Спосіб лікування раку за допомогою пухлиноасоційованого антигену, отриманого із цикліну d1

Реферат: Винахід стосується застосування пептиду, який складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO:6, для одержання активованих цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ), де спосіб включає контактування ЦТЛ з вказаним пептидом. UA 110473 C2 (12) UA 110473 C2 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується пептидів, отриманих із цикліну, для застосування в удосконаленому способі лікування пацієнтів, хворих на рак, особливо як комбінаційної терапії із застосуванням вакцини. Інші аспекти винаходу стосуються використання пептидів чи їхньої комбінації як діагностичного засобу. Передумова створення винаходу Стимуляція імунної відповіді залежить від присутності антигенів, що сприймаються імунною системою хазяїна як чужорідна речовина. Відкриття пухлино-асоційованих антигенів зробило можливим в даний час використання імунної системи хазяїна для втручання в ріст пухлини. Зараз вивчається можливість використання для імунотерапії раку різних механізмів, як гуморальної, так і клітинної ланки імунної системи. Певні компоненти клітинної ланки імунної системи здатні специфічно розпізнавати та знищувати пухлинні клітини. Виділення цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) із популяції пухлиноінфільтруючих клітин або з периферичної крові свідчить про те, що такі клітини відіграють важливу роль у природному імунному захисті проти раку (Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112; Zeh HJ, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC; J Immunol. 1999, 162(2):989-94; High avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy.). Важливу роль у цій відповіді відіграють, зокрема, CD8-позитивні Т-клітини + (TCD8 ), які розпізнають пептиди, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності I класу (MHC). Ці пептиди зазвичай складаються з 8-12 амінокислотних залишків, що отримані з білків або дефектних рибосомальних продуктів (DRIP) (Schubert U, Antón LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774), які містяться у цитозолі. Молекули MHC людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (HLA). Існує два класи молекул MHC. Молекули MHC I класу можна виявити в більшості клітин, що мають ядра, ці молекули презентують пептиди, які утворюються в результаті протеолітичного розщеплення ендогенних білків, продуктів DRIP та великих за розміром пептидів. Молекули MHC II класу містяться головним чином на професійних антиген-презентуючих клітинах (АПК) і презентують пептиди екзогенних білків, які поглинаються клітинами АПК в ході ендоцитозу, і проходять подальше трансформування (Cresswell P. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12:259-93). Комплекси пептидів і молекул MHC I класу розпізнаються CD8-позитивними цитотоксичними Тлімфоцитами, що несуть відповідний Т-клітинний рецептор (ТКР), в той час як комплекси пептиду і молекул MHC II класу розпізнаються CD4-позитивними Т-хелперами, що несуть відповідний ТКР. Загальновідомо, що ТКР, пептид і MHC, таким чином, є присутніми у стехіометричних кількостях при співвідношенні 1:1:1. CD4-позитивні Т-хелперні клітини відіграють важливу роль у регуляції ефекторних функцій T-клітин у протипухлинній відповіді, і з цієї причини ідентифікація епітопів CD4-позитивних Тклітин, отриманих із пухлино-асоційованих антигенів (TAA), може бути дуже важливою під час розробки лікарських засобів для ініціювання протипухлинних імунних реакцій ((Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. BorrasCuesta, and E. Celis. 2002. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin. Cancer Res. 8:3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. 2003. Survey of naturally occurring CD4+T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 100(15):8862-7) CD4-позитивні Тклітини можуть викликати локальне підвищення рівнів інтерферону-гамма (Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T; A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+T cells; Cancer Res. 2003 J; 63(14):4095-4100). За відсутності запалення експресія молекул MHC II класу обмежується головним чином клітинами імунної системи, особливо професійними антиген-презентуючими клітинами (АПК), наприклад, моноцитами, клітинами, отриманими з моноцитів, макрофагами, дендритними клітинами. Несподівано було виявлено, що клітини пухлин у пацієнтів експресують молекули MHC II класу (Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Müller M, Krämer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanović S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170). Оскільки конститутивна експресія молекул HLA II класу зазвичай обмежується клітинами імунної системи (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331), вважалося неможливим виділити пептиди класу II безпосередньо з первинних пухлин. Однак нещодавно Dengjel і 1 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 співавторам вдалося ідентифікувати декілька зв'язаних з молекулами MHC II класу епітопів, що безпосередньо експресуються тканинами пухлин (Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Müller M, Krämer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanović S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170). Щоби пептид ініціював (викликав) клітинну імунну відповідь, він має зв'язатися з молекулою MHC. Цей процес залежить від алеля молекули MHC і від амінокислотної послідовності пептиду. Пептиди, що зв'язують молекули MHC I класу, зазвичай мають 8-10 амінокислотних залишків у довжину і зазвичай містять два консервативні залишки ("якорі") у своїй послідовності, які взаємодіють з відповідною зв'язувальною щілиною молекули MHC. У такий спосіб кожний алель MHC має "зв'язувальний мотив", що визначає, які пептиди зможуть специфічно зв'язатися зі зв'язувальною щілиною (Rammensee H. G., Bachmann J. and Stevanovic, S; MHC Ligands and Peptide Motifs, Chapman & Hall 1998). В імунній реакції, залежній від молекул MHC I класу, пептиди не тільки мають бути здатними зв'язатися з певними молекулами MHC I класу, що експресуються клітинами пухлини, але вони також мають розпізнаватися Т-клітинами, що несуть специфічні Т-клітинні рецептори (ТКР). Антигенами, які розпізнаються пухлино-специфічними цитотоксичними Т-лімфоцитами, тобто їхніми епітопами, можуть бути молекули, що отримані з усіх класів білків, таких як ферменти, рецептори, фактори транскрипції тощо, активність яких підвищується у клітинах відповідної пухлини. Крім того, пухлино-асоційованами антигенами, наприклад, можуть також бути специфічні для пухлинних клітин елементи, наприклад, продукти мутованих генів, або з альтернативних відкритих рамок зчитування (ВРЗ), або білкового сплайсингу (Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van der Bruggen P, Boon T, Van den Eynde BJ. An antigenic peptide produced by peptide splicing in the proteasome, Science 2004 Apr 23; 304 (5670):587-90.). Іншим важливим класом пухлино-асоційованих антигенів є тканино-специфічні антигени, такі як CT ("раково-тестикулярні")-антигени, які експресуються у різних видах пухлин і у нормальних тканинах яєчок. По суті, будь-який пептид, що здатний зв'язувати молекулу MHC, може відігравати роль епітопу Т-клітини. Передумовою індукції відповіді Т-клітин in vitro або in vivo є присутність Т-клітин із відповідним Т-клітинним рецептором і відсутність імунологічної толерантності до цього конкретного епітопу. Таким чином, TAA є стартовою точкою для розробки протипухлинних вакцин. Методи ідентифікації і визначення характеристик TAA базуються на використанні ЦТЛ, які можна виділити з організму пацієнтів або здорових суб'єктів, або вони ґрунтуються на генерації різних профілів транскрипції або різному характері експресії пептидів тканинами пухлин і нормальними тканинами (Lemmel C., Weik S., Eberle U., Dengjel J., Kratt T., Becker H. D., Rammensee H. G., Stevanovic S. Nat. Biotechnol. 2004 Apr.; 22(4):450-4, T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H. G. Rammensee. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62 (20):5818-5827, 2002.). Проте ідентифікація генів, які надмірно експресуються пухлинними тканинами або лініями клітин пухлин людини або селективно експресуються в таких тканинах або клітинних лініях, не дає точної інформації щодо використання антигенів, що транскрибуються з цих генів, в імунній терапії. Причиною цього є те, що тільки окрема субпопуляція епітопів цих антигенів придатна для такого застосування, оскільки має бути присутня Т-клітина з відповідним ТКР, і імунологічна толерантність по відношенню до цього епітопу повинна бути відсутньою або мінімальною. Таким чином, важливо вибрати тільки такі пептиди з тих, що належать до надмірно експресованих або селективно експресованих білків, які презентуються в сполученні з молекулами MHC, проти яких можливо знайти нормально функціонуючу Т-клітину. Така нормально функціонуюча Т-клітина визначається як Т-клітина, яка при стимуляції конкретним антигеном може бути клонована і здатна виконувати функції ефектору ("ефекторна Т-клітина"). Т-хелперні клітини відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції ЦТЛ у протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперних клітин, які ініціюють реакцію цих клітин типу TH1, підтримують ефекторні функції CD8-позитивних Т-кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлини, що експонують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/MHC на поверхнях своїх клітин. У такий спосіб епітопи пухлино-асоційованих пептидів T-клітин-хелперів, самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованих пептидами, можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні відповіді. Оскільки обидва типи відповіді, залежні від CD8 та CD4, спільно та синергічно роблять свій внесок у протипухлинну дію, для розробки протипухлинних вакцин важливими є ідентифікація 2 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 та визначення характеристик пухлино-асоційованих антигенів, які розпізнаються або CD8позитивними ЦТЛ (ліганд: молекула MHC I класу + пептидний епітоп), або CD4-позитивними ЦТЛ (ліганд: молекула MHC II класу + пептидний епітоп). Циклін D1 належить до сімейства високо консервативних циклінів, більш конкретно, до підсімейства циклінів D (Lew DJ, Dulic V, Reed SI (1991). Isolation of three novel human cyclins by rescue of G1 cyclin (Cln) function in yeast. Cell 66, 1197-1206; Xiong Y, Connolly T, Futcher B, Beach D (1991). Human D-type cyclin. Cell 65, 691-699). Цикліни відіграють роль регуляторів циклінзалежних кіназ (CDK). Різні цикліни виявляють відмінність у характері експресії і деградації, що сприяє часовій координації кожної події у клітинному циклі (Deshpande A, Sicinski P, Hinds PW (2005). Cyclins and cdks in development and cancer: a perspective. Oncogene 24, 2909-2915.) Циклін D1 утворює комплекс із CDK4 або CDK6 і відіграє роль їхньої регуляторної субодиниці, чия активність є необхідною для переходу від G1- до S-фази клітинного циклу. CCND1 бере участь в утворенні голоферментного комплексу серин/треонінкінази з CDK4 і CDK6, надаючи цьому комплексу субстратну специфічність (Bates S, Bonetta L, MacAllan D, Parry D, Holder A, Dickson C, Peters G (1994). CDK6 (PLSTIRE) and CDK4 (PSK-J3) are a distinct subset of the cyclindependent kinases that associate with cyclin D1. Oncogene 9, 71-79.) Мутації, ампліфікація і надмірна експресія цього гена, які змінюють проходження клітин через клітинний цикл, часто спостерігаються у різних пухлинах і можуть сприяти онкогенезу (Hedberg Y, Davoodi E, Roos G, Ljungberg B, Landberg G (1999). Cyclin-D1 expression in human renal-cell carcinoma. Int. J. Cancer 84, 268-272; Vasef MA, Brynes RK, Sturm M, Bromley C, Robinson RA (1999). Expression of cyclin D1 in parathyroid carcinomas, adenomas, and hyperplasias: a paraffin immunohistochemical study. Mod. Pathol. 12, 412-416; Troussard X, vet-Loiseau H, Macro M, Mellerin MP, Malet M, Roussel M, Sola B (2000). Cyclin D1 expression in patients with multiple myeloma. Hematol. J. 1, 181-185). Циклін D1 надмірно експресується в клітинах колоректального раку, раку шлунка та стравоходу, легенів, нирки і молочної залози, а також у лімфомах і у хворих на лейкемію, в той час як у нормальних тканинах спостерігається невелика експресія. Він також зазвичай надмірно експресується в лімфомі з клітин мантійної зони; ця лімфома характеризуються транслокацією у t(11;14)(q13;q32) протоонкогену CCND1 з хромосоми 11q13 у ген важкого ланцюга молекули Ig на хромосомі 14q32 (Wang і співавт., 2009; Kondo і співавт., 2008). В результаті звичайного однонуклеотидного поліморфізму A/G (A870G) утворюються дві різні, a і b, ізоформи мРНК гена цикліну D1. Альтернативна сплайс-ізоформа b кодує усічений білок, пов'язаний з більшою частотою виникнення пухлини, включаючи спорадичну нирковоклітинну карциному, рак легенів і товстої кишки та інші види раку (Fu M, Wang C, LI Z, Sakamaki T, Pestell RG (2004). Minireview: Cyclin D1: normal and abnormal functions. Endocrinology 145, 5439-5447; Yu J, Habuchi T, Tsuchiya N, Nakamura E, Kakinuma H, Horikawa Y, Inoue T, Ogawa O, Kato T (2004). Association of the cyclin D1 gene G870A polymorphism with susceptibility to sporadic renal cell carcinoma. J Urol. 172, 2410-2413). Був виявлений зв'язок підвищеної експресії CCND1 із більш високим ступенем злоякісності пухлини, метастазами і скороченням виживаності (Maeda K, Chung Y, Kang S, Ogawa M, Onoda N, Nishiguchi Y, Ikehara T, Nakata B, Okuno M, Sowa M (1998). Cyclin D1 overexpression and prognosis in colorectal adenocarcinoma. Oncology 55, 145-151; McKay JA, Douglas JJ, Ross VG, Curran S, Murray GI, Cassidy J, McLeod HL (2000). Cyclin D1 protein expression and gene polymorphism in colorectal cancer. Aberdeen Colorectal Initiative. Int. J Cancer 88, 77-81; Bahnassy AA, Zekri AR, El-Houssini S, El-Shehaby AM, Mahmoud MR, Abdallah S, El-Serafi M (2004). Cyclin A and cyclin D1 as significant prognostic markers in colorectal cancer patients. BMC. Gastroenterol. 4, 22; Balcerczak E, Pasz-Walczak G, Kumor P, Panczyk M, Kordek R, Wierzbicki R, Mirowski M (2005). Cyclin D1 protein and CCND1 gene expression in colorectal cancer. Eur. J Surg. Oncol. 31, 721-726). У випадку колоректального раку часто реєструвалася надмірна експресія гена CCND1 на рівні мРНК і білка. Це можна пояснити добре відомим фактом, що CCND1 є геном-мішенню у сигнальному шляху бета-катенін-TCF/LEF, для якого часто спостерігається позитивна регуляція у колоректальній карциномі (Shtutman M, Zhurinsky J, Simcha I, Albanese C, D'Amico M, Pestell R, Ben-Ze'ev A (1999). Ген цикліну D1 є мішенню у сигнальному шляху бета-катенін/LEF-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96, 5522-5527; Tetsu O, McCormick F (1999). Бета-катенін регулює експресію цикліну D1 в клітинах карциноми товстої кишки. Nature 398, 422-426). Пептид CCN-001 (LLGATCMFV), що отриманий із цикліну, був ідентифікований Садовніковою і співавторами (Sadovnikova E, Jopling LA, Soo KS, Stauss HJ (1998). Generation of human tumor-reactive cytotoxic T cells against peptides presented by non-self HLA class I molecules. Eur. J. Immunol. 28, 193-200). Після індукціі алорестриктованих Т-клітин (тобто, від HLA-A2негативних донорів) проти декількох отриманих із цикліну D1 пептидів, що зв'язують HLA-A*02, було показано, що клони Т-клітин, що розпізнають CCN-001, можуть приводити до лізису HLA 3 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A*02-позитивних клітин пухлини, які ендогенно експресують циклін D1, але не HLA-A*02позитивних клітин, негативних до цикліну D1. Таким чином, було показано, що існують тільки непрямі докази процесингу і презентування CCN-001 у природних умовах. Деякий час існувала думка, що Т-клітини, які розпізнають епітопи цикліну D1, відсутні в спектрі Т-клітин у зв'язку з експресією цикліну D1 у тимусі. Якщо взяти це до уваги, генерація аутологічних ЦТЛ проти цикліну D1 була би неможливою. Однак Kondo і співавт. (Kondo E, Maecker B, Weihrauch MR, Wickenhauser C, Zeng W, Nadler LM, Schultze JL, von Bergwelt-Baildon MS (2008). Cyclin D1-specific cytotoxic T lymphocytes are present in the repertoire of cancer patients: implications for cancer immunotherapy. Clin Cancer Res 14, 6574-6579) довели, що ЦТЛ, специфічні до епітопу CCN-001 (LLGATCMFV), можна також отримати від HLA-A2-позитивних донорів. Вони показали це для здорових донорів, так само як і для пацієнтів, хворих на рак товстої кишки і пацієнтів з лімфомою з клітин мантійної зони. Як АПК вони використовували аутологічні CD40-активовані В-клітини. Wang і співавт. (Wang M, Sun L, Qian J, Han X, Zhang L, Lin P, Cai Z, Yi Q (2009). Cyclin D1 as a universally expressed mantle cell lymphoma-associated tumor antigen for immunotherapy. Leukemia 23, 1320-1328) отримали циклін D1-специфічні ЦТЛ проти CCN-001, використовуючи T-клітини пацієнтів, хворих на лімфому з клітин мантійної зони, і аутологічні ДК із зрілих моноцитів як АПК. Вони використовували не вихідний пептид, а гетероклітичний пептид, в якому перша амінокислота (L) була заміщена на Y, що підсилило зв'язування з молекулами MHC. Отримані ЦТЛ виявилися здатними знищувати клітини, що експресують циклін D1+, включаючи клітини первинної лімфоми від HLA-A2-позитивних пацієнтів, хворих на лімфому з клітин мантійної зони. Цей пептид використовували також у інших дослідженнях (Kondo E, Gryschok L, Klein-Gonzalez N, Rademacher S, Weihrauch MR, Liebig T, Shimabukuro-Vornhagen A, Kochanek M, Draube A, von Bergwelt-Baildon MS (2009a). CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp. Immunol. 155, 249-256; Kondo E, Gryschok L, Schultze JL, von Bergwelt-Baildon MS (2009b). Using CD40-activated B cells to efficiently identify epitopes of tumor antigens. J Immunother. 32, 157-160) з метою продемонструвати можливість використання CD40-активованих В-клітин як АПК. Buchner і співавт. (у Buchner et al. Phase 1 Trial of Allogeneic Gene-Modified Tumor Cell Vaccine RCC26/CD80/IL-2 in Patients with Metastatic Renal Cell Carcinoma. Human Gene Therapy. March 2010, 21(3): 285-297) посилаються на використання пептиду CCN-001 у клінічному дослідженні. У патенті WO 2005/035714 описуються вакцини для лікування або попередження захворювання на рак, які містять пухлино-асоційовані антигени, рестриктовані за молекулами HLA, зокрема, антигени, рестриктовані за молекулами HLA-А2. Згідно з конкретними аспектами патенту, пропонуються пептиди, отримані з цикліну D. Такі пептиди можуть використовуватися для стимуляції специфічних ЦТЛ, які переважно атакують пухлинні клітини. Пептид, отриманий із цикліну D, може містити послідовність LLGATCMFV або її фрагмент. Крім того, описується спосіб лікування і профілактики захворювання на рак, який включає введення пацієнту терапевтично ефективної кількості вакцини, що містить пептид. Спосіб може додатково включати лікування пацієнта другим протираковим препаратом, причому другий протираковий препарат вибраний із довгого списку препаратів, таких як хіміотерапевтичні препарати, наприклад, циклофосфамід. Другий протираковий препарат може бути введений одночасно з вакциною або в інший час ніж вакцина. Проте у заявці WO 2005/035714 не описано жодної переваги щодо застосування комбінаційної терапії з використанням пептидів, отриманих із цикліну D1. Беручи до уваги викладене вище, зараз дуже мало відомо про ефективне застосування пептидів, отриманих із цикліну D1, в ефективній імунотерапії раку. Отже, метою цього винаходу є впровадження нових підходів для більш ефективної імунотерапії раку з використанням пептидів, отриманих із цикліну D1. В першому аспекті винахід стосується пептиду, що складається або по суті складається з амінокислотної послідовності, вибраної з групи послідовностей від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 18, для застосування при лікуванні раку у пацієнта, або комбінації, що включає принаймні один пептид, що складається або по суті складається з амінокислотної послідовності, вибраної з групи послідовностей від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 18, для застосування при лікуванні раку у пацієнта. Відповідно до цього винаходу, рак може бути вибраний із групи, що складається з раку легенів, голови та шиї, раку молочної залози, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, раку нирки, раку стравоходу, раку кісток, раку яєчка, раку шийки матки, раку шлунковокишкового тракту, гліобластоми, лейкемії, лімфом, лімфоми з клітин мантійної зони, передракових захворювань легенів, раку товстої кишки, меланоми, раку сечового міхура та 4 UA 110473 C2 5 10 будь-яких інших неопластичних захворювань. Переважними є рак нирки, рак товстої кишки і гліобластома. В контексті цього винаходу, переважними є пептиди, які складаються з амінокислотної послідовності відповідно до будь якої послідовності від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 18. "По суті складається з" означає, що пептид, на додаток до послідовності відповідно до будь якої послідовності від SEQ ID NO. 1 до SEQ ID No. 18, містить додаткові N- та/або C-термінальні фрагменти ланцюга амінокислот, які не обов'язково утворюють частину пептиду, що функціонує як коровá послідовність пептиду, що містить зв'язувальний мотив, і як імуногенний епітоп Тхелперу. Однак ці фрагменти можуть бути важливими для забезпечення ефективного введення пептиду у клітини. У наступній таблиці наведено список пептидів, отриманих із цикліну D1, відповідно до контексту цього винаходу. Таблиця 1: Пептиди у контексті цього винаходу Назва пептиду Пептидна послідовність Положення в цикліні D1 (aa) CCN-001 LLGATCMFV 101-109 CCN-002 RLTRFLSRV 228-236 CCN-003 NPPSMVAAGSVVAAV 198-212 CCN-004 EVFPLAMNY 76-84 CCN-006 20 25 30 115-124 CCN-007 CCN-A CCN-B CCN-C CCN-D CCN-E CCN-F1 CCN-F2 CCN-F3 CCN-G CCN-H CCN-I CCN-J 15 ETIPLTAEKL ALLESSLRQA IVATWMLEV SVVAAVQGL SVVAAVQGLNL NYLDRFLSL DRVLRAML EEEVFPLAM EEVFPLAMNY EVFPLAMNYL NLRSPNNFLSY VNKLKWNL VQKEVLPSM MPEAEENKQII 253-262 59-67 207-215 207-217 83-91 25-32 74-82 75-84 76-85 216-226 145-152 48-56 168-178 Зв'язана з HLA-I HLA-A*02 HLA-I HLA-A*02 HLA-II DRB1*0401 HLA-I HLA-A*26 HLA-I HLA-A*02 HLA-A*68 HLA-I HLA-A*02 HLA-A*02 HLA-A*02 HLA-A*02 HLA-A*24 B*14 B*1801 HLA-I HLA-I HLA-I HLA-I HLA-I не визначено SEQ ID NO. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 В одному з втілень цього винаходу пептид відповідно до цього винаходу є гібридним білком, який містить 80 N-термінальних амінокислот HLA-DR-антиген-асоційованого інваріантного ланцюгу (p33, надалі "Ii"), одержаного з NCBI, інвентарний номер в генному банку (GenBank) X00497 (Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DRassociated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984). Якщо пептид відповідно до цього винаходу, який є більшим, ніж приблизно 12 амінокислотних залишків, використовується безпосередньо для зв'язування з молекулою MHC, переважно, щоб залишки, розташовані по краях корової ділянки зв'язування HLA, не мали значного впливу на здатність пептиду специфічно зв'язуватися зі зв'язувальною порожниною молекули MHC чи презентувати пептид ЦТЛ. Однак, як вже зазначалося вище, є зрозумілою можливість використання більших за розміром пептидів, особливо коли вони кодуються полінуклеотидом, оскільки ці більші за розміром пептиди можуть бути піддані фрагментації відповідними антиген-презентуючими клітинами. Прикладами пептидів лігандів MHC, мотивів, варіантів, а також деякі приклади N- та/або Cтермінальних подовжень можуть бути, наприклад, такі, що отримані з бази даних SYFPEITHI (Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for 5 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4):213-9) на веб-сайті http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/, і у посиланнях, наведених на ньому. Переважним є пептид відповідно до цього винаходу, специфічний до молекул MHC I класу, який має загальну довжину від 9 до 16, переважно від 9 до 12 амінокислот. Слід взяти до уваги, що такі пептиди можуть використовуватися (наприклад, у вакцині) як довгі пептиди, подібні до пептидів, що утворюють комплекси з молекулами MHC II класу. Фахівцям у цій галузі відомі методи ідентифікації специфічних до молекул MHC I класу "корових послідовностей", що мають певний HLAспецифічний амінокислотний мотив по відношенню до молекул HLA I класу, і ці послідовності можна спрогнозувати за допомогою, наприклад, комп'ютерних програм PAProC (http://www.unituebingen.de/uni/kxi/) і SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de). Термін "пептид" автори винаходу використовують не тільки для молекул, у яких амінокислотні залишки з'єднані пептидними (-CO-NH-) зв'язками, але також для молекул, у яких пептидний зв'язок є реверсованим. Такі ретро-інверсивні пептидні міметики можуть бути отримані методами, відомими в даній галузі, наприклад, описаними в роботі Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, яка включена в даний документ шляхом посилання. Такий підхід включає отримання псевдо-пептидів, які містять зміни із залученням остова, а не орієнтації бокових ланцюгів. Meziere і співавт. (1997) показують, що принаймні для відповіді молекул MHC II класу і T-клітин-хелперів зазначені псевдо-пептиди є прийнятними. Ретро-інверсивні пептиди, які вміщують зв'язки NH-CO замість пептидних зв'язків CO-NH, набагато більш стійкі до протеолізу. У особливо переважному втіленні пептид відповідно до цього винаходу включає амінокислотну послідовність як зазначено і додатково принаймні один епітоп Т-клітини, причому додатковий епітоп Т-клітини здатний сприяти Т-клітинній відповіді, спрямованій проти того виду пухлини, який аберантно експресує пухлино-асоційований антиген. Таким чином, пептиди за винаходом включають поліпептиди у вигляді так званих "вузлів на мотузці", які також можуть використовуватися як вакцини. З наведеного нижче стає зрозумілим, що у деяких втіленнях пептиди відповідно до цього винаходу можуть використовуватися безпосередньо (тобто вони не виробляються шляхом експресії полінуклеотиду у клітині пацієнта або в клітині, введеній пацієнту), в таких втіленнях переважно, якщо пептид матиме менше ніж 100 або 50 залишків. Переважним є пептид відповідно до цього винаходу, який має загальну довжину від 9 до 30 амінокислот. У контексті цього винаходу "комбінація" означає 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 або 18 різних пептидів або навіть більша кількість пептидів відповідно до цього винаходу. Прийнятна вакцина переважно містить 4, 5, 6 або 7 різних пептидів, і, найбільш переважно, 6 різних пептидів. Комбінація може також залежати від конкретного виду раку, на який хворіє пацієнт, що проходить лікування, а також статусу захворювання, попередніх режимів лікування, імунного статусу пацієнта і, звичайно, HLA-генотипу пацієнта. Переважні комбінації вибирають із принаймні одного пептиду, вибраного з групи від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 18 разом із другим пухлино-асоційованим пептидом, що отриманий не із цикліну, таким як, наприклад, пептид із групи від SEQ ID No. 19 до SEQ ID No. 26. Комбінація може включати пептиди як в окремих, так і в спільному контейнері або лікарських формах, які можуть вводитися одночасно або окремими дозами за умови, що пептиди виявляють сукупну дію, зокрема терапевтичну дію в контексті лікування, що описується тут. Пептиди або комбінація відповідно до цього винаходу особливо прийнятні в імунотерапевтичних методах для ефективного націлювання і знищення ракових клітин, які експресують або аберантно експресують циклін D1. В іншому важливому аспекті цього винаходу пропонується пептид або комбінація відповідно до цього винаходу, в якому зазначений пептид або комбінація вводиться у формі протиракової вакцини. Переважною є вакцина, що містить (синтетичний) пептид чи пептиди або їхню комбінацію як зазначено вище. Склад вакцини може також залежати від конкретного виду раку, на який хворіє пацієнт, що проходить лікування, а також статусу захворювання, попередніх режимів лікування, імунного статусу пацієнта і, звичайно, HLA-генотипу пацієнта. Переважною є комбінація відповідно до цього винаходу, яка додатково включає введення принаймні одного додаткового пухлино-асоційованого пептиду, що отриманий не із цикліну D1, такого як, наприклад, пептид, вибраний із групи від SEQ ID No. 19 до SEQ ID No. 26 відповідно до наступної таблиці 2. 6 UA 110473 C2 Таблиця 2: Пептиди комбінації відповідно до цього винаходу Назва пептиду Met-001 Muc-001 Muc-002 CEA-004 CEA-005 CEA-006 TGFBI-001 BIR-002 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Пептидна послідовність YVDPVITSI STAPPVHNV LLLLTVLTV YLSGANLNL YLSGADLNL SPQYSWRINGIPQQHT ALFVRLLALA TLGEFLKLDRERAKN Зв'язана з HLA-A*02 HLA-A*02 HLA-A*02 HLA-A*02 HLA-A*02 HLA-DR HLA-A*02 HLA-DR SEQ ID NO. 19 20 21 22 23 24 25 26 Переважною є комбінація відповідно до цього винаходу, в якій зазначений принаймні один додатковий пухлино-асоційований пептид вибраний виходячи на його здатності зв'язуватися з іншою молекулою HLA, ніж інші пептиди, які присутні у згаданій комбінації. Виходячи з вище зазначеного, переважні комбінації відповідно до цього винаходу вибирають із наступних комбінацій: комбінація, що включає SEQ ID No. 1 і SEQ ID No. 19; або SEQ ID No. 1 і SEQ ID No. 20; або SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 19 і SEQ ID No. 20; комбінація, що включає SEQ ID No. 1, пептид, вибраний із SEQ ID No. 22; SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 24; комбінація, що включає SEQ ID No. 1, пептид, вибраний із SEQ ID No. 22; SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 24; і SEQ ID No. 25; комбінація, що включає SEQ ID No. 1, пептид, вибраний із SEQ ID No. 22; SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 24; і SEQ ID No. 19; комбінація, що включає SEQ ID No. 1, і принаймні один пептид, вибраний із групи від SEQ ID No. 2 до SEQ ID No. 14; і комбінація, що включає SEQ ID No. 1 і SEQ ID No. 26. Відповідно до цього винаходу також пропонується комбінація, що включає SEQ ID No. 6 і принаймні один пептид, вибраний із групи від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 5 і від SEQ ID No. 7 до SEQ ID No. 14; і комбінація, що включає SEQ ID No. 5 і принаймні один пептид, вибраний із групи від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 4 і від SEQ ID No. 6 до SEQ ID No. 14. Відповідно до цього винаходу також пропонується комбінація, як зазначено вище, яка складається з пептидів як зазначено. Переважно, якщо пептид або комбінація відповідно до цього винаходу утворюють протипухлинну або протиракову вакцину. Вона може вводитися безпосередньо пацієнту, в уражений орган або системно, або вноситися ex vivo у клітини, отримані від пацієнта, чи у клітинну лінію людини, котрі згодом вводяться пацієнту, або використовуватись in vitro для вибору субпопуляції з імунних клітин, які отримані від пацієнта і які потім знов вводяться йому. Пептид може бути, по суті, чистим, або поєднаним з імуностимулюючим ад'ювантом на зразок Detox, чи використовуватись в комбінації з імуностимулюючими цитокінами, або вводитися з належною системою доставки, наприклад, ліпосомами. Пептид також може бути кон'югованим із належним носієм, таким як гемоціанін фісурели (KLH) або маннан (див. WO 95/18145 та роботу Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690, 276-291). Пептид також може бути міченим або бути злитим білком чи гібридною молекулою. Передбачається, що деякі пептиди, чиї послідовності наведені у цьому винаході, стимулюють CD8 ЦТЛ. Проте стимуляція є більш ефективною за умови сприяння з боку CD4позитивних Т-клітин. Отже, партнер по злиттю або сегменти гібридної молекули принагідно постачають епітопи, які стимулюють CD4-позитивні T-клітини. Епітопи, що стимулюють CD4позитивні Т-клітини, добре відомі фахівцям в цій галузі техніки і включають епітопи, що були ідентифіковані в правцевому анатоксині. Пептидом для застосування в протираковій вакцині може бути будь-який прийнятний пептид. Зокрема, ним може бути прийнятний 9-мерний пептид або прийнятний 7-мерний, або 8мерний, або 10-мерний, або 11-мерний, або 12-мерний пептид. Пептиди більшої довжини також прийнятні, але 9-мерні або 10-мерні пептиди, як описано в Таблиці 1 цього документу, є переважними в ролі пептидів, що зв'язуються з пептидами, які зв'язані з молекулами HLA I класу. Пептиди можуть вводитися внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, внутрішньочеревно, внутрішньовенно або підшкірно. Переважно, щоби вакцина вводилась у м'язи. Також 7 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно, щоби вакцина вводилась у шкіру, тобто внутрішньошкірно. Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується пептид відповідно до цього винаходу для внутрішньовенного (i.v.) введення, підшкірного (s.c.) введення, внутрішньошкірного (i.d.) введення, внутрішньочеревного (i.p.) введення, внутрішньом'язового (i.m.) введення. Переважними способами введення пептиду є s.c., i.d., i.p., i.m. та i.v. Можуть вводитися дози від 100 мкг до 100 мг пептиду або ДНК, переважно в діапазоні від 200 мкг і 800 мкг, ще більш переважно в діапазоні від 200 мкг і 600 мкг, і ще більш переважно в діапазоні від 400 мкг і 500 мкг і найбільш переважно біля 413 мкг. Пептидна вакцина може вводитися без ад'юванту. Переважно, якщо пептиди як активні фармацевтичні інгредієнти вводяться у комбінації з ад'ювантом, таким як, наприклад, ІЛ-2, ІЛ12, ГМ-КСФ або повний ад'ювант Фрейнда. Опис найбільш переважних ад'ювантів можна знайти, наприклад, у роботі Brinkman JA, Fausch SC, Weber JS, Kast WM. Peptide-based vaccines for cancer immunotherapy. Expert Opin Biol Ther. 2004 Feb;4(2):181-98. Пептидна вакцина може вводитися також із таким ад'ювантом, як БЦЖ або алюм. До інших прийнятних ад'ювантів можна віднести QS21 стимулон компанії Aquila (Aquila Biotech, Вустер, Масачусетс, США), який отримують із сапоніну, екстракти мікобактерій і синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин і патентовані ад'юванти, такі як Detox компанії Ribi. Може також використовуватися інший ад'ювант, отриманий із сапоніну, Quil A (компанія Superfos, Данія). Можуть також використовуватися такі інші ад'юванти, як CpG-олігонуклеотиди, стабілізовані РНК, іміквімод (комерційно доступний під торговою назвою Aldara® компанії 3M Pharma, США), неповний ад'ювант Фрейнда (комерційно доступний як Montanide ISA-51 компанії Seppic S.A., Париж, Франція) або ліпосомальні композиції. Також може бути прийнятним вводити пептиди, кон'юговані з гемоціаніном фісурели, переважно також, якщо вводити їх разом з ад'ювантом. Вакцину можливо вводити більше ніж один раз. Терапевтично ефективна кількість може становити від 0,20 мг до 5,0 мг, або від 0,025 мг до 1,0 мг, або від 2,0 мг до 5,0 мг пептиду або комбінації. Переважно, якщо вищезгаданий пептид або комбінація вводиться повторно, наприклад, щомісяця, щотижня або раз на два тижні. Вакцинація приводить до відповіді цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ), стимульованих професійними антиген-презентуючими клітинами. Після примування ЦТЛ може виникати позитивний ефект підвищеної експресії комплексу MHC у клітинах пухлин. Може також бути корисним націлювати вакцину на конкретну популяцію клітин, наприклад, на антигенпрезентуючі клітини або за рахунок вибору місця ін'єкції, використання націлених векторів і систем доставки, або селективною очисткою такої популяції клітин, отриманих у пацієнта, і введенням пептиду ex vivo (наприклад, дендритні клітини можуть бути розсортовані згідно з описом у роботах Zhou et al (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651). Відповідно до іншого важливого аспекту цього винаходу, пептид чи комбінація пептидів (наприклад, вакцини) відповідно до цього винаходу вводяться в організм хазяїна або самостійно, або в комбінації з іншим протираковим препаратом, переважно з метою інгібування або пригнічення утворення пухлин. Пептиди і комбінації відповідно до цього винаходу можуть використовуватися по відношенню до ракових захворювань, які можуть включати рак легенів, голови та шиї, рак молочної залози, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирки, рак стравоходу, рак кісток, рак яєчка, рак шийки матки, рак шлунково-кишкового тракту, гліобластому, лейкемію, лімфоми, лімфому з клітин мантійної зони, передракові захворювання легенів, рак товстої кишки, меланому, рак сечового міхура та інші неопластичні захворювання. Переважними є рак нирки, рак товстої кишки або гліобластома. З метою підвищення ефективності терапії пептидами та комбінаціями відповідно до цього винаходу може бути бажаним комбінувати композиції з іншими препаратами, ефективними при лікуванні цих захворювань і станів. Наприклад, лікування хворих на рак може здійснюватися з застосуванням пептидів і комбінацій відповідно до цього винаходу та інших засобів для лікування раку, таких як протиракові препарати. Таким чином, використання згідно з винаходом може додатково включати лікування пацієнта другим протираковим препаратом, де другий протираковий препарат є терапевтично активним поліпептидом, нуклеїновою кислотою, що кодує терапевтично активний поліпептид, хіміотерапевтичним препаратом, імунотерапевтичним препаратом або радіотерапевтичним препаратом. Другий протираковий препарат може бути введений одночасно з вакциною або в інший час ніж вакцина, переважно у вигляді однієї дози до введення вакцини. Особливо переважним є застосування пептиду або комбінації відповідно до винаходу, яке додатково включає лікування принаймні одним хіміотерапевтичним препаратом, таким як, 8 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, препарат, що інактивує та/або знищує CD4+CD25+T-клітини у згаданого пацієнта, переважно CD4+CD25hi FOXP3+CD127lo Т-клітини, таким як, наприклад, циклофосфамід. Також переважним є застосування пептиду або комбінації відповідно до винаходу, де згадане лікування згаданим принаймні одним хіміотерапевтичним препаратом має місце до введення згаданого пептиду чи комбінації, і переважно, якщо його вводять одноразово. Особливо переважним є застосування пептиду або комбінації відповідно до винаходу, де згадане лікування згаданим принаймні одним хіміотерапевтичним препаратом має місце до введення згаданого пептиду чи комбінації, і переважно, якщо його вводять одноразово, таким 2 як, наприклад, циклофосфамід у дозі 300 мг/м , переважно шляхом одноразового вливання. Переважним також є застосування пептиду або комбінації відповідно до винаходу, де згадане лікування є ад'ювантною терапією після попередньої терапії інгібіторами тирозинкінази (TKI), такими як, наприклад, сунітиніб або сорафеніб, та/або попередньої терапії цитокінами, такими як, наприклад, інтерферон або інтерлейкін. Найбільш переважним є застосування пептиду або комбінації відповідно до винаходу, де згадане лікування включає терапію цитокінами з послідуючим введенням однієї дози циклофосфаміду, з послідуючим введенням вакцини у вигляді попереднього етапу введення на 1-му тижні з вакцинацією у дні 1, 2, 3, 7, і потім раз у два тижні протягом принаймні 6 місяців. "Протираковий" препарат здатний негативно впливати на захворювання на рак у пацієнта, наприклад, шляхом знищення ракових клітин, індукції апоптозу ракових клітин, зниження швидкості росту ракових клітин, зменшення частоти виникнення і кількості метастазів, зменшення розміру пухлини, інгібування росту пухлини, зменшення кровопостачання пухлини або ракових клітин, сприяння імунній відповіді на ракові клітини або на пухлину, попередження або інгібування прогресії ракового захворювання або збільшення тривалості життя хворого на рак. Переважні протиракові препарати включають хіміотерапевтичні препарати. У контексті цього винаходу припускається, що терапія пухлино-асоційованими HLA-рестриктованими пептидами з використанням пептиду або комбінації за винаходом може так само застосовуватися у комбінації з хіміотерапевтичним лікуванням. Імунотерапевтичним засобом можуть бути ГМ-КСФ, ліганд CD40, моноклональні антитіла протиCD28, моноклональні антитіла проти CTL-4, моноклональні антитіла проти 4-1BB (CD137) і олігонуклеотид. Хіміотерапевтичним препаратом можуть бути доксорубіцин, даунорубіцин, дактиноміцин, мітоксантрон, цисплатин, прокарбазин, мітоміцин, карбоплатин, блеоміцин, етопозид, теніпозид, мехлоретамін, циклофосфамід, іфосфамід, мелфалан, хлорамбуцил, гексаметилмеламін, тіопета, бусульфан, кармустин, ломустин, семустин, стрептозоцин, дакарбазин, адріаміцин, 5-фторурацил (5FU), камптотецин, актиноміцин-D, пероксид водню, нітрозосечовина, плікоміцин, тамоксифен, таксол, трансплатин, вінкристин, вінбластин, антитіло проти рецептору TRAIL Rl або R2 або його агоніст, доластатин-10, бріостатин, аннаміцин, Мілотарг®, фенілацетат натрію, бутират натрію, метотрексат, децитабін, іматинібу мезилат (Gleevec®), інтерферон-альфа, бевацизумаб, цетуксимаб, талідомід, бортезоміб, гефітиніб, ерлотиніб, азацитидин, 5-aza-2'-дезоксицитидин, ревлімід, 2C4, антиангіогенічний фактор; засіб, що націлений на сигнальну трансдукцію; інтерферон-гамма, ІЛ-2 та ІЛ-12. Можуть застосовуватися різні комбінації, наприклад, якщо пептид або комбінацію або відповідну вакцину позначити як "A", а додатковий препарат – як "B": A/B/A, B/A/B, B/B/A, A/A/B, A/B/B, B/A/A, A/B/B/B, B/A/B/B, B/B/B/A, B/B/A/B, A/A/B/B, A/B/A/B, A/B/B/A, B/B/A/A, B/A/B/A, B/A/A/B, A/A/A/B, B/A/A/A, A/B/A/A, A/A/B/A. Введення пацієнтові пептиду або комбінації відповідно до цього винаходу здійснюється згідно із звичайним протоколом введення цього конкретного додаткового препарату з урахуванням токсичності, якщо вона має місце, лікування пухлино-асоційованими HLA-рестриктованими пептидами. Передбачається, що терапевтичні цикли у разі необхідності можуть повторюватися. Також береться до уваги, що різні стандартні терапевтичні методи, так само як і хірургічне втручання, можуть застосовуватися в комбінації для зазначених ракових клітин. Проте переважним є одноразове введення дози як описано далі. Переважно, крім цього, якщо моноклональні антитіла людини застосовуються як пасивна імунотерапія, оскільки у пацієнта вони викликають невелику кількість побічних ефектів або не викликають їх взагалі. Пептиди (принаймні такі, що містять пептидні зв'язки між амінокислотними залишками) можуть бути синтезовані Fmoc-поліамідним методом твердофазного синтезу пептидів, як це розкрито у роботі Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 і в посиланнях, що є в ній. Тимчасовий захист N-аміногрупи забезпечується 9-флуоренілметилоксикарбонільною (Fmoc) групою. Повторювальне розщеплення цієї дуже нестійкої до дії луг захисної групи здійснюється за допомогою 20 % розчину піперидину у N, N-диметилформаміді. Можна захистити функціональні 9 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 групи бокових ланцюгів, якщо отримати такі сполуки, як бутилові етери (у випадку серину, треоніну та тирозину), бутилові естери (у випадку глутамінової кислоти і аспарагінової кислоти), бутилоксикарбонільне похідне (у випадку лізину і гістидину), тритильне похідне (у випадку цистеїну) і 4-метокси-2,3,6-триметилбензосульфонільне похідне (у випадку аргініну). У сполуках, в яких С-термінальними залишками є глутамін або аспарагін, для захисту амідогруп бокових ланцюгів використовують 4,4'-диметоксибензгідрильну групу. Основою твердофазного носія є полідиметилакриламідний полімер, що складається з трьох мономерів: диметилакриламіду (каркасний мономер), біс-акрилоїлетилендіаміну (компонент для перехресного зшивання) і акрилоїлсаркозинметилового естеру (функціоналізуючий агент). Як агент, що утворює зв'язок пептиду і смоли і який піддається розщепленню, використовується нестійке до дії кислот похідне 4-гідроксиметилфеноксиоцтової кислоти. Всі амінокислотні похідні додають у вигляді заздалегідь синтезованих похідних симетричних ангідридів, за винятком аспарагіну і глутаміну, які додають з використанням зворотної N,N-дициклогексилкарбодіімід/гідроксибезотриазолопосередкованої реакції сполучення. Усі реакції сполучення і зняття захисту відслідковували за допомогою методів контролю з використанням нінгідрину, тринітробензолсульфонової кислоти і ізотину. Після завершення синтезу пептиди відщеплюють від смоли-носія з супутнім видаленням захисних груп бокових ланцюгів шляхом обробки 95 % трифтороцтовою кислотою, що містить 50 % суміші поглиначів. Зазвичай використовувані поглиначі включають етандитіол, фенол, анізол і воду, конкретний вибір залежить від амінокислотних складових пептиду, що синтезується. Для синтезу пептидів можливе також використання комбінації твердофазних і рідкофазних методик (див., наприклад, Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb;5(1):29-43 і посилання, наведені в цій роботі). Трифтороцтову кислоту видаляють випаровуванням у вакуумі з подальшим подрібнюванням із діетиловим етером, що забезпечує отримання сирого пептиду. Будь-які поглиначі, які присутні в матеріалі, видаляються простою процедурою екстракції, яка після ліофілізації водної фази дозволяє отримати сирий пептид, вільний від поглиначів. Реагенти для синтезу пептидів, як правило, можна придбати, наприклад, у компанії Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Велика Британія. Очищення може виконуватися за допомогою будь-якого одного методу або їхньої комбінації, таких як ексклюзійна хроматографія, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії та (зазвичай) зворотно-фазова високоефективна рідинна хроматографія із градієнтним елююванням у системі ацетонітрил/ вода. Аналіз пептидів може виконуватися за допомогою тонкошарової хроматографії, зворотнофазової високоефективної рідинної хроматографії, амінокислотного аналізу після кислотного гідролізу та мас-спектрометрії з бомбардуванням прискореними атомами (FAB), а також масспектрометричного аналізу MALDI та ESI. Зрозуміло, що певні клітини-хазяї здатні синтезувати пептиди за винаходом, наприклад, клітини бактерій, дріжджів і комах. Проте в певних терапевтичних методах можуть використовуватися інші клітини-хазяї. Наприклад, антиген-презентуючі клітини, такі як дендритні клітини, можуть принагідно використовуватися, щоби експресувати пептиди за винаходом, які можуть бути навантажені на відповідні молекули MHC. Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується використання пептиду або комбінації відповідно до цього винаходу для отримання активованих цитотоксичних Тлімфоцитів (ЦТЛ) in vitro, який включає контактування ЦТЛ з навантаженими пептидом або комбінацією молекулами MHC людини I або II класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації згаданого ЦТЛ у антиген-специфічний спосіб. Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується спосіб знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить амінокислотну послідовність відповідно до цього винаходу, причому спосіб включає введення в організм пацієнта ефективної кількості пептиду відповідно до цього винаходу або ефективної кількості полінуклеотиду чи вектору експресії, що кодує згаданий пептид, де кількість згаданого пептиду або кількість згаданого полінуклеотиду чи вектору експресії є такою, що забезпечує їхню ефективність щодо стимулювання імунної реакції проти клітин-мішеней в організмі згаданого пацієнта. Клітиною-мішенню зазвичай є клітина пухлини або ракова клітина. Зрозуміло, що щодо способів знищення клітин-мішеней у пацієнта особливо переважно, щоби клітинами-мішенями були ракові клітини згідно з наведеним вище, більш переважно – клітини раку нирки або товстої кишки. 10 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується, зокрема, застосування пептидів за винаходом для активної вакцинації in vivo; для проведення маніпуляцій з аутологічними дендритними клітинами in vitro, яке супроводжується введенням підданих таким маніпуляціям дендритних клітин in vivo з метою активації відповіді ЦТЛ; для активації аутологічних ЦТЛ in vitro, яка супроводжується адоптивною терапією (а саме, піддані таким маніпуляціям ЦТЛ вводять в організм пацієнта); і для активації ЦТЛ, отриманих від здорових донорів (сумісних чи несумісних за MHC) in vitro, яка супроводжується адоптивною терапією. Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується використання пептиду або комбінації відповідно до винаходу як діагностичного засобу для виявлення та/або моніторингу активації чи модуляції імунної системи пацієнта. Згідно з цим аспектом, пептиди можуть використовуватися для виявлення відповіді на протиракову терапію, зокрема, терапію без використання пептидів, або будь-яке іншу прийнятну терапію, що приводить до активації або модуляції імунної системи. Для цілей діагностики пептиди можуть бути мічені. Крім того, можуть також використовуватися антитіла проти пептидів (або комбінацій). Діагностику можна здійснювати in vivo або in vitro. Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується використання пептиду або комбінації відповідно до винаходу як діагностичного засобу для діагностики раку. По суті, присутність пептидів або їхньої комбінації в організмі пацієнта свідчить про рак. Наприклад, ще до вакцинації були виявлені відповіді на CCN-001 і CEA-004 у деяких пацієнтів, хворих на рак. Знову ж таки, для цілей діагностики пептиди можуть бути мічені. Крім того, можуть також використовуватися антитіла проти пептидів (або комбінацій). Діагностику можна здійснювати in vivo або in vitro. Термін "виділений" стосується матеріалу, який значною мірою або по суті є вільним від компонентів, які зазвичай супроводжують матеріал у тому стані, в якому він знаходиться в природі. Таким чином, виділені пептиди відповідно до винаходу переважно не містять матеріалів, зазвичай зв'язаних з пептидами в їх оточенні in situ. Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується пептид, що містить послідовність, вибрану з групи SEQ ID No. 5 або SEQ ID No. 6, або його варіант, який принаймні на 85 % є гомологічним послідовності SEQ ID No. 5 або SEQ ID No. 6, або його варіанту, який викликає перехресну реакцію Т-клітин зі зазначеним варіантом пептиду, де згаданий пептид не є відповідним (базовим) повнорозмірним поліпептидом. Переважно, якщо згаданий пептид вибраний з підгрупи пептидів, що є специфічними до HLA, такий як HLA-A*02. Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується нуклеїнова кислота, що кодує пептид відповідно до SEQ ID No. 5 чи SEQ ID No. 6 або його варіант за винаходом або вектор експресії, здатний експресувати згадану нуклеїнову кислоту. В іншому аспекті цей винахід стосується клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту чи вектор експресії за винаходом, де згадана клітина-хазяїн переважно є антиген-презентуючою клітиною, зокрема, дендритною клітиною або антиген-презентуючою клітиною. В іншому аспекті цей винахід стосується способу продукування активованих цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) in vitro, що включає контактування ЦТЛ in vitro з навантаженими антигенами молекулами MHC людини I, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини або штучної конструкції, яка імітує антиген-презентуючу клітину, протягом періоду часу, достатнього для активації згаданого ЦТЛ у антиген-специфічний спосіб, де згаданий антиген є пептидом з послідовністю відповідно до SEQ ID No. 5 або SEQ ID No. 6 за винаходом. В ще одному аспекті цей винахід стосується комплекту, що містить: (a) контейнер, що містить фармацевтичну композицію, яка містить пептид відповідно до SEQ ID No. 5 або SEQ ID No. 6 за винаходом, нуклеїнову кислоту або вектор експресії за винаходом, клітина за винаходом або активований цитотоксичний Т-лімфоцит за винаходом, у формі розчину або у ліофілізованій формі; (b) необов'язково, другий контейнер, що містить розріджувач або розчин для відновлення для ліофілізованої композиції; (c) необов'язково, принаймні один пептид, вибраний із групи, що складається з пептидів відповідно до SEQ ID NO від 1 до 4 та від 7 до 26, і (d) необов'язково, інструкцію для застосування розчину, і/або відновлення, і/або застосування ліофілізованої композиції. В ще одному аспекті цей винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язується з молекулою головного комплексу гістосумісності (MHC) людини класу I, яка входить до складу комплексу з антигенами, рестриктованими за HLA відповідно до SEQ ID No. 5 або SEQ ID No. 6 за винаходом, де антитіло переважно є поліклональним антитілом, моноклональним антитілом і/або хімерним антитілом. 11 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується спосіб лікування ракового захворювання, який базується на застосуванні пептиду, або комбінації, або вакцин як описано вище. Інші цілі, ознаки і переваги цього винаходу стануть зрозумілими з наведених нижче прикладів. Слід, проте, зрозуміти, що конкретні приклади, хоча описують переважні втілення винаходу, наведені лише для ілюстрації, оскільки різні зміни та модифікації в межах об'єму і сутності винаходу стануть зрозумілими фахівцю в цій галузі з цього детального опису. Для цілей цього винаходу всі посилання включені в цей документ в усій повноті. На Фігурах На Фігурі 1 показана амінокислотна послідовність цикліну D1 відповідно до SEQ ID No. 27 з розташуванням пухлино-асоційованих пептидів за винаходом, виділених товстим шрифтом. На Фігурі 2 зображено середнє значення для надмірної експресії CCND1 у клітинах раку нирки (ccRCC) відносно середнього значення експресії у нормальних тканинах (Фігура 2А), що воно є в 3,0 рази вищим (дані щодо експресії відповідно до набору даних 1). Окремо наведені результати аналізу для первинних пухлин, які є у 5,7 разів вищими, і для метастазів, що є у 5,4 рази вищими (Фігура 2В, дані щодо експресії відповідно до незалежного набору даних 2). 60 % первинних пухлин виявили надмірну експресію у порівнянні з нормальними тканинами нирки (Фігура 2А, чорні стовпці, позначені "I" від англ. "increased" (підвищена) вище стовпця). На Фігурі 3 показані кращі PFS (виживання без прогресування) (A) і загальне виживання (OS) (B) для пацієнтів, що були вакциновані IMA901 після попередньої терапії цитокінами (пунктирні лінії), у порівнянні з пацієнтами, що пройшли попередню терапію інгібіторами тирозинкінази (суцільні лінії). На Фігурі 4 наведено загальне виживання (OS) для пацієнтів, які отримували вакцину IMA901, що містить CCN-001, (як це описано, наприклад, у заявці EP1760089, яка включена в даний документ шляхом посилання), у порівнянні з пацієнтами, що лікувалися препаратами Sutent® (A) і Nexavar® (B) як препаратами 2-ої лінії після терапії цитокінами. На Фігурі 5 наведено зменшення кількості регуляторних Т-клітин у групі пацієнтів, які попередньо отримували циклофосфамід (+CY). Абсолютна кількість показана на (А), відсоток зміни у порівнянні з вихідним рівнем показаний на (В). Фігура 6 свідчить про те, що пацієнти, які демонструють терапевтичну відповідь на CCN-001, мають значно більші терміни виживання, ніж пацієнти, що не відповідають на CCN-001 (А). Такий сприятливий ефект від відповіді Т-клітин на CCN-001 виявився навіть більш очевидним у групі пацієнтів, які попередньо отримували циклофосфамід (В). На Фігурі 7 зображена відповідь на введення вакцини, що містить CCN-001. Пацієнтів імунізували у різні часові точки пептидним коктейлем IMA910 (як це описано, наприклад, у заявці WO2009/015841, яка включена в даний документ шляхом посилання) у присутності ГМКСФ (Когорта 1) або ГМ-КСФ + іміквімод (Когорта 2). Імунні відповіді на пептиди, що зв'язують HLA-A*0201, досліджували методом імунного моніторингу, аналізом мультимерів. Після цього PBMC (мононуклеари периферичної крові) пацієнтів були сенсибілізовані in vitro і проаналізовані методом проточної цитометрії та забарвлювання мультимерів. A) Рівень імунної відповіді на CCN-001 для усіх (чорний колір) пацієнтів або пацієнтів, що пройшли лікування без (світло-сірий) і з (темно-сірий) іміквімодом. Стовпці показують відносну кількість пацієнтів із відповіддю на введення вакцини, що містить CCN-001. В) Типова картина імунної відповіді пацієнта на CCN-001 до (зліва) і після (справа) вакцинації. Послідовності від SEQ ID NO. 1 до SEQ ID NO. 26 показують пептиди відповідно до контексту цього винаходу Послідовності SEQ ID No. 5 і SEQ ID No. 6 показують пептиди, отримані з цикліну, відповідно до цього винаходу. Послідовність SEQ ID No. 27 показує амінокислотну послідовність цикліну D1. Приклади Ідентифікація і характеристика пептидів відповідно до цього винаходу Зазвичай пептиди відповідно до цього винаходу ідентифікували за допомогою технології XPRESIDENT® згідно з описами (див., наприклад, Weinschenk et al. Integrated Functional Genomics Approach for the Design of Patient-individual Antitumor Vaccines, CANCER RESEARCH 62, 5818–5827, October 15, 2002) з використанням клітин раку нирки. Середнє значення для надмірної експресії цикліну D1 (CCND1) у клітинах ccRCC відносно середнього значення експресії у нормальних тканинах було в 3,0 рази вищим, і в 5,7 разів вищим у первинних пухлинах, і у 5,4 рази вищим у метастазах. 55 % первинних пухлин виявили надмірну експресію у порівнянні з нормальними тканинами нирки. HLA-обмеження пептидів за винаходом 12 UA 110473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Шаблонні розрахунки за допомогою комп'ютерної програми SYFPEITHI прогнозують для CCN-001 і CCN-002 суттєве зв'язування з HLA A*02 (Rammensee et al., 1997; Rammensee et al., 1999). Суттєве зв'язування CCN-001 з HLA A*0201 було підтверджено при використанні методу аналізу типу ELISA (Sylvester-Hvid et al., 2002). Що стосується CCN-004, було виявлено значне зв'язування з HLA-A*26 і практична відсутність зв'язування з HLA-A*02. Для пептиду CCN-006 прогнозується лише слабке зв'язування з HLA-A*02. Дійсно, очевидно, що CCN-006 здатний зв'язувати HLA-A*68. Новий пептид CCN-007 здатний на помірне зв'язування з HLA A*02. CCN-003 зв'язує молекулу HLA II класу і, таким чином, є рестриктованим за DRB1*0401. Для наступного клінічного дослідження був вибраний пептид CCN-001. Однак фахівцю в цій галузі зрозуміло, що можуть також використовуватися всі інші пептиди або їхня комбінація відповідно до цього опису, і що за необхідності ці приклади можна легко скорегувати відповідно до цих пептидів або до комбінації з їхнім використанням, як описано в цьому документі. Клінічне дослідження з використанням пептидів і комбінація за винаходом Деякі пацієнти отримували попередню терапію TKI, такими як сунітиніб або сорафеніб, інші – попередню терапію цитокінами, такими як інтерферон або інтерлейкін. Потім були сформовані 2 дві групи пацієнтів, одна з яких отримувала циклофосфамід (300 мг/м ) шляхом одноразового вливання до введення вакцини, що містить один із пептидів, отриманих із цикліну D1 (в цьому випадку вакцини IMA901 компанії Immatics Biotechnologies, яка містить CCN-001, 17 вакцинацій протягом 9 місяців), а друга група – не отримувала циклофосфамід до введення вакцини, що містить один із пептидів, отриманих із цикліну D1 (знову ж таки, IMA901, 17 вакцинацій протягом 9 місяців). Проводилося спостереження пацієнтів обох груп щодо виживання без прогресування (PFS) і загального виживання (OS). Результати дослідження Було показано, що загалом вакцина безпечна і дуже добре переноситься пацієнтами. Єдиним загальним несприятливим ефектом була місцева реакція в місці введення. Коефіцієнт контролю захворювання (DCR) в точці 6 місяців відповідав очікуванням (тобто ефект у пацієнтів, що пройшли терапію цитокінами, який оцінювали як DCR, перевищував 30 % в точці 6 місяців, що за протоколом дослідження вважалося клінічно достовірним ефектом). Вакцина, що містить пептид, отриманий із цикліну, продемонструвала краще OS, ніж інші препарати 2-ої лінії після терапії цитокінами (препаратами Sutent® або Nexavar®). Кращі показники PFS і OS були отримані для пацієнтів після попередньої терапії цитокінами у порівнянні з пацієнтами, що пройшли попередній курс терапії TKI. Аналіз виживання без прогресування (PFS) свідчить про відтермінований позитивний ефект у порівнянні з групою плацебо в іншому дослідженні. Виявляється, що загальне виживання (OS) було довшим у порівнянні з даними для TKI (тобто сорафінібом і сунітинібом у терапії другої лінії метастатичної нирково-клітинної карциноми). Спостерігалася виражена кореляція імунних відповідей на поліпептидну вакцину з показником OS у популяції в цілому. Неочікуваним був той факт, що попередня терапія низькими дозами циклофосфаміду додатково помітно покращувала результат лікування із застосуванням вакцини. Як очікувалось, низькі дози циклофосфаміду знижували кількість регуляторних Т-клітин. Порівняння виживаності пацієнтів, які демонстрували відповідь на CCN-001, з пацієнтами, що не відповідали на CCN-001, показало значно більші терміни виживання пацієнтів, у яких відповідь на CCN-001 могла бути спричинена вакцинацією. Такий сприятливий ефект на відповідь Т-клітин на CCN-001 виявився навіть більш очевидним у групі пацієнтів, які попередньо отримували циклофосфамід. 13 UA 110473 C2 14 UA 110473 C2 15 UA 110473 C2 16 UA 110473 C2 17 UA 110473 C2 18 UA 110473 C2 19 UA 110473 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 1. Спосіб одержання активованих цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) in vitro, де зазначений спосіб включає контактування ЦТЛ з пептидом, який складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NО:6, навантаженим на молекули МНС людини І або II класу, що експресуються на поверхні придатної антигенпрезентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації згаданих ЦТЛ у антигенспецифічний спосіб. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що ЦТЛ одержують від пацієнта, хворого на рак. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що ЦТЛ одержують від здорових донорів. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додатково включає контактування ЦТЛ з принаймні одним пухлиноасоційованим пептидом, який не походить з цикліну D1. 20 UA 110473 C2 21 UA 110473 C2 22 UA 110473 C2 23 UA 110473 C2 24 UA 110473 C2 25 UA 110473 C2 26 UA 110473 C2 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 27