Спосіб лікування молодих свиней за допомогою антигену pcv2

Реферат: У даній заявці описаний спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, які мають антитіла до PCV2, шляхом одноразового введення лише однієї дози зазначеного антигену PCV2, де зазначений антиген PCV2 є рекомбінантним білком ОРС-2 PCV2. Переважно вказані тварини є свинями, що не досягли статевої зрілості, або молодими поросятами. UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Посилання на родинну заявку По дійсній заявці клопоче пріоритет відповідно до попередньої заявки на патент США серійний номер 60/870311, подано] 15 грудня 2006 р., суть і вміст якої включені в дійсний опис як посилання. Перелік послідовностей У дійсну заявку входить перелік послідовностей в паперовій і електронній версії, суть і вміст яких включені в дійсний опис як посилання. Перелік послідовностей ідентичний включеному в WO 06/072065. Передумови створення винаходу Галузь техніки, до якої відноситься винахід Дійсний винахід належить до застосування імуногенної композиції, яка містить антиген, що є цирковірусом свиней типу 2 (PCV2), яка призначена для попередження, зменшення серйозності клінічних ознак, зменшення кількості випадків інфекції і/або клінічних ознак, і лікування декількох клінічних проявів у тварин, що мають специфічні відносно PCV2 антитіла. Переважно вказані специфічні відносно PCV2 антитіла є антитілами, отриманими від матері. Опис відомого рівня техніки Цирковірус свиней типу 2 (PCV2) є невеликим (діаметром 17-22 нм) ДНКовим вірусом з ікосаедральною структурою, що не має оболонки, який несе одноланцюговий циклічний геном. Послідовність PCV2 приблизно на 80 % ідентична послідовності цирковірусу свиней типу 1 (PCVl). Проте в даний час встановлено, що на відміну від PCVl, який, як правило, є невірулентним, зараження свиней PCV2 асоціюється з рядом хворобливих синдромів, які в цілому означають як асоційовані з цирковірусом хвороби свиней (PCVAD) (відомі також як хвороби свиней, пов'язані з цирковірусом (PCVD)) (Allan та ін., IPVS Congress, 2006). Як правило, основним клінічним проявом PCVAD вважається синдром післяот'ємного мультисистемного виснаження (PCVD) (Harding та ін., Swine Health Prod; 5, 1997 сс. 201-203; Kennedy та ін., J Comp Pathol; 122, 2000, сс. 9-24). PCVD уражує свиней віком 5-18 тижнів. З клінічної точки зору PCVD характеризується виснаженням, блідістю шкіри, худосочністю, респіраторним дистрес-синдромом, діареєю, жовтяницею новонароджених і жовтяницею. У деяких уражених захворюванням свиней виявляється комбінація всіх симптомів, тоді як у інших свиней виявляються лише один або два з вказаних симптомів (Muirhead, Vet. Rec., 150, 2002, с. 456). При розтині трупа виявляють також мікроскопічні і макроскопічні пошкодження багатьох тканин і органів, причому найчастіше пошкодження зустрічаються в лімфоїдних органах (Allan і Ellis, J Vet. Diagn. Invest., 12, 2001, сс. 3-14). Виявлена виражена кореляція між кількістю нуклеїнової кислоти або антигеном PCV2 і серйозністю мікроскопічних лімфоїдних пошкоджень. Рівні смертності у свиней, уражених PCV2, можуть досягати 80 %. Окрім PCVD з PCV2 зв'язані декілька інших інфекцій, включаючи псевдосказ, репродуктивно-респіраторний синдром свиней (PRRS), хворобу Глассера, стрептококовий менінгіт, сальмонельоз, коли-бактеріоз от'ємишей, пов'язаний з кормом гепатоз і гнійну плевропневмонію. Проте до теперішнього часу відсутні дослідження, які підтверджують, що всі ці клінічні симптоми дійсно є безпосереднім результатом зараження PCV2. Крім того, поки не відомо, чи можна які-небудь вказані клінічні симптоми ефективно знижувати або виліковувати за допомогою діючих речовин, що надають безпосередню дію на PCV2. Підходи до лікування інфекцій, що викликаються PCV2, засновані на застосуванні ДНКвакцини, описані в US 6703023. У WO 03/049703 описано одержання живої химерної вакцини, що містить каркас PCV-1, в якій ген каркаса PCV-1 замінений на імуногенний ген патогенних штамів PCV2. У WO 99/18214 описано декілька штамів PCV2 і процедури одержання убитої вакцини проти PCV2. Проте відсутні дані про їх ефективність. Ефективна субодинична вакцина на основі ОРС-2 (відкритої рамки прочитування 2) описана в WO 06/072065 і WO 2007/028823. Будь-яка з вказаних вакцин призначена для застосування з метою вакцинації/лікування свиней або молодих свиней (свиней, що не досягли статевої зрілості) старше за 3 тижні. Ні для однієї з вказаних вакцин не вказана можливість застосування на молодих поросятах віком менше 3 або 2 тижнів. Встановлено, що отриманий від матері імунітет забезпечує певну міру захисту від інфекції, що викликається, і клінічних станів PCV2, пов'язаних з PCV2-інфекцією. Встановлено, що вказаний захист залежить від титру антитіл: як правило, вищі титри забезпечують захисну дію, а при нижчих титрах вона відсутня (McKeown та ін., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12, 2005, сс. 13471351). Встановлено, що середній час напівжиття антитіл в тварин-от’ємишей складає 19,0 днів і вікно розпаду пов'язаних з пасивною імунізацією антитіл до PCV2 в популяції є відносно широким (Opriessnig та ін., J. Swine Health Prod. 12, 2004, сс. 186-191). Встановлено, що при низьких титрах розпад антитіл до PCV2, присутність яких у тварин віком 10-12 днів пов'язана з 1 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пасивною імунізацією, відбувається при досягненні тваринами віку приблизно 4,9 + 1,2 тижнів, при середніх титрах антитіла розпадаються досягши віку приблизно 8,1+1,9 тижнів, а при високих титрах антитіла розпадаються досягши віку приблизно 11,1+2,5 тижнів (Opriessnig та ін., 37-th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians (37-й Щорічний з'їзд американської асоціації з ветеринарії свиней), 2006 р.). Виявлена тісна кореляція між зниженням титрів антитіл і появою перших клінічних ознак PCVAD, які виникають у поросят у віці приблизно 5-12 тижнів (Allan та ін., Vet. Diagn. Investigation, 12, 2000, сс. 3-14). Крім того, PCV2 був виділений також з лімфатичних вузлів новонароджених поросят (Hirai та ін., Vet. Record, 148, 2001, сс. 482-484), що свідчить про те, що навіть молодші поросята можуть уражуватися PCVAD у відсутності титрів захисних материнських антитіл. Виражена кореляція між титром антитіл і захисною дією встановлена в досліді, проведеному в польових умовах в Іспанії: поросята, що мають низькі титри антитіл в 7-тижневому віці (середній титр антитіл 1:100, діапазон від 0 до 1:320), відрізнялися істотно вище коефіцієнтом смертності протягом наступних 5 тижнів, ніж тварини з вищими титрами антитіл (Rodriguez-Arrioja та ін., Am. J Vet. Res. 63, 2002, сс. 354-357). Присутність отриманих від матері антитіл не лише може забезпечувати певну міру захисту від вірусної інфекції, що проте є непрогнозованим, але так само, як відомо, впливає на ефективність імунізації. Наприклад, вищі титри отриманих від матері антитіл до класичного вірусу лихоманки свиней (CSFV) інгібують як клітинну, так і гуморальну імунну відповідь на вакцину проти CSFV, а при нижчих титрах не виявлено значної дії (Suradhat і Damrongwatanapokin, Vet. Microbiol, 92, 2003, сс. 187-194). Крім того, було висловлено припущення, що живі вакцини проти PCV2 повинні працювати ефективніше при їх введенні поросятам старше 7 або 8 тижнів, оскільки до цього часу материнські антитіла в основному розпадаються. На взаємодію з материнськими антитілами впливає тип імунної відповіді (Th1 або Th2), що викликається, яка залежить (серед іншого) від типу вакцини, типу антигена, типу ад'юванта, а також кількості введеного антигена. Отже, можна передбачити, що взаємодія з материнськими антитілами може бути різною для різних вакцин, навіть якщо вони захищають від одного і того ж патогена. В цілому, отримані від матері антитіла до PCV2 можуть забезпечувати певну міру захисту від PCV2, але, з іншого боку, ці антитіла можуть впливати на ефективність будь-якої вакцини проти PCV2. Захист тварин шляхом активної імунізації ускладнюється також тією обставиною, що а) час розпаду отриманих від матері антитіл (MDA) варіюється від тварини до тварини і б) багато хвороб виникають незабаром після розпаду антитіл. З врахуванням цієї проблеми в декількох стратегіях передбачається застосування двох режимів вакцинації шляхом уприскування для молодих тварин: першу вакцинацію здійснюють на ранній стадії життю для захисту тварин з низькими титрами MDA. Вважається, що ця перша вакцинація може не володіти ефективністю для тварин з високими титрами MDA через взаємодію з антигеном вакцини. Для того, щоб здійснювати захист також і цих тварин, потрібна друга вакцинація, коли очікується, що високі титри MDA вже знизилися. Цього типу схеми вакцинації застосовують в разі вакцин для багатьох дрібних тварин (наприклад, вакцин проти парвовірусів кішок, гепатиту кішок), вакцин для коней (наприклад, вакцин проти кінського грипу) і вакцин для свиней (наприклад, проти Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis). Оскільки виникнення PCVAD у тварин віком 5 тижнів або старше, ймовірно, пов'язано з розпадом антитіл до PCV2, що, як відомо, відбувається у тварин віком 4-11 тижнів, описані деякі засновані на застосуванні вакцин підходи до захисту від PCVAD, в яких застосовують два режими вакцинації шляхом уприскування для того, щоб уникнути можливої взаємодії з материнськими антитілами. У WO 2007/028823 описана вакцинація поросят, які мають отримані від матері антитіла до PCV2, з використанням більше 20 мкг антигена/дозу за допомогою описаного режиму двох вакцинацій шляхом уприскування. Початкову вакцинацію здійснюють у віці від 1 до 4 тижнів. Всіх тварин повторно вакцинують через три тижні після початкової вакцинації, коли отримані від матері антитіла у тварин з високими титрами MDA у момент першої вакцинації, повинні знизитися або зникнути. Таким чином, поки відсутня інформація, що стосується точної дії отриманих від матері антитіл до PCV2 на міру захисту або взаємодії. З цієї причини рекомендовано не вакцинувати поросят віком до трьох (3) тижнів з використанням щонайменше режиму однієї вакцинації шляхом уприскування. Вакцинація поросят віком менше 3 тижнів пов'язана з деякою мірою невизначеності відносно ефективності імунізації. З іншого боку, поросята з нижчими титрами отриманих від матері антитіл до PCV2, хоча до теперішнього часу нікому не відомі точні значення вказаних низьких рівнів, не мають достатнього захисту від інфекції, PCV2, що викликається, у віці до 3 тижнів. Іншими словами, стада, в яких тварини мають низькі титри MDA, якщо їх не вакцинують у віці до 3 тижнів, мають постійний ризик зараження PCV2 через 2 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відсутність достатнього імунного статусу. Крім того, не описано, що такі вакцини обумовлюють захисний імунітет від зараження PCV2 або зниження, зменшення серйозності, або зцілення будь-яких клінічних симптомів, що асоціюються з ними у молодих свиней, які вже мають антитіла до PCV2, переважно які мають материнські антитіла до PCV2. Короткий опис креслень На кресленнях показано: на фіг. 1 – рівні титрів антитіл до PCV2 до моменту вакцинації; на фіг. 2 – порівняння живої маси тіла у вакцинованих тварин з низькими ( 1:1000) титрами антитіл до PCV2; на фіг. 3 – відмінність в масі тіла у вакцинованих (IVP) тварин в порівнянні з контрольними обробленими плацебо тваринами (CP). Опис винаходу Дійсний винахід дозволяє вирішити властиві прототипам проблеми і він забезпечує виражений прогрес в даній галузі техніки. Основним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, які мають антитіла до PCV2, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, вводять в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, що містить антиген PCV2. При створенні винаходу непередбачувано і несподівано було встановлено, що присутність антитіл до PCV2, отриманих від матері, не впливає на ефективність вакцини, що містить антиген PCV2. Поняття «вакцина» або «імуногенна композиція» (обидва поняття є синонімами) в контексті дійсного опису належить до будь-якої фармацевтичної композиції, яка містить антиген PCV2, при цьому, композицію можна застосовувати для попередження або лікування асоційованого із зараженням PCV2 захворювання або стану у тварини. Переважна імуногенна композиція може індукувати, стимулювати або підвищувати імунну відповідь на PCV2. Під це поняття підпадають як субодиничні імуногенні композиції, описані нижче, так і композиції, які містять убиті (повністю знешкоджувані) або ослаблені і/або інактивовані PCV2. Таким чином, наступним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, які мають антитіла до PCV2, перш за все отримані від матері антитіла до PCV2, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, вводять в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, де імуногенна композиція є субодиничною імуногенною композицією, композицією, що містить убиті (повністю знешкоджувані) або ослаблені і/або інактивовані PCV2. У контексті дійсного опису поняття «Субодинична імуногенна композиція» належить до композиції, яка містить щонайменше один імуногенний поліпептид або антиген, але не всі антигени, що виведені або є гомологами антигена PCV2. Така композиція практично вільна від інтактного PCV2. Таким чином, «субодиничну імуногенну композицію» отримують щонайменше з частково очищених або фракціонованих (переважно практично очищених) імуногенних поліпептидів з PCV2, або їх рекомбінантних аналогів. Субодинична імуногенна композиція може містити субодиницю антигена або антигенів, що представляють інтерес, які практично вільні від інших антигенів або поліпептидів з PCV2, або є фракціонованими. Переважна імуногенна субодинична композиція містить білок ОРС-2 PCV2, описаний нижче. Найбільш переважними є імуногенні субодиничні композиції, які містять будь-який з антигенів PCV2,представлених в WO 06/072065, яка повністю включена в дійсний опис як посилання. Поняття «імунна відповідь» відноситься, але не обмежуючись лише цим, до формування в господарі клітинно- і/або опосередкованої для антитіла імунної відповіді на композицію, що представляє інтерес, або вакцину. Як правило, «імунна відповідь» включає, але не обмежуючись лише ними, одну або декілька з наступних реакцій: виробництво або активацію антитіл, B-клітин, T-клітин-хелперів, T-клітин-супресорів і/або цитотоксичних T-клітин, специфічно направлених на антиген або антигени, включений(і) в композицію, що представляє інтерес, або вакцину. Переважно організм-господар повинен виробляти або терапевтичну, або захисну імунологічну (вторинна імунна відповідь) відповідь так, щоб підвищувалася стійкість до нової інфекції і/або знижувалася клінічна серйозність захворювання. Таку захисну дію можна виявляти або по зниженню рівня або серйозності, або по відсутності описаних вище симптомів, що асоціюються із зараженням господаря PCV2, уповільненню появи вірусу в крові (віремія), зниженню персистентності вірусу, зниженню загального вірусного навантаження і/або зниженню вірусної екскреції. Поняття «антиген» в контексті дійсного опису належить до амінокислотної послідовності, яка 3 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 викликає імунологічну відповідь, описану вище. Антиген в контексті дійсного опису включає повнорозмірну послідовність будь-яких білків PCV2, їх аналогів або їх імуногенних фрагментів. Поняття «Імуногенний фрагмент» означає фрагмент білка, який містить один або декілька епітопів і в результаті цього викликає описану вище імунологічну відповідь. Такі фрагменти можна ідентифікувати за допомогою будь-якого з багаточисельних методів картирування епітопів, добре відомих в даній області (див., наприклад, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, том 66, під ред. Glenn E. Morris, вид-во Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Наприклад, лінійні епітопи можна виявляти, наприклад, здійснюючи конкурентний синтез великої кількості пептидів на твердих підкладках, де пептиди відповідають фрагментам молекули білка, і, піддаючи пептиди взаємодії з антитілами, при цьому пептиди залишаються прикріпленими до підкладок. Такі методи відомі в даній області і описані, наприклад в US 4708871; в Geysen та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 3998-4002; Geysen та ін., Molec. Immunol. 23, 1986, сс. 709- 715. Аналогічно цьому, конформаційні епітопи легко можна ідентифікувати шляхом визначення просторової конформації амінокислот, наприклад, за допомогою рентгенівської кристалографії і 2-мірного ядерного магнітного резонансу (див., наприклад, Epitope Mapping Protocols, вище). Поняття включає також синтетичні антигени, наприклад, поліепітопи, фланкуючі епітопи та інші, отримані рекомбінантними або синтетичними методами антигени (див., наприклад, Bergmann та ін., Eur. J. Immunol. 23, 1993, сс. 2777-2781; Bergmann та ін., J. Immunol. 157, 1996, сс. 3242-3249; Suhrbier A., Immunol, і Cell Biol. 75, 1997, сс. 402-408; Gardner та ін., 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 28 червня-3 липня 1998 р.). Наступним об'єктом винаходу є імуногенна композиція, як вона визначена в контексті дійсного опису, яка найпереважніше містить поліпептид або його фрагмент, який експресується ОРС-2 PCV2. ДНК ОРС-2 PCV2 і білок, які застосовують згідно винаходу для приготування композицій і за допомогою способів, пропонованих у винаході, є висококонсервативний домен в ізолятах PCV2 і тому згідно винаходу будь-яка ОРС-2 PCV2 має бути ефективною як джерело ДНК ОРС-2 PCV і/або поліпептиду. Переважним білком ОРС-2 PCV2 є білок, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 11 в дійсному описі і в WO 06/072065. Іншим переважним поліпептидом ОРС-2 PCV є поліпептид, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 5 в дійсному описі і в WO 06/072065. Проте фахівцям в даній області має бути очевидно, що послідовність може варіюватися в межах 6-10 % відповідно до поняття гомології послідовностей і все ще зберігати антигенні характеристики, які роблять її прийнятною для включення в імуногенні композиції. Антигенні характеристики імунологічної композиції можна оцінювати, наприклад, шляхом експериментів по контрольному зараженню, описаних в прикладі 4 WO 06/072065. Крім того, антигенні характеристики модифікованого антигена все ще зберігаються, коли модифікований антиген обумовлює щонайменше 70 %, переважно 80 %, переважніше 90 % захисного імунітету в порівнянні з білком ОРС-2 PCV2, який кодується полінуклеотидною послідовністю, представленою в SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO:4 в дійсному описі і в WO 06/072065. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованими із зараженням PCV2, у тварин, які мають антитіла до PCV2, перш за все отримані від матері антитіла до PCV2, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, вводять в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, де антиген PCV2 є антигенним білком ОРС-2 PCV2, який обумовлює щонайменше 70 %, переважно 80 %, переважніше 90 % захисного імунітету в порівнянні з білком ОРС-2 PCV2, який кодується полінуклеотидною послідовністю, представленою в SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO:4 в дійсному описі і в WO 06/072065. Переважно білок ОРС-2 PCV2 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 11 або SEQ ID NO: 5 в дійсному описі і в WO 06/072065. У деяких варіантах імуногенні ділянки білка ОРС-2 PCV2 застосовують а якості антигенного компонента в імуногенній композиції, що містить антиген PCV2. Поняття «Імуногенна ділянка» в контексті дійсного опису належить до укорочених і/або таких, що мають заміни форм або фрагментів білка і/або полінуклеотиду ОРС-2 PCV2 відповідно. Переважно такі укорочені і/або такі, що мають заміни форми або фрагменти повинні містити щонайменше 6 суміжних амінокислот з повнорозмірного поліпептиду ОРС-2. Більш переважно укорочені або такі, що мають заміни форми або фрагменти повинні містити щонайменше 10, переважніше щонайменше 15 і ще переважніше щонайменше 19 суміжних амінокислот з повнорозмірного поліпептиду ОРС-2. PCV. Дві переважні в цьому плані послідовності представлені у вигляді SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO:10 в дійсному описі і в WO 06/072065. Слід розуміти також, що вказані послідовності можуть бути частиною крупніших фрагментів або укорочених форм. 4 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як вказано вище, переважним є також будь-який поліпептид ОРС-2 PCV2, який кодується нуклеотидними послідовностями SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4. Крім того, як має бути очевидно фахівцям в даній області, ця послідовність може варіюватися в межах 6-20 % відповідно до поняття гомології послідовностей і все ще зберігати антигенні характеристики, які роблять її прийнятною для включення в імуногенні композиції. У деяких варіантах укорочені або такі, що мають заміни форми або фрагменти поліпептиду ОРС-2 PCV2 застосовують як антигенний компонент в композиції. Переважно такі укорочені або такі, що мають заміни форми або фрагменти повинні містити щонайменше 18 суміжних нуклеотидів з повнорозмірної нуклеотидної послідовності ОРС-2 PCV2, наприклад, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4. Більш переважно укорочені або такі, що мають заміни форми або фрагменти повинні містити щонайменше 30, переважніше щонайменше 45 і ще переважніше щонайменше 57 суміжних нуклеотидів з повнорозмірної нуклеотидної послідовності ОРС-2 PCV2, наприклад, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4. Поняття «ідентичність послідовностей», як відомо в даній області, належить до спорідненості між двома або більшою кількістю поліпептидних послідовностей або двома або більшою кількістю полінуклеотидних послідовностей, а саме між референс-послідовністю і даною послідовністю, що підлягає порівнянню з референс-послідовністю. Ідентичність послідовностей визначають шляхом порівняння даної послідовності з референс-послідовністю після оптимального вирівнювання послідовностей для одержання найбільш високої міри схожості послідовностей, що визначають по сумісності між відрізками вказаних послідовностей. Після вирівнювання ідентичність послідовностей оцінюють по основах (за типом «положення з положенням»), що знаходяться в однакових положеннях, наприклад, послідовності є «ідентичними» в певному положенні, якщо в цьому положенні нуклеотиди або амінокислотні залишки ідентичні. Загальну кількість таких ідентичних положень потім ділять на загальну кількість нуклеотидів або залишків в референс-послідовності, отримуючи % ідентичності послідовностей. Ідентичність послідовностей легко можна розраховувати за допомогою відомих методів, включаючи, але не обмежуючись лише ними, описані в: Computational Molecular Biology, під ред. Lesk A. N., вид-во Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, під ред. Smith D.W., вид-во, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, частина I, під ред. Griffin A.M. і Griffin H. G., вид-во Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., вид-во Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, під ред. Gribskov M. і Devereux J., вид-во M. Stockton Press, New York, 1991; і Carillo H. і Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48, 1988, с. 1073, вміст яких включений в дійсний опис як посилання. Переважні методи визначення ідентичності послідовностей створені так, щоб отримувати найбільшу відповідність між послідовностями, що вивчаються. Методи визначення ідентичності послідовностей приведені в систему в доступних громадськості комп'ютерних програмах, які дозволяють визначати ідентичність послідовностей для даних послідовностей. Прикладами таких програм є, але не обмежуючись лише ними, пакет програм GCG (Devereux J. та ін., Nucleic Acids Research, 12(1), 1984, с. 387), BLASTP, BLASTN і FASTA (Altschul S. F. та ін., J. Molec. Biol., 215, 1990, сс. 403-410). Програма BLASTX є доступній громадськості від фірми NCBI та інших джерел (BLAST Manual, Altschul S. та ін., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul S. F. та ін., J. Molec. Biol., 215, 1990, сс. 403-410), вміст яких включений в дійсний опис як посилання). Ці програми дозволяють здійснювати оптимальне вирівнювання послідовностей за допомогою значень, що приймаються за замовчуванням, таких як вага збитку, для того, щоб отримувати найбільш високий рівень ідентичності послідовностей для даної послідовності і референс-послідовності. Як ілюстрація: коли згадується полінуклеотид, нуклеотидна послідовність якого щонайменше на 85 %, переважно на 90 %, ще переважніше на 95 % «ідентична послідовності» нуклеотидної референс-послідовності, то мається на увазі, що нуклеотидна послідовність даного полінуклеотиду ідентична референспослідовності за винятком того, що дана полінуклеотидна послідовність може включати аж до 15, переважно аж до 10, ще більше переважно аж до 5 точкових мутацій на кожних 100 нуклеотидів нуклеотидної референс-послідовності. Іншими словами, для того, щоб полінуклеотид мав нуклеотидну послідовність, ідентичну щонайменше на 85 %, переважно на 90 %, ще більше переважно на 95 % з нуклеотидної референс-послідовністю, аж до 15 %, переважно 10 %, ще переважніше 5 % нуклеотидів в референс-послідовності можна вилучати шляхом делеції або замінювати на інший нуклеотид, або аж до 15 % нуклеотидів, переважно 10 %, ще переважніше 5 % від загальної кількості нуклеотидів в референс-послідовності можна вбудовувати в референс-послідовність. Ці мутації референс-послідовності можуть мати місце на 5'- або 3'-кінці нуклеотидної референс-послідовності або в будь-якому положенні між цими кінцями, або знаходячись індивідуально серед нуклеотидів в референс- послідовності, або у 5 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вигляді однієї або декількох суміжних груп в референс-послідовності. Аналогічно цьому під поліпептидом, дана амінокислотна послідовність якого ідентична щонайменше, наприклад на 85 %, переважно на 90 %, ще переважніше на 95 % амінокислотній референс-послідовності, мають на увазі, що дана амінокислотна послідовність поліпептиду ідентична референспослідовності за винятком того, що дана поліпептидна послідовність може включати аж до 15, переважно аж до 10, ще більше переважно аж до 5 амінокислотних замін на кожних 100 амінокислот амінокислотної референс-послідовності. Іншими словами, для одержання даної поліпептидної послідовності, яка щонайменше на 85 %, переважно на 90 %, ще переважніше на 95 % ідентична послідовності амінокислотної референс-послідовності, аж до 15 %, переважно аж до 10 %, ще переважніше аж до 5 % амінокислотних залишків в референс-послідовності можна вилучати шляхом делеції або замінювати на іншу амінокислоту, або аж до 15 % амінокислот, переважно аж до 10 %, ще переважніше аж до 5 % від загальної кількості амінокислотних залишків в референс-послідовності можна вбудовувати в референспослідовність. Ці зміни референс-послідовності можуть мати місце на аміно- або карбоксикінці амінокислотної референс-послідовності або в будь-якому положенні між цими кінцевими положеннями, або знаходячись індивідуально серед залишків в референс-послідовності, або у вигляді однієї або декількох суміжних груп в референс-послідовності. Переважно положення залишків, які є неідентичними, відрізняються консервативними амінокислотними замінами. Проте консервативні заміни не відносять до сумісних при визначенні ідентичності послідовностей. Визначення «гомології послідовностей» в контексті дійсного опису належить до методу визначення схожості двох послідовностей. Для визначення гомології послідовностей дві або більшу кількість послідовностей піддають оптимальному вирівнюванню і при необхідності інтродукують збитки. На відміну від оцінки ідентичності послідовностей при визначенні гомології послідовностей консервативні амінокислотні заміни вважають такими, що задовольняють умовам гомології. Іншими словами, для того, щоб поліпептид або полінуклеотид мав 95 % гомологію послідовності з референс-послідовністю, 85 %, переважно 90 %, ще переважніші 95 % амінокислотних залишків або нуклеотидів в референс-послідовності повинні відповідати або містити консервативну заміну на іншу амінокислоту або нуклеотид, або кількість амінокислот або нуклеотидів, що становить аж до 15 %, переважно аж до 10 %, ще переважніше аж до 5 % від загальної кількості амінокислотних залишків або нуклеотидів, не включаючи консервативні заміни, в референс-послідовності можна вбудовувати в референспослідовність. Переважно гомологічна послідовність містить щонайменше ділянку, що складається з 50, ще переважніше з 100, ще переважніше з 250, ще переважніше з 500 нуклеотидів. Поняття «Консервативна заміна» належить до заміни амінокислотного залишку або нуклеотиду на інший амінокислотний залишок або нуклеотид, що має схожі характеристики або властивості, включаючи розмір, гідрофобність тощо, внаслідок чого загальна функціональність не змінюється істотно. Поняття «виділений» означає «змінений людиною» відносно його стану, що зустрічається в природних умовах, тобто, якщо він зустрічається в природі, то його змінюють або видаляють з природного оточення, або здійснюють і те, та інше. Наприклад, полінуклеотид або поліпептид, що зустрічається в природних умовах в живому організмі, не є «виділеним», але цей же полінуклеотид або поліпептид, відокремлений від матеріалу, з яким він існує спільно в його природному стані, є «виділеним» згідно вживаному в описі поняттю. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, які мають антитіла до PCV2, перш за все отримані від матері антитіла до PCV2, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, вводять в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, де білок ОРС-2 PCV2 є будь-яким з вказаних вище білків. Переважно білок ОРС-2 PCV2 є: I) поліпептид, що містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 або SEQ ID NO: 11 в дійсному описі або в WO 06/07065; II) будь-який поліпептид, який щонайменше на 80 % гомологічний поліпептиду, вказаному в I), III) будь-який імуногенний фрагмент поліпептидів, вказаних в I) і/або II), IV) імуногенний фрагмент, вказаний в III), який містить щонайменше 10 суміжних амінокислот, що входять в послідовності, представлені в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 або SEQ ID NO: 11 в дійсному описі або в WO 06/072065 V) поліпептид, який кодується ДНК, що містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 3 6 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або SEQ ID NO: 4 в дійсному описі або в WO 06/072065. VI) будь-який поліпептид, що кодується полінуклеотидом, який щонайменше на 80 % гомологічний полінуклеотиду, вказаному в V), VII) будь-який імуногенний фрагмент поліпептидів, які кодуються полінуклеотидом, вказаним в V) і/або VI), VIII) імуногенний фрагмент, вказаний в VII), де полінуклеотид, що кодує імуногенний фрагмент, містить щонайменше 30 суміжних нуклеотидів, що входять в послідовності, які представлені в SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4 в дійсному описі або в WO 06/072065. Переважно будь-який з вказаних імуногенних фрагментів має імуногенні характеристики білка ОРС-2 PCV2, кодований послідовностями, які представлені в SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4 в дійсному описі або в WO 06/07065. Таким чином, згідно наступному об'єкту винаходу білок ОРС-2 PCV2 міститься в імуногенній композиції з таким рівнем включення антигена, який є ефективним для індукції необхідної імунної відповіді, а саме для зниження кількості випадків, зменшення серйозності або попередження або зниження одного або декількох клінічних симптомів, що є результатом зараження PCV2 або асоційованих з ним. Переважно рівень включення білка ОРС-2 PCV2 відповідає щонайменше 0,2 мкг антигена/мл кінцевої імуногенної композиції (мкг/мл), переважніше від приблизно 0,2 до приблизно 400 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 0,3 до приблизно 200 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 0,35 до приблизно 100 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 0,4 до приблизно 50 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 0,45 до приблизно 30 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 0,5 до приблизно 18 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 0,6 до приблизно 15 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 0,75 до приблизно 8 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 1,0 до приблизно 6 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 1,3 до приблизно 3,0 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 1,4 до приблизно 2,5 мкг/мл, ще переважніше від приблизно 1,5 до приблизно 2,0 мкг/мл і найпереважніше приблизно 1,6 мкг/мл. Згідно ще одному об'єкту винаходу рівень включення антигена ОРС-2 PCV складає щонайменше 0,2 мкг білка ОРС-2 PCV2, описаного вище, на дозу кінцевої антигенної композиції (мкг/дозу), переважніше від приблизно 0,2 до приблизно 400 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,3 до приблизно 200 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,35 до приблизно 100 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,4 до приблизно 50 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,45 до приблизно 30 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,5 до приблизно 18 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,6 до приблизно 15 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,75 до приблизно 8 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 1,0 до приблизно 6 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 1,3 до приблизно 3,0 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 1,4 до приблизно 2,5 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 1,5 до приблизно 2,0 мкг/дозу і найпереважніше приблизно 1,6 мкг/дозу. При створенні винаходу несподівано було встановлено, що рівень включення білка ОРС-2 PCV2 (вміст антигена) з розрахунку 20 мкг/дозу, переважно приблизно від 0,5 до 18 мкг/дозу, може обумовлювати імунітет у молодих тварин і/або у тварин, позитивних відносно антитіл до PCV2, зокрема, які є позитивними відносно отриманих від матері антитіл. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, які мають антитіла до PCV2, перш за все отримані від матері антитіла до PCV2, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, вводять менше 20 мкг/дозу, переважно приблизно від 0,5 до 18 мкг/дозу антигена PCV2 або імуногенній композиції, що містить антиген PCV2. Вказаний антиген PCV2 є будь-яким з вказаних в дійсному описі. Переважно вказаний антиген PCV2 є будь-яким білком ОРС-2 PCV2, переважно будь-який білок ОРС-2 PCV2, представлений в дійсному описі. Поліпептид ОРС-2 PCV2, вживаний в імуногенній композиції, пропонованій в дійсному винаході, можна отримувати будь-яким шляхом, включаючи виділення і очищення ОРС-2 PCV2, стандартний метод синтезу білків і метод рекомбінантної ДНК. Переважні методи одержання поліпептиду ОРС-2 PCV2 представлені в WO 06/072065, суть і вміст якої повністю включені в дійсний опис як посилання. В цілому, метод полягає в наступному: заражають чутливі клітини рекомбінантним вірусним вектором, який містить кодуючі послідовності ДНК ОРС-2 PCV2, експресують поліпептид ОРС-2 PCV2 за допомогою рекомбінантного вірусу і виділяють поліпептид ОРС-2 PCV2, який експресується, з супернатанту шляхом фільтрації, і інактивують загальноприйнятим методом, переважно використовуючи бінарний етиленімін (БЕІ), який потім нейтралізують для припинення процесу інактивації. Поняття «Імуногенна композиція» в контексті дійсного опису відноситься також до композиції, яка містить I) будь-який білок ОРС-2 PCV2, описаний вище, переважно у вказаних 7 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вище концентраціях, і II) щонайменше частину вірусного вектора, що експресує вказаний білок ОРС-2 PCV2, переважно рекомбінантного бакуловіруса. Крім того, імуногенна композиція може містити I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у вказаних вище концентраціях, II) по меншій частину вірусного вектора, що експресує білок ОРС-2 PCV2, переважно рекомбінантного бакуловіруса, і III) частина супернатанту клітинної культури. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, які мають антитіла до PCV2, перш за все отримані від матері антитіла до PCV2, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, вводять в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, де антиген PCV2 є рекомбінантний ОРС-2 PCV2, переважно який експресується в бакуловірусі ОРС-2 PCV2. Переважно рекомбінантні або експресуємі в бакуловірусі ОРС-2 PCV2 мають вказану вище послідовність. Поняття «Імуногенна композиція» в контексті дійсного опису відноситься також до композиції, яка містить I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у вказаних вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного вектора, що експресує вказаний білок ОРС-2 PCV2, переважно рекомбінантного бакуловіруса, і III) частину клітинної культури; де приблизно 90 % компонентів мають розмір менше 1 мкм. Поняття «Імуногенна композиція» в контексті дійсного опису відноситься також до композиції, яка містить I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у вказаних вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного вектора, що експресує вказаний білок ОРС-2 PCV2, переважно рекомбінантного бакуловіруса, III) частину клітинної культури, IV) інактивуючий агент, призначений для інактивації рекомбінантного вірусного вектора, переважно БЕІ, де приблизно 90 % компонентів I)-III) мають розмір менше 1 мкм. Переважно БЕІ присутній в концентраціях, ефективних для інактивації бакуловіруса, переважно від 2 до приблизно 8 мМ БЕІ, переважно приблизно 5 мМ БЕІ. Поняття «Імуногенна композиція» в контексті дійсного опису відноситься також до композиції, яка містить I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у вказаних вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного вектора, що експресує вказаний білок ОРС-2 PCV2, III) частину клітинної культури, IV) інактивуючий агент, призначений для інактивації рекомбінантного вірусного вектора, переважно БЕІ, і V) нейтралізуючий агент, призначений для припинення інактивації, опосередкованої інактивуючим агентом, де приблизно 90 % компонентів I)-III) мають розмір менше 1 мкм. Переважно, якщо інактивуючий агент є БЕІ, то вказана композиція містить тіосульфат натрію в кількостях, еквівалентних кількості БЕІ. Поліпептид включають в композицію, яку можна вводити тварині, чутливій до зараження PCV2. У переважних варіантах в композицію можна включати додаткові компоненти, відомі фахівцям в даній області (див. також Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е видавництво, вид-во Mack Publ., Easton, 1990). Крім того, до складу композиції можуть входити один або декілька прийнятних для застосування у ветеринарії носіїв. У контексті дійсного опису поняття «Прийнятний для застосування у ветеринарії носій» включає, але не обмежуючись лише ними, будь-які з перерахованих або всі розчинники, дисперсійні середовища, матеріали для нанесення покриття, ад'юванти, стабілізатори, розчинники, консерванти, антибактеріальні і протигрибкові агенти, агенти для надання ізотонічності, агенти, що уповільнюють адсорбцію тощо. У переважному варіанті здійснення винаходу імуногенна композиція містить білок ОРС-2 PCV2, описаний вище, переважно у вказаних вище концентраціях, який змішують з ад'ювантом, переважно карбополом, і фізіологічним розчином. Фахівцям в даній області має бути очевидно, що композиція, яку застосовують згідно винаходу, може включати відомі придатні для ін'єкції фізіологічно прийнятні стерильні розчини. Для приготування готового до застосування розчину для парентеральної ін'єкції або інфузії широко використовують водні ізотонічні розчини, такі, наприклад, як фізіологічний розчин або відповідні розчини білків плазми. Крім того, імуногенні композиції і вакцини, пропоновані в дійсному винаході, можуть включати розчинники, агенти для надання ізотонічності, стабілізатори або ад'юванти. Розчинники можуть бути водою, фізіологічним розчином, декстрозою, етанолом, гліцерином тощо. Агенти для надання ізотонічності можуть бути серед іншого хлоридом натрію, декстрозою, манітом, сорбітом і лактозою. Стабілізатори є серед іншого альбуміном і солями лужних металів і етилендіамінтетраоцтової кислоти. Поняття «ад'юванти» в контексті дійсного опису може відноситися до гідроксиду алюмінію і фосфату алюмінію, сапонінів, таким, наприклад, як Quil A, QS-21 (фірма Cambridge Biotech Inc., Кембрідж, шт. Массачусетс), GPI-0100 (фірма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бірмінгем, шт. Алабама), емульсії вода-в-маслі, емульсії масло-в-воді, емульсії вода-в-маслі-в-воді. Основою 8 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 емульсії може бути, зокрема, легке рідке парафінове масло (відповідно Європейській фармакопеї); ізопреноїдне масло, таке як сквалан або сквалеон; масло, що утворилося в результаті олігомеризації алкенів, раніше всього ізобутена або децена; ефіри кислот або спиртів, що містять лінійну алкільну групу, конкретніше рослинні олії, етилолеат, ди(каприлат/капрат) пропіленгліколю, три(каприлат/капрат) гліцерину або діолеат пропіленгліколю; ефіри розгалужених жирних кислот або спиртів, зокрема, ефіри ізостеаринової кислоти. Масла застосовують у поєднанні з емульгаторами для одержання емульсії. Емульгатори переважно є неіоногенними поверхнево-активними речовинами, перш за все складні ефіри сорбітану, манніту (наприклад, безводний маннітолеат), гліколю, полігліцерину, пропіленгліколю і олеїнової, ізостеаринової, рицин олеїнової або гідроксистеаринової кислоти, які необов'язково є етоксильованими, і блок-співполімери поліоксипропілену-поліоксіетилену, зокрема продукти типу Pluronic, перш за все L121 (див. Hunter та ін., The Theory and Practical Application of Adjuvants, під ред. Stewart-Tull D. E. S., вид-во John Wiley and Sons, NY, сс. 51-94, 1995 і Todd та ін., Vaccine 15, 1997, сс. 564-570). Наприклад, можна застосовувати SPT-емульсію, описану на с. 147 в: «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach», під ред. M. Powell і M. Newman, вид-во Plenum Press, 1995, і емульсію MF59, описану на с. 183 в цій же публікації. Іншим прикладом ад'юванта є сполука, вибрана з полімерів акрилової або метакрилової кислоти і співполімерів малеїнового ангідриду і алкенільної похідної. Переважними ад'ювантами є полімери акрилової або метакрилової кислоти, перш за все, зшиті з простими поліалкеніловими ефірами цукрів або багатоатомними спиртами. Ці сполуки відомі під назвою карбомери (Phameuropa, т. 8, №. 2 червня 1996 р.). Фахівцям в даній області як посилання можна запропонувати US 2909462, в якому описані вказані акрилові полімери, зшиті з полігідроксильованою сполукою, яка має щонайменше 3 гідроксильних групи, переважно не більше 8, при цьому атоми водню щонайменше трьох гідроксильних груп заміщені ненасиченими аліфатичними радикалами, які мають щонайменше 2 атоми вуглецю. Переважними є радикали, які містять від 2 до 4 атомів вуглецю, наприклад, вінілові, алільні та інші ненасичені групи ряду етилену. Ненасичені радикали можуть самі містити інші замісники, такі як метил. Найбільш переважними є продукти, що надходять у продаж під назвою карбопол (фірма BF Goodrich, шт. Огайо). Їх зшивають з алілсахарозою або алілпентаеритритолом. Серед них перш за все слід згадати карбопол 974P, 934P і 971P. Найбільш переважним для застосування є карбопол 971P. Найпереважніше застосовувати карбопол, зокрема можна застосовувати карбопол 971P, переважно в кількостях від приблизно 500 мкг до приблизно 5 мг на дозу, ще переважніше в кількості від приблизно 750 мкг до приблизно 2,5 мг на дозу і найпереважніше в кількості приблизно 1 мг на дозу. Також прийнятними ад'ювантами серед іншого є, але не обмежуючись лише ними, система RIBI- ад'ювантів (фірма Ribi Inc.), блок-співполімери (фірма CytRx, Атланта, шт. Джорджія), SAFM (фірма Chiron, Emeryville, шт. Каліфорнія), монофосфорил-ліпід A, ад'ювант на основі аміну ліпіду авридину, термолабільний ентеротоксин E. coli (рекомбінантний чи ні), токсин холери, IMS 1314 або мураміл-дипептид. Переважно ад'ювант додають в кількості від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. Ще переважніше ад'ювант додають в кількості від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. Ще переважніше ад'ювант додають в кількості від приблизно 500 мкг до приблизно 5 мг на дозу. Ще переважніше ад'ювант додають в кількості від приблизно 750 мкг до приблизно 2,5 мг на дозу. Найпереважніше ад'ювант додають в кількості приблизно 1 мг на дозу. Крім того, композиція може включати один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв. У контексті дійсного опису поняття «Фармацевтично прийнятний носій» включає будь-який з перерахованих або всі розчинники, дисперсійні середовища, матеріали для нанесення покриття, стабілізатори, розчинники, консерванти, антибактеріальні і протигрибкові агенти, агенти для надання ізотонічності, агенти, що уповільнюють адсорбцію тощо. Найпереважніше композиція, пропонована у винаході, містить білок ОРС-2 PCV2, виділений з супернатанту культивованих in vitro клітин, де вказані клітини інфікують рекомбінантним вірусним вектором, який містить ДНК ОРС-2 PCV2 і експресує білок ОРС-2 PCV2, і де вказану клітинну культуру обробляють від приблизно 2 до приблизно 8 мМ БЕІ, переважно приблизно 5 мМ БЕІ, для інактивації вірусного вектора і нейтралізуючого агента, узятого в еквівалентній концентрації, переважно розчином тіосульфату натрію в кінцевій концентрації від приблизно 2 до приблизно 8 мМ, переважно приблизно 5 мМ. Дійсний винахід відноситься також до імуногенної композиції, яка містить I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у вказаних вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного вектора, що експресує вказаний білок ОРС-2 PCV2, III) частину клітинної 9 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 культури, IV) інактивуючий агент, призначений для інактивації рекомбінантного вірусного вектора (переважно БЕІ), і V) нейтралізуючий агент, призначений для припинення інактивації, опосередкованої інактивуючим агентом, переважно тіосульфат натрію в кількостях, еквівалентних кількості БЕІ; і VI) прийнятний ад'ювант, переважно карбопол 971 у вказаних вище кількостях; де приблизно 90 % компонентів I)-III) мають розмір менше 1 мкм. Згідно ще одному об'єкту винаходу вказана імуногенна композиція містить також фармацевтично прийнятну сіль, переважно фосфат, у фізіологічно прийнятних концентраціях. Переважне значення pH вказаної імуногенної композиції доводять до фізіологічного значення рН, тобто приблизно від 6,5 до 7,5. У контексті дійсного опису імуногенна композиція є також композицією, яка містить в одному мл: I) щонайменше 1,6 мкг білка ОРС-2 PCV2, описаного вище, переважно менше 20 мкг, II) щонайменше частину бакуловіруса, що експресує вказанийбілок ОРС-2 PCV2, III) частину клітинної культури, IV) приблизно від 2 до 8 мМ БЕІ, V) тіосульфат натрію в кількостях, еквівалентних кількості БЕІ, і VI) приблизно 1 мг карбопола 971, і VII) фосфат у фізіологічно прийнятній концентрації; де приблизно 90 % компонентів I)-III) мають розмір менше 1 мкм, і значення pH вказаної імуногенної композиції доведене приблизно до 6,5-7,5. Імуногенні композиції можуть містити також один або декілька інших імуномодулюючих агентів, таких, наприклад, як інтерлейкіни, інтерферони або інші цитокіни. Імуногенні композиції можуть містити також гентаміцин і мертіолат. Хоча фахівець в даній області легко може визначити кількості і концентрації ад'ювантів і добавок, які можна застосовувати в контексті дійсного винаходу, в дійсному винаході запропоновані композиції, що містять від приблизно 50 до приблизно 2000 мкг ад'юванта і переважно приблизно 250 мкг/мл дози композиції вакцини. Так, імуногенна композиція, пропонована у винаході, є також композицією, яка містить від приблизно 1 до приблизно 60 мкг/мл антибіотиків і переважніше менше приблизно 30 мкг/мл антибіотиків. У контексті дійсного опису імуногенна композиція є також композицією, яка містить I) будьякий з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у вказаних вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного вектора, що експресує вказаний білок ОРС-2 PCV2, III) частину клітинної культури, IV) інактивуючий агент, призначений для інактивації рекомбінантного вірусного вектора, переважно БЕІ, і V) нейтралізуючий агент, призначений для припинення інактивації, опосередкованої інактивуючим агентом, переважно тіосульфат натрію в кількостях, еквівалентних кількості БЕІ; VI) прийнятний ад'ювант, переважно карбопол 971 у вказаних вище кількостях; VII) соляний буфер у фармацевтично прийнятній концентрації, переважно фосфат, і VIII) протимікробна діюча речовина; де приблизно 90 % компонентів I)-III) мають розмір менше 1 мкм. Поняття «Імуногенна композиція, яку можна застосовувати згідно винаходу», відноситься TM також до Ingelvac® CircoFLEX (фірма Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, шт. Міссурі, США), CircoVac® (фірма Merial SAS, Ліон, Франція), CircoVent (фірма Intervet Inc., Millsboro, шт. Делавер, США) або Suvaxyn PCV-2 One Dose® (фірма Fort Dodge Animal Health, Канзас-Сіті, шт. Канзас, США). Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, які мають отримані від матері антитіла до PCV2, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, вводять в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, де імуногенна композиція є CircoFLEX®, CircoVac®, CircoVent або Suvaxyn PCV-2 One Dose®. Найпереважніше імуногенна композиція є TM Ingelvac® CircoFLEX , і/або антиген PCV2 є ОРС-2 PCV2, переважно, який експресується в TM бакуловірусі білок ОРС-2 PCV2, найпереважніше включений в Ingelvac® CircoFLEX . Для вивчення можливої взаємодії антигена PCV2 з материнським антитілом проводили дослід, в якому визначали титри антитіла у піддослідних тварин у момент вакцинації, і потім тварин розділяли на групи з низьким, середнім або високим титром антитіл: геометричні середні значення титрів 1:1000 розглядалися як високі титри антитіл. Ця схема угрупування тварин відповідає схемі, яку застосовували в польовому досліді, проведеному в Канаді, в якому титри антитіл 1:80 розглядалися як низькі, титри антитіл 1:640 як середні, а титри антитіл > 1:1280 як високі (Larochelle та ін., Can. J. Vet. Res.; 67, 2003, сс. 114-120). Для того, щоб проаналізувати вплив низьких, середніх і високих титрів антитіл у момент вакцинації на віремію, вакцинованих і оброблених плацебо тварин порівнювали відносно початку, закінчення, тривалості віремії, кількості днів, в які були отримані позитивні зразки, і вірусного навантаження. При створенні винаходу несподівано було встановлено, що присутність антитіл до PCV2, 10 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зокрема отриманих від матері антитіл, не робило істотного впливу на якій-небудь з вказаних параметрів. Іншими словами, при створенні винаходу несподівано було встановлено, що ефективність антигена PCV2 відносно попередження або лікування зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, не залежала від присутності в день вакцинації антитіл до PCV2, переважно від титру антитіл PCV2 аж до 1:100, що переважно перевищує 1:100, ще переважніше перевищує 1:250, ще переважніше перевищує 1:500, ще переважніше 1:640; що ще переважніше перевищує 1:750, найпереважніше перевищує 1:1000. Це явище продемонстроване в експерименті з використанням однієї вакцинації шляхом уприскування, тобто коли антиген PCV2 вводили лише один раз і без якої-небудь подальшої обробки антигеном PCV2. Методи виявлення і кількісної оцінки антитіл до PCV2 добре відомі в даній області. Наприклад, виявлення і кількісну оцінку антитіл до PCV2 можна здійснювати за допомогою методу непрямої імунофлуоресценції, описаного в Magar та ін., Can. J. Vet Res. ; 64, 2000, сс. 184-186 або в Magar та ін., J. Comp. Pathol.; 123, 2000, сс. 258-269. Інші методи кількісної оцінки антитіл до PCV2 описані в Opriessnig та ін., 37-th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians (37-ой Щорічний з'їзд американської асоціації по ветеринарії свиней), 2006 р.). Крім того, в прикладі 2 описаний також непрямий імунофлуоресцентний аналіз, який може застосовувати фахівець в даній області. В разі спірних результатів і при будь-яких сумнівах слід мати на увазі, що вказані в дійсному описі титри антитіл до PCV2 відносяться до титрів, які установлені/можуть бути встановлені за допомогою аналізу, описаного в прикладі 2. Таким чином, наступним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, які мають антитіла до PCV2, перш за все отримані від матері антитіла, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, вводять в терапевтично ефективній кількості антиген PCV2, переважно з розрахунку менше 20 мкг/дозу, де у тварини виявлений титр антитіл до PCV2 аж до 1:100, що переважно перевищує 1:100, ще переважніше перевищує 1:250, ще переважніше перевищує 1:500, ще переважніше 1:640, що ще більше переважно перевищує 1:750, найпереважніше перевищує 1:1000. Переважно вказаний титр антитіл до PCV2 визначають і оцінюють кількісно за допомогою специфічного імунного аналізу антитіл до PCV2, переважно аналізу, описаного в прикладі 2. Більш переважно вказані антитіла до PCV2 є отриманими від матері антитілами. Найпереважніше антиген PCV2 вводять лише один раз, переважно в дозі менше 20 мкг/дозу. Поросята, які мають лише низькі титри (< 1:100) або середні титри ( 1:1000) приводила до укороченої на 9,5 дня тривалості віремії, на 11,9 дня раніше закінченню віремії, на 1,9 дня зменшення кількості днів, в які були отримані позитивні відносно віремії зразки, і до приблизно двократного зниження суми геномів еквівалентів/мл в порівнянні з невакцинованим контрольними тваринами. При порівнянні вакцинованих тварин з «високими», «середніми» і «низькими» титрами не виявлено істотної різниці в різних параметрах пов'язаної з PCV2 віремії. Ці результати свідчать також про те, що у присутності високих титрів антитіл до PCV2 антиген PCV2, застосований для вакцинації, ще може істотно знижувати віремію в крові (закінчення віремії, тривалість віремії, вірусне навантаження). У світлі цих даних не виявлено жодних відмінностей в живій масі тіла при порівнянні тварин у вакцинованих групах, що мають низькі і високі титри. Крім того, у вакцинованих тварин з високим титром (> 1:1000) антитіл до PCV2 у момент вакцинації/обробки виявлена також істотно більша вага тіла після початку віремії в порівнянні з обробленими плацебо тваринами з початковими високими титрами (див. фіг. 3). Отже, можлива вакцинація/обробка тварин віком 1 день або старше антигеном PCV2. Проте вакцинацію слід здійснювати протягом перших 8, переважно перших 7 тижнів життя. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, переважно у віці 1 день або старше, але не старше 8 тижнів, вводять в ефективній кількості антиген PCV2. Згідно переважному 11 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіанту здійснення винаходу потрібно менше 20 мкг антигена PCV2/дозу для надання імунітету такій тварині. Згідно переважнішому варіанту здійснення винаходу антиген PCV2, переважно в кількості менше 20 мкг/дозу, вводять лише один раз тварині, яка потребує такого лікування. Таким чином, наступним загальнішим об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у молодих тварин, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, вводять в ефективній кількості антиген PCV2. Поняття «Молода тварина» в контексті дійсного опису належить до тварини віком від 1 до 22 днів. Переважно під поняттям молода тварина мають на увазі тварину віком від 1 до 20 днів. Переважніше під поняттям молода тварина мають на увазі тварину віком від 1 до 15 днів, ще переважніше віком від 1 дня до 14 днів, ще переважніше віком від 1 до 12 днів, ще переважніше віком від 1 до 10 днів, ще переважніше віком від 1 до 8 днів, ще переважніше віком від 1 до 7 днів, ще переважніше віком від 1 до 6 днів, ще переважніше віком від 1 до 5 днів, ще переважніше віком від 1 до 4 днів, ще переважніше віком від 1 до 3 днів, ще переважніше віком від 1 до 2 днів, найпереважніше тварину віком 1 день. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у молодих тварин, що полягає в тому, що вводять в ефективній кількості антиген PCV2 тварині, яка потребує такого лікування, віком 1-22 дні, переважно віком 1-20 днів, переважніше віком 1-15 днів, ще переважніше віком 1-14 днів, ще переважніше віком 1-12 днів, ще переважніше віком 1-10 днів, ще переважніше віком 1-8 днів, ще переважніше віком 1-7 днів, ще переважніше віком 1-6 днів, ще переважніше віком 1-15 днів, ще переважніше віком 1-4 дні, ще переважніше віком 1-3 дні, ще переважніше віком 1 або 2 дні, найпереважніше віком 1 день. Наприклад, встановлено, що вакцинація/обробка, яку проводять у віці від 19 до 22 днів, є високоефективною вакцинацією. Крім того, встановлено, що вакцинація/обробка, яку проводять у віці від 12 до 18 днів, переважно від 12 до 14 днів, також є дуже ефективною відносно зниження клінічних симптомів, що асоціюються із зараженням PCV2, зниження загального вірусного навантаження, зниження тривалості віремії, уповільнення початку віремії, приросту маси. Крім того, встановлено також, що вакцинація, яку проводять у віці 1 тиждень, є також дуже ефективною відносно зниження клінічних симптомів, що асоціюються із зараженням PCV2, зниження загального вірусного навантаження, зниження тривалості віремії, уповільнення початку віремії, приросту маси. Переважно для надання імунітету вказаним молодим тваринам потрібно менше 20 мкг антигена PCV2/дозу. Таким чином, згідно переважнішому варіанту здійснення винаходу антиген PCV2 вводять переважно в кількості менше 20 мкг лише один раз вказаній молодій тварині, яка потребує такого лікування. Через повсюдне поширення PCV2 в польових умовах велика частина молодих поросят є серопозитивною відносно PCV2. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у молодих тварин, які мають антитіла до PCV2 в день вакцинації, що полягає в тому, що тварині віком 1-22 дні, переважно віком 1-20 днів, переважніше віком 1-15 днів, ще переважніше віком 1-14 днів, ще переважніше віком 1-12 днів, ще переважніше віком 1-10 днів, ще переважніше віком 1-8 днів, ще переважніше віком 1-7 днів, ще переважніше віком 1-6 днів, ще переважніше віком 1-5 днів, ще переважніше віком 1-4 дні, ще переважніше віком 1-3 дні, ще переважніше віком 1 або 2 дні, найпереважніше віком 1 день, яке потребує такого лікування, вводять в ефективній кількості антиген PCV2. Переважно вказана молода тварина в день вакцинації/обробки має титр антитіл, що виявляється, до PCV2 аж до 1:100, що переважно перевищує 1:100, ще переважніше перевищує 1:250, ще переважніше перевищує 1:500, ще переважніше 1:640, що ще переважніше перевищує 1:750, найпереважніше перевищує 1:1000. Переважно для надання імунітету вказаним молодим тваринам потрібно менше 20 мкг антигена PCV2/дозу. Таким чином, згідно переважнішому варіанту здійснення винаходу антиген PCV2 вводять переважно в кількості менше 20 мкг лише один раз вказаній молодій тварині, яка потребує такого лікування. Як описано вище, вакцинація/лікування молодих тварин антигеном PCV2 призводить до укорочення фази віремії впорівнянні з невакцинованими контрольними тваринами. Середнє укорочення часу складає 9,5 дня в порівнянні з невакцинованими контрольними тваринами цього ж вигляду. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є також спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у молодих тварин, що полягає в тому, що вводять в ефективній кількості антиген PCV2 тварині, яка потребує такого лікування, при цьому лікування або профілактика призводить до укорочення фази віремії на 5 або більше днів, переважно на 6 12 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або більше днів, ще переважніше на 7 або більше днів, ще переважніше на 8 або більше днів, ще переважніше на 9 днів, ще переважніше на 10 днів, ще переважніше на 12 днів, ще переважніше на 14 днів, найпереважніше більш ніж на 16 днів, в порівнянні з тваринами цього ж вигляду з необробленої контрольної групи. В деяких випадках фаза віремії коротшає більш ніж на 20 днів. В цілому, вакцинація молодих поросят призводить до зниження втрати приросту ваги, укорочення тривалості віремії, ранішого закінчення віремії і зниженому вірусному навантаженню. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є також спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у молодих тварин, що полягає в тому, що тварині, яка потребує такого лікування, вводять в ефективній кількості антиген PCV2, при цьому лікування або профілактика зараження PCV2 призводить до поліпшення в порівнянні з тваринами цих же видів з необробленої контрольної групи параметра ефективності, вибраного з групи, що включає зниження втрати приросту маси, укорочення тривалості віремії, раніше закінчення віремії, пониження вірусного навантаження або їх комбінації. Переважно потрібно менше 20 мкг антигена PCV2/дозу для підвищення вказаного вище параметра ефективності вакцини. Крім того, для досягнення підвищення вказаного вище параметра ефективності вакцини потрібно лише одне введення однієї дози. Поняття «Ефективна кількість» в контексті дійсного опису означає, але не обмежуючись лише вказаним, кількість антигена, яка викликає або може викликати імунну відповідь у тварини, якій вводять антиген PCV2 в ефективній дозі. Переважна ефективна кількість означає кількість антигена, при використанні якого тривалість імунітету (DOI) складає приблизно 10 тижнів, переважно DOI складає щонайменше 12 тижнів, переважніше DOI складає щонайменше 15 тижнів, найпереважніше DOI складає щонайменше 20 тижнів. Ефективна кількість залежить від інгредієнтів вакцини і схеми введення. Як правило, коли в комбінованій вакцині застосовують препарат інактивованого вірусу або модифікованого живого 2,0 9,0 вірусу, то вакцину застосовують в кількості, відповідній від приблизно 10 до приблизно 10 3,0 8,0 TCID50 на дозу, переважно від приблизно 10 до приблизно 10 TCID50 на дозу, переважніше 4,0 8,0 від приблизно 10 до приблизно 10 TCID50 на дозу. Зокрема, коли у вакцинах застосовують модифікований живий PCV2, то рекомендована для введенню чутливій тварині доза складає 3,0 переважно від приблизно 10 TCID50 (середня цитопатогенна доза, що інфікує 50 % клітин) 6,0 4,0 /дозу до приблизно 10 TCID50/дозу і переважніше від приблизно 10 TCID50/дозу до 5,0 приблизно 10 TCID50/дозу. В цілому, кількість антигена повинна складати від приблизно 0,2 до 2,0 9,0 3,0 6,0 4,0 5000 мкг і від 10 до 10 TCID50, переважно від 10 до 10 TCID50, переважніше від 10 до 5,0 10 TCID50, при застосуванні очищеного антигена. Субодиничні вакцини, як правило, вводять з рівнем включення антигена, що складає щонайменше 0,2 мкг антигена на дозу, переважно від приблизно 0,2 до приблизно 400 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,3 до приблизно 200 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,35 до приблизно 100 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,4 до приблизно 50 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,45 до приблизно 30 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,5 до приблизно 18 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,6 до приблизно 16 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 0,75 до приблизно 8 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 1,0 до приблизно 6 мкг/дозу, ще переважніше від приблизно 1,3 до приблизно 3,0 мкг/дозу. При створенні винаходу несподівано було встановлено, що профілактичне застосування описаних вище імуногенних композицій є ефективним відносно зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, переважно у молодих тварин і/або у тварин, що мають пасивний імунітет до PCV2 в день обробки. Зокрема, встановлено, що профілактичне застосування описаних вище імуногенних композицій, і зокрема композиції, що містять антиген ОРС-2 PCV2, володіють ефективністю відносно зниження лімфаденопатії, лімфоїдного виснаження і/або багатоядерних/гігантських гістоцитів у тварин, заражених PCV2 і що мають отримані від матері антитіла до PCV-2, в день обробки/вакцинації. Крім того, описане профілактичне застосування імуногенних композицій, пропонованих у винаході, і перш за все композицій, які містять антиген ОРС-2 PCV2, що володіють ефективністю відносно зменшення таких показників, як (1) інтерстиціальна пневмонія, що супроводжується інтерглобулярним набряком, (2) блідість шкіри або жовтяниця новонароджених, (3) плямиста атрофія печінки, (4) виразка шлунку, (5) нефрит і (6) репродуктивні порушення, такі, наприклад, як викидень, мертвонародження, висихання плоду в матці тощо, (7) Pia-подібні пошкодження, як правило, асоційовані із зараженням Lawsonia intracellularis (ілеїт), (8) лімфаденопатія, (9) лімфоїдне виснаження і/або (10) рівень багатоядерних/гігантських гістоцитів, (11) синдром свинячого дерматиту і нефропатії (PDNS), (12) асоційована з PCVAD смертність, (13) що асоціюється з PCVAD втрата маси, (14) відносна варіабельність росту, (15) відносна частота появи 13 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 «карликових» тварин, (16) відносне спільне зараження комплексом збудників репродуктивнореспіраторного синдрому свиней (PRRSV). Вказана імуногенна композиція володіє ефективністю також відносно підвищення економічної важливості параметрів росту, таких як час до забою, маса м'ясної туші, відносний вміст худої маси. Таким чином, поняття «Клінічні симптоми» в контексті дійсного опису означають, але не обмежуючись лише ними, (1) інтерстиціальну пневмонію, що супроводжується інтерглобулярним набряком, (2) блідість шкіри або жовтяницю новонароджених, (3) плямисту атрофію печінки, (4) виразку шлунку, (5) нефрит і (6) репродуктивні порушення, такі, наприклад, як викидень, мертвонародження, висихання плоду в матці тощо, (7) Pia-подібні пошкодження, як правило, асоційовані із зараженням Lawsonia intracellularis (ілеїт), (8) лімфаденопатію, (9) лімфоїдне виснаження і/або (10) рівень багатоядерних/гігантських гістоцитів, (11) синдром свинячого дерматиту і нефропатії (PDNS), (12) асоційовану з PCVAD смертність, (13) що асоціюється з PCVAD втрату маси, (14) відносну варіабельність росту, (15) відносну частоту появи «карликових» тварин, (16) відносне спільне зараження комплексом збудників репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV). Крім того, антигенна композиція, представлена в дійсному описі, знижує загальне навантаження цирковірусу, включаючи більш пізніший початок, укорочену тривалість і більш раніше закінчення віремії, а пониження вірусною навантаження і її імуносупресорної дії на молодих тварин, що зокрема мають антитіла до PCV2 в день вакцинації, призводить до вищого рівня загальної стійкості до захворювання і зниження випадків асоційованих з PCV2 захворювань і симптомів. Таким чином, ще одним об'єктом винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у молодих тварин і/або у тварин, які мають антитіла до PCV2, що полягає в тому, що вводять в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, що містить антиген PCV2, тварині, яка потребує такого лікування, де клінічні симптоми вибирають з групи, що включає: (1) інтерстиціальну пневмонію, що супроводжується інтерглобулярним набряком, (2) блідість шкіри або жовтяницю новонароджених, (3) плямисту атрофію печінки, (4) виразку шлунку, (5) нефрит і (6) репродуктивні порушення, такі, наприклад, як викидень, мертвонародження, висихання плоду в матці тощо, (7) Pia-подібні пошкодження, як правило, асоційовані із зараженням Lawsonia intracellularis (ілеїт), (8) лімфаденопатію, (9) лімфоїдне виснаження і/або (10) рівень багатоядерних/гігантських гістоцитів, (11) синдром свинячого дерматиту і нефропатії (PDNS), (12) асоційовану з PCVAD смертність, (13) що асоціюється з PCVAD втрату маси, (14) відносну варіабельність росту, (15) відносну частоту появи «карликових» тварин, (16) відносне спільне зараження комплексом збудників репродуктивнореспіраторного синдрому свиней (PRRSV). Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є спосіб лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у молодих тварин, що полягає в тому, що вводять в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, що містить антиген PCV2, тварині, яка потребує такого лікування, де клінічні симптоми вибирають з групи, що включає: (1) інтерстиціальну пневмонію, що супроводжується інтерглобулярним набряком, (2) блідість шкіри або жовтяницю новонароджених, (3) плямисту атрофію печінки, (4) виразку шлунку, (5) нефрит і (6) репродуктивні порушення, такі, наприклад, як викидень, мертвонародження, висихання плоду в матці тощо, (7) Pia-подібні пошкодження, як правило, асоційовані із зараженням Lawsonia intracellularis (ілеїт), (8) лімфаденопатію, (9) лімфоїдне виснаження і/або (10) рівень багатоядерних/гігантських гістоцитів, (11) синдром свинячого дерматиту і нефропатії (PDNS), (12) асоційовану з PCVAD смертність, (13) що асоціюється з PCVAD втрату маси, (14) відносну варіабельність росту, (15) відносну частоту появи «карликових» тварин, (16) відносне спільне зараження комплексом збудників репродуктивнореспіраторного синдрому свиней (PRRSV). Композицію, пропоновану у винаході, можна вводити орально, внутрішньошкірно, внутритрахеально або внутрішньопіхвово. Переважно композицію слід вводити внутрішньом’язово або інтраназально, найпереважніше внутрішньом’язово. Може виявитися переважним вводити описані вище фармацевтичні композиції в організм тварини внутрішньовенно або шляхом ін'єкції безпосередньо в тканини-мішені. Для системного введення переважними є внутрішньовенний, внутрішньосудинний, внутрішньом’язовий, інтраназальний, внутрішньоартеріальний, внутрішньочеревинний, оральний або внутрішньооболонковий шляхи введення. Локальніше введення можна здійснювати підшкірно, інтрадермально, внутрішньошкірно, внутрішньосерцево, внутрішньочастосково, інтрамедуллярно, внутрішньолегенево або безпосередньо в тканину, що підлягає обробці, або в довколишню область (сполучна, кісткова, м'язова, нервова, епітеліальна тканина). Залежно від необхідної тривалості і ефективності лікування композиції, пропоновані у винаході, можна 14 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вводити один або кілька разів, а також періодично, наприклад, з інтервалом один день протягом декількох днів, тижнів або місяців або з використанням різних доз. Переважно одну дозу описаної вище імуногенної композиції вводять внутрішньом'язово індивідуумові, що потребує цього. Ще одним об'єктом винаходу є антиген PCV2 або імуногенна композиція, що містить будь-який описаний вище антиген PCV2, яку фасують в флакони і вводять з розрахунку один (1) мл на дозу. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є імуногенна композиція об'ємом 1 мл, яка містить описаний вище антиген PCV-2, призначена для лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у молодих тварин шляхом введення в ефективної кількості антигена PCV2 або імуногенної композиції, що містить антиген PCV2, тварині, яка потребує такого лікування. Таким чином, ще одним об'єктом дійсного винаходу є також імуногенна композиція об'ємом 1 мл, яка містить описаний вище антиген PCV-2, призначена для лікування або профілактики зараження PCV2 або зниження клінічних симптомів, що викликаються або асоційованих із зараженням PCV2, у тварин, які мають антитіла до PCV2, шляхом введення в ефективній кількості антигена PCV2 або імуногенної композиції, що містить антиген PCV2, тварині, яка потребує такого лікування. Таким чином, ще одним об'єктом винаходу є щонайменше одне додаткове введення однієї дози імуногенної композиції, описаної вище, тварині, яка потребує цього, де друге або будь-яке додаткове введення здійснюють щонайменше через 14 днів після першого або будь-якого іншого попереднього введення. Переважно імуногенну композицію вводять у поєднанні з агентом, що стимулює імунітет. Переважно вказаний агент, що стимулює імунітет, вводять щонайменше двічі. Переважно між першим і другим або будь-яким наступним введенням агента, що стимулює імунітет, повинно пройти щонайменше 3 дні, переважніше щонайменше 5 днів, ще переважніше щонайменше 7 днів. Переважно агент, що стимулює імунітет, вводять щонайменше через 10 днів, переважно 15 днів, ще більш переважно 20 днів, ще переважніше щонайменше 22 дні, після первинного введення імуногенної композиції, пропонованої у винаході. Переважним агентом, що стимулює імунітет, є, наприклад, гемоціанін лімфи равлика (KLH), переважно емульгований з неповним ад'ювантом Фрейнда (KLH/ICFA). Проте, як має бути очевидно, можна застосовувати будь-який інший агент, що стимулює імунітет, відомий фахівцеві в даній області. Поняття «Агент, що стимулює імунітет» в контексті дійсного опису належить до будь-якого агента, який може «запускати» імунну відповідь, переважно без ініціації або підвищення специфічної імунної відповіді, наприклад, імунної відповіді на специфічний патоген. Крім того, прийнято вводити агент, що стимулює імунітет, в прийнятній дозі. Поняття «тварина» в контексті дійсного опису включає свиню, молоду (що не досягла статевої зрілості) свиню або поросяти. Детальний опис переважних варіантів здійснення винаходу Нижче в прикладах представлені переважні матеріали і процедури, вживані в дійсному винаході. Хоча при втіленні на практиці і перевірці дійсного винаходу можна застосовувати будь-які методи і матеріали, аналогічні або еквівалентні представленим в дійсному описі, нижче описані переважні методи, пристрої і матеріали. Проте слід розуміти, що ці приклади дані лише з метою ілюстрації і не направлені на обмеження загального об'єму винаходу. Приклад 1 Одержання антигена ОРС-2 PCV2 Початкові культури клітин лінії SF+, узяті з культури, що зберігається в рідкому азоті, вирощували в середовищі Excell 420 (фірма JRH Biosciences, Inc., Ленекса, шт. Канзас) в суспензії в стерильних колбах, що оберталися, при постійному перемішуванні. Культури вирощували в колбах, що оберталися, об'ємом від 100 до 250 мл, що містять від 25 до 150 мл безсироваткового середовища Excell 420. Коли клітини розмножилися до клітинної щільності 1,0 6 – 8,0 × 10 клітин/мл, їх розділяли, переносячи в нові ємності, використовуючи щільність посіву 6 0,5 – 1,5 × 10 клітин/мл. Наступні розмножуючі культури вирощували в колбах, що оберталися, об'ємом аж до 36 л або біореакторах з неіржавіючої сталі об'ємом аж до 300 л протягом 2-7 днів при 25-29 °C. Після посіву колби інкубували при 27 °C протягом 4 год. Потім до кожної колби вносили рекомбінантний бакуловірус, що містить ген ОРС-2 PCV2 (SEQ ID NO: 4). Рекомбінантний бакуловірус, що містить ген ОРС-2 PCV2, створювали згідно методу, описаному в WO 06/072065. Після внесення бакуловіруса колби інкубували при 27 ± 2 °C протягом 7 днів, і при цьому перемішували при 100 об/хв. протягом цього часу. Колби закривали вентиляційними кришками, що пропускають потік повітря. Після інкубації отриманий супернатант збирали, фільтрували для видалення клітинного дебриса і інактивували. Для інактивації супернатанту його температуру доводили до 37 ± 2 °C і 15 UA 103298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до супернатанту додавали бінарний етиленімін (БЕІ) до кінцевої концентрації 5 мМ. Подальше перемішування зразка продовжували протягом 72-96 год. Додавали 1,0M розчин тіосульфату натрію до кінцевої мінімальної концентрації 5 мМ для нейтралізації будь-яких залишкових кількостей БЕІ. Після інактивації ОРС-2 PCV2 забуферювали фосфатним буфером і додавали карбопол до приблизно 0,5-2,5 мг/дозу. Кінцева доза містила приблизно 16 мкг антигена ОРС-2 PCV2. Приклад 2 Імуноаналіз антитіл до PCV-2 1 Клітини лінії PK15 (наприклад, ATCC CCL-33) або VIDO R , описані в WO 02/07721, висівали в 96-лунковий планшет (приблизно 20000-60000 клітин на лунку). Клітини заражали ізолятом PCV2, коли конфлюентність моношарів досягала приблизно 65-85 %. Заражені клітини інкубували протягом 48 год. Середовище видаляли і лунки відмивали двічі ЗФР. Буфер для відмивання відкидали і клітини обробляли холодним фіксатором, що є сумішшю 50/50 метанол/ацетон (~100 мкл/лунку) протягом приблизно 15 хв. при температурі приблизно -20 °C. Фіксатор відкидали і планшети сушили на повітрі. Готували серійні розведення свинячої сироватки в ЗФР, додавали в планшети та інкубували, даючи антитілам, якщо вони були присутні в зразках сироватки, зв'язуватися, протягом приблизно 1 год. при 36,51 °C. Крім того, паралельно оцінювали серійні розведення, позитивні відносно антитіл до PCV2, і негативні контрольні зразки (зразки, що є позитивним контролем і негативним контролем). Потім планшети відмивали тричі ЗФР. ЗФР відкидали. Потім планшети забарвлювали козиним антисвинячим антитілом, що надходить у продаж, кон’югованим з ФІТЦ, розведенням в співвідношенні 1:100 в ЗФР, та інкубували протягом приблизно 1 год. при 36,51 °C, що давало можливість виявляти антитіла, пов'язані із зараженими клітинами. Після завершення інкубації мікропланшети вилучали з інкубатора, кон’югат відкидали і планшети відмивали двічі ЗФР. Планшети оцінювали за допомогою УФ-мікроскопа та індивідуальні лунки позначали як позитивні або негативні. Для оцінки тест-системи використовували зразки, що є позитивним контролем і негативним контролем. Якщо результати, отримані для контролів, знаходилися в очікуваних межах, то результати досліду приймалися як прийнятні з позицій методу оцінки параметрів. Титри сироваткових антитіл розраховували на основі найбільшого розведення, при якому спостерігалася специфічна IFA (метод непрямої імунофлуоресценції)-реактивність, і визначали кількість позитивних лунок для кожного розведення, або розраховували кінцеве значення TCID50 за допомогою відповідної формули Ріда-Менча. Приклад 3 TM Ефективність ОРС-2 PCV2 (Ingelvac® CircoFLEX ) відносно молодих тварин, що мають низький або високий титр антитіл до PCV2 Для вивчення можливої взаємодії вакцини з материнським антитілом проводили дослід, в якому титри антитіл у всіх піддослідних тварин визначали у момент вакцинації, після чого тваринних групували за ознакою низького, середнього або високого титру антитіл: геометричні середні значення титрів 1:1000 розглядалися як високі титри антитіл. Схема досліду Для досліду використовували приблизно 500 тварин. Цих піддослідних тварин збалансовано і порівну розділяли на дві оброблювані групи залежно від початкової ваги тіла і приналежності до певного приплоду. Всім тварини у віці 20 днів вводили одну дозу (1 мл) вакцини проти PCV2 (Investigational Veterinary Product (досліджуваний ветеринарний продукт), IVP) або однієї дози (1 мл) плацебо, що містить супернатант клітинної культури з ад'ювантом (Control Product (контрольний продукт), CP) шляхом внутрішньом'язової ін'єкції з праву сторону шиї. Піддослідних тварин досліджували до кінця періоду відгодівлі. Відбирали зразки крові всіх тварин і потім аналізували за допомогою IFAT (метод непрямої імунофлуоресценції) для визначення титрів антитіл у момент вакцинації. Потім визначали кореляцію початкових титрів антитіл і приросту маси. Крім того, залежно від початкових титрів антитіл тварин групували в три класи (низькі, середні і високі початкові титри антитіл)) і тварин, що мають «високий титр» з обох оброблюваних груп потім порівнювали відносно можливих відмінностей відносно приросту маси і віремії. Результати Початкові титри антитіл У момент проведення вакцинації більшість тварин мали або середні титри антитіл (на рівні від 1:100 до 1:1000), або високі титри антитіл (на рівні > 1:1000). Лише приблизно в 13 % тварин виявлені низькі титри антитіл (на рівні 1:1000) у момент вакцинації віремію, порівнювали вакцинованих і оброблених плацебо тваринних з високими титрами антитіл відносно початку, кінця, тривалості віремії, кількості днів, в які були отримані позитивні (відносно віремії) зразки, і вірусного навантаження. У таблиці 1 узагальнено порівняння параметрів віремії в тих, що мають «високі титри тварин» в обох оброблюваних групах. Таблиця 1 Порівняння параметрів віремії в тих, що мають «високі титри тварин» в обох оброблюваних групах Оброблювана група CP Початок віремії IVP CP-IVP CP Тривалість віремії IVP CP-IVP CP Кінець віремії IVP CP-IVP CP К-ть днів одержання IVP позитивних зразків CP-IVP CP Середнє значення IVP суми gE (log10) CP-IVP Оцінюваний параметр Кількість поросят 38 36 38 36 38 36 39 47 39 47 Середнє значення 111,90 дня 109,50 дня 2,4 дня 27,00 днів 17,50 дня 9,50 дня 138,90 дня 127,00 днів 11,9 дня 3,70 дня 1,80 дня 1,9 дня 18,79 gE 9,12 gE 9,67 gE Медіана P 113,00 днів 113,00 днів 0,7843 ns 27,50 дня 6,50 дня 0,05; ** достовірно, p 1:1000) виявлена також істотно вища маса тіла на початку віремії в порівнянні з обробленими плацебо тваринами з початковими високими титрами антитіл. Як видно з фіг. 3, маса тіла (LSMean) в тиждень 17 і тиждень 22 досліду опинилася дійсно істотно вище у вакцинованих «тварин з високими титрами» (тиждень 17 досліду: 1,55 кг, p = 0,0328; тиждень 22 досліду: 3,06 кг, p = 0,0007), ніж в оброблених плацебо «тварин з високими титрами». У поєднанні ці дані свідчать про відсутність взаємозв'язку між IVP і титром антитіл у момент вакцинації. Висновок Для вивчення можливої дії материнських антитілоцінювали кореляцію початкових титрів антитіл з двома параметрами ефективності, такими як віремія в крові і жива маса тіла. В порівнянні з обробленими плацебо «тваринами з високими титрами» виявлені наступні статистично значимі відмінності з вакцинованими «тваринами з високими титрами»: - зниження втрати приросту маси - коротша тривалість віремії і раніший кінець віремії - нижче вірусне навантаження. Приклад 4 TM Ефективність ОРС-2 PCV2 (Ingelvac® CircoFLEX ) для молодих тварин, що мають антитіла до PCV2, відносно лімфоїдного виснаження, лімфоїдного запалення і лімфоїдної імуногістохімії (ІГХ) Метою що цього проводиться усліпу з використанням як контрольне зараження вакцинації досліду була оцінка віку, в якому у поросят, вакцинованих вакциною свинячого цирковірусу типу 2, що містить убитий бакуловірусний вектор, розвивається імунітет у присутності отриманих від матері антитіл до свинячого цирковірусу типу 2 (PCV2). Після контрольного зараження аналізували три основні параметри. Ці три параметри були лімфоїдним виснаженням, лімфоїдним запаленням і результатами лімфоїдного імуноногістохімічного аналізу (ІГХ). Для демонстрації розвитку імунітету у присутності отриманих від матері антитіл до PCV2 у вирощених в стандартних умовах поросят, вакцинованих вакциною проти PCV2 у віці 3 тижня або 8 тижнів, мають бути виявлені статистично значимі відмінності (p