Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який являє собою варіант ліпази, яка стимулюється солями жовчі (bssl) і має її активність (варіанти), поліпептид (варіанти), фармацевтична композиція

УКРАЇНА (19»UA (11)48109 (із) С 2 (5i)6C12N9/20,9/16,15/55,A61K38/00, 38/46,С07Н21/04 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ОПИС ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) МОЛЕКУЛА НУКЛЕЇНОВОЇ КИСЛОТИ, ЩО КОДУЄ ПОЛІПЕПТИД, ЯКИЙ ЯВЛЯЄ СОБОЮ ВАРІАНТ ЛІПАЗИ, ЯКА СТИМУЛЮЄТЬСЯ СОЛЯМИ ЖОВЧІ (BSSL) І МАЄ ЇЇ АКТИВНІСТЬ (ВАРІАНТИ), ПОЛІПЕПТИД (ВАРІАНТИ), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu G.y 5 10 15 Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp H e 20 25 Phe Lys 30 Val Gly Asn lie Ali Ala Phe Gly Gly Asp ISO Asr 210 Ala Pro ТЬЕ Lys Ala Leu G.u Asn Pro Gin Pro 40 45 H e Thr Gin Asp Ser Thr Tvr Gly Asp Glu Asp Cys 70 75 aO H e Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin Val Ser 85 SO Э5 Arg 115 Vil Civ 14 = вїв As- T- - Glv 120 Thr Arg C'v Asn Va 135 125 — - Pne Asr TV- Ar 26; 27S Pro 250 iso Ars 27 0 Mac Leu Vxs T,r Val Gly Phe Val 280 285 H e Asp Gly Asp Phe H e Pro Ala Asp Pro H e АЗГ Leu Tyr 2SS 303 hU As- Ala Ala Asa H e Asp Tvr 1'e Ala Gxv Thr As- As, Met Asp 315 Gly 4_s IiS Ph° Ala Ser H e Asp Me; 325 335 330 Ala rie * « Lys 335 Asi U s L\s Val Thr Glu ClU Asp Pre Ту, Lys Leu Va- 5ЄЕ Glu Phe Thr 345 340 Ї.. Thr Lys Gly Leu Arg Gly 355 350 Lys Th' Thr Phe Asp Val Туг Thr Giu Ser ТЕП Ala Gin Asp Pro Ser Gl- Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val 3^0 375 3E0 Val A s - Phe Glu ThE Asp Val Leu Pne Leu Val "is ThE GlU H e Ala 3E5 395 400 390 " ^ A.a Gin HIE Arg Ala Asn Ala 410 405 Leu Ser Pro Ser Aro Het Pro Val Tyr 425 S20 Ala As» His Ala A s p Asp He 435 О CO Ala Lvs Thr Tyt Ala Туг HIS 415 Pro Lya Trp Val Gly Gin I . I Val Phe Gly Lvs Pro phe Ala " 440 445 о Thr Pro ThE Gly Tyc Arg Pro Gin Aso Arg Thr Val Eer Lys Ala Met •160 450 455 He Ala L/E Thr Gly Asp Pro As» Met Gly Tyr Trp Tftr Asn 475 480 47 0 Phe 4 55 Asp Se- Ala val Prn T^E HJ.S 4S5 Leu Glu I L 500 Tnr A ™ 515 530 Asp W 54 5 Tl" v=: T>ir L s Tip Glu Pro ТЛЕ Trr T Glu AS- Ser "-~ 490 Li* Met Gl> *ЄЕ Ser S*r Met L ' Arg SOS 5iO Phe Leu Ara ~V r Trp ThE L... Ї :Tyr " ; =-PEG T " S2C ThE AS= Gin G.u A.a T'r Pro 5J5 54; L Glu Ala Tl-r Pro V*l F-o Pro Thr Gly AS= *.r S55 5ЄЕ ClU Ala Gl Thr Ala 560 Gly Ala fto Pro Vsi Pro Pro Thr 570 57 5 Gly Asp Ser G.y Ala Pro Pro V*l Pro Pro Thr Gly Asp ser Gly Ala 5SS sao 580 Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Cly Ala Pro Pro Val Pro Pro 600 6Л= ThE Gly Asp Ser Gly X I . Pro Pro Val Pro Pro ТІ1Е G_v Asp Ser Gly 610 62S L e u Leu 220 260 Pro Le., Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Val Pro Pro Thr Glv Asp 565 Se- C!y His Gly Ala Asn Phe Leu Asi Asn T,r Leu T i t Asp Gl/ Glu О „ :,і д.a 1 j 215 Cys Leu Lya Val T^r Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lvs Lys Arg Cys 55 60 Leu Tyr Le Gly Leu H e Arg Arg Ala lls Ser Gin Eer Gly Val Ala Leu Ser Leu A.a 150 Aia Gil. Lys Val Gly Cys Pro Val Gly As о Ala Ala Arc Het Ala Glr 24.5 250 255 H-s Gly Trp 50 Asn Asr H e Thi Leu p n e Gly Ser Pro Trp Val H e Gin Lys Asn pro Leu Phe Trp Ala Lys L/s Val 225 235 230 240 Gi, 35 185 Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Se- Leu Gin Tr-r Leu Sei Pro Tyr 200 205 Ala Pro Pro Val "o 625 Pro Thr G'y Asp 630 s " Gly Ala P-o Pro Val Pro 640 ass Pro Tir Gly Asp Ala G.y Pro Pra Pra Val PEO 645 650 PEO Г--Е Gly Asp Ser 6S5 481 (21)95083973 (22)25 02 1994 (24)15 08 2002 (86) PCT/SE94/00160, 25 02 1994 (31)9300686-4 (32)01 03 1993 (33) SE (31)9300722-7 (32)04 03 1993 (33) SE (46) 15 08 2002, Бюл № 8, 2002 р (72) Блекберг Ларс , SE, Едлунд Мікаель , SE, Ханссон Леннарт , SE, Хернелль Олле , SE, Лундберг Леннарт , SE, Стрьомквіст Мате , SE, Тьорнелль Ян , SE (73) АСТРА АКТІЄБОЛАГ, SE (56)WO9118923A1, 12 121991 WO 9115234 А1, 1710 1991 (57) 1 Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, который представляет собой вариант стимулируемой солями желчи липазы (BSSL) и имеет ее активность, включающий менее чем 722 аминокислот, у которого одна или более, но не все из аминокислот участка, соответствующего аминокислотам 536-722 представленной последовательности, обозначаемой как SEQ Ю NO 3 в списке последовательностей, делетированы 48109 Gi. A-a Pra P-c Val F-o ?rs Tir G l / Asp Sar О , ' А„а Pi; Ргз V = I 660 6S5 E?0 L.'S Lvs Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr. Lys Lev. Val Ser Glu Phe Thr 340 345 3S0 Thr F;a u Pro Tnr Val Thr Asp Sir. Gly =35 535 l i e A.a Tvr Trp Tr.r Asn Phe Ala L-'S Tr.r Gly Asp Fro Asn Met Gl, Asp Ser Gly Ala Pro Pro Vai Pro Pro Г т е « у Asp Ser Lys Glu Ala 5 l 1 5 г 0 555 560 " 455 Asp Se 470 Ala Val Pro Thr Kis 4Э5 J75 Trp Clu Pro Tjr 490 48Є T h r ThE G l u Asn 195 Ser Cln «ее Pro Ala Val lie Arg Phe 565 ~s Г-- * е- • } - ""v- ' at. *• P r = V a l 540 P z a р „0 r h , '" c l ti_ Gly ТЧГ Leu Glu l i e Thr Lys Lys Met Sly Sei Ser Ser «SE Lys Arg S0G 505 510 Met Leu Thr M e t Gly Arg Leu Glr. Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys ~" -20 -із ,10 Ser Leu Arg Thr Asn Pha Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyt Leu Ala 515 , $20 525 Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu -5 1 5 Leu Pro Thr Val Thr Asp Gin Lys Glu Ala Gin Met Pro Ala Val 530 535 540 Sly Gly Phe V a l Glu Gly Val As.-) Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp 10 її 20 2S Arg Phe 545 lie Ser Vai Asp H e Phe Lys Oly ; u Pro phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala 30_ 35 40 , * Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Cly Gly Phe Val Glu Gly Val 1 5 10 15 Leu Glu Asn Pro Gin Pro Pis Pro Gly Trp Gin-Gly Thr Leu Lys Ala 45 SO 55 Asn L/s Lys Leu Gly Lau Leu Gly Asp Ser Val Asp l i e Phe Lys Gly 20 25 30 Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Lei, Gin Ala Thr H e Thr Gin Asp Ser 60 65 70 l i e Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro й і п Pro His 35 40 45 Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn H e Trp Val Pro Gin 75 B0 35 Pro Gly Trp Gin Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys SD 55 60 Gly Arg Lys Gin Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Het H e Trp H e Tyr SO 95 100 105 Leu Gin Ala Thr l i e Thr Gin Asp Sex Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys 65 70 75 30 Gly Gly Ala Pne Leu Met Gly Ser Gly Kis Gly Ala Asn Phe Leu Asn 110 115 120 Leu Tyr Leu Asn l i e Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin Val Ser Arg B5 90 95 Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu H e Ala Thr Arg Gly Asn Val H e 125 130 135 Asp Leu Pro Val Ke: l i e Trp l i e Tyt Gl/ Gly Ala Phe Leu Mac Gly lOv IDS П0 Val Vai Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr 140 14S _ 150 Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin his Met 155 160, 165 Ala H e Ala Trp '.'a! Lys Arg Asn H e Ala Ala Phe Gly Gly Asn Prc 170 175 130 185 S*i- Giy His Cly Ala As.-, Pne i-^j Asn Asn Tyr Leu Tvr Asp Gly Glu US 13C US Glu l i e Ale Thr Arg Gl/ Asn Val 120 US l i e Val Val Thr Phe Asn Tyr Arc _ 140 Val Gly Pro Leu Gl/ Fhe Leu Ser Thr Gly Asp A U Asn Leu Pro Gl/ 115 ISO 1SS 16І Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin His Met Ala lie Ala Trp Val Lys Arg US 170 175 Asn H e Ala Ala Pbe Gly Giy Asp Pro Asn Asn lie Thr Leu Phe Cly ISO IBs 190 • Giu Ser Ala Gly Gly A!a Ser Val Eer Leu Gin Thr Leu Ear Pro Tyr 195 200 205 Asn Lys Gly Leu lie Arg Arg Ala lie Ser Sin Eer Gly Val Ala Leu 210 215 220 Ser Pro Trp Val Ц е Gin Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val 225 23C 235 240 Ala Glu Lys Val Civ Cvs Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg fet A U Gin 245 " 250 255 cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Lau Thr Leu Ala Tyr Lys Val 2S0 265 270 Pro Leu Ala Gl/ Leu Glu Tyr Pro MetLeu His Tyr Val Gly Phe Val 275 " 2S0 285 Pro Val lie Asp Giy Asp Phe H e Pro Ala Asp Pro lie Aso Leu Tyr 290 2SS 300 Ala Asn Ala Ala Asp H e Asp Tyr lie Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp >0S 310 313 320 Gly His H e Phe Ala Ser H e Asp Met Pro Ala lie Asn Lys Gly Asn 325 330 335 Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr 340 345 350 H e Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr 355 360 ЗЙ5 Glu Ser Trp Ala Gin Asp Pro Sec Gin Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val 370 3-7S 380 Val Asp"phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Tnr Giu H e hie. 385 390 3S5 400 Leu Ala Gin His Arg Aia Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr 405 410 _ 41£ Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly 420 425 430 Ala Asp His Ala Asp Asp tie Gin Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe A U 435 440 445 Tr.r Pro ThE Gly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Val Eer Lys Ala Met 450 455 460 H e Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala L/s Thr Gly A ly Asp Pro Asn M e C Gl> 75 (so Asp Ser Ala \al Pro T - r Kis Trp Glu Pro Тут Tr.r 7hr G"u Asn Ее.. 435 490 "' * 455 Asn Asr, H e Thr Leu Phe Cly Glu Ser Ala Gly Cly Ala Ser Val Ser 19C 1?S 20C Leu G1-. Thr Lsv Se; F: 20= Asr. Lvs G-*n Leu H e Arg Arc Aia. H e 210 " 215 Ser Gin Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp Val H e Gin Lys Asn Pro 220 225 230 Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly 235 240 245 Asp Ala Ala Arg Met. Ala Gin Cys Leu t \ s Val Thr Asp Pro Arg Ala , 250 255 260 265 Leu Thr Leu Ala їуг Lys Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met 270 275 280 Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val H e Asp Gly Asp Phe H e Pro 235 290 295 Ala Asp Pro H e Asn Leu Tyr Ala Asn Ala Ala As-p H e Asp Tyr H e 300 305 310 Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His lie Phe Ala Eer H e Asp Met ЗІЕ 320 325 Pro Ala H e A.SB Lys Gly Asn Lys Lys Vai Thr Glu Glu Asp Phe Tyr 330 335 340 345 Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr H e Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys 350 355 3S0 Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Aia Gin Asp Pro Ser Gin 365 370 375 Glu Asn Lys Lye Lys Thr Val Val Asp Pne Glu Thr Asp Val Leu Phe 380 3S5 390 Leu Val Pro Thr Glu H e Ala Leu Ala Gin His Arg Ala Asn Ala Lys 395 400 405 Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Eer His Pro Ser Arg Met Pro 410 415 420 425 Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp H e Gin Tyr 430 435 440 48109 Ttr A.a 57S G . y Asp S e r G i u 55; P-o P r o \ * i Pro The G.y Asa Gly ro Ser Ala p-o V*i Т с Ser С у 590 hie ASK pic 58s S a r C i J A-S 5SC P r o Pr= Val P r o P r o Thr Gly Asp Ser 5*5 EOS P r o P r o Т Ы G l y Asp S e r G l . A l s S10 Pro Pro SIS Vai L / s G l u A l a G l P Met P r o A l s 63S 640 Va, Phe Ala Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Asp Sex Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr 4S0 Thr Thr AsnSer 455 T> r Gi\ ;: 470 L e u G . i . H e T i r L y s Lv 50C обозначаемые как SEQ ID NO 5, 6, 9 в списке последовательностей 8 Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, который представляет собой вариант стимулируемой солями желчи липазы (BSSL) и имеет ее активность, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 90% гомологична следующей аминокислотной последовательности Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val I S 10 15 Asi- Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp lie Phe Lys Gly 20 25 30 lie pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gin Pro His 35 40 45 Lvs р . э ™br V a l 53 3 •ї G.\ Ser Ser Ss --Г P r o Val 540 Pro Prc T r r Gl, Co Ale T 4 r Aso Сіл G l u 5 = • Ser Gli T !" J ' - Pr = Pro Pro THr « > 5Є5 Asp Pro Val 1 Glv Asp Pro Pro Val Pro Eer Gly Ala 5B0 5Э5 Pro pro Ser Val Pro Thr Gly 555 6-У Pro 5E5 Gly A U Pro 615 Ala Pro Pro Val Pio P'O 530 Thr ci> G l / Asp Ala Gly 61S Pro Pro Thr Glv Ala Pro Pro Pro Pro \al G l y T r p G i n G l y T h r L e u L y s A l a L y s A s n P h e L y s L y s A r g Суг 50 SS SO Pro Val 605 pro Ser Pro Pro T'-r Gly Asp 620 Glv 53 5 Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser S5S Pro Leu 6S G i n A l a T h r H e T h r G i n A s p S e r T h r T y r G l y A s p G l u A s p Су? їй 75 ao Leu T y r L e u Asn H e T r p V a l as A s p Leu P r o Val І00 Ser P r o Gin Gly Arg SO Met H e T r p l i e Lys G i n Val Tyc Gly G l y Ala 105 Seir A r g 95 P h e Leu Me£ G l y 110 G l y H i s G l y A l e Asn P h e L e u Asn Asn T y r L e u T y r Asp G l y G l u 115 120 125 Glu l i e Ala 130 T h r A r g G l y Asn V a l US чаї 145 G l y P r o L e u G l y Pi-э L e j S e r T n r С ISO " Asp Ala 155 Asn L e u P r o G l / ISO AET T y r Gly Leu Arg Asp G i n h i s 165 H e Ala T r p Val Asr H e Ala С І Ї lie T h r L e - P h e Gl> 190 Glu S e r A l a G l y G l y A l a S e r \ a l S e r L e a G_n T h r L e u S e r 195 200 20$ Ala ISO P h e G l j G l y Asp H e Vei Мес A . a I"c r = As13= Val T h r P h e Asn T y r 140 Arg L>s Arg 175 P r o Tyr Asn Lys Gly Leu H e Arg Arg Ala H e Ser Gin Ser Gly Val Ala Leu 210 215 220 Ser Pro Trp Val H e Gin Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val 225 230 235 240 A-ta Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Мес Ala Gin 245 250 255 Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val 260 265 270 Pro LEU Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val 275 230 2S5 Pro Vil H e Asp Gly Asp Phe H e Pro Ala Asp Pro U s Asn Leu Tyr 290 2SS 300 Ala Asn Ala Ala Asp lie Asp Tyr H e Ala Gly Thr Asn Asn Мес Asp 305 310 315 320 Gly His H e Phe Ala Ser lie Asp Met Pro Ala lie Asn Lys Gly Asn 325 330 325 Lys Lys Val Thr Glu 340 GIJ Asp Phe Tjf L.s Leu Val Ser Glu Phe Thr 345 350 H e Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys T4r ^hr Phe Asp Val Tyr Thr 355 360 J65 Glu Ser Trp Ala Gin Asp Pro Eer Gin Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val 370 375 380 Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu P*ie Leu Val Pro Thr Glu H e Ala 38= 390 395 400 Leu Ala Gin His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr 405 , 410 41S Leu Pbe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly «D 425 430 Ala Asp His Ala Asp Asp H e Gin Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala 435 410 445 Thr Pro Thr Cly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met 4S0 455 460 Val Pro Thr ЄВ5 dy As = Glu Ala A.a Pro Pro Ala Val He 720 Gly Asp Ssr Gly Al! T*-r °ro Tbr Gly S7S Asp ser Glu Ala Pro V*l ==o Ala **> Pro Val Pro Pro \al Prc 7C5 Arg Pro Thr Asp Asp Sec 710 G'y Asp Lvs Gil. Pro 540 Pro Pro Pro Т1Г Gly pro Ssr V.I Val Ser T Ala Pro 6S0 ss; P-o 575 ser Gly Ala 590 Pro 6Ё0 Pro Pro Pro Thr Gly Asp 655 Pro £гг 570 Ser Gly Ser Gly 610 Asp 600 Asp Tnr Glu . L e u A r a " Г " Asn Phe Let. Arg 515 5;v Ass SiS 12г Arg Phe е 64 Gly 430 Asn Le Asp Set Cly A.a Pro Pro Val 635 Pro Тії 620 He Ala Tyr Trp Thr 455 P r « P r o T h - O.v a"S P r o P r o Val fiOS P r o P r o TV— C i v A s p S e r Q i . 10 AU Pro 670 700 715 Phe обозначаемой как SEQ ID NO 7 в списке последовательностей, за исключением тех молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид, имеющий остаток аспарагина в положении 187 9 Молекула нуклеиновой кислоты по п 8, отличающаяся тем, что кодирует полипептид, содержащий следующую аминокислотную последовательность Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Vil 1 5 1 0 15 Asr Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ssr Val Asp He Phe Lys Gly 20 25 30 He Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gin Pro His 3S iO 45 Pro Gly Trp Gin Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys 50 55 if, Leu Gin Ala Thr He Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp CyE 6S 70 75 S O Leu Tyr Leu An He Trp Val Pro eln Gly Arg Lys Gin Val Ser Aig s S5 50 35 Asp Leu Pro Val Mt He Trp He Tyr Cly Gly A Phe Leu Met Gly e U 100 105 H O Sar G l y H i s C l y A U Asn P h e ї-eu Asn Asn T y r Leu T y r Asp G l y G l u 115 120 125 Glu H e A l a T h r Arg Gly Asn Val 130 135 H e V41 V a l T h r Phe Asn T y r Arg 140 . a l G l y P r o Leu G l / P h - Le IKS 150 Asp A l a Asn Leu P r o G1- 1 1S5 ISO Asn T > r C l y Leu A r g Asp G i n h i s Мес „ . a 165 „ H e A l a T r p Val Asr H e Ala Ala Pne Gl/ Gly Asp Glu Ser Ala Gly Gly 195 Asn Lys Gly Leu H e 210 Ser Pro Trp Val lie 225 L j s Arg 175 lie Thr Le_ Phe ISO Ala Ser \al Eer Lej G_n Thr Leu £er Pro Tyr 200 205 Arg Arg Ala H e Ser Gin Ser Gly Val Ala Leu 215 220 Gin Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val 2Ї0 235 240 Cys Leu Lys Val Tnr Asp Pro Arg Ala Leu Tfir Leu Ala Tyr Lys Vai 2S0 26= 270 Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Мес Leu His Tyr Val Gly Phe-Vai 275 230 285 Pro Val H e Asp Gly Asp Phe H e Pro Ala Asp Pro H e Asn Leu Tyr 290 295 300 A l a Asn A l a A l a Asp l i t Asp T y r lie 305 310 \1& G l y T h r Asii Asn Мес Asp 3IS 320 11 її» 48109 Gly 4iS Рче A l a S e r l i e Акр Met p ~ a A l a 325 130 L^5 L y s V a l T h r G l u G . . Asp Р*-в Т у г 340 315 He T h i Lys G l y L-ч Arg Giy Ala L y s 35=. JSE l i e Asn Lys G l y Asrs 33= ДЕР Pbe SHI Pha M p Val i-yr Т я г 365 T h r Asp Val і л ц Рйе Leu V a i P e e T h r G l u l i e 35Є Ї95 Ala 800 Lei. A l a / Leu Arg Gly Ala Lys 350 355 360 Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gin Asp Pro Ser Gin 3ES 370 375 Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr A S B Val Leu Phe 3S0 385 ЭЭО Leu Val P==> Tnr Glu H e Ala Leu Ala Gin "-s Arg Ala Asn Ala Lys 395 400 405 Еэг Ala Lys Thr Tyr Ala Tj r Leu Phe Ser я-s Fro Ser Axg Met P E O 410 4 IS 423 «5 Val Tyr ?ro ІЛ-S Trp Val Gly Ala Asp "Is Ала Asp Asp H e Gin Tyr 430 435 440 Val Phe Gly Lvs =ro phe АІД Thr P-o ™hr G_y Туг Агя Pro Gin Азо 445 450 455 Arg Thr Val Ser Lys Ala Met H e Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys 4=0 465 470 Thr Gly 47b ASD Pro Азп Мес Gly Asp ser Ala .'aI Fro Thr Hi.s Trp Glu «HO 435 P-o Tyr Thr Tnr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Gli. H e Thr Lys Lys Met 490 4Э5 sac SOS Gly Sar Ser Ser Met Lys Arg Esr Leu Arg Tnr Asr Phe Lau Arg Tyr 510 515 S20 Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gin Glu Ala 525 530 S3S Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro 540 545 550 Thr Gly Asp Ser Glu Tir A-a Pro Val Pro Pro Thr Glv Asp Ser Gly 5S5 5S0 565 Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val pro 570 575 5S0 585 Pro Tht Cly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gl> Asp Ser ЕЭ0 595 600 Oh A b * Pro Pro val Pro Prs Ttr Glv Asp Ser Gly Ala Prc Pro Vai oS5 S10 Sis *>ro Pro Thr Glv A S D Sar Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Glv Asp 620 S2S ВЭО Нес Leu Thr Мес Glv Axg Leu Gin Leu Val Val Leu Glv Leu Thr Cys -21 20 -15 10 Sar Glv Ala Pro Pro \лі Pro Pro Tfr Ci/ ЙЗэ eiC Cys Trp Ala Val Ala -S \лі Pro Pro Thr Sly 650 Asp Ser Gly Ala "it, S70 Pro Val Pro Pro Thr SES SB; Ala A-a Lys Leu Gly Ala Val Туг Thr Glu 1 5 Су cly Pne Val Glu Gly V*l Asn 10 15 LJS LVS Leu Glv Leu Leu Gly Asp 20 25 Se: val Asp H e Pfe Lys Gly H e Pro phe Ala Ala Pro Thr Lvs Ala 30 is 40 Leu Glu Asn Pro Gin Fro Jxs Pro Gly Trp Gin Gly Thr -en Lys Ala 45 50 55 L.'S Asn Phe Lys Lvs Arg Cvs Leu Gin Ala Thr H e Thr Gin Ast> Sei 60 65 70 Thr Tyr Gly Asp Gig Asp Cvs Lej Tyr Lau Asn lie Trp Val Pro Gin 15 Gly Arg Lys Gin Val Ssr Arg Asa Leu Pro Val Met lie Trp lie Tyr 90 9S 100 105 Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Sar Gly His Gly Ala Asn. Phe Leu Asn 110 115 120 Asn ТІГ Lau Tyr Ase Gly Glu Glu H e Ala Thr Arg Gly Asn Val H e 125 130 135 Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Ml Gly Pro Lea Gly Phe Leu Ser Thr 140 1*5 ISO Gly Asp Ala Asn Leu Pro Cly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin His Me; 1S5 ХЄ0 165 Qiy C,s Pro Vai Gly 245 _ J S .Л. Asp AJa ~.a Arg Чес Ala Gin Cys Leu i / -a! Trr Asp prc Arg Ala .s 250 Э55 2Zi: Pro Asr Met P r o T**C H . s T r p OIL P r u T y r T h r T h r C i v Asn S e r 485 і 0 4C5 e_ P.c T-r \al The 530 Ala H e Ala Trp Val Lys Arg Asn H a Ala Ala Pha Gly Gly Asp Pro 170 175 130 IBS Asn C-« S e r Trt> A l a С П Asp ? - o S e r G i n S . u Asn L y s L v s іл-s T h e V a l 370 375 380 V»! 385 12 Gly ASD A U CI/ P-= »'» Pro S4S Asp Ser Ciy Ala Prc Pro Val Pro Pro Thr Gly 655 660 665 Pro val Г-it Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala 6"5 S80 Gly Asp Ssr Gly Aaa "to Pio Val P-o Prc Thi 69C 69S А з р E e r Gj,u A l a A l a P r o V a l P r o P r o T h r Asp Asp S e r L y s e l u 700 705 710 Ala Gin J^et Prc Ala Val H e Arg Pbe 715 720 обозначаемую как SEQ ID NO 2 в списке последовательностей, отличающийся тем, что представляет собой делеционный мутант, выбранный из группы, включающей - полипептид, у которого аминокислотные остатки -23-0 и 536-711 представленной последовательности делетированы, - полипептид, у которого аминокислотные остатки -23-0, 536-568 и 591-711 представленной последовательности делетированы, 13 48109 14 - полипептид, у которого аминокислотные остатки -23-0 представленной последовательности делетированы и аминокислота Asn в положении 187 заменена на Gin, - полипептид, у которого аминокислотные остатки 632-708 представленной последовательности делетированы 11 Полипептид по п 10, отличающийся тем, что находится, по существу, в чистой форме 12 Полипептид по п 10 или 11, отличающийся тем, что его применяют в терапии 13 Полипептид, кодируемый последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп 1-9 14 Полипептид по п 13, отличающийся тем, что находится, по существу, в чистой форме 15 Полипептид по п 13 или 14, отличающийся тем, что его применяют в терапии 16 Фармацевтическая композиция для использования в лечении патологических состояний, связанных с экзокринной недостаточностью поджелудочной железы, муковисцидозом, хроническим панкреатитом, жировой малабсорбцией, вследствие физиологических причин, отличающаяся тем, что включает эффективное количество полипептида по любому из пп 10, 11, 13 или 14 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель 17 Полипептид, применяемый для производства лекарственного препарата для лечения патологи ческого состояния, относящегося к экзокринной панкреатической недостаточности, отличающийся тем, что указанный полипептид представляет собой полипептид по любому из пп 10, 11, 13 или 14 18 Полипептид по п 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата для лечения муковисцидоза 19 Полипептид по п 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата для лечения хронического панкреатита 20 Полипептид по п 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата для лечения жировой малабсорбции 21 Полипептид по п 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата для лечения малабсорбции жирорастворимых витаминов 22 Полипептид по п 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата для лечения жировой малабсорбции вследствие физиологических причин 23 Полипептид по п 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата для улучшения усвоения пищевых липидов 24 Полипептид по п 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата для улучшения усвоения пищевых липидов недоношенными детьми Настоящее изобретение относится к новым полипептидам, которые представляют собой варианты стимулируемой солями желчи липазы /BSSL, ЕС 3 1 1 1 / Оно также относится к молекулам ДНК, кодирующим упомянутые полипептиды, и к субпродуктам, содержащим упомянутые молекулы ДНК Изобретение также относится к способам продуцирования упомянутых вариантов BSSL, и к продуцированию трансгенных млекопитающих, не принадлежащих к человеку, способных экспрессировать варианты BSSL Кроме того, изобретение относится к таким трансгенным животным, и также к детскому питанию /infant formula/, содержащему молоко таких трансгенных животных Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим упомянутые полипептиды, и к применению упомянутых полипептидов и молекул ДНК в производстве лекарственных препаратов гидролиза сложноэфирных связей, чтобы дать начало менее гидрофобным абсорбируемым продуктам Эти реакции катализируются специфической группой ферментов, называемых липазами Полагают, что существенными для человека липазами являются желудочная липаза, панкреатическая зависящая от колипаэы липаза /гидролиз три- и диацилглицеролов/, панкреатическая фосфолипаза А2 /гидролиз диацилфосфатидилглицеролов/ и карбоксилэстераза /СЕН//гидролиз холестерилэфиров и эфиров жирорастворимых витаминов, но также три- , ди- и моноацилглицеролов/ При грудном вскармливании новорожденных стимулируемая солями желчи липаза /BSSL/ играет важную роль в гидролизе некоторых из вышеупомянутых липидов Вместе с солями желчи продукты переваривания липидов образуют смешанные мицеллы или однослойные везикулы /Helnell et al , 1990/, из которых происходит абсорбция Гидролиз пищевых липидов Пищевые липиды являются важным источником энергии Богатые энергией триацилглицеролы составляют более 95% таких липидов Некоторые из липидов, например, некоторые жирные кислоты и жирорастворимые витамины, являются существенными составляющими пищи До желудочнокишечной абсорбции триацилглицеролы, так же, как и минорные компоненты, т е , эстерифицированные жирорастворимые витамины и холестерол, и диацилфосфатидилглицеролы, требуют Стимулируемая солями желчи липаза Стимулируемая солями желчи липаза /BSSL/ является составной частью молока ряда видов, например, человека, гориллы, кошек и собак /Hernell et al , 1989, Hamosh et al , 1986/ При смешении с желчью в содержимом верхнего отдела тонкого кишечника BSSL специфически активируется первичными солями желчи /Hernell, 1975/ BSSL, которая отвечает приблизительно за 1% всего белка молока /Blackberg & Hernell, 1981/, не 15 разрушается во время прохождения через желудок, и в дуоденальном содержимом защищается солями желчи от инактивации панкреатическими протеазами, такими как трипсин и химотрипсин Тепловая обработка человеческого молока /пастеризация при 62,5°С ЗОмин /, которая инактивирует BSSL полностью /Bjoksten et al , 1980/, снижает коэффициент поглощения жиров у недоношенных новорожденных приблизительно на 1/3 /Williamson et al, 1978, Atkinson et al , 1981/ Следовательно, лучшее усвоение триацилглицерола свежего человеческого молока по сравнению усвоением детского питания с подобным жировым составом происходит благодаря BSSL /Hernell et al ,1991, Cnapelletal , I986/ BSSL является неспецифической липазой /ЕС 3 1 1 1 / , поскольку она гидролизует не только триглицерол, но также и ди- и моноглицерол, сложные холестерилэфиры и сложные эфиры жирорастворимых витаминов /Blackberg & Hernell, 1983/ Так, после активации BSSL имеет возможность гидролизовать большинство липидов человеческого молока сама по себе, хотя наиболее эффективное усвоение триглицерола человеческого молока требует синергичного действия желудочной липазы /ЕС 3 1 1 3 / , зависящей от колипазы панкреатической липазы /ЕС 3 1 1 3/ и BSSL /Berbacketal 1990/ Последние исследования говорят о том, что молочный фермент является особенно важным для усвоения новорожденными длинноцепных полиненасыщенных жирных кислот /1993/ Такие жирные кислоты являются важными предшественниками эйкозаноидов и важны для развития нервной системы Новорожденные, особенно родившиеся преждевременно, имеют ограниченную способность синтеза таких жирных кислот и их предшественников Следовательно, они считаются важными в течение пока еще не установленного периода после рождения В последних исследованиях ряда лабораторий охарактеризованы структуры кДНК как молочной липазы, так и карбоксиэстеразы поджелудочной железы /СЕН/ /ЕС 3 1 1 1 / /Baba et al , 1991, Hui et al , 1991, Nilsson et al , 1990, Reue et al , 1991/, и делается вывод, что молочный фермент и фермент поджелудочной железы являются продуктами одного и того же гена Последовательность кДНК и выведенная аминокислотная последовательность гена BSSL /СЕН /SEQ Ю N0 1/ раскрываются также в ВОИС 91/15234 /Oklahoma Medical Research Foundation/ и в ВОИС 91/18923 /Aktiebolaget Astra/ BSSL является гликопротеином с одной цепью Выведенный белок /SEQ ID NO 3/ содержит 722 аминокислотных остатка и является высоко гликозилированным /Abouakil et al , 1989/ NКонцевая половина белка показывает удивительную гомологию с ацетилхолинэстеразой и некоторыми другими эстеразами /Nilsson et al , 1990/ Предполагаемый остаток серина с активным сайтом располагается в серине-194, последовательность вблизи этого серина согласуется с консенсусной последовательностью активного сайта серингидролаз Единственный предполагаемый 48109 16 сайт N-гликозилирования определяется только семью N-концевыми остатками серина активного сайта /Nilsson et al , 1990/ Последовательность BSSL содержит в своей С-концевой части 16 богатых пролином повторов из 11 аминокислотных остатков каждый Оказывается, что изменение в числе повторов является главным объяснением различий в размере молекул и аминокислотном составе между соответствующими ферментами различных видов /Han et al , 1987, Fontaine et al , 1991, Kyger et al , 1989/ Эти повторы несут большую часть 15 - 20% углевода белка /Baba et al , 1991, Abouakil et al , 1989/ Уникальное структурное различие между BSSL и типичными эстеразами кроется в Сконцевой части полипептидной цепи, т е в 16 богатых пролином повторах из 11 аминокислотных остатков Соответствующие ферменты поджелудочной железы коровы и крысы имеют только 3 и 4 повтора, соответственно /Han et al , 1987, Kyger et al , 1989/ Следовательно, возможно предположение, что С-концевая часть, или по крайней мере часть ее, обязательны для липазной активности, т е , для действия против эмульгированного длинноцепного тирацилглицерола Липидная малабсорбция Обычными причинами малабсорбции и, следовательно, недостаточного питания, являются пониженные внутрипросветные /intralummal/ уровни панкреатической, зависящей от колипазы, липазы и/или солей желчи Типичными примерами случаев такой липазной недостаточности являются пациенты, страдающие муковисцидозом обычным генетическим нарушением, приводящим к недостаточности в течение всей жизни у 80% пациентов, и страдающие хроническим панкреатитом, часто вследствие хронического алкаголизма В настоящее время лечение пациентов, страдающих от дефицита панкреатической липазы, состоит в пероральном введении весьмабольших доз сырого препарата панкреатических ферментов Однако, зависящая от колипазы панкреатическая липаза инактивируется при низком рН, преобладающем в желудке Этот эффект не может быть полностью преодолен применением больших доз фермента Таким образом, большие вводимые дозы являются неадекватными для большинства пациентов, и, сверх того, препараты являются неочищенными и неприятными Сформулированы некоторые таблетки, которые проходят через кислотные отделы желудка и выделяют фермент только в относительно щелочной среде тощей кишки Однако, многие пациенты, страдающие панкреатическими нарушениями, имеют паталогически кислую среду в тощей кишке, и в таких случаях фермент из таблеток может не выделиться Более того, так как препараты, имеющиеся в настоящее время на рынке, происходят из нечеловеческого источника, существует опасность иммунореакций, которые могут вызвать опасные для пациента эффекты или привести к снижению эффективности лечения Другим недостатком имеющихся препаратов является то, что не установле 17 но содержание в них других липолитических активностей, кроме зависящей от колипазы липазы В действительности, большинство из них имеет очень низкий уровень активности BSSL /СЕН Это может быть одной из причин, почему многие пациенты, страдающие от муковисцидоза, вопреки дополнительному лечению, страдают от недостатка жирорастворимых витаминов и основных жирных кислот Таким образом, существует большая потребность в продуктах со свойствами и структурой, происходящими от липаз человека, и с широкой субстратной специфичностью, которые могут быть введены перорально пациентам, страдающим от нехватки одного или нескольких липолитических ферментов Продукты, которые могут быть получены при применении настоящего изобретения, удовлетворяют этой потребности сами по себе, или в сочетании с препаратами, содержащими другие липазы Варианты рекомбинантной BSSL по настоящему изобретению сохраняют каталитическую активность, но содержат меньше сайтов гликозилирования, чем полная BSSL, и получаются, таким образом, с потенциально пониженной степенью углеводной гетерогенности Это уменьшенное разнообразие облегчает очистку и исследование рекомбинантного белка, что будет приводить к более эффективному, по стоимости, производству полипептидов, обладающих активностью BSSL С другой стороны, пониженная степень гликозилирования менее требовательна к хозяину, и допускает более высокое продуцирование в некоторых клетках-хозяевах И еще, уменьшенное число сайтов гликозилирования в варианте BSSL допускает эффективное продуцирование в низших эукариотах и ограничивает потенциальный риск гликозилирования с отклонениями от нормы, которые могут вызвать иммунологические реакции Уменьшенный размер и меньшая сложность гликозилирования также предполагает, что круг хозяев шире, чем для белка, имеющего очень сложные и тяжелые углеводные составляющие Терапевтическое применение варианта BSSL, который меньше по размеру, но равен по активности, означает, что уменьшается масса вещества, необходимая для добавления Другим возможным преимуществом варианта рекомбинантной BSSL лишенного большинства или всех Огликозилированных повторов, является уменьшенный риск иммунологической реакции у отдельного реципиента Это происходит благодаря тому, что О-связанный сахар может очень гетерогенно зависеть от клетки, в которой он продуцируется В научной литературе имеются указания, что нативная BSSL связывается с и поглощается слизистой оболочкой кишечника Вариант BSSL, который выбирают для уменьшения поглощения, будет активным на субстратах пищевых липидов в течение более продолжительного периода времени, что ведет к более эффективному внутрипросветному перевариванию Примерами таких вариантов являются молекулы с пониженным гликозилированием 48109 18 Как упоминалось выше, предполагается, что BSSL имеет особую важность для усвоения длинноцепных полиненасыщенных жирных кислот /Hernell et al , 1993/, которые имеют большое значение для развития нервной системы у новорожденных, и для усвоения витамина А Вариант BSSL по изобретению, который является в этом отношении более эффективным, может быть выбран известными способами Усеченный, или укороченный, фермент должен, вероятно, отличаться в отношении конформации, которая может влиять на специфичность против различных липидных субстратов С одной стороны, изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который представляет собой вариант BSSL короче 722 аминокислот, причем упомянутый вариант BSSL содержит часть аминокислотной последовательности, представляемой как остатки 536 - 722 в SEQ ID NO 3 Выражение "часть аминокислотной последовательности" следует понимать как одну единственную аминокислоту, а также и как последовательность нескольких аминокислот или несколько таких соединенных последовательностей Термин "вариант BSSL" следует понимать как полипептид, имеющий активность BSSL и содержащий часть аминокислотной последовательности человеческой BSSL, представленной в списке последовательностей как SEQ ID NO 3 Термин "полипептид, имеющий активность BSSL" следует понимать, как полипептид, обладающий по крайней мере свойствами /а/ подходить для перорального введения, /Ь/ активироваться специфическими солями желчи, /с/ активирования, как неспецифической липазы, в содержимом тонких кишок, т е , способность гидролизовать липиды, относительно независимые по своей химической структуре и физическому состоянию /эмульгированные, мицеллы, растворенные/, и, не обязательно, обладающие одним или несколькими из следующих свойств /d/ способность гидролизовать триацилглицеролы с жирными кислотами с различной длиной цепи и различной степенью ненасыщенности, /е/ способность гидролизовать также диацилглицерол, моноацилглицерол, сложные холестерилэфиры, лизофосфатидилацилглицерол и ретинил и другие сложные эфиры жирорастворимых витаминов, /f/ способность гидролизовать в триацилглицероле не только сложноэфирные связи SO -1 (3), но также и сложноэфирные связи SO -2, /g/ способность взаимодействовать не только с первичными, но так же и со вторичными солями желчи, /п/ зависимость оптимальной активности от солей желчи, /і/ устойчивость в том смысле, что содержимое желудка не будет влиять на каталитическую эффективность в сколько-нибудь заметной степени, 19 /j/ устойчивость к инактивации панкреатической протеазой, например, трипсином, при условии, что присутствуют соли желчи, /к/ способность связываться с гепарином или производными гепарина, например, с гепаринсульфатом, /I/ способность связываться с интерфазами липид-вода, /т/ достаточная устойчивость, которая допускает лиофилизацию, /п/ устойчивость при смешении с составляющими пищи, такими как человеческое молоко или молочная смесь С другой стороны, изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты в соответствии с вышесказанным, при этом упомянутый вариант BSSL имеет остаток фенилаланина в своем Сконцевом положении, или содержит в С-концевой части последовательность Gln-Met-Pro, альтернативно, содержит аминокислотную последовательность, представляемую как остатки 712 - 722 в SEQ ID NO 3 своей С-концевой части В контексте настоящего описания термин "Сконцевое положение" означает положение заключительного С-концевого остатка в то время как термин "С-концевая часть" следует понимать, как приблизительно 50 аминокислотных остатков, которые составляют С-концевое окончание варианта BSSL Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, в соответствии с вышесказанным, при этом упомянутый вариант BSSL содержит менее 16 повторяющихся единиц В контексте настоящего описания термин "повторяющаяся единица" означает одну из повторяющихся единиц из 33 нуклеотидов каждая, которые указываются в списке последовательностей в SEQ ID NO 1 В других аспектах изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, в соответствии с вышесказанным, которая кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 90% гомологична с аминокислотной последовательностью, показанной как SEQ ID N0 5, 6 или 9 в списке последовательностей, так же, как и к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, показанной как SEQ ID NO 7 в списке последовательностей, за исключением тех молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, которые имеют остаток аспарагина в положении 187 Изобретение также относится к полипептиду, выявленному как SEQ ID NO 5, 6, 7 или 9 в списке последовательностей, также как и к полипептиду, кодируемому аминокислотной последовательностью, как упоминается выше Изобретение также относится к гибридному гену, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, в соответствии с вышеупомянутым, к вектору воспроизводимой экспрессии, содержащему такой гибридный ген, и к клетке, несущей такой гибридный ген Эта клетка может быть прокариотной клеткой, одноклеточным эукариотным организмом 48109 20 или клеткой, происходящей от многоклеточного организма, например, от млекопитающего В контексте настоящего описания термин "гибридный ген" означает последовательность нуклеиновых кислот, содержащую, с одной стороны, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант BSSL, как определяется выше, и с другой стороны последовательность нуклеиновой кислоты гена, который способен посредничать в экспрессии продукта гибридного гена Термин "ген" обозначает полный ген, как и его субпоследовательность, которые способны посредничать и нацеливать экспрессию гибридного гена в ткани, представляющей интерес Обычно, упомянутая субпоследовательность представляет собой суб последовательность, которая включает один или несколько промоторных участков, сайт инициации транскрипции, 3' и 5' -некодирующие участки и структурные последовательности Гибридный ген образуется, предпочтительно, вставкой in vitro последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант BSSL, в ген, способный посредничать в экспрессии, с применением технических приемов, известных в технике С другой стороны, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант BSSL, может быть вставлена in vivo путем гомологической рекомбинации В контексте настоящего описания термин "воспроизводимый" означает, что вектор способен реплицироваться в данном типе клетки-хозяина, в которую он введен Непосредственно в обратном направлении последовательности нуклеиновой кислоты может быть получена последовательность, кодирующая сигнальный пептид, присутствие которого обеспечивает секрецию варианта BSSL, экспрессированного клетками-хозяевами, несущими вектор Сигнальная последовательность может представлять собой последовательность, естественно ассоциируемую с последовательностью нуклеиновой кислоты или другого происхождения Вектор может представлять собой любой вектор, который можно удобно подвергнуть технологии рекомбинантных ДНК, и выбор вектора часто будет зависеть от клетки-хозяина, в которую он должен быть введен Таким образом, вектор может представлять собой автономно реплицирующиыся вектор, т е вектор, который существует как внехромосомный объект, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, примерами такого вектора являются плазмида, фаг, космида, минихромосома или вирус С другой стороны, вектор может представлять собой вектор, который, когда вводится в клетку-хозяина, интегрируется с геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой /хромосомами/, с которой он объединен Примерами подходящих векторов являются вектор бактериальной экспрессии и вектор экспрессии дрожжей Вектор настоящего изобретения может нести любую из последовательностей нуклеиновых кислот по изобретению, о которых упоминалось выше С другой стороны, изобретение относится к способу продуцирования рекомбинантного поли 21 пептида, причем упомянутый способ включает /і/ вставку молекулы нуклеиновой кислоты, упоминавшейся выше, в гибридный ген, который способен реплицироваться в специфической клеткехозяине или организме, /и/ введение получающегося в результате рекомбинантного гибридного гена в клетку-хозяина или организм, /ш/ выращивание образующейся в результате клетки в или на культуральной среде, или идентифицирование и репродуцирование организма, для экспрессии полипептида, и /iv/ извлечение полипептида Среда, используемая для выращивания клеток, может быть любой обычной средой, подходящей для этой цели Подходящим вектором может быть любой вектор из описанных выше, и соответствующая клетка-хозяин может быть любой из типа клеток, описанных выше Способы, используемые для конструирования вектора и осуществления введения его в клетку-хозяина, могут быть любыми из известных методов, применяемых для этих целей в технологии рекомбинантных ДНК Вариант рекомбинантной человеческой BSSL, экспрессированный клетками, может быть секретирован, т е транспортирован через клеточную мембрану, способом, зависящим от типа клетки и состава вектора Если вариант BSSL продуцируется внутриклеточно рекомбинантным хозяином, т е , он клеткой не секретируется, он может быть извлечен стандартными процедурами, включающими разрушение клетки механическими способами, например, ультразвуком или гомогенизацией, или ферментными или химическими способами, с последующей очисткой В целях секреции последовательности ДНК, кодирующей вариант BSSL, должна предшествовать последовательность, кодирующая сигнальный пептид, присутствие которого обеспечивает секрецию варианта BSSL из клеток таким образом, что по крайней мере значительная часть экспрессированного варианта BSSL секретируется в культуральную среду и извлекается Изобретение также относится к системе экспрессии содержащей гибридный ген, который экспрессируется в клетке-хозяине или организмехозяине, несущих упомянутый гибридный ген, так что рекомбинантный полипептид продуцируется, когда экспрессируется гибридный ген, причем упомянутый гибридный ген продуцируется посредством вставки последовательности нуклеиновой кислоты, упомянутой выше, в ген, способный посредничать в экспрессии упомянутого гибридного гена Возможным способом получения варианта рекомбинантной BSSL по изобретению является способ с использованием трансгенных, не принадлежащих к человеку, млекопитающих, способных выделять вариант BSSL в свое молоко Использование трансгенных, не относящихся к человеку, млекопитающих имеет то преимущество, что можно получать большой выход варианта рекомбинантной BSSL при разумной стоимости, и особенно то, что когда не относящимся к человеку млекопитающим является корова, вариант рекомбинантной BSSL продуцируется в молоке, которое 48109 22 является естественной составляющей, например, детского питания, так что не требуется дорогостоящей очистки, когда вариант рекомбинантной BSSL должен использоваться в качестве питательной добавки к продуктам на основе молока Кроме того, продуцирование в высшем организме, таком как не принадлежащее к человеку млекопитающее, естественно, ведет к правильному процессингу белка млекопитающего, например, в отношении посттрансляционного процессинга, как обсуждается выше, и к надлежащей складчатости Также можно получить большое количество по существу, чистого варианта BSSL Соответственно, система экспрессии, отнесенная к вышеупомянутой, может представлять собой систему экспрессии у млекопитающего, содержащую последовательность ДНК, кодирующую вариант BSSL, вставленную в ген, кодирующий белок молока не принадлежащего к человеку млекопитающего, с тем, чтобы образовать гибридный ген, который экспрессируется в молочной железе взрослой самки млекопитающего, несущей упомянутый гибридный ген Молочная железа, как ткань экспрессии, и гены, кодирующие белки молока, вообще, рассматриваются как особенно подходящие для использования при производстве гегерологичных белков в трансгенных, не принадлежащих к человеку, млекопитающих, так как белки молока продуцируются естественно при высоком уровне экспрессии в молочной железе Кроме того, молоко легко собирается и доступно в больших количествах В связи с этим использование генов белка молока при продуцировании варианта рекомбинантной BSSL, имеет еще то преимущество, что он продуцируется в условиях, подобным условиям его естественного производства в смысле регуляции экспрессии и места продуцирования /молочная железа/ Когда гибридный ген, упомянутый выше, используется в трансгенном млекопитающем, он, предпочтительно, содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид, с тем, чтобы создать возможность правильного секретирования гибридного генного продукта в молочной железе Сигнальный пептид будет, как правило, представлять собой пептид, который обычно обнаруживается в гене молочного белка, о котором идет речь, или пептид, ассоциированный с последовательностью ДНК, кодирующей вариант BSSL Однако, другие сигнальные последовательности, способные посредничать в секреции продукта гибридного гена в молочную железу, также являются уместными Конечно, различные элементы гибридного гена должны сливаться таким образом, чтобы создать возможность для правильной экспрессии и процессинга генного продукта Таким образом, последовательность ДНК, кодирующая сигнальный пептид отбора, должна быть точно слита с Nконцевой частью последовательности ДНК, кодирующий вариант BSSL В гибридном гене последовательность ДНК, кодирующая вариант BSSL, будет обычно, содержать его стоп-кодон, но не расщепление своей собственной информации и сайт полиаденилирования В прямом направлении 23 48109 24 последовательности ДНК, кодирующей вариант BSSL, процессинговые последовательности мРНК гена белка молока будут обычно сохраняться Предполагается, что ряд факторов является ответственным за фактический уровень экспрессии определенного гибридного гена Способность промотора, как и других регуляторных последовательностей, как упоминается выше, интеграция сайта системы экспрессии с геномом млекопитающего, интеграция сайта последовательности ДНК, кодирующей вариант BSSL, с геном, кодирующим белок молока, элементы, сообщающие посттранскрипциональную регуляцию, и другие подобные факторы, могут представлять существенное значение для получаемого уровня экспрессии На основе знаний о различных факторах, влияющих на уровень экспрессии гибридного гена, специалисту будет известно, как сконструировать систему экспрессии, подходящую для данной цели копитающего, с тем, чтобы включить систему экспрессии в зародыш млекопитающего, и /Ь/ развитие получающихся в результате интродуцированных оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона во взрослую самку млекопитающего, не принадлежащего к человеку Включение системы экспрессии в зародыш млекопитающего может быть осуществлено с использованием подходящих технических приемов, описанных , например, в "Manipulating the Mouse Embryo", A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986 Например, несколько сот молекул системы экспрессии могут быть введены непосредственно в оплодотворенную яйцеклетку, например, в оплодотворенную одноклеточную яйцеклетку или в ее пронуклеус, или в эмбрион отобранного млекопитающего, и микроинъецированные яйцеклетки затем переносят в яйцеводы псевдобеременных приемных матерей, и оставляют развиваться Ген белка молока, который используется, может быть получен из того же вида, в котором должна размещаться система экспрессии, или он может быть получен от другого вида В этой связи показано, что регуляторные элементы, которые нацеливают экспрессию гена в молочную железу, являются границами функционально перекрестных видов, что может происходить благодаря возможному общему предшественнику /Henmghausen etal , 1990/ Примеры подходящих генов, кодирующих белок молока или его эффективные последовательности, которые используются при конструировании системы экспрессии настоящего изобретения, обычно находят среди белков молочной сыворотки, полученной от различных млекопитающих, например, ген кислого белка молочной сыворотки /WAP/, предпочтительно происходящей от мыши, и ген р-лактоглобулина, предпочтительно происходящего от овцы Найдено, что также гены казеина различного происхождения могут быть подходящими для трансгенного получения варианта BSSL, например, коровий US1 -казеин и кроличий Р-казеин Предпочтительным, в данном случае, геном является ген мышиного WAP, так как обнаружено, что он способен обеспечивать высокий уровень экспрессии ряда чужеродных человеческих белков в молоке различных трансгенных животных/Henmghausen etal , 1990/ Способ продуцирования трансгенного, не принадлежащего к человеку млекопитающего, способного экспрессировать вариант BSSL, может также включать метод, при котором упомянутое млекопитающее, по существу, не способно экспрессировать BSSL из самого млекопитающего Такой способ включает /а/ разрушение способности экспрессирования BSSL млекопитающего таким образом, что BSSL млекопитающего, по существу, не экспрессируется, и введение вышеупомянутой системы экспрессии в зародыш млекопитающего так, что в млекопитающем экспрессируется вариант BSSL, и/или /Ь/ замещение гена BSSL млекопитающего или его части на вышеупомянутую систему экспрессии Другой последовательностью, предпочтительно взаимодействующей с системой экспрессии настоящего изобретения, является так называемая стабилизующая экспрессию последовательность, способная посредничать в экспрессии высокого уровня Существуют твердые указания, что такие стабилизирующие последовательности обнаруживаются около и в обратном направлении генов белков молока В изобретение также включается способ продуцирования трансгенного, не принадлежащего к человеку, млекопитающего, способного экспрессировать вариант BSSL, включающий /а/ введение вышеупомянутой системы экспрессии в оплодотворенную яйцеклетку или клетку эмбриона не принадлежащего к человеку мле Способность экспрессирования BSSL млекопитающего может быть подходящим образом разрушена путем введения мутаций в последовательность ДНК, ответственную за экспрессию BSSL Такие мутации могут включать мутации, которые выставляют последовательность ДНК из рамки, вводят стоп-кодон или осуществляют делецию одного или нескольких нуклеотидов из последовательности ДНК Ген BSSL млекопитающего или его часть могут быть замещены системой экспрессии, определенной выше, или последовательностью ДНК, кодирующей вариант BSSL, путем использования хорошо известных принципов гомологичной рекомбинации Важным аспектом изобретения является также трансгенное, не относящееся к человеку, млекопитающее, несущее в своем геноме последовательность ДНК, упомянутую выше Упомянутая последовательность ДНК может присутствовать, предпочтительно, в зародыше млекопитающего, и в гене белка молока млекопитающего Трансгенное, не принадлежащее к человеку млекопитающее может быть, выбрано, предпочтительно, из группы, состоящий из мышей, крыс, кроликов, овец, свиней и крупного рогатого скота В изобретение также включаются потомство упомянутого, не принадлежащего к человеку, млекопитающего, а также молоко, полученное от такого трансгенного, не принадлежащего к человеку, 25 48109 млекопитающего Изобретение также относится к детской формуле /детскому питанию/, содержащей вышеупомянутое молоко, и к детской формуле, содержащей вышеупомянутый вариант BSSL Детская формула может быть получена с использованием обычных технических приемов, и содержать любые необходимые добавки, такие как минеральные соли, витамины и т п Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей вышеупомянутый вариант BSSL, а также, к применению такого ваианта BSSL при лечении В других аспектах, изобретение относится к применению вышеупомянутого варианта BSSL для производства лекарственных препаратов для лечения паталогического состояния, относящегося к экзокринной недостаточности поджелудочной железы, муковисцидозу, хроническому панкреатиту, жировой малабсорбции, малабсорбции жирорастворимых витаминов, жировой малабсорбции вследствие физиологических причин Изобретение также относится к применению варианта BSSL для производства лекарственных препаратов для улучшения усвоения пищевых липидов, в особенности, недоношенными детьми ПРИМЕРЫ 1 Экспрессия рекомбинантной BSSL в эукариотных и прокариотных клетках 1 1 Методики экспериментов 1 1 1 Рекомбинантиые плазмиды Плазмиду pS 146, содержащую кДНК человеческой BSSL с 2,3 т п о , клонированную в pUC19, переваривают с Hind III и Sal I, и кДНК вводят в вектор экспрессии вируса папилломы коровы /BPV/ pS 147 /фиг 1А/ Этот вектор содержит кДНК человеческой BSSL под контролем энхансера мышиного металлотионеина 1 /тМТ-1/ и промоторного элемента /Pavlakis Hamer, 1983/ Сигналы процессинга мРНК обеспечиваются геномным фрагментом, содержащим часть экзона II, интрона II, экзона III, и в прямом направлении элементы гена кроличьего р-глобина Эту единицу транскрипции клонируют в вектор, содержащий полный геном BPV Транскрипция является однонаправленной для BPV и для единицы транскрипции BSSL Для размножения вектора в Е сом вектор содержит также pML 2d, производное pBR322 /Salver et al 1982/ Вектор экспрессии pS 147 котрансфецируют вектором, кодирующим ген устойчивости к неомицину, произведенному 5' длинным концевым повтором вируса саркомы Харвея и сигналами полиаденилирования обезьяньего вируса 40 /Lusley & Bobchan, 1984/ Для экспрессии BSSL в Е coEi кДНК BSSL субклонируют как фрагмент Ndel - Bam HI из плазмиды рТ7-7 /Ausubol et al , 1992/ в плазмиду pGEMEX-1 (Promega, Nadison, Wl, USA) /Studier & Moffat, 1986/ Этой процедурой клонирования кодирующую последовательность гена 10 Т7 замещают геном BSSL, кодирующим зрелый белок, предшествующий инициирующему кодону Окончательный вектор экспрессии, рСЕМЕХ/ BSSL, 26 подтверждается расшифровкой последовательности ДНК с использованием внутренних праймеров специфичной BSSL 1 1 2 Мутагенез Нуклеотидный номер 1 присваивается А в инициирующем кодоне ATG Для нумерации аминокислот первый метионин в сигнальном пептиде является 23, и первый аминокислотный остаток зрелого белка - аланин - снабжается номером 1 Для конструирования варианта делеции A/SEQ ID NO 4/ синтезируются два праимера PCR - PCR -1 и PCR - 2 л-абл 1/ Для клонирования в различных плазмидах создают сайты Hind III, Sal I и Bam HI Сайт Всі I генерируют в последовательности BSSL без изменения аминокислотной последовательности Это делается для облегчения добавления синтетической ДНК для получения других вариантов Праймер PCR - 2 содержит два синтетических стоп-кодона Получающиеся в результате фрагменты PCR переваривают с ВаМ HI и Hind III и клонируют в р UC18 для анализа последовательности Эту плазмиду обозначают pS 157 Правильный фрагмент PCR вставляют в вектор экспрессии BPV путем слияния с последовательностью BSSL в уникальном сайте Asp700 /положение 1405 в кДНК BSSL/, и в сайте Sal I перед фрагментом гена р-глобина, получая в результате pS 257 Конструкцию В-варианта /SEQ ID NO 5/ создают, используя олигонуклеотиды с номерами 3, 4, 7 и 8 /табл 1/ Гибридизованные олигонуклеотиды кодируют самую С-концевую аминокислотную последовательность, представляющую в белке полной длины часть с лизина 712 по фенилаланин 722 Этот фрагмент сливают с глутамином 535 Конец трансляции вставляют прямо после последнего фенилаланина Фрагмент содержит сайт Всі І В 5'-окончании и сайт Sal І в 3' -окончании, допуская интродукцию в pS 157 Получающуюся в результате плазмиду переваривают с Asp700 и Sal I, и фрагмент 313 т п о вставляют в вектор экспрессии, как описано выше Получающуюся в результате плазмиду обозначают pS 258 Таблица 1 Синтетические олигонуклеотиды, используемые для конструирования вариантов BSSL Нуклеотиды сайтов рестрикции подчеркнуты Стопсигналы трансляции указываются жирными буквами Измененный кодон в варианте N указывается в PCR-3 жирными буквами и звездочкой 0/ЖГО яукдеотаи, PCF-1 - , -(5'-3'S іослеяовательность CT G CC C CC TC C A C C A CG AAGCTClTKCACTTACTXCtGATCSGTC ACT3TGGGC AGCGC С AG GGGGvSCCCCAACCASAXACGCTCTTCGGGGAGTCT CGOG ЙТССС «C A? A3 GCCCCCCCCGTGCCGCCCACGOGTCiACTCCAAGCAAGCTCAGA TGCCTGCASTCATTAGGTTXTACTAACTCGACA 48109 27 Продолжение таблицы 1 Одиго •(5'-У) Последовательность яталеотад 4 5 6 7 A CT T ^ T C A A C T T A T G I C CT A T A A C f G C G t A CG CT rA CT CI GCCC C TG C G A G a G G A G AC O TCT A T A C Ge C G CC GG G G e 'G CC 3 A C OG GC CGC GBCC C G G GCCT Tc C TG CSSGG G G CCC f C GCGAGA CCG c A AS AGTA A f T в C C CC C C T C rC A G f T A CT C T t Чтобы сконструировать ген, кодирующий Свариант /SEQ ID NO 6/, используют олигонуклеотиды с 1 по 6 /габл 1/ Фрагмент гибридизованной ДНК содержит два повторения/ кодирующих одиннадцать аминокислот, идентичные консенсусу /Nilsson et at, 1990/, вставляемых между глутамином 535 и последовательностью с лизина 712 по фенилаланин 722 Этот фрагмент содержит также сайт Всі I в 5' - окончании и сайт Sal І в 3' окончании/ создавая условия для такой же стратегии клонирования/ которая описана выше Получающаяся в результате плазмида обозначается pS259 Для конструирования варианта N /вариант не N-гликозилированный, SEQ ID NO II синтезируют два праймера PCR /PCR-3 и PCR-4 в табл 1/ Создают сайты EcoR I и Ват НІ для клонирования продукта PCR в 360 т п о в pUC19 для анализа последовательности Сайт потенциального Nсвязанного гликозилирования в аспарагине 187 заменяют на глутамин Модифицированную последовательность выделяют как фрагмент Bal I Hind III и клонируют в Sac I и Hind III расщепленную pUC19 вместе с Sac I и Bal I Фрагментом, содержащим промотор тМТ-1 и 5'-окончание кДНК BSSL Из этой плазмиды выделяют фрагмент Sac I - Dra III приблизительно в 1 , 2 т п о , и вставляют в элемент тМТ-1 и последовательность кДНК BSSL, соответственно, в вектор экспрессии Получающуюся в результате плазмиду обозначают pS 299 1 1 3 Культура клеток млекопитающего и трансфекции Векторы котрансфецируют в клеточную линию мышей С127 /АТСС CRL 1616/ в соответствии со способом осаждения фосфатом кальция /Graham &VanderE8, 1973/ Клетки С127 выращивают в смеси Ham's F12 и модифицированной по способу Дульбекко среды Игла /DMEM/ /1 1/,с добавлением 10% фатальной телячьей сыворотки Отбирают клоны клеток, устойчивых к неомицину, с 1,5 мг х мл 1 G 418, и через 1 0 - 1 5 дней выделяют клоны устойчивых клеток из мастер-планшетов и берут на анализ 1 1 4 Бактериальные штаммы и условия культивирования Для экспериментов по экспрессии вектор pGEMEX/B трансформируют в штаммы Е coh J М109 (D ЕЗ) и BL 21 (DE3) pLus S Эксперименты по экспрессии выполняют так, как описано в Studier et at (1986) После сбора бактерий клетки осаждают центрифугированием /5000 х g в течение Юмин при 4°С/ Для получения фракций пе 28 риплазмы и цитоплазмы осадок ресуспендируют в 4мл Трис-СІ с 20% сахарозы, рН 8/0, 200мкл 0,1 М ЭДТК и 40мкл лизоцима /15мг/мл в воде/ на грамм клеточного осадка Суспензию инкубируют на льду в течение 40 минут Добавляют 160мкл 0,5М МдС1 на грамм осадка, после чего суспензию центрифугируют при 12000 х g Образующийся в результате супернатант содержит белки периплазмы, и осадок представляет собой цитоплазменную фракцию С другой стороны, для получения растворимых белков клетки суспендируют в 40мМ Трис-С1, 0,1 мМ ЭДТК, 0,5мМ фенилметилсульфонилфторида, рН 8,2, замораживают-оттаивают и разрушают ультразвуком, в течение некоторого времени, чтобы вызвать лизис Клеточный лизат центрифугируют /30000 ч о в течение ЗОмин при 25°С/ 1 1 5 Анализ нуклеиновых кислот РНК и ДНК получают из изолированных клеточных линий млекопитающего или из клеток Е coh, /Ausubcl et al , 1992/ РНК и ДНК фракционируют на агарозных гелях и блотируют на GeneScreen Plus/New England Nuclear/, и гибридизируют в соответствии с указаниями поставщика 1 1 6 Получение нативного фермента Стимулируемую солями желчи липазу очищают от человеческого молока как описано ранее /Blackberg & Hernell, 1981/ Очищенный препарат является гомогенным, судя по SDS - PAGE /электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия/, и имеет специфическую активность в ЮОмкмоль выделенных жирных кислот х мин 1 и мг 1 , когда испытывается с длинноцепным триацилглицеролом в качестве субстрата 1 1 7 Ферментный анализ Ферментный анализ проводят как описано в /Blackberg & Hernell,1981/, используя в качестве субстрата триолеин, эмульгированный с аравийской камедью Инкубацию выполняют с ЮмМ холата натрия в качестве активирующей соли желчи Когда проверяют зависимость от соли желчи, соли желчи /холат натрия или дезоксихолат натрия, Sigma Chem Co/ добавляют до концентраций, данных на фиг 3 1 1 8 Вестерн-блоттинг Для получения важных реакций в блоттингэкспериментах кондиционные среды концентрируют хроматографией на сефароэе Blue /Pharmacia LCB Biotechnology/ Соответствующие среды смешивают с сефарозой /приблизит 10мл среды на мл геля/ Гель промывают /10мл на мл геля/ 0,5М буфером Трис-СІ, рН 7,4, содержащим 0,1 М KCI Ферментную активность оценивают в том же буфере с 1,5М KCI По этой процедуре получают 25 - 30-кратную концентрацию, так же, как и 3 - 5-кратную очистку SDS-PAGE выполняют на 10% полиакриламидных гелях, в соответствии , по существу, с Laemmh /1970/ После переноса в нитроцеллюлозные мембраны и инкубации с политональной кроличьей антисывороткой к очищенной BSSL, осуществляют определение, используя козий антикроличий IgG, конъюгированный с щелочной фосфатазой, и проявляющий набор от ВюRad 1 1 9 Обработка N-гликозидазой F 29 48109 К Юмкл варианта В, содержащим активность BSSL в 2,5мкмоль выделенных жирных кислот х мин, добавляют 1мкл 1М р-меркаптоэтанола и 0,5мкл 10% (м/о) SDS После кипячения в течение 5мин добавляют Юмкл Na-фосфатного буфера, рН 8,0, бмкл 0,1 М ЭДТК, 4мкл 7,5% (м/о) нонидета Р 40 и 5мкл /1Е/ N-гликозидазы F /Boehnger, Mannheim/ для контроля обрабатывают идентично такое же количество варианта В, за исключением того, что гликозидазу не добавляют После инкубации в течение ночи при 37 С образцы прогоняют на SDS-PAGE и блотируют, используя политональную кроличью антисыворотку BSSL 1 2 Результаты 1 2 1 Конструирование вариантов в BSSL Модификации вариантов BSSL по отношению к BSSL с полной длиной суммируются в табл 2 и на фиг1Б Стратегия, применяемая для генерации этих вариантов, описывается в разделе 1 1 Для варианта A /SEQ ID NO 4/ вводят стоп-кодон после глутамина в положении 535, удаляя, тем самым, последние 187 аминокислот белка полной длины Для варианта В /SEQ ID NO 5/ домен, кодирующий 11 самых С-концевых аминокислот, и первоначальный трансляционный конец сливают с глутамином-535 Следовательно, этот вариант лишен всех повторов Для варианта С /SEQ ID NO 6/ фрагмент, содержащий два повтора, имеющих последовательность, идентичную консенсусу /Nilsson et al , 1990/, вставляют между глутамином535 и последовательностью с лизина-712 по фенилаланин-722 Чтобы проанализировать важность единственной экспериментальной N-связанной углеводной структуры, расположенной около активного сайта серина-194, конструируют вариант Вариант N /SEQ ID NO II получают путем перестройки сайта потенциального N-гликозилирования в аспарагине-187 в глутамин Таблица 2 Аминокислотные последовательности вариантов BSSL относительно последовательности человеческой BSSL Вариант A (SEQ ID NO 4) В (SEQ ID NO 5) С (SEQ ID NO 6) N (SEQ ID NO 7) Стертые осЗамен остатки татки 536 - 722 536 - 711 536 - 568, 591 -711 Asn 187 ^ Gin 1 2 2 Исследование рекомбинантной ДНК в клеточных линиях млекопитающего Образцы ДНК получают из клеточных линий, трансфецированных векторами экспрессии, кодирующими различные варианты BSSL Полученные ДНК расщепляют Bam HI, фракционируют на агарозных гелях и переносят на мембраны для гибридизации Используемым зондом является кДНК BSSL, меченая 32 Р Результаты гибридизации подтверждают присутствие рекомбинантных генов, а также то, что число копий вектора прибли ЗО зительно одинаково в различных клеточных линиях /фиг 2/ Положения гибридизующихся фрагментов отражают различную длину последовательностей различных BSSL, и согласуются с ожидаемыми размерами Положения подобны также ДНК, полученной из бактерий, используемой в эксперименте с трансфекцией, что указывает, что в клеточных линиях не происходит главной реаранжировки векторной ДНК /фиг 2/ Верхние сигналы гибридизации в образце ДНК, представляющем вариант А, существуют, вероятно, вследствие частичного расщепления 1 2 3 Экспрессия мРНК для BSSL полной длины и мутированной в клетках млекопитающего Чтобы проанализировать экспрессию различных рекомбинантных BSSL, гены РНК получают из изолированных клеточных линий Нозерн-блотэксперименты и гибридизация с кДНК BSSL, меченой 3 Р, показывают, что рекомбинантную мРНК можно обнаружить во всех клеточных линиях, несущих вектор BSSL /фигЗ/ Гибридизация не обнаруживается в контрольном образце, полученном из клеточной линии, содержащей идентичный вектор, за исключением кДНК BSSL /фиг 3/ Различная длина гибридизующихся мРНК находится в соответствии с модификациями кДНК Уровни устойчивого состояния вариантов мРНК рекомбинантных BSSL являются одинаковыми за исключением варианта А /фигЗ/ Причина уменьшенного накопления мРНК варианта А неизвестна, но ее наблюдают в двух популяциях клеточных линий, как и в изолированных клонах Присутствие равных количеств РНК в различных образцах подтверждается гибридизацией с зондом к мышиному Р-актину/фиг 3, нижний снимок/ 1 2 4 Получение BSSL полной длины и вариантов BSSL в клетках млекопитающего Среды из отдельных клонов клеток С127 , трансфецированных BSSL полной длины и BSSL различных мутированных форм, собирают и испытывают на активность BSSL /фиг 4/ Для молекулы полной длины и вариантов N, В и С активность в клонах с наивысшей экспрессией лежит в интервале от 0,7 до 2,3мкмоль выделенных жирных кислот х мин х(мл среды) 1 Для специфичной активности, сравнимой с активностью нативной BSSL молока, это будет соответствовать уровню экспрессии 7 - 23мкг х (мл среды) 1 Для варианта А все анализированные клоны имеют активность ниже 0,05мкмоль выделенных жирных кислот х мин 1 и (мл среды) 1 Концентрация сефарозы Blue и лиофилизацин клона, демонстрирующего наивысшую активность, показывают, что активный фермент в самом деле экспрессируется, хотя с очень низким уровнем Вероятность, что низкая активность, полученная для варианта А, частично может быть объяснена значительно более низкой специфической активностью, не может быть исключена Вестерн-блоты клонов различных экспериментов с трансфекцией приводятся на фиг5А Как и ожидалось, существуют явные Мг вариантов BSSL Однако, следует отметить, что для BSSL полной длины, как и для вариантов В и С, получают двойную полосу Поскольку все три имеют единствен 31 48109 ный неповрежденный сайт N-гликозилирования, тогда как вариант N, который не демонстрирует двойной полосы, не имеет такого сайта, вероятным объяснением будет то, что двойная полоса является результатом различий в Nгликозилирования Следовательно, вариант В подвергается перевариванию с N-гликозидазой F Как видно из фиг5В, только следовые количества остаются от верхней полосы, в то время как нижняя полоса усиливается, указывая, что только часть экспрессированного варианта Nгликозилируется Одной из особенностей BSSL является ее специфическое активирование первичными солями желчи, например, холатом /Hernell, 1975/ Все различные рекомбинантные формы BSSL показывают одну и ту же зависимость от концентрации для активации холатом /фиг 6/ Максимальную активность в использованной системе испытаний получают при ЮмМ Когда холат заменяют на дезоксихолат /вторичная соль/, активации не происходит Таким образом, рекомбинант полной длины, так же, как и различные варианты, обнаруживают одинаковую специфичность относительно активации солями желчи 1 2 5 Экспрессия и биохимические исследования BSSL полной длины в Е coh Два штамма Е coh - JM109 (DE3) и BL 21 (DE3) pLysS/Studier et al , 1986/ - трансформируют вектором экспрессии pGEMEX/BSSL, содержащим кДНК человеческой BSSL под контролем промотора Т7 Трансформанты из обоих штаммов идентифицируют, культивируют и индуцируют IPTG /изопропилтиогалактозидом/ в течение около 90мин /Studier et al , 1986/ Анализ полной мРНК нозерн-блотированием с использованием кДНК BSSL в виде пробы, меченой 32 Р, показывает, что экспрессия эффективно индуцируется в обоих штаммах, и что транскрипция твердо регулируется /фиг7А/ Обнаруженный размер мРНК рекомбинантной BSSL - приблизительно 2,4 т п о - соответствует ожидаемой длине Разделение образцов белка SDS - PAGE и иммунологический анализ с антителами анти- BSSL показывают, что BSSL полной длины эффективно продуцируется в Е coh /фиг7В/ В штамме BL 21 (DE3)pLysS секретируется белка в периплазму больше, чем в штамме J M109 (ОЕЗ)/фиг7В/ Индуцированные IPTG культуры Е сом содержат активную растворимую BSSL в количестве, соответствующем 0,5 - 4мкг белка BSSL на мл культуры Вестерн-блоттинг показывает, что в нерастворимом осадке находится от 20 до 60% реакционноспособного материала Неиндуцированные бактерии не содержат сколь-нибудь заметной активности BSSL Активность липазы из выращенных бактерий показывает такую же зависимость от солей желчи, как и нативная молочная BSSL 2 Очистка и исследование рекомбинантных полной длины и мутированных форм стимулируемой солями желчи липазы 2 1 Методики экспериментов 2 11 Ферменты и варианты ферментов 32 Конструируют и экспрессируют рекомбинантные BSSL с полной длиной и варианты BSSL В, С и N, как описано ранее По сравнению с нативным ферментом вариант в /SEQ ID NO 5/ не имеет все 16 уникальных, О-гликозилированных, богатых проливом С-концевых повторов /аа 536 - 711/, но имеет наибольший C-концєвой фрагмент/аа 712 722/, слитый с глутамином 535 Вариант С /SEQ ID NO 6/ содержит такой же С-концевой фрагмент и два повтора из 11 остатков между глутамином 535 и лизином 712, В варианте N /не-Nгликозилированный вариант, SEQ ID NO II аспарагин 187, ответственный за единственный Nсвязываемый сахар, обменивается на остаток тутами на Нативную BSSL очищают от человеческого молока как описано в Blackberg & Hernell (1981) 2 1 2 Ферментный анализ Активность липазы проверяют так, как описано в Blackberg & Hernell (1981), используя в качестве субстрата триолеин, эмульгированный в аравийской камеди В качестве активирующей соли желчи используют холат натрия /ЮмМ/ Различные модификации испытаний даются в подписях к рисункам 2 1 3 Получение иммуносорбента Очищенную молочную BSSL /5мг/ связывают с сефарозой, используя CNBr, как рекомендует производитель Через колонку пропускают 40мл политональной антисыворотки, полученной в кролике против очищенной молочной BSSL Специфичные антитела элюируют 0,1 М глицином с HCI , рН 2,5 Сразу же доводят рН до приблизит 8 твердым Трисом После обессоливания и лиофилизации 6мг аффинных очищенных антител связывают с сефарозой, как описано выше 2 1 4 Процедура очистки Кондиционные культуральные среды, содержащие 5 - 25мкг рекомбинантной экспрессированной BSSL или варианта BSSL, смешивают с сефарозой синей /Pbarmacia, Sweden/ 10мл сред на мл структурированного геля После перемешивания в течение ЗОмин гель ополаскивают 0,05 М Трис-СІ, рН 7,0, 0.05М KCI, и липазную активность элюируют 0,05 М Трис-СІ, рН 7,0, 1,5М КСІ Пики активности объединяют и диализуют против 5мМ натрийверонала, рН 7,4, 0.05М NaCI Диализат вносят в колонку с гепаринсефарозой Колонку элюируют градиентом 0,05 - 1,0М NaCI в 5мМ натрийверональном буфере, рН 7,4 Фракции, содержащие липазную активность, объединяют и вносят в колонку с иммуносорбентом После промывания 0.05М Трис-СІ, рН 7,5, 0,15М NaCI, связанную липазу элюируют 0,1 М глицином с HCI, рН 2,5 Величину рН фракций сразу же доводят до приблизит 8 твердым Трисом 2 1 5 Электрофорез Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия /SDS-PAGE/ осуществляют, по существу, в соответствии с Laeemmh /1970/ Белки подкрашивают кумассии бриллиантовым голубым 2 1 6 Анализ N-концевой последовательности 33 48109 Анализ аминокислотных последовательностей осуществляют на пульсирующем жидкофазном секвенаторе Applied Biosystems Inc, 477A и на линейном фенилтиогидантоиновом анализаторе 120А с регулярными циклическими программами и химикатами от производителя Вычисленные из секвенированного стандартного белка /рлактоглобулин/, начальный выход и выход повторов /repetitive/ составляют 47% и 97%, соответственно 2 2 Результаты 2 2 1 Очистка рекомбинантнои BSSL и вариантов BSSL Хроматографию на сефарозе синей кондиционных сред используют, прежде всего, как стадию концентрирования Последующая хроматография на гепарин-сефарозе дает начальную очистку, главным образом, за счет удаления большей части альбумина, присутствующего в культуральной среде Эта стадия также показывает, что молекулы рекомбинантнои BSSL остаются все связанные гепарином После иммуносорбента оказывается, что все варианты BSSL имеют чистоту более 90%, судя по SDS-PAGE /фиг 8/ Фермент полной длины, как и варианты В и С, мигрирует как дублет Обнаруженные Мг различных вариантов приводятся в табл 3 Анализ N-концевой последовательности дает единственную последовательность для всех вариантов для 8 циклов Ala-Lys-Len-Gly-AlaVal-Tyr-Thr2 2 2 Активность липазы В табл 3 указывается найденная молекулярная масса различных препаратов Специфические активности препаратов находятся в интервале от 75 до 120мкмоль выделенных свободных жирных кислот в мин и на мг белка Следовательно, нельзя обнаружить существенного различия в активности между BSSL с полной длиной и вариантами BSSL Все препараты демонстрируют абсолютную необходимость первичной соли желчи /холат натрия/ для активности против эмульгированного длинноцепного триацилглицерола /фиг 9А/ Дезоксихолат натрия активирует некоторые варианты /данные не приводятся/ Однако, когда соединяют различные соли желчи, дезоксихолат имеет двойное действие /фигЭВ и С/ Во-первых, он снижает концентрацию холата, необходимую для активации, и во-вторых, он ингибирует ферментную активность при более высокой концентрации соли желчи Таблица 3 Найденные Мг рекомбинантнои BSSL с полной длиной и вариантов BSSL Фермент Полная длина Вариант В Вариант С Вариант N Мг (кДа), определенные SDS-PAGE 105, 107 63, 65 60, 62 95 34 2 2 3 Устойчивость рекомбинантнои BSSL и вариантов BSSL Рекомбинантная BSSL, как и варианты BSSL, обнаруживают ту же рН-устойчивость, что и нативная молочная BSSL /фиг 10/ Инактивация во всех случаях происходит при рН 2,5 - 3 При рН свыше 3 все варианты совершенно устойчивы, при условии, что концентрацию белка достаточно высока Это достигается путем добавления альбумина коровьей сыворотки или яичного альбумина /данные не приводятся/ Разбавленные образцы менее устойчивы при всех проверенных рН, но предел остается тем же самым /данные не приводятся/ Фиг 11 показывает, что термостойкость рекомбинантных ферментов сравнима с термостойкостью нативного молочного фермента При температуре 37 - 40° С активность начинает снижаться Варианты /В, С и N/ оказываются несколько менее устойчивыми, чем рекомбинантный фермент с полной длиной и фермент молока Однако, если концентрация белка увеличивается путем добавления альбумина коровьей сыворотки, все варианты являются устойчивыми также при 40°С/фиг11/ Нативная молочная BSSL и все рекомбинантные варианты чувствительны к трипсину Получают зависимость инактивации от времени /фиг 12/ Однако, если в буфер включаются соли желчи, т е , холат, варианты липазы защищаются, и активность липазы сохраняется /фиг 12/ Таким образом, что касается характеристик in vitro, т е , активации солями желчи, связывания гепарином, рН- и термоустойчивости и защиты солью желчи от инактивации протеазами, то не обнаружено существенных различий при сравнении различных вариантов BSSL с нативной молочной BSSL 3 Экспрессия в трансгенных животных 3 1 Конструирование векторов экспрессии Чтобы сконструировать вектор экспрессии для продуцирования варианта человеческой рекомбинантнои BSSL в молоке трансгенных животных, используют следующую стратегию /фиг 13/ Получают три плазмиды, содержащие различные части гена человеческой BSSL /pS309, pS310 и pS311/, используя способы, описанные в LidBerg et al /1992/ Плазмида pS309 содержит фрагмент Sph I, перекрывающий ген BSSL от 5' нетранскрибируемой области до части четвертого интрона Плазмида pS310 содержит фрагмент Sad, перекрывающий генную последовательность варианта BSSL от части первого интрона до части шестого интрона Наконец, плазмида pS311 содержит фрагмент Bam HI, перекрывающий ген BSSL из основной части пятого интрона и остатка структуры интрон/экзон с делециями в экзоне 11 Последовательности с делециями представляют собой 231 п о , что приводит к последовательности, кодирующей вариант BSSL, который содержит точно 77 аминокислот, или на семь повторов меньше, чем BSSL с полной длиной Нуклеотидная последовательность получающегося в результате варианта BSSL /"Вариант Т'У дается в списке последовательностей как SEQ ID NO 8 Аминокислотная 35 последовательность варианта Т приводится в списке последовательностей какЭЕО. ID NO 9 Вследствие высоко повторяющейся последовательности в экзоне 11 гена человеческой BSSL, можно ожидать относительно высокую частоту реаранжировок, когда эту последовательность клонируют в плазмиде и размножают в бактериях На основе этого предположения нужный вариант BSSL, который содержит усеченный экзон 11, идентифицируют, изолируют и проводят анализ последовательности Другую плазмиду п S283, содержащую часть кДНК человеческой BSSL, клонированную в плазмиде pl_IC19 в сайтах Hind III и Sad, используют для слияния геномных последовательностей Плазмиду pS283 также используют, чтобы получить сайт правильной рестрикции фермента, Крп I, расположенный в 5' нетранслируемой лидерной последовательности BSSL Плазмиду pS283 раскрепляют Ncol и Sad, и электрофорезом выделяют фрагмент около 2,7 т п о Плазмиду pS309 расщепляют Ncol и В spEI, и выделяют фрагмент около 2,3 т п о , содержащий 5' -часть гена BSSL Плазмиду pS310 расщепляют В spEI и Sad, и выделяют фрагмент около 2,7 т п о , содержащий часть средней области гена BSSL Эти три Фрагмента лигируют и трансформируют в компетентный Е coli, штамм TG2, и трансформанты изолируют отбором с ампициллином Получают плазмиды из некоторого количества трансформантов, и одну плазмиду, называемую pS312 /фиг 14/, содержащую нужную конструкцию, используют для дальнейших экспериментов Чтобы получить модификацию pS311, в которой сайт Bam HI, расположенный в прямом направлении от стоп-кодона, был превращен в сайт Sal І для облегчения дальнейшего клонирования, используют следующий способ Плазмиду pS311 переводят в линейную форму частичным перевариванием Bam HI Выделяют фрагмент, приобретший линейную форму, и вставляют линкер синтетической ДНК, который конвертирует сайт Ват НІ в сайт Sal I (51 -GATCGTCGAC-31), разрушая этим сайт Bam HI Так как существуют два возможных положения для интеграции синтетического линкера, получающиеся в результате плазмиды анализируют путем рестрикционного ферментативного гидролиза Плазмиду с линкером, вставленным в нужном положении в прямом направлении экзона 11, изолируют и обозначают pS313 Чтобы получить конечную конструкцию вектора экспрессии, несущего геномные последовательности варианта человеческой BSSL, используют существующий вектор экспрессии, pS314, предназначенный для промежуточной стадии и специфической экспрессии ткани в клетках молочной железы в периоды лактации Плазмида pS314 содержит геномный фрагмент из гена кислого белка сыворотки /WAP/ мыши /Campbel et al 1984/, клонированный как фрагмент Not I Геномный фрагмент имеет приблизительно 4,5 т п о регуляторных последовательностей все четыре экзона мышиного WAP и все интронные последо 48109 36 вательности, и 3-т п о -последовательность в прямом направлении последнего от экзона Уникальный сайт Крп I располагается в первом экзоне в 24 п о в обратном направлении от инициирующего кодона трансляции природного WAP Другой уникальный сайт фермента рестрикции представляют собой сайт Sal I, расположенный в экзоне 3 Геномную последовательность варианта человеческой BSSL вставляют между этими сайтами - Крп I и Sal I - по следующей стратегии Вопервых, pS134 переваривают с Крп I и Sal I, и фрагмент, представляющий собой расщепленную плазмиду, выделяют электрофорезом Во-вторых, pS132 переваривают с Крп I и Bam HI, и выделяют фрагмент приблизительно в 4 7 т п о , представляющий собой 5' - часть гена человеческой BSSL В-третьих, pS313 переваривают с Bam HI и Sal I, и выделяют З'-часть гена человеческой BSSL Эти три фрагмента лигируют, трансформируют в компетентную бактерию Е coli, и трансформанты изолируют после селекции с ампициллином Получают плазмиды из нескольких трансформантов и тщательно анализируют путем рестрикционного ферментного картирования и анализа последовательностей Одну плазмиду, представляющую нужный вектор экспрессии, характеризуют, и обозначают рЭ317/фиг 15/ Чтобы удалить прокариотные плазмидные последовательности, pS317 расщепляют Not I Элемент рекомбинантного вектора, состоящий из последовательности мышиного WAP, примыкающей сбоку геномного фрагмента варианта человеческой BSSL, затем выделяют электрофорезом в агарозе Изолированный фрагмент затем очищают электроэлюцией перед тем, как вводить его в мышиные эмбрионы Рекомбинантный ген для экспрессии варианта человеческой В в молоке трансгенных мышей приводится на фиг 16 3 2 Генерация трансгенных животных Фрагмент Not I выделяют из плазмиды pS317 в соответствии с разделом 3 1 Этот фрагмент ДНК состоит из промотора мышиного WAP, связанного с геномной последовательностью, кодирующей вариант человеческой BSSL Выделенный Фрагмент при концентрации Знг/мкл вводят в пронуклеус эмбрионов 350 C57B1/6J xCBA/2J -f2, полученных от доноров-мышей, подвергнутых воздействию 5 ИЕ гонадотропина сыворотки беременной конематки, для суперовуляции Животных C57BI/6J XCBA/2J -fi получают из Bomholtdard Breeding and Research Centre LTD, Ry Denmark После сбора эмбрионов из яйцеводов их отделяют от клеток яйцевого бугорка посредством обработки гиалуронидазой в среде М2 /Hogan et al , 1986/ После промывания эмбрионы переносят в среду М16 /Hogan et al , 1986/, и выдерживают в инкубаторе в атмосфере с 5% ССЬ Инъекции выполняют в микрокапле М2 под легким парафиновым маслом, используя гидравлические микроманипуляторы Nanshidi и инвертированный микроскоп Nikon, снабженный оптикой Nomarski После инъекции 267 выглядящих здоровыми эмбрионов имплантируют в 12 псевдобеременных С57В1 /6J xCBA/2J -fi реципиентов, получивших 37 48109 интраперитонеально 0,37мл 2,5% авертина Мышей, которые интегрировали трансген, идентифицируют PCR-анализом ДНК из образцов хвоста для биопсии, полученных через три недели после рождения животных Позитивные результаты подтверждаются саузерн-блот-анализон Для отбора молока дающим молоко самкам вводят 2 ИЕ окситоцина, интраперитонеально, и через 10 минут дают наркоз 0,40мл 2,5% авертина - интраперитонеально Устройство для накопления молока подсоединяют к ниппелю через силицированный трубопровод, и молоко собирают в 1,5мл пробирки Эппендорфа /Eppendorf/, осторожно массирую молочную железу Количество молока изменяется, в зависимости от дня лактации, от 0,1 до 1,5мл от мыши за сбор 3 3 Экспрессия варианта В в трансгенных мышах Трансгенных мышей идентифицируют посредством анализа ДНК, которую получают из образцов, отрезанных от хвоста Образцы ткани инкубируют с протеиназои К и экстрагируют фенолом с хлороформом Выделенную ДНК используют в полимеразно-цепных реакциях /PCR/ с праймерами, которые усиливают специфичные фрагменты, если присутствует гетерологичная введенная ДНК, представляющая фрагмент вектора экспрессии Животных также проверяют опытами гибридизации ДНК, чтобы подтвердить данные PCR и проверить на возможные реаранжировки, структуру элементов интегрированного вектора, и получить информацию о числе копий элементов интегрированного вектора В одной серии экспериментов анализируют 31 мышь двумя методами, и результаты показывают, что 1 мышь несет элемент вектора гетерологичной ДНК, полученный из pS317 Результаты PCRанализа и экспериментов с гибридизацией являются идентичными /фиг17А-С/ Вообще, обнаруживают, что 10 из 65 проверенных животных являются трансгенными для pS317 Мышь, идентифицированную как несущую элемент векторной ДНК /животное-основатель/, затем спаривают, и помет F1 проверяют на трансген по тем же методикам РНК, выделенную из различных тканей pS317трансгенных самок в период лактации, отделяют электрофорезом в агарозном геле с формальдегидом, блоттируют на мембраны и гибридизуют с кДНК BSSL, меченной 32 Р, в качестве зонда Полученные результаты показывают, что экспрессия ограничивается молочной железой в период лактации /фиг 18/ Образцы молока отбирают под наркозом от животного-основателя, обработанного оксктоцином для индуцирования лактации, и анализируют на присутствие варианта рекомбинантнои человеческой BSSL Это делается SDS - PAGE, переносом на нитроцеллюлозные мембраны и инкубацией с политональными антителами, генерированными против нативной человеческой BSSL Полученные результаты демонстрируют экспрессию варианта рекомбинантнои человеческой BSSL в молоке трансгенных мышей Фиг 19 показывает присутствие варианта рекомбинантнои человече 38 ской BSSL в молоке трансгенных мышей Разделение SDS - PAGE и иммуноблотирование образцов молока, полученных от различных трансгенных для pS317 мышей, показывают эффективное продуцирование варианта рекомбинантнои BSSL с уменьшенной определяемой молекулярной массой по сравнению с рекомбинантнои BSSL с полной длиной, полученной из молока мыши, трансгенной для pS314 Плазмида pS314 подобна pS317, за исключением того, что pS314 содержит кДНК человеческой BSSL с полной длиной вместо геномного варианта Дублетная полоса, которая выявляется во всех образцах мышиного молока, представляет мышиную BSSL, и показывает, таким образом, перекрестную реактивность антисыворотки Этот вывод подтверждается также наблюдением, что эта дублетная полоса появляется в узкой полоске 9 на фиг 19, которая содержит очищенную мышиную BSSL Генерируют устойчивые линии трансгенных животных Подобным образом могут быть получены другие трансгенные животные, такие как кролики, коровы или овцы, способные экспрессировать варианты человеческой BSSL Депозиты Перечисленные далее плазмиды депонированы, в соответствии с Будас Будапештским договором, в DSM /Deutche Sammlung von Mikroorgamsmen und Zellkulturen/ Плазмида pS309 pS310 pS311 pS317 pS147 pS257 pS299 pS258 pS259 Депозит № DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM 7101 7102 7103 7104 7495 7496 7497 7501 7502 Дата депонирования 12 июня 1992 25 февраля 1993 3 марта 1993 Краткое описание рисунков Фиг 1 А Карта вектора на основе BPV, используемого для экспрессии различных вариантов BSSL В Схематичное изображение различных анализированных вариантов BSSL FL обозначает BSSL полной длины Активный сайт указывается кружочком, и сайт для возможного Nприсоединенного углевода указывается треугльником Область, содержащая повторы, указывается в виде заштрихованного пространства, и область сохраненного С-окончания - в виде зачерненного участка Фиг 2 Саузерн блот-анализ ДНК из клеточных линий, экспрессирующих варианты BSSL Анализировали ДНК, полученные из клеточных линий, экспрессирующих BSSL полной длины /FL/, варианта А /А/, вариант В /В/, вариант С /С/ и вариант N /N/ ДНК, произведенные соответственными полученными 39 48109 клетками /слева//5мкг/ и 1 нг векторной ДНК, произведенной очищенными бактериями /справа/, переварены с Bam HI Образцы ДНК разделены на агарозном геле, перенесены на мембрану Сепе Screen Plus и гибридизованы с кДНК человеческой BSSL, меченой 32 Р ФигЗ Нозерн-блот-анализ РНК из изолированных клеточных линий, экспрессирующих варианты BSSL Анализированы Юмкг полной РНК, полученной из клеточных линий, продуцирующих BSSL полной длины /FL/, вариант А /А/, вариант В /В/, вариант С /С/ и вариант N /N/ РНК из клеточной линии С127, таящей вектор BPV .идентичный вектору на фиг1, за исключением того, что он кодирует белок, неродственный BSSL, использовали в качестве негативного контроля (-) /верхний снимок/ Фильтры гибридизованы с кДНК BSSL, меченой 32 Р Фильтр затем регибридизован с зондом кДНК мышиного р-актина Сигналы мРНК р-актина /нижние снимки/ использовали в качестве внутреннего контроля количества РНК, загруженной на каждую дорожку (полосу) Фиг 4 Экспрессия активности BSSL в клетках С127, трансфектированных человеческой BSSL полной длины и ее мутированными формами Клетки С127 трансфектированы различными конструкциями BSSL полной длины /FL/, вариантом N /N/, вариантом С /С/, вариантом В /В/, вариантом А /А/ После начального периода роста отбирали отдельные клоны и давали им возможность расти до слияния Число отобранных клонов /п/ указывается на рисунке Активность липазы определяли на кондиционных средах Значения выражаются в мкмолях выделенной жирной кислоты х мин х(мл кондиционной среды) 1 Фиг 5 А Вестерн-блоттинг полной длины и мутированных рекомбинантных BSSL Количество липазной активности, выраженное в мкмолях выделенный жирной кислоты ч мин \ нанесенной на гель, составляет при полной длине - 0,2 /полоска 1/, для варианта N - 0,16 /полоска 2/, для варианта С - 0,6 /полоска 3/, для варианта В - 0,8 /полоска 4/, и для нативной BSSL - 0,1 /полоска 5/ Применяют антисыворотку, полученную в кролике против BSSL, очищенной от человеческого молока Положение маркеров размера /предварительно окрашенные SDS - PAGE Standards Low Range, Bio Rad/ указывается слева В Вестерн-блоттинг варианта В, обработанного N-гликозидазой F Вариант В переваривали с N-гликозидазой F, как описано в методиках экспериментов Полоска 1 относится к необработанному, а полоска 2 - к обработанному, варианту В Фиг 6 Зависимость BSSL полной длины и ее мутированных форм от солей желчи Липазную активность определяли в присутствии различных концентраций холата натрия /сплошные линии/ или дезоксихолата натрия /прерывистые линии/ на кондиционных средах для рекомбинантной BSSL полной длины /*/, варианта А /•/, варианта В /А/, 40 варианта С /•/, варианта Н /•/ и очищенной BSSL человеческого молока /О/ Для варианта А кондиционную среду концентрировали на сефарозе голубой, как описано в методиках экспериментов Количество источника соответствующего фермента выбирали таким образом, чтобы получить одинаковые уровни максимальной активности, за исключением варианта А, который имел максимальную активность только в одну десятую от других Контрольные эксперименты показали, что среда роста не влияет на уровень активности или на зависимость от солей желчи нативной BSSL /данные не приводятся/ Фиг 7 А Нозерн -блоттинг BSSL, полученной различными штаммами Е coh с использованием pGEMEX Бактерии индуцировали IPTG, как описано в экспериментальных методиках Условия эксперимента такие же, какие описаны для фиг 2 Полоса 1 - штамм BL 21 (DE3)pLysS не индуцирован, полоса 2 - штамм BL 21 (DE3)pLysS, не индуцирован, полоса 3 - штамм 3 JM109(DE3), не индуцирован, полоса 4 - штамм JM109(DE3), индуцирован В Вестерн-блоттинг, с использованием антител к очищенной молочной BSSL, из 8 - 18% SDS PAGE, показывающего экспрессию рекомбинантной BSSL в различных штаммах Е coh с применением pGEMEX Бактерии индуцировали IPTG, и цитоплазменные и периплазменные белки получали из лизата, как описано в методиках экспериментов Количества бактериальных белков, загруженных на полосы 2-5 /периплазменные препараты/ и 7 - 10 /цитоплазменные препараты/, представляют одинаковый объем культуры, дающий окраску, пропорциональную уровню продуцирования Полоса 1 - маркеры размера молекулы Parmacia, полосы 2 и 8 штамм JM109 (DE3) , индуцирован, полосы 3 и 7 - штамм JM109(DE3), не индуцирован, полосы 4 и 10 - штамм BL 21 (DE3)pLysS, индуцирован, полосы 5 и 9 - штамм BL 21 (DE3)pLysS, не индуцирован, полоса 6 - 25нг очищенной нативной BSSL Фиг 8 SDS - PAGE очищенных рекомбинантной BSSL и вариантов BSSL Рекомбинантную BSSL полной длины /FL/ и варианты BSSL N, В и С очищали так, как описано Наносили по Змкг каждого, за исключением варианта В, который использовали в количестве 1,5мкг Наносили 5мкг очищенной молочной BSSL /ПАТ/ Положение маркеров размера указывается слева Фиг 9 Влияние дезоксихолата на активацию рекомбинантной BSSL и вариантов BSSL холатом натрия Проверяли липазную активность очищенных препаратов рекомбинантной BSSL полной длины /О/, вариантов рекомбинантной BSSL В /О/, С /•/ и N/A/, и очищенной нативной молочной BSSL /•/ при различных концентрациях холата натрия в отсутствии /левый график/ и в присутствии 5мМ /график в центре/ или ЮмМ /правый график/ дезоксихолата ФигЮ 41 Устойчивость рекомбинантной BSSL и вариантов BSSL при различных рН Нативную BSSL, рекомбинантную BSSL полной длины и варианты BSSL инкубировали при 37°С в различных буферах с рН 2 - 8 Все буферы содержали 1мг/мл альбумина коровьей сыворотки Через ЗОмин отбирали аликвоты и проверяли липазную активность Пояснения символов см в описании фиг 9 Фиг 11 Термоустойчивость рекомбинантной BSSL и вариантов BSSL Очищенные рекомбинантную BSSL полной длины, варианты BSSL и нативную молочную BSSL инкубировали при указанных температурах в 50мМ буфере Трис-СІ, рН 7,5 К одной серии образцов добавляли альбумин коровьей сыворотки /BS А/ до 1мг/мл Через ЗОмин отбирали образцы и проверяли липазную активность Активность выражают в процентах от активности каждого образца при Омин Пояснения символов см в описании фиг 9 Фиг12 Влияние солей желчи на инактивацию рекомбинантной BSSL и вариантов BSSL трипсином Очищенные рекомбинантную BSSL полной длины, варианты BSSL и нативную молочную BSSL /15мкл, содержащие 1 - 4мкг/ добавляли к бОмкл 1,0 Трис-СІ, рН 7,4 с Юмкг трипсина /ТРСК - трипсин, Boehnnger - Mannheim/ при 25°С в отсутствии /прерывистые линии/ и в присутствии /сплошные линии/ ЮмМ холата натрия В указанное время отбирали аликвоты и проверяли на липазную активность Величины выражаются в процентах от величин, полученных при контрольных инкубированиях в отсутствие трипсина Пояснения символов см в описании фиг 9 Фиг13 Способ получения плизмиды pS317 Подробности см в разделе 3 1 Фиг 14 Схематическое строение плазмиды pS312 Фиг 15 Схематическое строение плазмиды pS317 Фиг16 Физическая карта, отражающая физическое введение геномной структуры варианта человеческой BSSL в первый экзон гена WAP, как описано в разделе 3 1 Фиг 17 А Схематическое изображение локализации праймеров PCR, применяемых для идентификации трансгенных животных Праймер 5' располагается в последовательности WAP, начинающейся в положении -148 п о в обратном направлении слияния между WАР и вариантом BSSL Праймер 3' располагается в первом интроне варианта BSSL, заканчивающем 400 п о в прямом направлении из точки слияния В Последовательности использованных праймеров PCR С Полученные на агарозном геле показатели типичного анализа анализов PCR потенциальных животных-основателей М молекулярная масса маркеров Полоса 1 - контрольный продукт PCR, генерированный из плазмиды pS317 Полосы 2 13 -реакции PCR с препаратами ДНК от потенци 48109 42 альных животных-основателей Фиг18 Нозерн-блоттинг РНК, полученных из различных тканей, выделенных из самки мыши, трансгенной для pS317 Ткани выделяли на четвертый день лактации Анализировали Юмкг полной РНК из каждой ткани посредством агарозноформальдегидного разделения, переносили на мембраны и гибридизовали с кДНК человеческой BSSL, меченой 32 Р Полосы содержат Мд - молочную железу, Li - печень, Ki - почку, Sp - селезенку, Не - сердце, Lu -легкое, Sg - слюнную железу, Вг - головной мозг Размеры ДНК в нуклеотидах указываются слева Фиг19 Вестерн-блоттинг молока, полученного от трансгенных для pS314 мышей, от мышей, трансгенных для вектора кДНК полной длины pS314, и контрольных животных Образцы отделяли SDS PAGE и переносили на иммобилизующие /Immobilon/ фильтры, и иммуноблотировали с антисывороткой против нативной человеческой BSSL Полоса 1 - маркеры молекулярной массы, полосы 2, 3, и 4 - 2мкл молока от трех F1 - дочерей /F1 30, 31, и 33/р Э317-основателя F0 # 91, полоса 5 - 2мкл молока от рЭ314-основателя # 90 Полосы 6,7 и 8 - 2мкл молока от трех нетрансгенных для BSSL животных, полоса 9 - очищенная мышиная BSSL, полоса 10 - очищенная человеческая нативная BSSL Список литературы 1 Abouakil, N , Rogalska, E, and Lombardo, D (1989) Biochim Biophys Acta 1002, 225 - 230 2 Atkinson, S A , Bryan, M H , and Andersson, G H (1981) J Pediatr 99, 617-624 3 Ausubel, P M , Brent, R , Kingston, R E , Moore, D D , Seidman, J G , Smith, J A , Struhl, К (eds) in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, edition of 1992) 4 Baba, T , Downs, D , Jackson, KW , Tang, J and Wang, С S (1991) Biochemistry 30, 500 - 510 5 Bernback, S , Blackberg, L, and Hernell, О (1990) J Clm Invest 85, 1221 -1226 6 Bjorksten, В, Burman, L G , deChateau, P, Frednkzon, В , Gothefors, L & Hernell, О (1980) Br Med J 201,267-272 7 Blackberg, L & Hernell, О (1981) Eur J Biochem 116, 221 -225 8 Blackberg, L and Hemell, О (1983) FEBS Lett 157, 337-341 9 Campbell, S M , Rosen, J M , Henmghausen, L G , Strech-Jurk, U and Sippel, A E (1984) Nucleic Acid Res 12, 8685-8697 10 Chappell, J E , Clandmm, M T , Kearney-Volpe, С , Reichman, В , and Swyer, P W (1986) J Pediatr 108, 439-447 11 Fontaine, R , Carter, С , and Hui, D (1991) Biochemistry 30, 7008-1014 12 Graham, F L , and Van der Eb, A J (1973) Virology 52, 456 - 467 13 Hamosh, M , Freed, L M , York, С M , Sturman, J A , and Hamosh, P (1986) Fed Proc 45, 1452 14 Han, J H , Stratowa, С , and Rutter, W J (1987) Biochemistry 26, 1617 -1625 15 Henmghausen, L , Ruiz, L & Wall, R (1990) Cur 43 rent Opinion in Biotechnology 1, 74 - 78 / іД / Признак 16 Hernell, О (1975) Eur J Clm Invest 5, 267 272 17 Hernell, O, Blackberg, L, and Lmdberg, T in Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E ed) pp 209 - 217 (Raven Press, New York 1989) 18 Hernell, O, Staggers, J E and Carey, M C (1990) Biochemistry 29 2041 -2056 19 Hernell, О and Blackberg, L in Encydopedia of human biology (Dulbecco, R ed) Vol 3, pp 47 - 56 (Academic Press, San Diego 1991) 20 Hernell, О , Blackberg, L, Chen, Q , Sternby, В and Nilsson, A (1993) J Pediatr Gastroenterol Nutr (In press) 21 Hogan, B, Constantmi, F and Lacy, E (1986) Manipulating the mouse embryo A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press 22 Hui, D and Kissel, J A (1990) Febs Lett 276,131 -134 23 Kyger, E M , Wiegand, R С , and Lange, L G (1989) Biochem Biophys Res Commun 164,13021309 24 Laemmli, U К (1970) Nature (London) 227, 680 685 25 Lidberg, U , Nilsson, J , Stromberg, К, Stenman, G , Sahlm, P , Enerback, S G and Bjursell, G (1992) Genomics13, 630-640 26 Lusky, M , and Botchan, M R (1984) Cell 36,391 -401 27 Nilsson, J , Blackberg, L , Carlsson, P , Enerback, S , Hemell, О and Bjursell, G (1990) Eur J Biochem 192, 543-550 28 Pavlakis, G N , and Hamer, D H (1983) Proc Nad Acad Sci USA 80, 397 - 401 29 Reue, К, Zambaux, J , Wong, H , Lee, G , Leete, T H , Ronk, M , Shively, J E , Sternby, В , Borgstrom, B, Ameis, D and Schotz, M C (1991) J Lipid Res 32, 267 - 276 30 Sarver, R, Byrne, J С , and Howell, P M (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79, 7147 - 7151 Srudier, FW and Moffat, В A (1986) J Мої Biol 189,113-130 31 Williamson, S , Fmucane, E, Ellis, H , and Gamsu, H R (1978) Arch Dis Childhood 53, 555 563 /2/ И ф р а и о последовательности В 1 /g£Q ГЕ № ' і/ н о мц я 0 і і. І Характеристики последовательности /В/ Локализация; 1373.. 1575 /t*/ Признак /А/ Название/ключ: эквон /В/ Локализация: 1576..2415 /Їх/Признак /А/ Название/ключ: зрел.пептид /В/ Локализация; 151. .2316 /її/ Признак /А/ Название/ключ: сигнал полни. /В/ Вокализация. 23S7.-24O2 / к /Признак /В./ Назвдзие/кягач: повтор, область /В/ Докаякзапия; 1756.-2283 /£?/Приэыак /А/ Назвавие/кЛ!оч: 5 f /Б/ Логалагакиа: W?R 1..81 / ! * / Признак /А/ Название/кл>оч: повтор, единица /В/ Локап!івачия:П56..17ВВ /її/Признак /а/ йазвание/квшч: повтор, единица /В/ Локализация: 1783.-1821 / і * / Признак /й/ Название/клич: повтор, единица /В/ Локализация: 1Е22..1854 /ЇЇ/Признак /й/ Назваинэ/ключ повтор, единица /В/ Локализация: 1355..1887 /ti/Признак /А/ Нааванне/ЕЯIJ4. повтор, единица /В/ Локализация- 1аВВ..192О / і* /Признак /А/ Назнание/Клкч: повтор, еянянма /В/ Докалиаадияі 19Ї1..1953 / L > /Признак г /й/ Назвааие/кякм: повтор, единица* /В/ Локализация: 1954..19S5 /і>/ Признак /ix/Приэиэя /А/ Название/ключ: повтор.заинииа неї /а/ Локализация; 2О53..^О85 /vi./ Источник происяокщения / Lx /Признак 5яр'ЄПЬ /А/ Наававие/елви. повтор, единица /В/ їїнп ткани: ноломная железа /В/ Локализация; 2086...Ша / ьї/Нрнэнак Л*/Признак /Й/ Назиание/кяюч: СЙб /hi Назвзвив/ключі яовтор. единица /В/ Локализация: 32..2319 Другая информация: /продукт = "стимулируемая желчи лнпаза" /А/ Название/ключ; зквон /В/ Локализация.2C2G..2052 К Н с мРНК Д К І хлл.1 Гипотетичность: нет /3/ f їх / Признак /А/ Название/иноч: повтор, единица /X /Еоподогия: линейная Организм: Нетле /А/Название/кяяч. экзон /В/ Локализация: 1174..1377 h і/Признак /С/чягло нитей: диунизевая /V /В/ Локализация; 985 .. 1173 /t.i/ Признак /В/ Локализация: 13Е7..2О19 /В/ Тип: нуклеиновая кислота / Lti/ Днтнч^ветвительнопіь. /А/ Название/кличі акзоа /A/ Hasванне/ключ: повтор- единица /й/ Днина: 242Й пар оснований / Ц / їип молекули! 44 48109 /S/ Локализация: 211S..2151 солями 45 48109 46 /ii/пряэнак /А/ Название/клич /h! Локализация повтор 215г единица 2Ш /ч/Признак /ft/ Йазваниа/клїоч /В/ Локализация повтор единица 21S5 2217 / f/Признак /А/ Нвзвакие/кявч /В/ Локализация повтор 2218 единица СЛА CCC A A^T A J ; C 15 1 0 G у G i y P h e V a l С L С у V a l As 1С IS Val ТП А5р Pro Arg A a Leu The 2S0 2,5 •*' «SO p a P о "lit 6j; S S D A5D £ e Cly 64S Pis fro Ее G / A s «1 Oly P r o P-o S 0 P о П » I.I А о ^ss О j к о ї Ala Ala о Й І а Va! p о Phe Lys Glu s i s G г Я t Vs Й 1 / Jssp u e о последе ват є ть о w Sly Leu l y s Al FTTi p t o T h r з lj 10 Leu С И Ss f P t o Val 6S0 krg а in ю Тп * T ssn Vai ьоіочйая « леза О u Ъ,: S Val Ser Lys Ala i'et 460 Till Cly Азр Р о h n Met Gly 630 0пчсач>)е посч^довате^ьчост^ A l s Lys І Ї r ІІ П P t o ""hr G у A s p J J s Gly 615 Гщотт^ность не? ІСЮЧНКГ иооиосешелмя {ж t [ Я G i. =0S ""nr P r o 1\ Gl * s ті а и Val Ы G Homo sap ens Ll s T h r Al» Длиа s Тич в її і {v Й Г P;o ТОПОЛОГИЯ С ГаНЯЗйІМ Tyr Ніг Alii Аїр As) lie Cln Tyt Vsl Phe Cl; Lys Pro Pha Ala 435 440 4SS The p о Thr Cly туе Aj-g "ro сіл Ass f q Th 'S 455 Asp С ід " " h r Tb Leu с e ser H s pro Ear As:g Met P о Vsl Tyr P о Lys Trp lal Gly -20 \l 430 ~ = a / P £15 січ Pie 3So Gin his Srg ala Ssn Ala ь s I B I Ala Lys T^r Tyt Ala Ту 40S 410 SIS s T J! 1E Pro иес Leu JSD зга S«r Gl/ Ma 5-sc S t 1 SiC Ser Oly M a « * A 9 ЧеС Ala Gin JaS Ala Gly Leu elu Ту J?S « 5 sli Vai 210 PEO L S J U e л і Ту :er G SO -ej Суз Lau Lvs \al The Asp Pro Aig Ala Lej Thr _eu Ala tyr Lys Val 260 265 i70 Asp P о T-sr -hr Thr Glu Asn 4-r Gly эуг Leu G u H e Thr Lys Lys Met "0 495 500 505 і Ala lie GIT о А Б П Мес Gly Аїр Згг A a %ai Pro Thr His Trp Glu 480 4SS P t e Thr О у * s p A l a Ljs Arg Thr Val Sex Lys Ala Men H a „la Tyr --& Thr A S T Phe Ala Lvs 4D0 465 570 P L e j Pne Є у 190 эз5 As Ala С і hys Val Gly Суз P-= "l '"ІУ P , 24S 2S3 A«p ^3= I I * Gin 1 > t Val = w О у Lvs Pra Phe А л "hi P I ""hr G V Ту ^J 445 450 Thr Ely Агр i^S Sei 230 G / H 5 Ир Ч I J ! Hi s Ala Аз 30^ ТПг Val Val A p ?he G u Thr A s s Val 385 390 S s r Ala Ly5 T h r Ту «0 5 РГО He s e r ^ U , Ph9 Thr H e " h r - s С / Leu Л.Э Gly Ala Phs Asp Val 3e5 С і. А ґ Т" Asp u G і "n* * Gly 2-5 у Us * ' ft г Л а р *2s I k i Ala Xsp Л a T"r AS"! ft.g Olu tlv IS s P h e !.ys JO ?r Ї30 ISi 190 а и S e r Ala 155 Sly Lvs Lei. 210 Sly P г T r p Vdl Л a S и uvs Val Eer Є-ro 22* T p Чиї Ц е с п Ly3 ftsn Fro Leu P»]* Trp A a Lyis Lvs V! 2sO 23= „40 A a G u Lys U Gly O S Pro Val Gly Asp Ala M a A_g » a 345 250 « a (Sir 25 C О s Leu Lys ,1*1 T-ir Asp Pro Are * l * Leu Tbr Leu A a Tyr bys 2s0 265 Ї70 Val P о Leu Ala Gly Leu їЛи Гуг Pro 1 s t Leu К s Tyr Val и / Phe Val 27$ Pro Vil ЗЭП 280 гаг l i e Asp О у Asp Phe H e £ о АІД Asp Pro H e fi.sn Let «YE > 2°, 300 Ais Дзп Ala Ala Asp І і г д p Tyr l i e Ala Gly Ttir A-n Asn MeC ftsp H e КІЗ Phe Ala 25 5ВГ He /sp Met P r o 530 Ala Ala H e S e - Va Arg Arg lie 21з He G h Ala "ia „ е ц Ala G l y Let. G l u " V t Se' T h r Leu S e r 205 Pro Gin Sec Val Ala. LVE t 220 Gly -0 Leu Phe T-p M a 23S Lvs g l y CVE P r c %a ^•JS Cys Leu Lvs Val Thx Asp г50 Pro Gin Ee G v Aso Ala A l a Arg Me- A l a C,n 2=0 2S5 Л g Aia L*4 Thr L e j Л a T y t Lys 265 270 Va f p r o He- Leu H i s Т у ї V a l Val G l y Phe P a Val 290 l i e Asp Cly Asp =he 4 e 2SS P r o „ l a Asp P i c l i e Asn Leu Ту зоо Ala b hsi, Ala A l a ivsp Ц е Asp T y r 310 l i e Д і й Gly T h r Asn Asn Met Asp Jib 320 C/ Pis U S ; t L s L/s ie ^h Phe A s a Be J25 lie M p Met P с A l a 330 t i e Asr \ a l " h r Glu G l u Asp ° h e Tv Lys Leu Val 340 34= Lys Gly Leu A g C l y M a Lys 3SS ЗЄС T B t-r TV Lys Gly Asr 33S S e r G l u P h e Th 350 h 6 Aso Val Збз Tyr G и S e r T r p А л Gin Asp P r o S e t Gin G i u Asn L"s Lvs Lys T h r 3 0 375 3E0 Asp 3^5 • T Vil 1- ' Thr . L I In! 1. Glu 1 e Ala 360 p „ l a Gin i s o Pre £ і -s Bsr s r Phe Gio Tlic Jso Val L^j Phe Wj Vel »r : "^ Leu Val 38= Asp Phe Glu T h t Asp Val ЗЭ0 -eu Ala Gin 4 l s I* Pie Se Leu Phe „ e u \ a l 3°5 Ai-g А . а Ази Ala SOS P r o Thr G l u l i e Lvs S e - Ala 410 IHis P о Set A 9 Met °ra Va Tht Val Ala ІОН Lys Thr T y t Й a Tyr 415 T, r Pro Lvs Trp Va й V Hi Ы) Asp HIS Ala Asp ftsp lie S i n Ту J4C L/s Pro Phs Al «1 Lys AJi He Se о госледевзтельностл "s 5 стика последоваїелькосге ЇЇ6 ЗііТНОЮІС 1 0 1 fan. я о последовательное^ * £ ^"еристика носэецоватеяьчос™л аь щоюіс ю т слота „ Тлп ополотая белок нет Ис^очнич ггаогетолдевия »одоччая « л е з а Птзязчак , Тан молек>чы Йелок Гиютет/чяооть не" (А) i-ra ткани IF Яокализацияз іїшзнач и пептла ' діїгая Hutip*аий« « (41 L y = Leu ї ї Asn i-ys lie P r o P h e В a kit, tys Sla Va! ^/c T t С і ч Oly Gly Р і к Lr= T - p Val ile С n Lvs 23C A a Clu Lys Val Gly 215 Cys O.s Let, Lys \=1 •*! 260 Asp ! ft-sj 2!S Ліі 200 u Gin Gin Thr Ser P-o Ser Gly 220 Val А з Leu Sec Ala 19s Lys 210 Ser 225 Aia p p l Leu 205 G и Lys y Aie U e ДЕН Pro L » J Phf 2Ї5 Trp Ala tvs Lys P r c Val Giy Asp 250 Ala M a ftig He* Ala 255 Ala 2^5 Leu Th Leu A b l y t Lys 270 Gl/ AU Ser Gly їли 11= Arg A s 21s Pro Trp Val lie C i 230 )S /a! Gly 255 Су-. P-o Val Val P r o Leu Ala G!y Leu Clu "Vr JUS 4e Vai Т'іг G L U C I J AEJJ 340 Hi5 lie ?he Ala «s Ее W J G Ala Ile ier Clu Sex Gly 220 Val Ala Leu Asn Pro Leu Phe 235 Trp Ala Lys Lya Val 240 G у -sp A 2=0 Ala Arg Мес A U 255 lie A = c Me 325 Pro Ala le Asn Lv5 330 Gly a P-o Л Ч Asp P r o t i e Asn 1>м т у г 350 Asp He P h e r ^ » о ?АД .i.>0 l i e Asn Ьуз G l y Asn 335 /= LS41 Ja 3 4 5 Asn 335 oln P r o Мес Leu Ч і в T y t Val Gly Phe Val 2S0 285 P r o Val Ц е Asp Glj- Asp Phe U s 290 295 P о Val І в Asp « > Asp Pns П е Р - А г Asp P-o 4 i Asr Leu IV-О 293 2S5 300 Gly Val 2uO С air Pr« Gly U> 240 A g « Phe Leu MeE Gly no £" Tnr j c .sn Se LEJ Xe ik!j А ! г Pne G , u J *sp c л ISO 3 Asr C'u j Ala T с Gl/ Lot Arg Asp G r -us MsE « а і 16a Gly С Tyr G l / Cly 105 A r>sp .55 Trp l i e Jisi phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tvr Aso Gly Glu 120 125 'le Thr hy^ Gly ьеч Arg Gly Ala Lys т\ 35= JSC Ser Glu Phe Tl-r 350 T r Phe Asp Va 365 Tyr "ir Glu se- Trn Ala Gli hsp ?-o Sec Gin Clu Asn Lys Lys Lys Thr V*l 370 37S ЗЗЙ The Ly^ „ у Leu Ara Gly Aia !>,$ -П-- The Phe Asp \al Tyr "Th 35S 360 36S Val Asp Phe Clu Trr Asp Val »ea Pie Leu /at Fro TMr Glu H e Ala 385 390 3S5 40Я LEJ 5. Asp Phe Glu "•-- Asp Va йь 390 Leu °h Val 3=5 0 Leu Phe Se Leu Ala Glfr A s А о «la ?sn Ala L/3 Ssr Ala LyE Th- T> 405 410 G у M s Asp His Ala >.sp Asp ile Gin Tyr Val Phe Cly Lys Pro Phe Ala 435 110 445 Ssp His 420 Ala Туї «I е -eu Ph» Ser i 5 prs Sec Aj.g MeE Pro Val Tyr Pco Lvs Trp Va 420 425 430 "5, Ala Gin H)3 M g Ala Asi Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr A a Tvr Thr Glu lie ""hr Pco Thr Gly Ту- Aig Pro GJn Asp Arg Thr Val Se. Lys Ala Met 450 (55 ISO Ile A a Tyr T p Thr Asn Phe A a L/s The Cly Asp. P о Asn Met Giy 4Sa 470 475 430 p о ftsn УЄ e u Ols. 1 e ft 5J0 І S P г Агз £* Gly Ala " a P r o \ a . 5 , = h o ? с " h r О у Asf. S J O С і «*t P r o Ala Val Sar Lys Glu ЗЗІ ЗІЄ A g P r o P r o \*1 Val f Aia = S J Phe И в ф о р * н щ я о о о с л е д о Эйфель FOG т в #15 Харзктешсетка юстадовательчоо а^кчокиототи аии іокйоло''а линейная Тип і оле^ули Оеяоч Гипотетичное ть А і Pro Prc p - c T^i- G l / Abe С у A ft p - o HST A3a 645 P о Pro \il F о ?ro Thr Cly Asp £^r Vol Pre Источник аро^охоиениї гегочкая ^елез& Іризчак Названле/кдач ? о Pro "і- Є у Asp £гг С ч Ala А д Г SE 3 JO» пептид s Другая инігомзіійяі?е ка - варіант гание ітослеловател=носет г ? Ala 1 Lys U u Gly Ala 5 А5Г Lys Ly= ь « і JO G l y Leu L»u GJy Asp 25 Ser Vai He T o Phe Ala 35 Ala P и Tbr Lys JO AJa J-eu G l u Д і л T i p Kin S l y T b r Leu Lys 55 АЇО l » s Asn isr Tv: G y '5 Aso ftr0 Oln Val Pru Cly =0 L=u « I n 6S Ala Leu « y x L e u Asn "si Tnr EJe H i 70 ile Tyr Thr Glu Gl/ Gly 10 С » 1 p Trp Val ТП Pro C'n С у rbe Val Glu Ciy Js Val Asp He Phe Lys 30 Oly P i e Glu £ r o 45 G MB і- о A l a Ніг Phe Lys 60 Lys iys rys Gla Asp Cys 8U Ser brj I о поелєяовате.'їьносіи Іячна т а востелоштелыос ТИП Arg 1іітачтеоїзртеп.ность нет С ( Cm A i№! G? Т Г С - р т П І the Aip i l TVr Th 5А Г" G 0 Se область Іризяак Назврчле клеч овтон "дик да 55 S B Рриачак "азза ше/кмпч повтоо единица 89 1321 Признак Назван. «/ключ повтор еливнца локализаци юкалязаиїя B2.J '.iU Назван лв/кшч Локализация ПОЕТОН G.» s r Asp /a CA H і ЛОА С С S ^ " Aig K U to IPS m Cft Cis 4^0 едш«иа SSS Рокалйзаіья Єї » Назван ЇЄ/КЛЗЧ: їївнаяак 192 вазнал повтов ЧазвЁйлеЛжзч ТА "yr At T *C 1 Г a T G-T " I C S * Asp I * З І 1 ^ [ V s l Pus 01 CG* С CM С A g Р Т Е Oln n s p CIS Г " -ей ?Ре ТСС Заг ! ї й , С'Ч; GS» GCC C Cft-T 1 n o Val 6 1 / A l a i s p l !^ 45Г1 (35 AA CC F [ C t К I B s P о f • Д ) а Thf Ш еігніца ИС й ЇД Ч г . И П -J1S С А™ P о Lvs U GuC r ^ C C l y 1\t НазЕалуе/ лпч Локализация ПОСТОВ г с **•• А АГ" а СТА G CAG Річ Т 1 !! G и Н е А г Lsu Ala GSr OCC AA» ACT СЄС S i C S є _ s = - ft a « y s 4S5 CCC TCT COS ЛТС CCC C X P : a S e c A . g i f e t P o Va.i «> U J 5» A l a ksa 1 r -пг л ct Leu phe Lei. Vs CC РГ А -л, A^A CTC " A s "Sir Va Se AA» L/s GCC * K Ala Ke ACG Th( J55 U* A~C ОС lie А г ЇАС туг ащыиоэ повтор Я А С ДАС ТТТ GC r p Tht Asn P r a S i s 410 елпн на л ^ Д A A GOG G~C ССС АА L s Th » t y А о і т с Asn АТС Є SAC ТС„ Gt Иге Є у Asp S» A r ^азвач^є/кігоч Іочализашш CTG C X АСА CSC TGG AA CCC "A'' A T 1 G Gift АЛС ACC GGC ТА Vo P r o T h r H £ T p (. и P r o T y r T»ir "ЙТ Gill AEn S « 1 у Ту 4SS 990 19з V~ Leu Нззваггае/ключ Птазка\ ;0 0 2 5 02 по^^оо єднктда OOBTOD G^G АТС ACC AAG ASG * ~ G G-C A s C y s T р Ala V e l Liu G у 1-е ЯК С С у Ala О— Va ТАС Ь С^й ™ Т С~^ чу г Thr С u S l y C l j PEO Val Рте »ro . ТТС и-ТЇ САД GGC ОТ- ДАТ .ЛО Pha V a l G и « l y V a l Лвл Lys С С A „ CT P і Tnt Oly 565 AAG Lys С„ Asp T-C ™, se el/ G С С™ CC —• CCG IXC SCC O3T Gj. A a P r o P о Val P r o P r o Th G у S s p 570 j75 Ю Н 585 f P о АТС -Кк, G An A a АїП GTC ТС Val S e r *u CGG О„С СТС ССС Ага А і р L e u P E P A A C»C ™ A '"• A a u l y T T iXk, Leu 1 IS» C ~-CCl. J s p W : 0-^ Se A.1 ! t S ) С CA- ATG CCT C-A a 'ivі Ь s 6 5 " ."c^A-sct; с A C W G I G T г Pro p ДТ ~ lla ;ссм C G u a t IKO С С Т Г С Т У A U P^ie L e u 110 A.S As 3 TTC C t " P h e vBi. 15* И We в™ al AT^ С " " lie \al С — ACC T™C 1Д Val " t t r P>te P s r HO A»C Se ЙСТ G ~ GS GCC А„Т С ї ~ C "Иг с у i s p A l a Asn Ь * и 155 П Ь и І і: G l y Sal PSe 64S TAC COT " " C OGC CC T>r A;a i a l c l y Pio І45 ССЯ GAT С В " САС А~С К С ^Cii A s o С г Ь s Ц і ї , і V J 4 С _J л Asu ^, c P о Asn „ А sn ^с lie д СТС c Thr 185 GCC A A a £ r lie j - t L=u A S P l i e a T h r G i n Asp Site Trp Ja pts Gl I ! ~ p 1г Ту 105 Asr Чіе eu Asn PHe „fti. S T Tnr S5 Asp Se Clu Ы Tyr Leu ~t, It Ala 5 E5 Ala Vil ) с Лід £ys ?э Cl/ ^ g "11 Vil G у u Asp Cvs Lsu ОІ/ Oly CTC TAC CCC AAC GC L e u T y r „ l a Asn Ala SC5 ™ Le.1 C i v і e CCAla 275 P о AAC AST e 1; S о A a i.vs 5 Glv io Ь s Asn чТС A~^ CA a і e Gin 30 ^ д ^ («5ЛЄ Se __^ uly ™ El ID -ett ™i А-»С CCG lie Ala ; А _ ibtl Топотог я ISO АТТ С~Т ТО^ О Т - АЛО MM AA7 1 M U t р Й 1 . і A . ) AST -тек CC T-CC КС Gly JJ Т L? •* Pl-e КЛ » J a l Ce і 00 iy « Я CiA Ь 5 G f О Ь ™ G i n -. у Arq Val ft5p Asp 1 t GSC TCC 5er та * і С 7Gftp ACC GCC CCC C T - CCC H i t Ati F r o Val Pic • c c s ft"1^ Us a CAG вій Let. Ї 0 V o ! 4= Зі! 1 s gl/ 1 1 * Ala 13« 1 С у Pro Гчг АІД Arg * u Gly Gl 55 СІП Asr Glr 220 Lej Ph* Trp Ala Vs 235 Ap Ala s 250 Lu Thr e 205 Gly V a A Is L . . Ее' Ala Lys -її »EO T-p Val 1-ї G n L/s Tyr Val Phe Oiy Val Arg Бе Ail Pro Th, Val £er Ala G l u lys Val cys Pro Val Asp PEG A g Ala 265 Ala Ту- * , ЛО Val He Asr b e . Т у , AJs fen Asn 4 . t Leu Leu A3.4. Leu P-o T 1 — V a l ТЇ-- Asp G i n C . j A. T r r G i y Asp S e - C l u 555 mi P-, Си Tv. Pea TM P i o T h - Ciiy Ass SI 5 T h r Туг P-o i = l H e A*p G.y Л^р РПа H e P r o AsAla Asn A..a Ala Asp H e Asp Tyr Ser Ala la і,:. P о P ' o -- ? ( U ' 550 T h - C ' v Asp f : s« He 3io Asn Lys Gly Asr P-o Thr Gly S e r G I J Phe TSr 3so Sly Ala PEO FX Asp Val Tyr T r r 36S Pro Pro T-ir T-p Ala a a Asp "y fro Trp lie 'зо Lys Leu V a G , ft n Lys зэ" Val Prc 39S GIL Asn Ser Cly Туг .ыш Q.u H e Thr Lya Lys Met 495 SOO Ё05 Me- Lvs Arg S s r Leu Arg Th. ASK Phe Leu Arg = = =S0 s e r S10 pro Leu A a Giy L e j G I J Tyt Pro Нес iS 2S0 305 "•'p ThE Aar Рїіе А Thr Gly Asp Pra Oly S e r S e r Aid As, ^ Ala Met Tie U = " j r Gin «60 Gly Thr Gly Ala Asp и s Ala Aso ^ s p l i e G -j TyAla Tnr Pra T v r Cly Tyr Arg P r o 45Я 453 PEC Cly ft! L s ш L*j . e A-g A-3 А з 1 1 ^ 21= A-g HeС Ala G-tl Oly P . , V . I Pro Ala І. і G 3iO M o Se Lys T r p • *l P r o туг T h r Tht val U» rfw Tyr Va. Pro 300 Cly Thr JiS В S Мї і * A * *U РЬе S l y СІ/ 180 G'u S e ' A a GEy Oly «г 56 48109 Pro S e - G l r Asn Ser Pro V a l &5 0 Glv A s p Ala Lya ESS 1 E e r G l y Й1& p - o F r o Vd P r c ?*= 590 5=5 его Tl-r \ a l Se; Gl/ А і Ї.В0 ""'С P-o 1.* Prc 58. ТЧї С у Asp S00 Sel P r o Prt> T r r G l y Asp 5 e r 610 G , Pro Pro SIS Val Se»- O l y A l a P r o ">-o \zl 625 P r o P r o T h r Asp 630 Asp P r o A l a Val lie Ala ksg ™]i Glu 1 1 . Ala Lej Ala Gin His Arg А . э Азп Ala dan S e r H i s Pro Ser его Arg Met P r o «5 ПОЛНОЕ клетки F L A B C N HindHI 28S 535 Fl 722 ИЙ-СШЬ .533 18S 535 187 187 535 535 Zt-COOH актина Ш гглаэмюш F L A 8 C N АКТИВНОСТЬ со 5 м 3 СП (Л "(И • t BSSL О О о, > i t го о со Ю о М И (О О X о О1 І и * ю j en ц і о» І І I V во 1 го СП 00 О) to CD о I UJ -г 59 48109 60 Время, мин ¥иг.12 лят 2,35 ї . п . о . Ъ.п т . а . о BseH Ncol Sacl Соль желчи |PS3U > с В&тНГ Измят ГНерэвар с р | и Яаб!. изолят . 1 1 , 9 *-.П.О, Sail 5,3 Т.Я.р, Sail Хояэт яатрия. 2 П Sa:. Вапні Sail 1Г 2С к ч . Темпеоатура, °С Тиг.15 5Г.П Bm l aH