Процес визначення порогових та неефективних рівнів похідних сульфонілсечовини в короткочасному експерименті

Процес визначення порогових та неефективних рівнів пестицидів похідних сульфонілсечовини, що включає дослідження перебігу змін вільнора 3 го та доступного процесу визначення порогових та неефективних рівнів дії похідних сульфонілсечовини, що досягається шляхом оцінки стану перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), окислювальної модифікації білків (ОМБ) та антиоксидантної активності (АОА) в біосубстратах лабораторних тварин в динаміці субхронічного експерименту протягом 30 діб при введенні 2-3 доз пестицидів в дозах, близьких до NOAEL, встановленої в хронічному довготривалому та субхронічному експериментах, що важливо для об'єктивації нешкідливого впливу пестицидів на працюючих та скороченні термінів обґрунтування (розробки) гігієнічних нормативів для працюючих. Наша пропозиція щодо визначення порогових та неефективних рівнів пестицидів похідних сульфонілсечовини в малих дозах в короткочасному експерименті за показниками ПОЛ, ОМБ та АОА базується на вперше встановленій нами в умовах токсикологічного експерименту закономірності, яка полягає в тому, що введення похідних сульфонілсечовини (метсульфурон-метилу та хлорсульфурону) призводить до порушення перебігу вільнорадикальних процесів ПОЛ та OМБ і проантиоксидантного співвідношення в залежності від рівнів дії цих препаратів і, таким чином, обумовлює досягнення задачі корисної моделі. Раніше оцінка перебігу вільнорадикального окислення ПОЛ, OМБ та АОА з цією метою не використовувалася. Заявлений процес здійснюється в три етапи: 1) Аналіз літератури та даних досьє фірм. Проводиться з урахуванням встановлених порогових, підпорогових та недіючих доз. При цьому необхідно звернути увагу не тільки на самі величини недіючих та неефективних доз, а й рівні, при яких виявлялись статистичне значимі зміни, але вони не були враховані при обґрунтуванні вище зазначених доз. Відбираються дві-три дози препарату, близькі до NOAEL. 2) Експериментальні дослідження. Проводяться на щурах у відповідності з вимогами лабораторної практики. Для цього формують 2-3 дослідні групи і одну контрольну по 6-10 тварин. Тварини повинні бути однієї статі, рівні за віком та пройти карантин. Вибрані на першому етапі дози препарату вводять лабораторним тваринам у вигляді водного розчину чи емульсії в допустимих об'ємах (до 1мл/100г маси тіла). Препарати вводять натщесерце щоденно протягом 30 діб. На 7, 14, 30 добу та у відновний період (14 діб) здійснюють декапітацію. Біохімічні показники визначають за загальноприйнятими методами. Для дослідження показників ПОЛ, OМБ та АОА відбирають біосубстрати - кров, тканину печінки. Еритроцити крові шляхом центрифугування при 3000об/хв. протягом 10 хвилин відділяють від плазми. Еритроцити тричі відмивають фізіологічним розчином. З тканини печінки готують гомогенат в трис-буферному розчині (рН 7,4). ПОЛ оцінюють за вмістом малонового діальдегіду (МДА) в еритроцитах [Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лаборато 12064 4 рной диагностике: Т 2. - Минск: Беларусь, 2000.495с.], спонтанним накопиченням МДА в печінці [Гацко Г.Г., Мажуль Л.М., Позднякова Е.А. Перекисное окисление липидов в тканях крыс разного возраста в норме и при голодании //Бюл. эксперим. биол. и медицины.- 1982.- № 4. - С. 30-32.] та кількістю дієнових кон'югатів (ДК) в плазмі крові [Камышников B.C. Справочник по клиникобиохимической лабораторной диагностике: Т 2. Минск: Беларусь, 2000.-495с.]. Окислювальну модифікацію білків плазми крові щурів визначають за утворенням альдегідних і кетонних груп у радикалах залишків аліфатичних амінокислот білків плазми крові [Мещишен І.Ф. Метод визначення окиснювальної модифікації білків плазми (сироватки) крові //Буковинський медичний вісник.-1998.- т. 2, № 1.-С. 156-158]. Антиоксидантну активність в плазмі крові визначають за вмістом церулоплазміну [Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2т. Т 2. - Минск: Беларусь, 2000.-495с.] та кількістю сульфгідрильних груп [Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arh. Biochem. Biophys. - 1959. - 82. - P. 70-76]. 3) Аналіз отриманих даних та обґрунтування величин порогових та неефективних рівнів. Проводиться з урахуванням динаміки змін, їх величини, статистичної значимості, про-антиоксидантного співвідношення. Одержані результати досліджень піддають статистичній обробці та визначенням співвідношення змін показників ПОЛ, OМБ і АОА. Об'єктивним критерієм мінімального рівня виявлених шкідливих ефектів (LOAEL), що можуть передувати патології чи створювати передумови її є: а) статистичне значимі зміни інтенсифікації ПОЛ та OМБ при введенні препарату та не повна їх нормалізація у відновному періоді; б) лінійна залежність змін у часі; в) накопичення змін інтенсивності ПОЛ, OМБ та АОА в динаміці експерименту; г) порушення співвідношення інтенсивності вільнорадикальних процесів та АОА. Об'єктивним критерієм нешкідливої дії (LOEL) є: а) окремі статистичне значимі зміни інтенсифікації ПОЛ та ОМБ при введенні препарату та їх нормалізація у відновному періоді; б) S-образна залежність змін у часі; в) окремі порушення співвідношення інтенсивності вільнорадикальних процесів та АОА. Об'єктивним критерієм максимального рівня, що не викликає шкідливого ефекту (NOAEL) є: а) чередування змін інтенсифікації ПОЛ та ОМБ з нормалізацією їх при введенні препарату; б) окремі порушення співвідношення інтенсивності вільнорадикальних процесів та АОА. Об'єктивним критерієм максимального неефективного рівня (NOEL) є: а) окремі зміни інтенсифікації ПОЛ та ОМБ при введенні препарату в перші терміни дослідження; б) окремі порушення співвідношення інтенсивності вільнорадикальних процесів та АОА в перші терміни дослідження. Приклади 1. Препарат метсульфурон-метил. За літературними даними при повторному 5 12064 введенні метсульфурон-метилу відмічались зміни в показниках крові та активності індикаторних ферментів при дії доз (1,11мг/кг та 7,0мг/кг). Тому, в наших дослідженнях використані вищевказані дози метсульфурон-метилу та проміжна між ними 3,5мг/кг. В результаті перорального введення щурам гербіциду на основі метсульфурон-метилу виявлено порушення перебігу інтенсивності перекисного окислення ліпідів, ОМБ та активності антиоксидантної системи організму щурів. При дії максимальної дози (7,0мг/кг) збільшення інтенсивності ПОЛ в еритроцитах, ОМБ в плазмі крові було лінійним в часі, що може свідчити про поступове накопичення пошкоджуючого ефекту і навіть при відсутності статистичне значимих змін ПОЛ та ОМБ антиоксидантний захист не був реалізований. Також відзначались суттєві зміни проантиоксидантних співвідношень ПОЛ/АОА (більше 1,3) виявлені при дії цієї дози в печінці в усі терміни дослідження, в еритроцитах на 14-30 добу, в сироватці крові на 14 добу, а ОМБ/АОА на 7-14 добу експерименту, що дозволяє розцінити цю дозу як мінімальний рівень виявлених шкідливих ефектів чи межу напруження захисних реакцій LOAEL. При дії доз 1,11мг/кг та 3,5мг/кг спостерігалося чередування змін інтенсивності ПОЛ в еритроцитах та плазмі крові та ОМБ в плазмі крові. Також були відзначені окремі порушення співвідношення інтенсивності вілонорадикальних процесів та антиоксидантного захисту. Вищенаведене дозволяє розцінити ці дози як максимально неефективний рівень - NOAEL. Комп’ютерна верстка Д. Дорошенко 6 2. Препарат хлорсульфурон. Величини неефективних та порогових рівнів хлорсульфурону в субхронічному і хронічному експериментах встановлені за загальнотоксичними показниками - 6,67мг/кг маси тіла лабораторних. Ця та в 2 рази менша (3,34мг/кг) дози були відібрані для дослідження. В результаті проведених експериментальних досліджень на щурах при введенні гербіциду на основі хлорсульфурону виявлені дозо-залежні зміни ПОЛ. Статистичне значимі зміни досліджених показників вільнорадикальних процесів, лінійна залежність їх у часі, порушення співвідношень ПОЛ, ОМБ та антиоксидантної активності при дії більшої дози (6,67 мг/кг) дозволяють трактувати її згідно міжнародної класифікації як LOAEL. При дії меншої дози (3,34 мг/кг) відмічене чередування змін інтенсивності ПОЛ та ОМБ та окремі порушення співвідношень ПОЛ, ОМБ з АОА є основою до віднесення її до NOAEL. Таким чином, отримані дані свідчать про ефективність та перспективність заявленого процесу визначення порогових та неефективних рівнів пестицидів похідних сульфонілсечовини в малих дозах в короткочасному експерименті. Спосіб доступний для застосування, не потребує спеціальних коштовних та дефіцитних реактивів та обладнання, здійснюється в короткочасний термін. Отже заявлений процес корисний для практичної гігієни і токсикології і може бути рекомендований для поширеного використання при гігієнічній регламентації застосування похідних сульфонілсечовин - сучасних засобів захисту рослин. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601