одна така векторна бляшок, як описано в Прикладі 1. Після чотирьох конструкція згідно з даним винаходом розкрита на повторів процедури очистки методом бляшок реФігурі 13 (pBNX88). комбінантні віруси, MVA-PrM4, були ідентифіковані Рекомбінантний вектор для міжгенної ділянки за допомогою PCR аналізу, використовуючи прай44-45 (IGR 44-45) мерну пару, селективно ампліфікуючу інсерційний Для вставки екзогенних послідовностей в MVA сайт IGR136-137 (oBN1008: gataccgatcacgttcta. геном в так звану міжгенну ділянку (IGR) 44-45, яка SEQ ID, NO.: 16; і oBN1009 ggatatgattatgtagag. SEQ відповідає геномній позиції 37.330, був сконструID, NO.: 17). 27 90838 28 Вставка PrM2 в MVA PrM4+3+2, були ідентифіковані за допомогою PCR Клітини були інфіковані MVA-PrM4 згідно з аналізу, використовуючи праймерну пару, селекописаним вище протоколом та додатково трансфітивно ампліфікуючу інсерційний сайт IGR44-45 ковані інсерційним вектором pBN34, який містить (oBN904: cgttagacaacacaccgacgatgg. SEQ ID, NO.: PrM ген другого серотипу вірусу тропічної лихома20; і oBN905 cggatgaaaaatttttggaag. SEQ ID, NO.: нки та ген BFP як ген-репортер. Оскільки трансфі21). кований вектор містить ген-репортер, BFP, то синPCR аналіз рекомбінантного вірусу, який містезований протеїн в інфікованих рекомбінантним тить три PrM гени вірусу тропічної лихоманки, повірусом клітинах виявляється найпізніше через три казаний на Фіг.19. PCR експерименти виконувадні. Одержані рекомбінантні віруси мають бути лись як описано в Прикладі 1. Праймерна очищені методом бляшок, як описано в Прикладі комбінація OBN1008 і OBN1009 є специфічною 1. Після шести повторів процедури очистки методля IGR136-137, який містить PrM4 вставку (Фіг.19, дом бляшок рекомбінантний вірус MVAнижня панель). Очікуваний PCR фрагмент рекомPrM4+PrM2 додатково пропассажували та амплібінантного вірусу має розмір 1kb (показаний полофікували і неочищений вихідний матеріал був госою 4, 5 і 6) як позитивний плазмідний контроль товий. Рекомбінант був ідентифікований шляхом (полоса 8). Холостий векторний контроль, який не PCR випробувань з використанням праймерних містить PrM 4, показує очікуваний фрагмент 190bp пар, селективно ампліфікуючих інсерційний сайт (полоса 2). Μ полоса показує маркер молекулярної IGR07-08 (oBN903: cfcggataaatacgaggacgtg. SEQ ваги та полоси 1, 3 і 7 є холостими. Праймерна ID, NO.:18; і OBN904: gacaattatccgacgcaccg; SEQ комбінація οΒΝ902 та oBN903 є специфічною для ID, NO.: 19). IGR07-08, який містить вставку PrM2 (Фіг.19, верхВставка PrM 3 в МVА ня панель). Очікуваний фрагмент PCR рекомбінаКлітини були інфіковані MVA-PrM2+4 згідно з нтного вірусу має розмір 960bp (показано полосаописаним вище протоколом та додатково трансфіми 4-6) як позитивний плазмідний контроль ковані інсерційним вектором pBN47, який містить (полоса 8). Холостий векторний контроль, позбавPrM ген третього серотипу вірусу тропічної лихолений PrM 2, показує очікуваний фрагмент 190bp манки та ген EGFP як гeн-репортер. Оскільки тра(полоса 2). Праймерна комбінація οΒΝ904 і нсфікований вектор містить ген-репортер, EGFP, οΒΝ905 є специфічною для IGR44-45, який містить то синтезований протеїн в інфікованих рекомбінавставку PrM3 (Фіг.19, середня панель). Очікуваний нтним вірусом клітинах виявляється найпізніше фрагмент PCR рекомбінантного вірусу має розмір через три дні. Одержані рекомбінантні віруси ма932bp (показано полосами 4-6) як позитивний плають бути очищені методом бляшок, як описано в змідний контроль (полоса 8). Холостий векторний Прикладі 1. Після трьох повторів процедури очистконтроль, позбавлений PrM 2 показує очікуваний ки методом бляшок рекомбінантні віруси, MVAфрагмент 185bp (полоса 2). 29 90838 30 31 90838 32 33 90838 34 35 90838 36 37 90838 38 39 90838 40 41 90838 42 43 90838 44 45 90838 46 47 90838 48 49 90838 50 51 90838 52 53 90838 54 55 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 90838 Підписне 56 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Recombinant poxvirus expressing homologous genes, introduced into poxvirus genome

Автори англійською

LEYRER SONJA, Leyrer Sonja

Назва патенту російською

Рекомбинантный поксвирус, который экспрессирует гомологические гены, вставленные в поксвирусный геном

Автори російською

Хаули Пол, Лейрер Сонья

МПК / Мітки

МПК: C12N 15/863, A61P 31/12, A61K 39/285, C12N 7/00, C12N 15/09, C07K 14/07

Мітки: гені, поксвірус, поксвірусний, рекомбінантний, вставлені, експресує, гомологічні, геном

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/28-90838-rekombinantnijj-poksvirus-yakijj-ekspresueh-gomologichni-geni-vstavleni-v-poksvirusnijj-genom.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Рекомбінантний поксвірус, який експресує гомологічні гени, вставлені в поксвірусний геном</a>

Подібні патенти