Спосіб діагностики невиносності ацетилсаліцилової кислоти in vitro у хворих на бронхіальну астму

Изобретение относится к медицине, в частности к аллергологии, и может быть использовано в лабораторной диагностике непереносимости ацетилсалициловой кислоты у больных бронхиальной астмой. Известен способ диагностики непереносимости ацетилсалициловой кислоты заключающийся в определении интенсивности цитотоксического влияния веществ, выделяемых активированными ацетилсалициловой кислотой тромбоцитами на культуру Способ осуществляют следующим образом: из периферической крови больного путем центрифугирования при 2000об/мин выделяют тромбоциты, помещают их в буфер Тироде, затем инкубируют их с ацетилсалициловой кислотой, после чего снова центрифугируют при 3000об/мин, полученный супернатант добавляют в пробирку с культурой инкубируют в течение 30мин и подсчитывают количество живых клеток тест-культуры до и после инкубации с супернатантом и по уменьшению количества живых клеток судят о наличии повышенной чувствительности к ацетилсалициловой кислоте у больных бронхиальной астмой. Однако данному способу присущи следующие недостатки: применение в качестве тест-объекта культуры патогенного штамма небезопасно для исследователя, т.к. достаточно высока вероятность заражения дизентерией; технологическая сложность осуществления способа (специфическая оснащенность лаборатории для работы с бактериями, выделение чистой культуры тромбоцитов). В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа диагностики непереносимости ацетилсалициловой кислоты у больных бронхиальной астмой, в котором определяют специфическую активацию тромбоцитов больного в присутствии ацетилсалициловой кислоты в реакции активного розеткообразования, где в качестве тесткультуры используют лимфоциты больного, выявляют угнетение интенсивности больных, что позволяет диагностировать непереносимость ацетилсалициловой кислоты у больных более простым и безопасным способом. Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики непереносимости ацетилсалициловой кислоты у больных бронхиальной астмой путем инкубации тромбоцитов больного в присутствии ацетилсалициловой кислоты с тест-культурой, согласно изобретению, в качестве тест-культуры используют лимфоциты, выделенные из периферической крови больного, в реакции активного розеткообразования определяют исходное количество и количество после инкубации лимфоцитов с супернатантом обогащенной тромбоцитами плазмы в присутствии ацетилсалициловой кислоты и при снижении количества в пробе с ацетилсалициловой кислотой на 25% и более по сравнению с исходным диагностируют непереносимость ацетилсалициловой кислоты. Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор 10мл крови из вены больного утром натощак. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы 5мл крови помещают в силиконированную или пластиковую пробирку, содержащую 0,5мл 3,8% цитрата натрия. Стабилизированную цитратом кровь центрифугируют 5 - 7мин при 1000об/мин, затем 2мл обогащенной тромбоцитами плазмы помещают в силиконированную пробирку, добавляют 20мкг аспизола, который является растворимой формой аспирина, и инкубируют в течение 15мин при 37°C, после чего центрифугируют в течение 15мин при 3000об/мин и собирают супернатант. Для выделения лимфоцитов 5мл крови обследуемого больного помещают в пробирку с 0,1мл гепарина. Выделение лимфоцитов и приготовление взвеси эритроцитов для проведения реакции активного розеткообразования осуществляют по стандартной методике (по Реакцию активного розеткообразования проводят в двух вариантах: определение исходного количества определение в присутствии супернатанта обогащенной тромбоцитами плазмы, преинкубированной с аспизолом. Определение исходного количества проводят следующим образом: в пробирку вносят 0,1мл 3% взвеси эритроцитов барана, добавляют 0,1мл лимфоцитарной взвеси (в концентрации в 1мл), затем перемешивают. Смесь инкубируют 30мин при 37°C, центрифугируют в течение 5мин при 1000об/мин, полученные клетки ресуспендируют, в камере Горяева подсчитывают 200 лимфоцитов и определяют процент розеткообразующих клеток. Определение в присутствии супернатанта обогащенной тромбоцитами плазмы, преинкубированной с аспизолом, проводят следующим образом: 0,1мл взвеси лимфоцитов (в концентрации в 1мл) инкубируют с 0,1мл супернатанта обогащенной тромбоцитами плазмы в течение 30мин при 37°C, после чего проводят реакцию активного розеткообразования по общепринятой методике (по Реакция считается положительной при снижении количества розеткообразующих клеток в пробе с ацетилсалициловой кислотой на 25% и более относительно исходного уровня. Опытным путем установлено, что доза аспизола 20мкг явилась наиболее оптимальной для проведения реакции с диагностической целью. Доза аспизола менее 20мкг в недостаточной степени вызывала активацию тромбоцитов больных аспиринзависимой бронхиальной астмой. Доза больше 20мкг оказывал а такое же действие на интенсивность активного розеткообразования. Разведение аспизола готовится следующим образом: 0,5г аспизола разводится в 4,5мл среды 199, в полученном разведении содержится 100мг аспизола в 1мл, из этого разведения 0,5мл + 4,5мл среды 199 - в 1мл - 10мг, из последнего разведения 0,1мл + 0,9мл среды (1мл - 100мкг). Доза 20мкг будет содержаться в 0,2мл. Приводим конкретные примеры выполнения способа. Пример 1. Больная У., 38 лет, диагноз: бронхиальная астма инфекционно-аллергическая форма, 1ст., тяжелое течение, гормонозависимая, фаза обострения. Хронический полипозный этмоидит. Непереносимость нестероидных противовоспалительных препаратов. Накануне исследования, для подтверждения непереносимости аспирина, проведена провокационная ингаляционная проба с аспизолом in vivo, проба положительная. Иммунологическое исследование крови выполнено предлагаемым способом: исходный уровень составил 22%, а при постановке реакции с супернатантом обогащенной тромбоцитами плазмы, преинкубированной с аспизолом, составила 11%, т.е. по сравнению с исходным уровень снизился на 50%. Реакция положительная. Пример 2. Больной К., 42 года, диагноз: бронхиальная астма, атопическая форма, 1ст., тяжелое течение, фаза обострения. Хронический полипозный этмоидит. Непереносимость нестероидных противовоспалительных препаратов. Накануне исследования, для подтверждения непереносимости аспирина, проведена провокационная ингаляционная проба с аспизолом. Проба положительная. Иммунологическое исследование крови выполнено предложенным способом: исходный уровень составил 29%, а при постановке с супернатантом обогащенной тромбоцитами плазмы, преинкубированной с аспизолом, составили 21%, по сравнению с исходным уровень снизился на 27,6%, реакция положительная. Пример 3. Больной М., 52 года, диагноз: бронхиальная астма, инфекционно-аллергическая форма, 1ст., течение средней тяжести, фаза обострения. Хронический рецидивирующий полипозный этмоидит. Провокационная ингаляционная проба с аспизолом отрицательная. Иммунологическое исследование крови выполнено предлагаемым способом: исходный уровень - 28%, в реакции с тромбоцитарной плазмой, преинкубированной с аспизолом, уровень - 24%. Снижения уровня не выявлено. Реакция отрицательная. Данные по проведенным исследованиям обобщены в табл.1. Из таблицы видно, что в среднем исходный уровень у больных аспиринчувствительной БА (1 группа) и больных другими формами БА, переносящих аспирин, был одинаковым. При использовании в реакции розеткообразования обогащенной тромбоцитами плазмы, преинкубированной с аспизолом, уровень в 1 группе снизился в среднем на 50,3 ± 7,6%, а во 2 группе на 14,7 ± 2,9%. При этом непереносимость аспирина была подтверждена в 70% случаев больных 1 группы, ложно положительная реакция наблюдалась у 1 больного 2 группы. Для определения диагностической значимости метода проводили 4 варианта реакции: 1 - определение исходного уровня 2 - определение в присутствии аспизола; 3 - определение в присутствии обогащенной тромбоцитами плазмы; 4 - определение в присутствии обогащенной тромбоцитами плазмы, инкубированной с аслизолом. Полученные данные представлены в табл.2. Для разработки метода диагностики непереносимости ацетилсалициловой кислоты были сформированы 2 группы больных БА: 1 - я 17 больных АЗБА, у которых непереносимость АСК была подтверждена положительной оральной или ингаляционной провокационными пробами, и 2 - я, в количестве 11 человек, которые переносили ацетилсалициловую кислоту. При анализе полученных данных было установлено, что исходный уровень в1и2 проявляла группах достоверно не отличался. В присутствии аспизола интенсивность тенденцию к снижению, как в 1 так и во 2 группе, однако это снижение было статистически недостоверным. Добавление обогащенной тромбоцитами плазмы также вызывало угнетение розеткообразования, но и это снижение интенсивности реакции было недостоверным. При проведении реакции в присутствии обогащенной тромбоцитами плазмы, инкубированной с аспизолом, угнетение активного розеткообразования наступало только у больных АЗБА (с 31,0 ± 3,15% до 14,6 ± 2,62%, При определении процента снижения установлено, что в 1 группе он составил 50,3 ± 7,6%, а во второй - 14,7 ± 2,8%. Исходя из этого можно было считать реакцию положительной при снижении интенсивности на 35% и более по сравнению с исходным уровнем однако, учитывая, что среди аспиринзависимых больных в 3 случаях процент снижения реакции был равен 25,9 ± 1,2% (что достоверно больше, чем во 2 группе - 14,7 ± 2,9), мы сочли возможным считать реакцию положительной при ее падении на 25% и более. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с прототипом является безопасным за счет исключения патогенных микроорганизмов в качестве тест-культуры и замены последней на лимфоциты того же больного, а также методически более простым и легко выполнимым. Предлагаемый способ может быть широко использован в учреждениях практического здравоохранения.